Badanie miękkiej materii i układów biologicznych w szerokiej skali długości od rozmiarów nanometrów i mikrometrów na małokątowym dyfraktometrze neutronowym KWS-2

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do badania miękkiej materii i systemów biofizycznych w szerokiej mezoskopowej skali długości, od nm do μm, która obejmuje użycie dyfraktometru KWS-2 SANS o wysokiej intensywności i regulowanej rozdzielczości.

Streszczenie

Dyfraktometr KWS-2 SANS jest dedykowany do badania miękkiej materii i systemów biofizycznych w szerokiej skali długości, od nm do μm. Instrument jest zoptymalizowany pod kątem eksploracji szerokiego zakresu przenoszenia pędu Q od 1x10-4 do 0,5 ^A-1 poprzez połączenie klasycznej metody otworkowej, ogniskowania (z soczewkami) i czasu przelotu (z helikopterem), przy jednoczesnym zapewnieniu wysokiej intensywności neutronów o regulowanej rozdzielczości. Ze względu na możliwość regulacji intensywności i rozdzielczości w szerokich granicach podczas eksperymentu, w połączeniu z możliwością wyposażenia określonych środowisk próbek i urządzeń pomocniczych, KWS-2 wykazuje dużą wszechstronność w zakresie szerokiego zakresu badań strukturalnych i morfologicznych w tej dziedzinie. Struktury równowagi można badać w pomiarach statycznych, podczas gdy procesy dynamiczne i kinetyczne można badać w skalach czasowych od minut do dziesiątek milisekund przy użyciu podejść czasowo-rozdzielczych. Typowe systemy, które są badane za pomocą KWS-2, obejmują zakres od złożonych, hierarchicznych systemów, które wykazują wiele poziomów strukturalnych (np. żele, sieci lub makroagregaty) do małych i słabo rozpraszających systemów (np. Pojedyncze polimery lub białka w roztworze). Niedawna modernizacja systemu detekcji, która umożliwia detekcję szybkości zliczania w zakresie MHz, otwiera nowe możliwości badania nawet bardzo małych morfologii biologicznych w roztworze buforowym ze słabymi sygnałami rozpraszania w pobliżu poziomu rozpraszania buforowego przy wysokim Q.

W tym artykule przedstawiamy protokół do badania próbek o charakterystycznych poziomach wielkości obejmujących szeroką skalę długości i wykazujących uporządkowanie w strukturze mezoskalowej za pomocą KWS-2. Szczegółowo przedstawiamy, jak korzystać z wielu trybów pracy, które oferuje instrument i jaki jest osiągany poziom wydajności.

Wprowadzenie

Materiały miękkie i biologiczne wykazują bogatą różnorodność morfologiczną, charakteryzującą się takimi cechami jak samoorganizacja i samorzutne składanie jednostek elementarnych w większe, złożone agregaty. Wykazują one również kooperatywne oddziaływania z dużą liczbą stopni swobody; słabe oddziaływania między jednostkami strukturalnymi, a co za tym idzie wysoką wrażliwość na pola zewnętrzne, oraz korelacje czasoprzestrzenne obejmujące szeroki zakres, od nanometrów do milimetrów i od nanosekund do dni. Ze względu na rozległy zakres istotnych skal długości i czasu, eksperymentalna charakterystyka właściwości tych materiałów jest bardzo wymagająca. Techniki rozpraszania neutronów odgrywają istotną rolę w badaniu struktury, dynamiki i właściwości termodynamicznych tak złożonych układów. Jako unikalne sondy, neutrony oferują korzyść w postaci różnych oddziaływań między izotopami wodoru ¹H i ²H (deuterem, D). Duża różnica w gęstości długości rozpraszania koherentnego między wodorem a deuterem stanowi podstawę metod zmienności kontrastu i dopasowania kontrastu. Ponieważ większość materii miękkiej i układów biologicznych składa się z węglowodorów, podstawienie wodoru deuterem (H/D) daje możliwość zmiany gęstości długości rozpraszania koherentnego związku w szerokim zakresie. Dzięki tej technice wybrane składniki w złożonym układzie mogą zostać oznakowane poprzez wymianę izotopową. W zależności od kontrastu – czyli kwadratu różnicy między gęstością długości rozpraszania danego składnika a gęstością pozostałych komponentów – wybrane elementy lub obszary w złożonej morfologii materii miękkiej lub biofizycznej mogą stać się widoczne lub niewidoczne w eksperymencie rozpraszania bez chemicznej modyfikacji układu. Ponadto neutrony charakteryzują się wysoką przenikliwością i mogą być stosowane jako sondy nieniszczące oraz do badania próbek w specjalnych środowiskach, w których wkład materiałów dodatkowych umieszczonych w wiązce może być wiarygodnie zmierzony i skorygowany.

Eksperymenty z rozpraszaniem sprężystym dostarczają informacji o strukturze i morfologii próbki. Natężenie rozproszonego promieniowania mierzone jest w przestrzeni odwrotnej jako funkcja przeniesienia pędu Q, gdzie Q=4π/λ sin Θ/2, przy czym λ - długość fali neutronu a Θ - kąt rozpraszania; dane te są następnie przekształcane w przestrzeń rzeczywistą za pomocą odwrotnej transformaty Fouriera. Zatem duże wartości Q odnoszą się do krótkich skal długości, w których korelacje międzyatomowe są badane za pomocą klasycznej dyfrakcji neutronowej (ND). Przy małych wartościach Q można badać duże skale długości za pomocą małokątowego rozpraszania neutronów (SANS). Zazwyczaj pojedyncze lub agregujące makrocząsteczki syntetyczne lub naturalne w roztworach, stopach, filmach lub próbkach objętościowych są charakteryzowane w szerokim zakresie skal długości, od rozmiarów nanometrowych i mikrometrowych, poprzez zastosowanie klasycznej techniki SANS z otworkiem (pin-hole) oraz techniki ultra-SANS (opartej na ogniskowaniu lub dyfraktometrii monokryształowej). Jednak połączenie różnych metod lub urządzeń w celu uzyskania pełnej charakterystyki strukturalnej jest niekiedy trudne ze względu na takie kwestie jak dostępna ilość próbki, stabilność próbek w długim czasie, odtwarzalność efektów w szczególnych warunkach termodynamicznych oraz wspólna analiza danych eksperymentalnych uzyskanych w różnych geometriach eksperymentalnych. Co więcej, badania dotyczące struktur i szybkich zmian strukturalnych, które wymagają wysokiej rozdzielczości przestrzennej lub czasowej, są bardzo wymagające i necessitate specjalistycznych układów eksperymentalnych. Dlatego opracowanie wysoce wszechstronnych instrumentów SANS, w których ograniczenia mogą być przesuwane poza typową konfigurację w łatwy i praktyczny sposób, jest korzystne dla zaspokojenia wszystkich specjalnych wymagań społeczności użytkowników.

Dyfraktometr SANS KWS-2 (Rycina 1), obsługiwany przez Jülich Centre of Neutron Science (JCNS) w Heinz Maier-Leibnitz Center (MLZ) w Garching, był pierwotnie klasycznym instrumentem SANS typu pinhole, wykorzystującym wysoki strumień neutronów (Rycina uzupełniająca 1) dostarczany przez źródło neutronów FRM II¹ oraz dedykowany system prowadnic^2-4. Po wielokrotnych modernizacjach instrument został zoptymalizowany do badania szerokiego zakresu Q, od 1x10^-4 do 0.5 Å^-1, zapewniając wysoką intensywność neutronów i regulowaną rozdzielczość. Dzięki dostępności specjalistycznych środowisk dla próbek oraz urządzeń pomocniczych (Tabela 1), instrument może zostać wyposażony do badania materii miękkiej i układów biofizycznych w szerokiej skali długości, od nm do µm, poprzez pomiary statyczne; może on również prowadzić badania struktur i morfologii w czasie, w stanie równowagi lub podczas transformacji wynikających z procesów kinetycznych, obejmując szeroką skalę czasową od minut do dziesiątek milisekund. W konwencjonalnym trybie pracy (Rycina 2A) można pokryć zakres Q od 7x10^-4 Å^-1 do 0.5 Å^-1 poprzez zmianę odległości od próbki do detektora i/lub długości fali. W związku z tym w przestrzeni rzeczywistej (gdzie wymiar jest traktowany jako 2π/Q) można badać poziomy strukturalne i efekty korelacyjne w skali długości od 10 Å do 9 000 Å. Wybór długości fali, w zakresie od 4.5 Å do 20 Å, za pomocą mechanicznego monochromatora (selektora prędkości) zapewniającego rozrzut długości fali Δλ/λ= 20%, zmiana warunków kolimacji (długość kolimacji L_C oraz otwory apertur: A_C – apertura wlotowa, znajdująca się za ostatnim segmentem prowadnicy neutronów w wiązce, oraz A_S – apertura próbki, bezpośrednio przed próbką) oraz zmiana odległości detekcji L_D odbywają się automatycznie, za pomocą sterowania komputerowego.

W celu zwiększenia wydajności instrumentu przeprowadzono niedawno znaczące ulepszenia w zakresie intensywności próbki, rozdzielczości przyrządu, minimalnego przekazu pędu Q_m oraz szybkiej detekcji przy wysokich szybkościach zliczania w zakresie MHz. W trakcie tego procesu instrument został wyposażony w dodatkowe funkcje.

Zastosowano siekacz dwutarczowy⁵ ze zmienną szerokością szczelin (Supplementary Figure 2) oraz trybem akwizycji danych w czasie przelotu (TOF). Siekacz może pracować z częstotliwością f_chopper w zakresie od 10 Hz do 100 Hz oraz z kątowym otworem dwóch okien siekacza w przedziale 0° ≤ Δφ ≤ 90°, co uzyskuje się poprzez zmianę wzajemnego położenia obu tarcz. Poprawę rozdzielczości długości fali Δλ/λ osiąga się poprzez skrócenie czasu otwarcia prowadnicy neutronów τ_w, co uzyskuje się poprzez zmniejszenie Δφ i/lub zwiększenie f_chopper. Powstałe impulsy rejestrowane przez detektor są dzielone na odpowiednią liczbę kanałów czasowych, których szerokość odpowiada τ_w i które charakteryzują się dążoną wartością Δλ/λ.

Znajdują się tam również elementy ogniskujące w postaci soczewek parabolicznych z fluorku magnezu MgF₂⁶ o średnicy 50 mm (Rysunek 1). 26 soczewek MgF₂ pogrupowano w trzy pakiety (4+6+16 soczewek), które mogą być niezależnie przemieszczane w wiązce w celu uzyskania warunków ogniskowania dla różnych długości fal λ= 7-20 Å. Aby zwiększyć transmisję poprzez redukcję rozpraszania na fononach w materiale soczewek, są one utrzymywane w temperaturze 70 K przy użyciu specjalnego systemu chłodzenia.

Znajduje się tam wtórny detektor scyntylacyjny czuły na pozycję o wysokiej rozdzielczości z rozdzielczością pozycyjną 1 mm i rozmiarem piksela 0,45 mm. Detektor jest zazwyczaj umieszczony w wieży na górze zbiornika próżniowego w stałej odległości L_D = 17 m i może być przesuwany pionowo do wiązki lub poza nią (Rysunek 1). Główny detektor znajduje się w pozycji końcowej zbiornika przy 20 m, natomiast detektor wtórny jest przesuwany do wiązki podczas przeprowadzania badań o wysokiej rozdzielczości (niskie Q) z użyciem soczewek^4,7. Detektor wtórny jest umieszczony w jednej ogniskowej układu soczewek, podczas gdy mała apertura wlotowa przy L_C = 20 m znajdowałaby się w tym przypadku w drugiej ogniskowej.

Zastosowano nowy główny system detekcji, który składa się z matrycy 144 lamp ³He (o globalnej wydajności na lampę wynoszącej 85% dla λ = 5 Å) i wyznacza aktywny obszar detekcji równoważny 0,9 m² (Rycina 1). Innowacyjna elektronika szybkiego odczytu, zamontowana w zamkniętej obudowie z tyłu ramy lamp ³He, poprawia charakterystykę odczytu i redukuje szum tła. Nowy system, który zastąpił stary detektor scyntylacyjny (scyntylator ⁶Li i matryca 8x8 fotopowielaczy, Rycina 1), charakteryzuje się efektywną stałą czasu martwego wynoszącą 25 nsec oraz całkowitym tempem zliczeń sięgającym 5 MHz przy 10% czasie martwym dla profili płaskich. Cechy te wynikają z faktu, że system zawiera niezależne kanały pracujące równolegle, co stanowi przewagę nad systemami, w których czas martwy występuje po każdym zdarzeniu. Znacznie wyższe tempo zliczeń skraca czas pomiaru, a tym samym zwiększa liczbę eksperymentów, które można przeprowadzić w tym samym przedziale czasowym.

Dzięki wszystkim tym innowacjom instrument stał się niezwykle wszechstronnym narzędziem, które pozwala na przeprowadzenie szerokiego zakresu badań strukturalnych, oferując wiele trybów pracy (Tabela 2), które można wybierać i wykorzystywać w sposób bezpośredni i intuicyjny. W trybie wysokiej intensywności (Rysunek 2B), dzięki zastosowaniu soczewek i zwiększeniu rozmiaru próbki, można osiągnąć do dwunastokrotny wzrost intensywności w porównaniu z konwencjonalnym trybem otworkowym przy zachowaniu tej samej rozdzielczości. W trybie rozdzielczości regulowanej z użyciem choppera i akwizycji danych TOF, możliwość zmiany rozdzielczości długości fali Δλ/λ w zakresie od 2% do 20%⁵ umożliwia lepszą charakterystykę cech rozproszeniowych w różnych zakresach Q. W trybie rozszerzonego zakresu Q (Rysunek 2C), przy użyciu soczewek i wtórnego detektora o wysokiej rozdzielczości, można osiągnąć wartość Q_m tak niską jak 1 x 10^-4 Å^-1, co w połączeniu z trybem otworkowym pozwala na badanie rozmiarów w ciągłej skali długości od zakresu nm do mikronów. Zastosowanie choppera w celu zawężenia Δλ/λ zapewnia precyzyjne charakterystyki wiązki, eliminując efekty grawitacyjne i chromatyczne podczas korzystania z soczewek. W trybie czasu rzeczywistego, dzięki wysokiej intensywności oraz zewnętrznemu wyzwalaniu akwizycji danych przez środowisko próbki, można rozdzielić zmiany strukturalne z rozdzielczością czasową do 50 msec. Poprzez poprawę rozdzielczości długości fali do Δλ/λ= 5% za pomocą choppera, można osiągnąć rozdzielczość czasową rzędu 2 msec.

W niniejszym opracowaniu szczegółowo przedstawiamy protokół przeprowadzania typowych eksperymentów na urządzeniu KWS-2 w jego różnych trybach pracy oraz sposób uzyskiwania informacji strukturalnych z badanych próbek na podstawie zebranych danych za pomocą redukcji danych. W tej demonstracji wykorzystamy SANS do charakterystyki roztworów standardowych cząstek o kilku różnych rozmiarach oraz jednego wysokostężonego roztworu miceli polimerowych, aby wykazać, w jaki sposób rozmiar i uporządkowanie mogą być badane w szerokich zakresach w sposób elastyczny i wydajny za pomocą KWS-2 podczas jednej sesji eksperymentalnej. Sferyczne cząstki polistyrenu o różnych rozmiarach (promienie R = 150, 350, 500, 1 000 i 4 000 Å) i polidyspersyjności rozmiaru σ_R 8% są rozproszone w roztworze wodnym (mieszanina 90% D₂O i 10% H₂O) przy ułamku objętościowym 1%. Micele utworzone przez diblokowe kopolimery C₂₈H₅₇-PEO5 w D₂O przy stężeniu 12% wykazują strukturę uporządkowaną.

Protokół

1. Załadowanie komórek próbkowych

1. Rozproszyć sferyczne cząsteczki polistyrenu o różnych rozmiarach (promienie R = 150, 350, 500, 1 000 i 4 000 Å) i polidyspersyjności rozmiaru σ_R 8% w roztworze wodnym (mieszanina 90% D₂O i 10% H₂O) przy ułamku objętościowym 1%.
2. Przenieść sześć roztworów cząsteczek polistyrenu w D₂O/H₂O, roztwór C₂₈H₅₇-PEO5 w D₂O oraz rozpuszczalniki D₂O/H₂O i D₂O do kuwet kwarcowych (Rysunek 3) za pomocą pipet Pasteura. Napełnić każdą z kuwet kwarcowych aż do szyjki. Zamknąć kuwety kwarcowe korkami.
   UWAGA: Operacja napełniania kuwet kwarcowych próbkami musi być przeprowadzona w laboratorium przygotowania próbek FRM II, z zachowaniem określonych tam specjalnych warunków pracy.
3. Zainstalować napełnione kuwety kwarcowe w aluminiowych kasetach uchwytu na próbki (Rysunki 3). Umieścić każdą napełnioną kuwetę kwarcową w gnieździe kasety i sprawdzić, czy kuweta jest wystarczająco wypełniona próbką, określając, czy próbka całkowicie pokrywa otwór okna w kasecie przeznaczony dla neutronów. Umieścić próbki korekcyjne i standardowe (pustą kuwetę kwarcową, płytkę z węglika boru oraz płytkę z pleksiglasu) w dodatkowych miejscach w kasecie i pozostawić jedno miejsce wolne do pomiaru wiązki pustej.
4. Przykryć kasetę aluminiowymi płytkami osłonowymi powlekanymi Cd (Rysunek 3) za pomocą śrub imbusowych (M3x5). Przymocować kasetę do aluminiowej ramy uchwytu na próbki, używając specjalnych śrub aluminiowych (Rysunek 4).

2. Pozycjonowanie uchwytu próbki/otoczenia próbki na stole próbkowym

1. Wyznaczyć niezbędną przestrzeń w miejscu umieszczenia próbki w uchwycie na próbki poprzez regulację długości noska kolimacyjnego (Rycina 5). Wybrać odpowiednią konfigurację uchwytu na próbki z zapisanych konfiguracji w systemie sterowania noskiem kolimacyjnym.
2. Zainstalować odpowiedni uchwyt na próbki/środowisko próbki na stole pomiarowym w wyznaczonej pozycji na płycie optycznej, używając śrub imbusowych M6x40 (Rycina 6).
3. Zamknąć zmotoryzowane przesuwne drzwi ołowiane (Rycina 5), używając pokręteł znajdujących się po ich zewnętrznej stronie; należy trzymać pokrętła sterujące w pozycji aktywnej, aż drzwi osiągną pozycję końcową, co zostanie zasygnalizowane sygnałem świetlnym.
   Uwaga: Dopóki drzwi nie zostaną całkowicie zamknięte, a wyłącznik krańcowy aktywowany, migawka wiązki nie może zostać otwarta – ani ręcznie, ani za pomocą oprogramowania sterującego pomiarem; oprogramowanie pomiarowe będzie wymagać dodatkowej weryfikacji tego stanu przed rozpoczęciem pomiaru.

3. Planowanie eksperymentów

1. Wybierz odpowiednią konfigurację i tryb eksperymentalny do przeprowadzenia badania w zakresie Q dostosowanym do skali długości struktur oraz efektów korelacji ujawnionych przez próbkę. Sprawdź zakres dynamiczny instrumentu⁴ (Rysunek 7 i Tabela 2).
2. Wybierz odpowiednią konfigurację i tryb eksperymentalny w celu zapewnienia właściwej intensywności na próbce, opierając się na szacowanym poziomie intensywności rozproszonej, znając przybliżony rozmiar, stężenie i czynnik kontrastu charakteryzujące badane próbki⁸. Jest to konieczne w celu optymalizacji czasu pomiaru dla założonej statystyki pomiarowej oraz dostosowania do stabilności próbek w przypadku tych o krótkim czasie stabilności. Sprawdź mapę intensywności dla różnych konfiguracji eksperymentalnych⁴ (Rysunek uzupełniający 1 i Tabela 2).
3. Wybierz odpowiednią konfigurację i tryb eksperymentalny w celu zapewnienia właściwej rozdzielczości na podstawie przybliżonej wiedzy o stopniu polidyspersyjności rozmiaru oraz stężeniu obiektów rozpraszających w próbce⁸. Jest to konieczne, aby umożliwić rozdzielenie drobnych cech rozproszenia, które występują w wyniku efektów uporządkowania w próbce. Sprawdź możliwość dostrojenia rozdzielczości długości fali⁵ (Tabela 2).

4. Przygotowanie oprogramowania pomiarowego oraz przeprowadzenie i wizualizacja eksperymentu

1. Uruchom oprogramowanie pomiarowe, wpisując KWS2TC w oknie terminala na komputerze sterującym pomiarami instrumentu KWS-2, aby aktywować menu główne (Rycina uzupełniająca 3). Użyj lewego zestawu funkcji, aby zdefiniować podstawowe pozycje silników (Configuration), wybrać próbki i ustawić warunki (Definition), rozpocząć pomiar i nadzorować wszystkie silniki (Control) oraz monitorować bieżący detektor (Live-Display).
2. Wybierz funkcję Configuration w menu głównym, aby aktywować menu kws2-Configuration (Rycina uzupełniająca 4) w celu zdefiniowania danych użytkownika oraz skonfigurowania podstawowych pozycji silników oraz wartości zadanych dla urządzeń i pól na próbce.
   1. Wybierz funkcję UserData (Rycina uzupełniająca 4) i wypełnij pola User name, E-mail, First part of filename oraz Measurement comment w menu danych użytkownika (widok/edycja). Wyjdź z menu, klikając Save.
      Uwaga: W prefiksie nazwy pliku nie należy używać znaków specjalnych, takich jak @, $, %, itp.. Należy unikać używania znaków specjalnych w całej procedurze eksperymentalnej.
   2. Wybierz funkcję Sample (Rycina uzupełniająca 4), aby aktywować menu konfiguracji próbek (Rycina uzupełniająca 4). Wypełnij pola Sample title, Sample beam window - Size, Sample thickness oraz Comment dla każdej próbki i pozycji wybranych z lewej pionowej listy menu. Zapisz każdą konfigurację próbki po zakończeniu definiowania. Wyjdź z menu, klikając Close.
   3. Zapisz wszystkie konfiguracje za pomocą funkcji File w górnym zestawie funkcji w menu Configuration.
3. Wybierz funkcję Definition w menu głównym (Rycina uzupełniająca 3), aby aktywować menu kws2 Definition (Rycina uzupełniająca 5) w celu zdefiniowania układu eksperymentalnego i programu pomiarowego.
   1. Wybierz funkcję Sample, aby aktywować menu Select Samples (Rycina uzupełniająca 5).
      1. Wybierz z listy znanych próbek w lewym pionowym polu dwanaście próbek do pomiaru (jak pokazano na Rycini 3) i przenieś je do pola Selected Samples za pomocą niebieskiej strzałki. Uporządkuj listę wybranych próbek, używając niebieskich strzałek pionowych.
      2. Sprawdź parametry próbek i w razie potrzeby skoryguj nazwę, grubość oraz komentarz. Wyjdź z menu, klikając Save lub Close.
   2. Wybierz funkcję Detector, aby aktywować menu Definition of Measurements (Rycina uzupełniająca 6).
      1. Wybierz statyczny typ pomiaru, zaznaczając Standard w obszarze Measurement. W obszarze End Conditions wybierz odpowiednią jednostkę czasu dla pola czasu pomiaru.
      2. W obszarze Select Detector and Collimation Distances wybierz układ eksperymentalny i tryb pracy, wybierając odpowiednie wartości dla długości fali (pole Selector), odległości detekcji (pole Detector Distance), trybu akwizycji danych (pole TOF), zamierzonej rozdzielczości długości fali (pole DLambda/Lambda), czasu pomiaru (pole Time), konfiguracji soczewek (pole Lenses) oraz odległości kolimacji (pole Collimation Distance).
      3. Po pełnym zdefiniowaniu jednej konfiguracji kliknij przycisk New, aby ją zatwierdzić i zapisać w dolnej tabeli. Definiuj kolejne konfiguracje i zapisuj je w ten sam sposób, aż zostanie ukończony cały zestaw konfiguracji (Rycina uzupełniająca 6). Kliknij Save lub Close w menu Definition of Measurements po zakończeniu ustawiania układu eksperymentalnego i trybów pracy.
      4. Posortuj listę pomiarów zgodnie z trzema pętlami (warunkami sortowania) generowanymi przez program, widocznymi na dole menu (Rycina uzupełniająca 7). Usuń niepożądane pomiary, zaznaczając odpowiednią linię i klikając przycisk „X” zaznaczony na czerwono. Dostosuj czas pomiaru dla każdego pomiaru według uznania, sprawdzając całkowity zdefiniowany czas pomiaru w centralnym polu zaznaczonym na czerwono w menu kws2 Definition, które pozostaje stale aktywne na ekranie.
      5. Wyjdź z menu za pomocą Save lub Close i wróć do menu kws2 Definition (Rycina uzupełniająca 5). Zamknij menu kws2 Definition i wróć do menu głównego (Rycina uzupełniająca 3).
4. Wybierz funkcję Control w menu głównym oprogramowania pomiarowego KWS2 (Rycina uzupełniająca 3), aby aktywować menu sterowania pomiarem Measurement control (Rycina uzupełniająca 8).
   1. Zaloguj się za pomocą nazwy użytkownika i hasła przekazanego przez naukowca obsługującego instrument i zablokuj sesję w celu wygenerowania skryptu, który wykona polecenia wgranego programu pomiarowego. Wybierz Loop Definition, aby sprawdzić wgrany program pomiarowy.
   2. Naciśnij przycisk Start i odpowiedz na pytania generowane przez program dotyczące aktualnego stanu drzwi pozycji próbki oraz przesłony wiązki. Program pomiarowy zostanie uruchomiony. Wybierz Current Values, aby włączyć wizualizację trwającego pomiaru (pozycje silników i stan komponentów instrumentu, szybkość zliczeń oraz ewolucja intensywności całkowitej w czasie).
      UWAGA: Wyświetlana jest intensywność całkowita na detektorze oraz szybkości zliczeń detektora i monitorów; mogą one służyć do zmiany programu pomiarowego, pojedynczo lub dla całego zestawu pomiarów.
5. Pozostaw pomiary do przeprowadzenia i zakończenia zgodnie z zdefiniowanym programem pomiarowym.
   UWAGA: Pomiary można przerwać lub zatrzymać, aktywując funkcję Stop i wybierając żądaną opcję (kontynuacja, zatrzymanie bieżącego pomiaru z zapisem lub bez zapisu pliku lub zatrzymanie całego programu), gdy intensywność całkowita zebrana do pewnego punktu czasowego zostanie uznana za wystarczającą lub gdy w sekwencji pomiarowej zostaną zidentyfikowane błędy.
   1. Wygeneruj dziennik (Logbook) sesji pomiarowej, klikając przycisk Print w opcji Loop Definitions (Rycina uzupełniająca 8) po zatrzymaniu lub zakończeniu zdefiniowanego programu pomiarowego.
6. Wybierz Live-Display w menu głównym oprogramowania pomiarowego KWS2 (Rycina uzupełniająca 3), aby aktywować interfejs KWSlive_MainWindow (Rycina uzupełniająca 9).
   1. Na ekranie Type wybierz GEDET lub PSD, aby zwizualizować dane zebrane odpowiednio głównym lub pomocniczym (wysokorozdzielczym) detektorem. Wybierz tryb wizualizacji w Display Mode, wybierając tryb trójwymiarowy (Surface), dwuwymiarowy (Contour) lub jednowymiarowy (Radial average). Wprowadź opcje wykresu (skala liniowa lub logarytmiczna) oraz wartości parametrów (długość fali i odległość detekcji L_D) w polach menu opcji Radial average, aby umożliwić prezentację danych jako intensywność n (niepoprawiona) względem Q.
   2. Wybierz żądany kanał TOF, aby zwizualizować dane zebrane w trybie TOF (za pomocą detektora głównego lub pomocniczego).

5. Analiza danych

1. Uruchom oprogramowanie do przetwarzania danych, wpisując polecenie qtiKWS w oknie terminala komputera do analizy danych instrumentu KWS-2. Wybierz opcję New Script po prawej stronie głównego interfejsu.
2. Wybierz opcję DAN w górnym menu funkcji głównego interfejsu (Rycina uzupełniająca 10), aby aktywować funkcje analizy danych. Z menu Options po prawej stronie wybierz instrument KWS-2, aby aktywować tryb analizy danych dla pomiarów wykonanych na KWS-2 przy użyciu głównego detektora. Zdefiniuj folder, w którym znajdują się zmierzone pliki danych oraz w którym będą przechowywane poprawione pliki danych.
3. Wybierz opcję Tools i aktywuj funkcję Header(s) w menu po prawej stronie (Rycina uzupełniająca 11), a następnie wygeneruj tabelę informacyjną zawierającą pliki do przetworzenia. Zdefiniuj nazwę tabeli, klikając lewy zestaw zielonych strzałek w polu Header(s). Wczytaj zmierzone pliki, klikając prawy zestaw zielonych strzałek w polu Header(s) i wybierając odpowiednie pliki pomiarowe.
   UWAGA: Tabela informacyjna zawierająca pełne informacje o każdym pliku pomiarowym jest przechowywana w menu przypominającym eksplorator w dolnej części projektu. Będą tam przechowywane wszystkie wyniki wygenerowane później w projekcie.
4. Aktywuj funkcję Mask w menu po prawej stronie (Rycina uzupełniająca 12) i wygeneruj aktywną maskę definiującą obszar detektora, który zostanie uwzględniony w przetwarzaniu danych. W przypadku analizy izotropowych obrazów rozproszenia wprowadź wartości w polach Edge i Beam-Stop, aby zdefiniować dolny lewy i górny prawy róg prostokątnej maski.
5. Aktywuj funkcję Sensitivity w menu po prawej stronie (Rycina uzupełniająca 13) i wygeneruj czułość detektora dla określonej konfiguracji, wpisując w zaznaczonych zielonych polach numery pomiarów (run numbers) dla próbki wzorcowej (pleksiglas), pustego wiązki (EB) oraz zablokowanej wiązki (B4C).
   1. Kliknij zestaw zielonych strzałek obok żółtego pola (Transmission), aby obliczyć transmitancję próbki wzorcowej. Wygeneruj i nazwij macierz czułości, wybierając Calculate as New, a następnie zwizualizuj wygenerowaną macierz, korzystając z odpowiednich funkcji wykresów w dolnym menu. Powtórz tę procedurę w przypadku innych konfiguracji.
6. Aktywuj funkcję Data Processing w menu po prawej stronie (Rycina uzupełniająca 14) i wygeneruj tabelę korekcji i kalibracji oraz tabelę skryptów, aby przeprowadzić korekcję, kalibrację i uśrednianie radialne danych.
   1. Zdefiniuj liczbę warunków użytych w eksperymencie za pomocą poziomego suwaka na górze menu prawego (czerwona strzałka). Wypełnij pola oznaczone żółtą ołówkiem, wpisując dla każdego warunku eksperymentalnego numery pomiarów dla pustej komórki (EC), zablokowanej wiązki (B4C) oraz próbek wzorcowych: pleksiglasu (Abs. Cal. FS), pustej wiązki do korekcji standardowej (Abs. Cal. EB) i zablokowanej wiązki do korekcji standardowej (Abs. Cal. B4C).
   2. W polu Center wprowadź numery pomiarów z silnym rozproszeniem w kierunku przednim. W polu EB wprowadź numer pomiaru pustej wiązki i zaznacz odpowiedni warunek eksperymentalny do obliczenia transmitancji próbek, zaznaczając pole obok funkcji Tr (Ec-to-EB).
   3. Kliknij każdy przycisk wskazany zestawem obracających się zielonych strzałek w pionowej serii opcji (Rycina uzupełniająca 14), aby wczytać informacje niezbędne do przetwarzania danych z zdefiniowanych plików i obliczyć transmitancję pustej komórki. Kliknij nagłówek każdej żółtej kolumny, aby zdefiniować jej nazwę.
   4. Kliknij przycisk New, aby wygenerować i nazwać tabelę plików danych, które zostaną przetworzone. Kliknij przycisk Add, aby wczytać pliki danych do przetworzenia. Kliknij przycisk Tr wskazany zestawem obracających się zielonych strzałek w obszarze Script-Table Tools, aby obliczyć transmitancję każdej próbki. Sprawdź wyniki w wygenerowanej tabeli (Rycina uzupełniająca 14).
   5. Wybierz Project w prawym dolnym rogu interfejsu (Rycina uzupełniająca 14), aby zapisać wszystkie wyniki jako tabele lub macierze w bieżącej sesji qtiKWS (projekcie). Kliknij przycisk I[x,y], aby przeprowadzić korekcję i kalibrację danych dwuwymiarowych. Kliknij przycisk I(Q), aby przeprowadzić korekcję, kalibrację i uśrednianie radialne danych. Wykreśl wyniki za pomocą funkcji graficznych w opcji Graph (Rycina uzupełniająca 15).
      UWAGA: Wszystkie wyniki zostaną wygenerowane jako pliki zewnętrzne i zapisane w zewnętrznym folderze zdefiniowanym w kroku 5.2, jeżeli w prawym dolnym rogu interfejsu zamiast Project zostanie wybrana opcja File.
7. Wybierz Tools w menu po prawej stronie (Rycina uzupełniająca 11) i aktywuj opcję TOF|RT (Rycina uzupełniająca 16), aby rozdzielić dane zebrane głównym detektorem w trybie pracy TOF na pojedyncze pliki odpowiadające każdemu kanałowi czasowemu.
   1. Kliknij funkcję TOF :: Calculate Parameters i wczytaj jeden plik, z którego zostaną wyodrębnione informacje o warunkach TOF. Kliknij funkcję TOF|RT :: Sum vs Number :: Read i wczytaj interesujący plik, zmierzony w trybie czasu rzeczywistego lub TOF, aby wygenerować tabelę sum-tof-file, taką jak ta pokazana po lewej stronie interfejsu roboczego. Wykreśl całkowitą intensywność jako funkcję kanałów czasowych (Rycina uzupełniająca 16) z pliku sum-tof-file, korzystając z opcji graficznych w funkcji Graph w górnym menu funkcji.
   2. Zdefiniuj parametry przetwarzania w polach funkcji TOF. Kliknij przycisk TOF|RT :: All Selected Steps :: Proceed, aby wczytać pliki danych, które zostaną rozdzielone na pojedyncze pliki odpowiadające każdemu z zdefiniowanych przedziałów czasowych.
      UWAGA: Pliki zawierające dane zmierzone w każdym przedziale czasowym są generowane i przechowywane w lokalizacji plików zdefiniowanej w kroku 5.2 i otrzymują nazwę oryginalnego pliku TOF, po której następuje numer przedziału czasowego.
   3. Postępuj zgodnie z krokiem 5.6, aby przeanalizować dane zmierzone z poprawioną rozdzielczością, odpowiadającą Δλ\λ_aimed, przy użyciu choppera.
8. Wybierz instrument KWS2-HRD z opcji Options w menu po prawej stronie głównego interfejsu (Rycina uzupełniająca 17), aby aktywować tryb analizy danych dla pomiarów wykonanych na KWS-2 przy użyciu pomocniczego detektora wysokiej rozdzielczości. Aktywuj funkcję Mask w menu po prawej stronie (Rycina uzupełniająca 18A) i wygeneruj aktywną maskę definiującą aktywny obszar detektora.
   1. Wybierz opcję DANP w górnym menu funkcji głównego interfejsu (Rycina uzupełniająca 18B). W menu po prawej stronie wybierz opcję ASCII.2D. Aktywuj funkcję 2D Masking, aby zdefiniować specjalny sektor na detektorze, który zostanie uwzględniony w analizie danych.
   2. Wprowadź centrum blokady wiązki w polu Center. Wybierz macierz maski i wartość 0 w Mask :: Conditions, aby zignorować obszar poza specjalną maską. Wybierz sektor kątowy i kliknij kolorowy przycisk po prawej stronie pól sektorów. Postępuj z danymi zmierzonymi detektorem wysokiej rozdzielczości analogicznie do kroków 5.5 i 5.6.
9. Zapisz projekt qtiKWS (funkcje zapisu w opcji File w górnym menu).

Wyniki

Reprezentatywne wyniki pomyślnego eksperymentu przeprowadzonego za pomocą KWS-2 w różnych trybach pracy w odniesieniu do struktury i morfologii dwóch reprezentatywnych typów układów materii miękkiej przedstawiono na rysunkach 8-11. Wyniki te pochodzą z badania serii cząstek polistyrenu o standardowych rozmiarach w roztworach D₂O/H₂O o zawartości D₂O wynoszącej 90% oraz w pełni protonowanego kopolimeru diblokowego C₂₈H₅₇-PEO5 w D₂O przy wysokiej frakcji objętości polimeru (12%). Do przetestowania konwencjonalnego trybu pinhole przy różnych kombinacjach odległości detekcji L_D i długości fal λ wykorzystano cząstki polistyrenu o standardowych rozmiarach i promieniach R = 150, 350, 500 oraz 1,000 Å. Cząstki o większym rozmiarze (R = 4,000 Å) posłużyły do przetestowania i uruchomienia trybu rozszerzonego zakresu Q. Kopolimer diblokowy, który przy wysokich stężeniach D₂O tworzy uporządkowaną strukturę micelarną, został wykorzystany do przetestowania i uruchomienia trybu regulowanej rozdzielczości.

Rysunek 8 przedstawia wyniki dwuwymiarowych wzorów rozpraszania zmierzonych w trybie pinhole przy użyciu głównego detektora (starego detektora scyntylacyjnego) oraz w trybie rozszerzonego zakresu Q przy użyciu soczewek skupiających i drugorzędnego detektora o wysokiej rozdzielczości. Rysunek 8A przedstawia wzór rozpraszania dla cząsteczek polistyrenu o R = 500 Å zmierzony przy L_D = 8 m dla λ=5 Å. Rysunek 8B pokazuje wzór rozpraszania dla cząsteczek polistyrenu o R = 1,000 Å, zebrany przy L_D = 20 m dla λ= 20 Å. Dla pomiarów wykonanych przy  λ = 5 Å wiązka bezpośrednia była zbierana na centralnym ograniczniku wiązki (beam-stop) zainstalowanym przed detektorem, a wiązka transmitowana mogła być monitorowana za pomocą małego licznika ³He zainstalowanego w środku ogranicznika wiązki. Jest to tzw. Monitor 3 (Rysunek uzupełniający 8). Instrument posiada dwa dodatkowe liczniki ³He, które są zainstalowane przed selektorem prędkości (Monitor 1) w celu monitorowania wiązki polichromatycznej oraz za selektorem prędkości (Monitor 2) w celu monitorowania wiązki monochromatycznej. Ze względu na ograniczenia techniczne, pomiary przy  λ = 20 Å były wykonywane z wiązką bezpośrednią padającą na detektor, co było typową konfiguracją stosowaną ze starym detektorem KWS-2. Słabsze natężenie wiązki bezpośredniej przy długich długościach fal, które spada z powodu grawitacji, mogło zostać wykryte bez uszkodzenia detektora. Wiązka transmitowana w tym przypadku była monitorowana za pomocą Monitora 3 przy krótkiej odległości detekcji L_D = 2 m. W tym przypadku efekty grawitacyjne są słabe, a wiązka bezpośrednia pada na ogranicznik wiązki (podobnie jak na Rysunku 8A). Dane zebrane dwuwymiarowo na detektorze dla rozmiaru piksela 5,25 mm x 5,25 mm zostały następnie skorygowane o czułość detektora, a wkłady z pustej celi, tła instrumentu i rozpuszczalnika zostały absolutnie skalibrowane przy użyciu rozpraszania z drugorzędnego wzorca z Pleksiglasu⁴. Na koniec wzory rozpraszania, które były rozłożone izotropowo wokół pozycji Q→0, zostały uśrednione radialnie, co pozwoliło uzyskać dΣ/dΩ dla każdego systemu cząsteczek polistyrenu.

Dwuwymiarowy obraz rozproszenia dla dużych cząstek polistyrenowych (R = 4,000 Å) przedstawiono na Rysunku 8C, zmierzony za pomocą detektora o wysokiej rozdzielczości przy rozmiarze piksela 0,5 mm x 0,5 mm. Mała wiązka bezpośrednia jest ogniskowana przez układ soczewek na płaszczyźnie detekcji i przechwytywana przez małą przesłonę wiązki (beam-stop, 4 mm x 4 mm) zainstalowaną na powierzchni detektora. Cień kwadratowej przesłony można zaobserwować na Rysunku 8C w lewym górnym rogu aktywnego obszaru detektora. Efekty grawitacyjne powodują szeroki pionowy rozkład neutronów o różnych długościach fal na detektorze. Dodatkowo, ponieważ soczewki są idealnie ogniskowane, selektor prędkości^2,5 dostarcza jedynie neutrony charakteryzujące się centralną długością fali λ rozkładu trójkątnego; neutrony o innych długościach fal wokół wartości centralnej docierają do detektora z lekkim rozogniskowaniem. Te dwa efekty powodują powstanie słabych śladów wiązki bezpośredniej, które można zaobserwować tuż powyżej i poniżej przesłony wiązki. W statycznym trybie rozszerzonego zakresu Q z użyciem soczewek i detektora o wysokiej rozdzielczości dane są zbierane w sposób ciągły. Aby zmniejszyć wpływ efektów grawitacyjnych, dane z rozproszenia są analizowane w wąskim sektorze kątowym, który zaczyna się od przesłony wiązki i rozciąga się poziomo w prawo, jak pokazano na Rysunku 8C. Dane są następnie przetwarzane przy użyciu typowego podejścia w celu wyznaczenia dΣ/dΩ. Rysunek 8D przedstawia intensywność w funkcji odległości od przesłony wiązki w kierunku krawędzi detektora, zebraną w wąskim poziomym wycinku o szerokości 1 piksela (0,5 mm) na detektorze o wysokiej rozdzielczości. Dane z roztworu próbki oraz referencji (rozpuszczalnika) przedstawiono w formie zebranej podczas krótkiego pomiaru testowego trwającego 5 min. Spadek intensywności przy krótkich odległościach wynika z obecności przesłony wiązki. Z stosunku intensywności przy najkrótszych odległościach można było oszacować transmitancję próbki (87%).

Skorygowane i skalibrowane wyniki uzyskane w postaci dΣ/dΩ dla roztworu cząsteczek polistyrenu o R = 500 Å przedstawiono na Rysunku 9, wraz z wynikami dla rozpuszczalnika. Wyniki te ilustrują zakres Q, który można pokryć za pomocą KWS-2 w konwencjonalnym trybie pinhole poprzez zmianę pozycji detekcji L_D oraz zastosowanie jednej lub więcej długości fal. Ujawniono również cechy czynnika kształtu^8,9 cząsteczek sferycznych: obszar Guiniera przy niskich wartościach Q oraz oscylacje wynikające z funkcji Bessela dla sfery w średnim zakresie Q. W wysokim zakresie Q profil rozpraszania jest zdominowany przez rozpraszanie z rozpuszczalnika, w związku z czym wykazuje on płaski przebieg, analogiczny do rozpuszczalnika. Minima czynnika kształtu są z jednej strony wpływane przez rozdzielczość przyrządu⁵, a z drugiej przez polidyspersyjność rozmiaru cząsteczek. Rozdzielczość przyrządu w przypadku KWS-2 jest w głównej mierze określona przez rozrzut długości fal Δλ/λ= 20%. Polidyspersyjność rozmiaru dla wszystkich typów cząsteczek wynosiła około σ_R = 8%. Rysunek 10 przedstawia wyniki uzyskane w badaniu SANS dla wszystkich typów cząsteczek polistyrenu, wyrażone jako dΣ/dΩ po zastosowaniu korekty o wkład rozpuszczalnika. Obszary Guiniera są wyraźnie widoczne dla wszystkich cząsteczek przy niskich wartościach Q , podczas gdy w wysokich zakresach Q ujawnia się nachylenie -4, co jest typowe dla czynnika kształtu obiektów sferycznych. Parametry strukturalne cząsteczek o standardowym rozmiarze zostały potwierdzone poprzez dopasowanie danych do czynnika kształtu sfer polidyspersyjnych^8,9 splotego z funkcją rozdzielczości przyrządu^10-12.

Rysunek 11 przedstawia dwuwymiarowe oraz radialnie uśrednione jednowymiarowe wzory rozpraszania z uporządkowanej struktury miceli polimerowych C₂₈H₅₇-PEO5 występującej w D₂O przy ułamkowej objętości polimeru wynoszącej 12%. Wyniki zebrano dla różnych odległości detekcji L_D, łącząc w jednej sesji pomiarowej konwencjonalny tryb pinhole oraz tryb rozdzielczości regulowanej. Podczas badania układu w konwencjonalnym trybie pinhole przy rozrzucie długości fali Δλ/λ= 20% (zapewnionym przez selektor prędkości) i ciągłym (statycznym) gromadzeniu danych, we wzorach rozpraszania przy L_D = 4 m obserwuje się trzy szerokie piki. W trybie rozdzielczości regulowanej, dzięki zastosowaniu choppera i gromadzeniu danych TOF w połączeniu z selektorem prędkości, możliwe jest poprawienie rozrzutu długości fali, co pozwala sprawdzić, czy cechy te są rzeczywiste, czy też w końcu pojawi się ich struktura subtelna. Pierwszy i drugi piki obserwowane przy Δλ/λ= 20% wykazują rozszczepienie podczas pomiaru przy Δλ/λ= 5%, co umożliwiło jednoznaczną identyfikację uporządkowania miceli w kryształy regularne ściennie centrowane (fcc)^5,13.

Są to dwa typowe przykłady pokazujące, w jaki sposób wszechstronność i wydajność dyfraktometru SANS KWS-2 mogą być wykorzystane w prosty i intuicyjny sposób poprzez zastosowanie dostarczonego protokołu do prowadzenia szczegółowych badań nad materią miękką i układami biofizycznymi, które wykazują złożone cechy strukturalne pod względem skali długości i uporządkowania.

Rycina 1: Układ instrumentu KWS-2 SANS, uwzględniający wszystkie modernizacje przeprowadzone między 2010 a 2015 rokiem. (A) Widok ogólny instrumentu. (B) Wtórny detektor o wysokiej rozdzielczości oraz jego wieża na górnej części zbiornika próżniowego. (C) Soczewki skupiające z MgF₂, zgrupowane w trzy pakiety, oraz ich system chłodzenia (głowica chłodząca). (D) Stary detektor główny (scyntylacyjny) z matrycą fotopowielaczy 8 x 8. (E) Nowy detektor główny (lampy ³He) o większej powierzchni detekcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 2: Schematyczny widok trzech trybów pracy oferowanych w KWS-2. (A) Konwencjonalny tryb otworkowy (pinhole). Dla L_C = L_D, gdzie L_C i L_D to odpowiednio długość kolimacji i detekcji, oraz optymalnego warunku otworka A_C =2A_S, gdzie A_C i A_S to odpowiednio apertura wejściowa kolimatora i apertura próbki, profil wiązki I'_P w detektorze ma kształt w przybliżeniu trójkątny o szerokości podstawy równej 2A_C. (B) Tryb ogniskowania o wysokiej intensywności. Dzięki zastosowaniu soczewek można mierzyć większe próbki z taką samą rozdzielczością jak w konwencjonalnym trybie otworkowym (w tym przypadku profil wiązki I'_P w detektorze jest prostokątny). (C) Tryb ogniskowania z rozszerzonym zakresem Q. Dzięki zastosowaniu soczewek i małej apertury wejściowej A_C (zazwyczaj 4 mm x 4 mm) umieszczonej w jednej z ognisk układu soczewek, na detektor, umieszczony w drugim ognisku soczewek, przekazywana jest wąska wiązka. Dzięki temu można osiągnąć niższą wartość minimalnego przeniesienia wektora falowego Q_m niż w konwencjonalnym trybie otworkowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 3: Widok próbek zamontowanych w aluminiowym wkładzie uchwytu próbek do pomiarów w temperaturze otoczenia. W przygotowanych w aluminiowym wkładzie wgłębieniach (A) można umieścić kuwetki kwarcowe (B) wypełnione próbkami i zamknięte korkami (C). Pozycje w aluminiowym wkładzie zostały zajęte przez próbki w następujący sposób: w pozycjach od nr 1 do nr 5 znajdowały się cząstki polistyrenu o rozmiarach R = 150, 350, 500, 1 000 i 4 000 Å w rozpuszczalniku D₂O/H₂O; w pozycji nr 6 kopolimer diblokowy C₂₈H₅₇-PEO5 w D₂O; w pozycjach nr 7 i nr 8 rozpuszczalniki D₂O/H₂O oraz D₂O; w pozycji nr 9 pusta kuwetka kwarcowa (referencja); w pozycji nr 10 Plexiglas (standard); w pozycji nr 11 nic (do pomiaru pustej wiązki); w pozycji nr 12 płytkę B₄C (przyklejoną taśmą od tyłu; do pomiaru tła instrumentu przy zablokowanej wiązce). Aluminiowa płyta przykrywająca (D), pokryta maską z Cd na zewnętrznej powierzchni, jest przymocowana do górnej części wkładu za pomocą śrub (E) w celu zabezpieczenia kuwet z próbkami i zdefiniowania okna neutronowego (F). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4: Widok jednego z wielopoziomowych i wielopozycyjnych uchwytów na próbki stosowanych w KWS-2 do pomiarów w warunkach otoczenia. Próbki dla bieżącej sesji eksperymentalnej zostały zainstalowane na poziomie środkowym. Trzy poziomy mogą zostać wyposażone w wkłady (A) zaprojektowane dla różnych geometrii komórek, które są zamykane pokrywami z Al powleczonymi maskami z Cd od strony zewnętrznej (skierowanej w stronę neutronów). Instalacja wkładów w uchwycie odbywa się za pomocą śrub (B). Uchwyt posiada podstawę wsporczą (C), która umożliwia jego instalację w określonej pozycji na stole próbek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 5: Schematyczna rzut z góry obszaru próbkowania KWS-2. (A) Przedstawienie dwóch skrajnych konfiguracji noska kolimacyjnego, pokazujące dostępną przestrzeń do instalacji różnych środowisk próbek w wiązce (neutrony nadlatują od dołu, co wskazują żółte strzałki). (B) Panel sterowania ołowianymi drzwiami z klawiszami otwierania i zamykania (odpowiednio 1 i 2). Silnik drzwi pracuje tylko tak długo, jak klawisze są stale wciśnięte. Krawędzie drzwi wyposażone są w czujniki, które powodują wyłączenie silnika po wykryciu przeszkody. Po usunięciu przeszkody blokadę silnika można zwolnić górnym klawiszem (3), a następnie wznowić operację otwierania lub zamykania. (C) Panel sterowania noskiem kolimacyjnym. Z panelu noska można wybrać odpowiednią konfigurację za pomocą klawisza (4). Nosek jest przemieszczany poprzez stałe aktywowanie klawisza (5) aż do osiągnięcia wybranego położenia, po czym ruch zatrzymuje się automatycznie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 6: Instalacja wielopoziomowego i wielopozycyjnego uchwytu próbek na stole próbkowym do pomiarów SANS w temperaturze otoczenia (Źródło zdjęcia: Wenzel Schürmann, Technische Universität München, Niemcy). Głównymi elementami w pozycji próbki są: nos kolimatora z aperturą próbki na jego końcu (A), stół próbkowy umożliwiający poziome i pionowe pozycjonowanie próbek w wiązce (B), okno wlotowe zbiornika próżniowego detektora (C), ołowiane drzwi z czujnikami na krawędzi (D) oraz podstawa uchwytu celi (E), która umożliwia montaż uchwytu na płycie optycznej (F) stołu próbkowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 7: Zakres dynamiczny dla różnych konfiguracji aparatury na KWS-2. I₀ oznacza strumień neutronów w pozycji próbki. Wyznaczone obszary wskazują dostępny zakres Q, który można pokryć przy zmianie długości fali w przedziale od 4.5 Å do 20 Å dla konkretnych konfiguracji kolimacji i detekcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 8: Przykłady dwuwymiarowych obrazów rozproszenia zarejestrowanych podczas sesji eksperymentalnej zgodnie z niniejszym protokołem. (A) Obraz rozproszenia zarejestrowany przy L_D = 8 m dla cząsteczek polistyrenu o promieniu R = 500 Å w D₂O/H₂O, pomiar wykonany przy λ= 5 Å. Obraz rozproszenia jest rozłożony izotropowo wokół beam-stopu, który blokuje wiązkę bezpośrednią w centrum detektora. (B) Obraz rozproszenia zarejestrowany przy L_D = 20 m dla cząsteczek polistyrenu o promieniu R = 1 000 Å w D₂O/H₂O, pomiar wykonany przy λ= 20 Å. Obraz rozproszenia jest rozłożony izotropowo wokół pozycji wiązki przechodzącej, która dla tej długości fali znajduje się pod beam-stopem i jest maskowana wraz z nim za pomocą funkcji oprogramowania do wizualizacji. (C) Obraz rozproszenia zarejestrowany detektorem wysokiej rozdzielczości przy L_D = 17 m dla cząsteczek polistyrenu o rozmiarze R = 4 000 Å w D₂O/H₂O, pomiar wykonany przy λ= 7 Å w rozszerzonym zakresie Q, z wykorzystaniem soczewek i detektora wysokiej rozdzielczości. Obraz rozproszenia jest rozłożony izotropowo wokół małego beam-stopu (4 mm x 4 mm), który blokuje skupioną wiązkę bezpośrednią. Sektor kątowy, w którym dane są dalej analizowane, jest zaznaczony po prawej stronie beam-stopu. (D) Intensywność w funkcji odległości od beam-stopu, zarejestrowana podczas krótkiego pomiaru testowego w wąskim poziomym przekroju o szerokości 1 piksela (0,5 mm) na detektorze wysokiej rozdzielczości. Przedstawiono dane dla roztworu próbki oraz referencji (rozpuszczalnika). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 9: Wzory rozpraszania cząstek polistyrenu w roztworze D₂O/H₂O (symbole) oraz rozpuszczalnika (linie). Dane zostały zebrane w konwencjonalnym trybie pinhole przy różnych konfiguracjach instrumentu, które są oznaczone różnymi kolorami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 10: Wzory rozproszenia dla cząsteczek polistyrenu o różnych rozmiarach w D₂O/H₂O po zastosowaniu korekty na rozproszenie rozpuszczalnika. Linie czerwone reprezentują dopasowania z wykorzystaniem sferycznego czynnika formy⁹, z uwzględnieniem rozdzielczości instrumentu^{10, 11} oraz polidyspersyjności rozmiarów. Typowe asymptotyczne zachowanie Q^-4 dla sferycznego czynnika formy jest zaznaczone linią prostą w wysokim zakresie Q. Dolna granica zakresu Q pokryta różnymi długościami fal lub konfiguracjami jest specjalnie oznaczona. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 11: Dwuwymiarowe i radialnie uśrednione jednowymiarowe wzory rozpraszania dla miceli polimerowych C₂₈H₅₇-PEO5k w D₂O (przy ułamku objętości polimeru 12%), zmierzone w konwencjonalnym trybie pinhole z Δλ/λ= 20% (góra) oraz w trybie rozdzielczości regulowanej, z Δλ/λ= 5% przy L_D = 4m (lewa strona) i L_D = 8m (prawa strona). W trybie konwencjonalnym można zaobserwować trzy szerokie piki. Dzięki poprawie rozdzielczości Δλ/λ ujawniona zostaje struktura subtelna dwóch pierwszych pików^{5, 13}. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 12: Wzorzec rozpraszania dla w pełni protonowanych miceli diblokowego kopolimeru PHO10k-PEO10k w D₂O (po zastosowaniu korekcji o rozpraszanie rozpuszczalnika), pomiar wykonany poprzez połączenie konwencjonalnego trybu pinhole i rozszerzonego zakresu Q. Morfologię cylindryczną typu rdzeń-otoczka wskazuje zależność natężenia rozproszonego światła od Q^-1 przy pośrednich wartościach Q oraz zależność Q^-5/3 (rozpraszanie typu blob) obserwowana przy wysokich wartościach Q. Plateau natężenia przy niskich Q oraz zakrzywienie przy pośrednich Q ujawniają odpowiednio długość i grubość cylindrów. Krzywa czerwona przedstawia dopasowanie danych eksperymentalnych do modelu cylindra typu rdzeń-otoczka⁹, z uwzględnieniem rozdzielczości przyrządu^10-12. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 13: Wzory rozproszenia dla cząsteczek polistyrenu (R = 150 Å) w D₂O/H₂O, zmierzone w konwencjonalnym trybie z otworkiem (pinhole) oraz w trybie wysokiej intensywności (z soczewkami). (A) Jednowymiarowe wzory rozproszenia zmierzone dla λ = 7 Å przy L_D = 8 m w trybie konwencjonalnym oraz przy L_D = 20 m w trybie wysokiej intensywności z soczewkami. W trybie wysokiej intensywności zastosowano różne rozmiary wiązki na próbce w celu zwiększenia natężenia. Uzyskano do 12-krotny wzrost natężenia przy zastosowaniu 26 soczewek w porównaniu do konwencjonalnego trybu z otworkiem. Dużą próbkę umieszczono w wiązce, wykorzystując okrągłą celę kwarcową o średnicy 5 cm. (B) Dwuwymiarowy wzór rozproszenia zarejestrowany na detektorze w trybie z otworkiem dla rozmiaru wiązki 10 mm x 10 mm. (C) Dwuwymiarowy wzór rozproszenia zarejestrowany na detektorze w trybie wysokiej intensywności przy użyciu 27 soczewek i rozmiaru wiązki 30 mm x 30 mm. Rozmiar (rozdzielczość) wiązki bezpośredniej ogniskowanej na detektorze jest taki sam jak w trybie z otworkiem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 14: Wzór rozpraszania dla roztworu buforowego oraz dla monomerów białka beta-amyloidu (Aβ 1-42, masa cząsteczkowa M_W = 4.5 kDa) w buforze z deuterowanego heksafluoroisopropanolu dHFIP o stężeniu 5.6 mg/ml po trzech tygodniach inkubacji. Kropki reprezentują krzywą rozpraszania dla roztworu białka, natomiast trójkąt reprezentuje krzywą rozpraszania dla roztworu buforowego. Niebieskie kropki oznaczają przekrój czynny rozpraszania (na prawej skali pionowej) dla monomerów po zastosowaniu korekty o wkład buforu. Słupki błędów reprezentują odchylenia standardowe wynikające z liczby zliczeń neutronów. Czerwona linia ciągła przedstawia dopasowaną funkcję Beaucage'a z ustaloną wymiarowością d=2¹⁴. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 15: Wzory rozproszenia dla lizozymu 50 mg/ml w 50 mM buforze octanowym w D₂O oraz dla roztworu buforu, pomierzone przy różnych ciśnieniach, od ciśnienia otoczenia do 5,000 bar. Symbole reprezentują dane z roztworu białka, natomiast linie przedstawiają dane z buforu. Dane zostały zebrane przy dwóch odległościach detekcji, L_D = 4 m (symbole puste) oraz L_D = 1 m (symbole pełne). Wstawka przedstawia zależność natężenia rozproszenia w przód I(Q→0) dla roztworu białka, buforu oraz samego białka (po zastosowaniu korekty o wkład buforu) od ciśnienia. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Parametr / Funkcja	Wyposażenie pomocnicze	Zakres stosowania	Dokładność	Szczegóły techniczne
Pozycjonowanie	Stół próbkowy			maks. obciążenie 600 kg
	X	0 - 360 mm	0,05 mm
	Y	0 - 330 mm	0,05 mm
	Z (oś wiązki)	ręcznie, 600 mm
	θr (rotacja)	0° - 360°	0,002°
	θt (kołyska)	± 30°	0,002°
Temperatura otoczenia	trzystopniowy wielopozycyjny uchwyt Al (maski Cd)			3x9=27 szerokich kuwet kwarcowych
				3x12=36 wąskich kuwet kwarcowych
	trzy pozycje			3 duże kuwety kwarcowe (średnica Φ = 5 cm)
	uchwyt Al (maska B4C)
Temperatura	termostat (łaźnia olejowa) +	od -25 °C do 200 °C	± 0,5 °C	4 pozycje
	mały blok miedziany			w powietrzu lub w komorze próżniowej (z uszczelnionymi kuwetami)
	termostat (łaźnia wodna) + wielopozycyjny dwustopniowy	od 5 °C do 85 °C	± 0,2 °C	2x9=18 szerokich kuwet kwarcowych; 2x12=24 wąskich kuwet kwarcowych
	blok Al
	termostat + piec wysokoprecyzyjny	od 10 °C do 120 °C	< 0,1 °C	1 pozycja, szeroka kuweta kwarcowa
	uchwyt kuwet z termostatem Peltiera	od -20 °C do 140 °C	± 0,2 °C	8 pozycji (wszystkie typy kuwet kwarcowych lub kuwety typu kanapkowego z mosiądzu); atmosfera kontrolowana poniżej 5 °C
	(maska B4C)
Ciśnienie	komórka wysokociśnieniowa SANS + termostat (łaźnia wodna)	do 5 000 bar		Temperatura w zakresie od 5 °C do 85 °C
Niska temperatura	Kriostat z oknami szafirowymi	do 50 K
Reometria	Reometr; tryby stanu stacjonarnego i oscylacyjny
Wilgotność	Komórka wilgotności	od 5% do 95%		Temperatura w zakresie od 15 °C do 60 °C
In-situ FT-IR20	Spektrometr FT-IR			Kuwety próbkowe z oknami ZnSe

Tabela 1: Lista osprzętu pomocniczego dostępnego dla dyfraktometru SANS KWS-2, zawierająca zakres zastosowania, dokładność oraz szczegóły każdego urządzenia.

Tryb pomiaru	Układ eksperymentalny	Rozdzielczość	rozmiar wiązki/próbki	maks. intensywność [n/s]	zakres Q [Å-1]
		Δλ/λ
Konwencjonalny otwór wiertniczy (pinhole)	λ = 7 Å	20%	10 x 10 mm2	1,3 x 108	0.002 .. 0.3
	LC = 2 m – 20 m
	LD = 1 m – 20 m
	λ = 4.5 Å, LC = 2 m, LD = 1 m	20%	10 x 10 mm2	2 x 108	0.01 .. 0.5
	λ = 10 Å, LC = 20 m, LD = 20 m	20%	10 x 10 mm2	7,5 x 105	0.001 .. 0.02
	λ = 20 Å, LC = 20 m, LD = 20 m	20%	10 x 10 mm2	4 x 104	7x10-4 .. 1,5x10-2
Ogniskowanie wysokiej intensywności	λ = 7 Å, LC = 20 m, LD = 17 m	20%	Φ = 50 mm	3 x 107	≈ 0.002  .. 0.03
Ustawianie ostrości wysoka rozdzielczość (rozszerzony zakres Q)	λ = 7 Å, LC = 20 m, LD = 17 m, AC = 4 x 4 mm2	20%	10 x 10 mm2	1,6 x 104	≈ 2x10-4 .. 0.02
Regulowana rozdzielczość	λ = 4.5 Å,	5%	10 x 10 mm2	ok. 7% w stosunku do trybu konwencjonalnego	0.002 .. 0.5
	LC = 20 m,
	LD = 1 m .. 20 m

Tabela 2: Konfiguracje eksperymentalne dostępne na dyfraktometrze SANS KWS-2.

Rysunek uzupełniający 1: Bezwzględny strumień neutronów w pozycji próbki instrumentu KWS-2 jako funkcja długości fali λ dla różnych długości kolimacji L_C oraz dla optymalnego wypełnienia zimnego źródła reaktora. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 2: Schematyczna budowa przerywacza z podwójnym dyskiem ze zmienną szerokością szczeliny. Szerokość szczeliny Δφ może być regulowana w zakresie od 0° do 90°, dzięki czemu, w zależności od częstotliwości przerywacza f_chopper, można zmieniać czas otwarcia τ_w prowadnicy (czerwony prostokąt na prawym pionowym szeregu obrazów). Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rycina uzupełniająca 3: Główny interfejs użytkownika oprogramowania sterującego pomiarami i wizualizacją urządzenia KWS-2. Funkcje po lewej stronie (A) mogą być wykorzystywane przez badaczy, natomiast funkcje i wskaźniki po prawej stronie (B) służą osobie odpowiedzialnej za instrument. Serwer lub proces wyświetlony w menu po prawej stronie jest operacyjny i działa poprawnie, gdy jest zaznaczony na zielono. Komponenty zaznaczone na żółto nie są aktywne. Wszelkie awarie są sygnalizowane kolorem czerwonym. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinię.

Rysunek uzupełniający 4: Widok menu kws2-Configuration oraz funkcji konfiguracji próbek. Użytkownicy muszą najpierw uzupełnić informacje w polach UserData, a następnie przeprowadzić konfigurację próbek. Pola, które muszą zostać wypełnione, oraz czynności, które należy podjąć, są zaznaczone na czerwono. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 5: Widok menu Definiowania (Definition) oraz funkcji Wyboru Próbki (Select Sample) w programie kws2. Czynności, które musi wykonać użytkownik, zostały opisane w kroku 4.3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 6: Widok menu Definicji (Definition) oraz funkcji Definicji Pomiarów (Definition of Measurements) w programie kws2. Czynności, które musi wykonać użytkownik, zostały opisane w kroku 4.3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 7: Program pomiarowy wygenerowany poprzez połączenie zdefiniowanych próbek i zdefiniowanych warunków eksperymentalnych. Czynności, które musi podjąć użytkownik, opisano w kroku 4.3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 8: Menu sterowania pomiarem kws2 oraz opcja Wartości bieżące (Current Values). Wyświetlone są parametry stałe (pozycje, nazwy, długość fali itp.) oraz zmienne (czas, intensywności, szybkość zliczania itp.) charakteryzujące przeprowadzany pomiar. Czynności, które musi wykonać użytkownik, zostały opisane w kroku 4.4. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 9: Opcja Live-Display z menu KWSlive_MainWindow i różnymi opcjami wizualizacji danych. Wybrany jest tryb wizualizacji Surface. Po wybraniu trybu Radial average (obraz po prawej stronie), ustawienia parametrów znajdują się w menu Options Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 10: Główny interfejs oprogramowania do redukcji danych qtiKWS z opcjami wyboru instrumentu oraz lokalizacji danych eksperymentalnych i przetworzonych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rycina uzupełniająca 11: Funkcje definiowania dziennika dla zestawu danych do przetworzenia (tabela informacyjna). Działania, które musi podjąć użytkownik, opisano w kroku 5.3. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rysunek uzupełniający 12: Funkcje służące do definiowania maski detektora, dla której przetwarzane będą dane. Czynności, które musi wykonać użytkownik, zostały opisane w kroku 5.4. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 13: Funkcje służące do definiowania map czułości detektora. Czynności, które musi podjąć użytkownik, zostały opisane w kroku 5.5. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rycina uzupełniająca 14: Funkcje służące do generowania tabeli skryptu dla korekcji, kalibracji i uśredniania radialnego danych. Czynności, które musi podjąć użytkownik, opisano w kroku 5.6. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rycina uzupełniająca 15: Funkcje służące do wykreślania przetworzonych danych. Czynności, które musi wykonać użytkownik, opisano w kroku 5.6.5. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rycina uzupełniająca 16: Funkcje służące do przygotowania i podziału danych pomiarowych uzyskanych w trybie rozdzielczości regulowanej. Dane z dwóch impulsów dostarczonych przez chopper i zebrane początkowo w 64 kanałach TOF są łączone w jeden impuls. Kilka kanałów jest grupowanych w taki sposób, aby wynikowe kanały czasowe, charakteryzujące się wartością Δλ/λ_aimed, mogły zostać zapisane jako oddzielne pliki. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rycina uzupełniająca 17: Główny interfejs oprogramowania do redukcji danych qtiKWS z wybraną opcją przetwarzania danych zmierzonych przy użyciu detektora o wysokiej rozdzielczości. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rycina uzupełniająca 18: Funkcje służące do definiowania masek detektora wysokiej rozdzielczości, dla których dane będą przetwarzane. Działania, które musi podjąć użytkownik, są opisane w kroku 5.8. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinię.

Rysunek uzupełniający 19: Przegląd wszystkich typów ogniw z próbkami zazwyczaj stosowanych na KWS-2 do badania materii miękkiej i próbek biologicznych w temperaturze otoczenia lub zmiennej. (A) Widok dużych ogniw kwarcowych dostępnych dla trybu wysokiej intensywności z soczewkami i dużym rozmiarem wiązki. Uchwyt ogniwa, wyposażony w maski z plastiku borowanego (1), umożliwia zaplanowanie i przeprowadzenie trzech pomiarów w jednej sesji. (B) Widok ogniw kwarcowych lub mosiężnych używanych jako pojemniki na próbki oraz uchwytu z kontrolą temperatury (typu Peltiera) wyposażonego w wkłady 8-pozycyjne odpowiednie dla każdego typu ogniwa. Uchwyt jest osłonięty maskami z plastiku borowanego (1) z obu stron. (C) Widok ogniwa ciśnieniowego w trakcie pracy na KWS-2. Ogniwo może wytworzyć ciśnienie na próbce od ciśnienia otoczenia do 5,000 bar w trybie automatycznym, sterowanym przez program pomiarowy. Okrągła maska z Cd (1) z małym otworem w środku wyznacza rozmiar wiązki na próbce. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Dyskusja

Materia miękka oraz układy biofizyczne charakteryzują się zazwyczaj korelacjami strukturalnymi oraz powiązanymi ze sobą poziomami mikrostrukturalnymi i morfologicznymi, które obejmują szeroką skalę długości, od nanometrów do mikrometrów. Aby zrozumieć mechanizm tworzenia się i ewolucji morfologii takich układów oraz związek między ich cechami mikroskopowymi a właściwościami makroskopowymi, istotne jest zbadanie ich mikrostruktury w całej skali długości i w odpowiednich warunkach środowiskowych (np. temperatura, ciśnienie, pH, wilgotność, itp.). W tego typu badaniach zazwyczaj wykorzystuje się techniki rozpraszania pod małym kątem z użyciem neutronów (SANS) lub promieniowania rentgenowskiego z synchrotronu (SAXS). Niższa intensywność wiązki neutronów w porównaniu do promieniowania rentgenowskiego z synchrotronu jest rekompensowana poprzez zastosowanie stosunkowo dużych Δλ/λco jednak prowadzi do pogorszenia rozdzielczości instrumentalnej. Niemniej jednak SANS zapewnia unikalne zalety dzięki możliwościom oferowanym przez zmienność kontrastu, szczególnie pomiędzy izotopami wodoru. W związku z tym SANS jest metodą eksperymentalną stosowaną specjalnie w badaniach materii miękkiej i układów biofizycznych, dla których dostarcza ona unikalnych informacji strukturalnych i morfologicznych. Większość dyfraktometrów SANS na świecie²¹ zasada otworu zwory (Rycina 2A), co umożliwia zamierzone niskie-Q rozdzielczość. W praktyce wszystkie dyfraktometry SANS o wysokim strumieniu charakteryzują się podobnym strumieniem maksymalnym rzędu 1 x 10⁸ n cm^-2 sek^-1Dzięki obniżonej rozdzielczości długości fali, KWS-2 charakteryzuje się niemal dwukrotnie większym strumieniem.^{2, 4}W ostatnim czasie uruchomiono bardzo wyspecjalizowane dyfraktometry SANS, które dzięki zoptymalizowanej charakterystyce służą do konkretnego zakresu zastosowań, np. do badań przy bardzo małych wektorach rozpraszania^{22, 23}W związku z niedawnym uruchomieniem specjalistycznych dyfraktometrów TOF-SANS przy reaktorach stanu stacjonarnego²⁴ lub źródła spallacyjne ^{25, 26}, znacząco zwiększona dynamika Q zakres w danej konfiguracji eksperymentalnej oraz oferowana jest zwiększona elastyczność i optymalizacja w zakresie wyboru rozdzielczości eksperymentalnej. W przypadku dyfraktometru SANS KWS-2, na klasycznym instrumentie SANS uzyskano wysoki poziom wszechstronności i wydajności, niezbędny do prowadzenia bardzo specyficznych badań strukturalnych w dziedzinie materii miękkiej i biofizyki. Optymalizacja, elastyczność i spontaniczność w projektowaniu oraz przeprowadzaniu złożonych badań, wspierane przez opisany protokół, zostają osiągnięte dzięki połączeniu zoptymalizowanych parametrów eksperymentalnych (np. intensywność, skala długości, rozdzielczość przestrzenna i rozdzielczość czasowa) oraz złożone środowiska próbek. Wykorzystując liczne tryby pracy wymienione we wstępie i poparte wynikami przedstawionymi w Ryciny 8-15KWS-2 w prosty i praktyczny sposób zwiększa wydajność klasycznego dyfraktometru SANS w stacjonarnym źródle neutronów (reaktorze), wykraczając poza konwencjonalne ograniczenia tego typu instrumentów.

Niniejszy protokół przedstawia kroki, które zwykły użytkownik musi wykonać w celu zdefiniowania i przeprowadzenia prostego programu eksperymentalnego, obejmującego jedynie badanie próbek w otoczeniu termodynamicznym (temperatura, ciśnienie, wilgotność względna) i w warunkach statycznych (brak kinetyki tworzenia lub transformacji struktury, brak ścinania lub przepływu). Dostępnych jest kilka uchwytów z kontrolą temperatury lub specjalnych środowisk dla próbek (Tabela 1 oraz Rycina uzupełniająca 19), takich jak komory ciśnieniowe, reometry lub komory wilgotności, które mogą zostać optymalnie zainstalowane i dostrojone przy specjalnej pomocy zespołu instrumentu. Protokół ten nie zawiera instrukcji dotyczących ustawień i sterowania takim sprzętem. Definiowanie i aktywacja zewnętrznych kontrolerów wymagają zastosowania innego, bardziej złożonego protokołu. Niniejszy protokół przedstawia przypadek pracy z kwarcowymi komorami na próbki o wąskim, prostokątnym kształcie (Rycina 3). Niemniej jednak użytkownikom oferowany jest szeroki zakres geometrii i typów komór (Rycina uzupełniająca 19), aby zapewnić większą elastyczność i wydajność w prowadzeniu eksperymentów. W przypadku użycia takich komór można stosować niniejszy protokół po dostosowaniu parametrów omówionych w kroku 4.2.2. Oprogramowanie sterujące pomiarami zostało opracowane tak, aby zaoferować użytkownikom większą elastyczność w realizacji celów naukowych oraz optymalizację techniczną eksploatacji instrumentu. Wszystkie regulacje i konfiguracje specjalnych funkcji oraz komponentów instrumentu są wykonywane przez zespół instrumentu. Udział użytkowników naukowych w konfiguracji, definiowaniu i wykorzystaniu instrumentu jest uproszczony i ograniczony wyłącznie do tych aspektów, które wiążą się z kwestiami naukowymi sesji eksperymentalnej. Pliki konfiguracyjne są zdefiniowane z góry, aby objąć wszystkie specjalne kwestie eksperymentalne, takie jak pozycjonowanie specjalnych uchwytów w wiązce, pozycjonowanie próbki w wiązce (współrzędne x, y, Φ oraz ω na stole próbek, stole obrotowym lub w kolebce na Rycini uzupełniającej 5), dostrojenie pozycji detektora i beam-stopu dla różnych długości fal, dostrojenie parametrów choppera (częstotliwość i okno otwarcia) dla różnych długości fal, odległości detekcji i zamierzona rozdzielczość, itp. Ponadto obecny protokół nie opisuje sposobu korzystania z trybu czasu rzeczywistego na KWS-2. W celu przeprowadzenia eksperymentów SANS z rozdzielczością czasową wymagane jest również zastosowanie bardziej złożonego protokołu.

Ponadto protokół ten przedstawia sposób korygowania zmierzonych danych o różne wkłady rozpraszania pochodzące z instrumentu oraz referencji i ich kalibrację w celu uzyskania różnicowego przekroju czynnego na rozpraszanie próbki, dΣ/dΩ, wyrażonego w cm^-1. Wielkość ta zawiera pełne informacje strukturalne i morfologiczne o próbce i jest mierzona w szerokim zakresie Q, odpowiadającym szerokiej skali długości, w której pojawiają się korelacje strukturalne i powiązane ze sobą poziomy wielkości charakterystyczne dla badanego układu. Przekrój czynny na rozpraszanie dΣ/dΩ wiąże zatem natężenie zmierzone w statycznym eksperymencie rozpraszania pod kątem Θ, I_s=f(Θ), z właściwościami strukturalnymi próbki.

Aby ocenić dΣ/dΩ dla badanego układu, poza pomiarem samego układu, konieczne są dodatkowe pomiary w celu skorygowania danych o wszelkie rozpraszanie zewnętrzne (t.j. otoczenie, kuwetka pomiarowa, rozpuszczalnik lub roztwór buforowy w przypadku układów z substancją rozpuszczoną itp.) oraz w celu kalibracji skorygowanych danych w jednostkach bezwzględnych⁸. Należy również zmierzyć tło zewnętrzne (kuwetkę lub pojemnik), próbkę referencyjną (roztwory rozpuszczalnika lub buforu), transmitancję próbki (niezbędną do prawidłowego odjęcia tła i kalibracji skorygowanych wyników w jednostkach bezwzględnych), tło elektroniczne detektora, czułość detektora (niejednorodność sprawności detektora, która jest immanentną cechą detektorów powierzchniowych) oraz znormalizowaną próbkę standardową. W przypadku KWS-2 jako próbkę standardową stosuje się pleksiglas (PMMA). Jest to tak zwany standard wtórny, który jest okresowo kalibrowany względem standardu pierwotnego, którym jest wanad. Wanad wykazuje bardzo słabą intensywność rozpraszania i wymaga bardzo długich czasów pomiaru w celu zgromadzenia odpowiedniej statystyki, przez co jest niepraktyczny w zastosowaniach SANS. Intensywność zebraną z badanej próbki I_S oraz z próbki standardowej I_St można wyrazić w następujący sposób:

[1]

[2]

gdzie I₀ oznacza natężenie wiązki padającej (dostarczanej przez układ kolimacyjny), t to grubość, A to powierzchnia naświetlana wiązką, T to transmitancja, a Δψ to kąt bryłowy, pod którym komórka detekcyjna jest widoczna z pozycji próbki. Jeśli zarówno próbka, jak i wzorzec są mierzone w tych samych warunkach w odniesieniu do wiązki padającej (tj. L_C, A_C i A_S, a także λ i Δλ/λ), I₀ oraz A są identyczne, a kąt bryłowy jest wyrażony jako A_D/L_D (gdzie A_D oznacza powierzchnię komórki detekcyjnej). Poprzez podzielenie obu zależności otrzymuje się przekrój czynny na rozpraszanie próbki w postaci:

[3]

gdzie I_St jest wyrażone jako średnia (standard jako niespójny układ rozpraszający generuje płaski obraz rozproszenia). Wartość I_S uzyskuje się po skorygowaniu zmierzonej intensywności próbki w kuwecie (pojemniku) o wkład pustej kuwety I_ECell oraz tło detektora dla wiązki zamkniętej, I_B. Współczynnik t_StT_St(dΣ/dΩ)_St, który zawiera parametry rozproszenia i fizyczne próbki wzorcowej, zależy od długości fali neutronów λ i jest zazwyczaj znany z kalibracji próbki wzorcowej. W związku z tym jest on wyszczególniony w tablicach oprogramowania do redukcji danych⁴. Parametry i wielkości w rów. 3, które są znane z procedur kalibracyjnych i definicji układu eksperymentalnego (t_S, L_D), tworzą tak zwany czynnik kalibracyjny k. Intensywności oraz transmitancja próbki T_S występujące w rów. 3 muszą zostać zmierzone. Program do analizy danych qtiKWS umożliwia korekcję, kalibrację i uśrednianie radialne danych eksperymentalnych oraz wyznaczenie dΣ/dΩ dla badanych próbek w elastycznym i wszechstronnym trybie pracy. Końcowe wyniki wygenerowane za pomocą oprogramowania qtiKWS są przedstawione w formie tabel z czterema kolumnami: Q, I, ΔI, Δσ, gdzie I oznacza dΣ/dΩ, a Δσ jest rozdzielczością Q⁵.

Z praktycznego punktu widzenia, za pomocą KWS-2 można przeprowadzać połączone badania SANS i USANS, z tą zaletą, że geometria próbki oraz warunki termodynamiczne pozostają stałe. W sposób bezpośredni można badać duże morfologie wykazujące wiele poziomów strukturalnych obejmujących szeroką skalę długości, od rozmiarów nanometrowych do mikrometrowych, co przedstawiono na Rysunku 12. Oprócz granicy strukturalnej w małej skali R_C obserwowanej na krzywej rozpraszania mierzonej w konwencjonalnym trybie pinhole, poprzez aktywację soczewek i detektora o wysokiej rozdzielczości, w trybie pracy w rozszerzonym zakresie Q można było zaobserwować granicę strukturalną w dużej skali L_C cylindrycznych miceli typu rdzeń-powłoka utworzonych przez diblokowy kopolimer poli(tlenek heksylenu-co-tlenek etylenu) PHO10k-PEO10k (w pełni protonowany) w D₂O¹⁴ przy bardzo niskich wartościach Q. Cylindryczne micele charakteryzują się całkowitą grubością około 300 Å i długością około 7 000 Å, co ujawniło dopasowanie wyników eksperymentalnych do czynnika kształtu cylindrów typu rdzeń-powłoka^9,14. Zatem określone efekty wrażliwe, takie jak żele termoreaktywne lub formowanie i wzrost morfologii krystalicznych lub częściowo krystalicznych, mogą być jednoznacznie badane za pomocą KWS-2, w przeciwieństwie do klasycznego podejścia wymagającego zastosowania dwóch lub więcej różnych instrumentów i geometrii próbek.

Jak przedstawiono na Rysunku 11, układy skorelowane i struktury uporządkowane można badać z dostosowaną rozdzielczością w bardzo elastyczny sposób, bez poświęcania czasu i wysiłku na instalację złożonych systemów monochromatyzacji, co wiązałoby się z dodatkową troską i kwestiami bezpieczeństwa. Co więcej, dzięki zastosowaniu choppera i trybu akwizycji danych TOF, monodyspersyjne układy materii miękkiej lub kompleksy o niskiej polidyspersyjności rozmiarów mogą być charakteryzowane bardzo precyzyjnie przy zachowaniu wysokich intensywności⁵.

Utrudnienia wynikające ze słabego rozpraszania spowodowanego zastosowaniem systemów silnie rozcieńczonych lub niekorzystnych warunków kontrastu można pokonać poprzez wykorzystanie jeszcze większych natężeń opartych na większym rozmiarze wiązki na próbce, przy jednoczesnym zachowaniu rozdzielczości. Rysunek 13A przedstawia wzory rozpraszania cząsteczek polistyrenu o promieniu R = 150 Å, zmierzone w trybie wysokiego natężenia z użyciem soczewek i kwadratowego rozmiaru wiązki w zakresie od 10 mm x 10 mm, co jest typowym rozmiarem stosowanym w konwencjonalnym trybie otworkowym, do 30 mm x 30 mm. Dodatkowo pokazano wynik pomiaru z wiązką okrągłą o średnicy 50 mm (pełny rozmiar soczewki). Równolegle przedstawiono znormalizowany wynik uzyskany w konwencjonalnym trybie otworkowym. Stosując 26 soczewek z neutronami o λ= 7 Å i tym samym rozmiarze apertury wlotowej A_C co w konwencjonalnym trybie otworkowym (Rysunek 2B), uzyskuje się wzrost natężenia na próbce około 12-krotny przy zachowaniu stałego rozmiaru wiązki (rozdzielczości) na detektorze, co pokazano na Rysunku 13B-C. System 27 soczewek ma transmitancję około 32% w temperaturze otoczenia. Po ochłodzeniu do temperatury 50 K transmitancja soczewek wzrasta ze względu na tłumienie rozpraszania na fononach w materiale soczewki. System 26 soczewek parabolicznych ma transmitancję około 65% dla okrągłego rozmiaru wiązki 50 mm, gdy wiązka przechodzi przez całą objętość soczewki, i około 92% dla kwadratowego rozmiaru wiązki 10 mm x 10 mm, gdy w wiązce znajduje się tylko niewielka ilość materiału soczewki. Tryb wysokiego natężenia z soczewkami oferuje korzyści w przypadku słabego rozpraszania, które zazwyczaj występuje przy dużej odległości detekcji i jest szczególnie problematyczne w przypadku słabych warunków kontrastu. Dodatkowo, gdy próbka jest stabilna tylko przez krótki czas, zastosowanie tego trybu stanowi wyraźną zaletę, co wykazano w innym opracowaniu¹⁵.

Z drugiej strony, w przypadku układów biologicznych do eksperymentów zazwyczaj dostępne są niewielkie objętości próbek. Małe cząsteczki biologiczne w warunkach fizjologicznych o rozmiarach kilku nanometrów generują słabe sygnały rozproszenia, które są przesłonięte przez dominujące rozproszenie roztworów buforowych. Takie sygnały można zmierzyć za pomocą KWS-2, korzystając z wysokiej intensywności instrumentu w konfiguracji niskiej rozdzielczości w trybie otworkowym (pinhole), stosując krótkie długości kolimacji L_C = 2 m lub 4 m oraz krótkie odległości detekcji L_D = 1 m, 2 m lub 4 m. Rysunek 14 przedstawia wzory rozproszenia monomerów białka beta-amyloidu (Aβ 1-42, M_W = 4,5 kDa) w deuterowanym heksafluoroisopropanolu dHFIP, uzyskane po zastosowaniu korekcji o sygnał rozproszenia buforu. Dopasowanie modelu do danych wskazało rozmiar monomeru wynoszący około 16 ± 1 Ź⁶. Wymagany był długi czas pomiaru, rzędu kilku godzin dla każdego warunku eksperymentalnego (odległość detekcji L_D i typ próbki), mimo że pomiary prowadzono przy krótkich odległościach detekcji. Stary detektor, który wykazywał ograniczenia w zakresie szybkości zliczania, utrudniał stosowanie krótkich odległości kolimacji L_C, co wymusiło wykorzystanie maksymalnego strumienia instrumentu. Dzięki uruchomieniu nowego systemu detekcji, umożliwiającego wykorzystanie pełnego strumienia neutronów, tak słabe intensywności będą w przyszłości mierzone w krótszym czasie i z lepszą statystyką.

Wreszcie, efekty wrażliwości na bodźce można badać w elastyczny i łatwy sposób, wykorzystując specjalistyczne wyposażenie pomocnicze KWS-2. Przykład przedstawiono na Rysunku 15, który ukazuje wzory SANS dla białka lizozymu w buforze D₂O oraz dla buforu zebranego przy różnych ciśnieniach. Szczególną uwagę poświęcono badaniu tła i rozpraszania w przód cząsteczek lizozymu, co zostało wykorzystane w teście wydajności nowej celi ciśnieniowej wykonanej wewnętrznie zgodnie z projektem PSI ze Szwajcarii. Wyniki były podobne do tych uzyskanych przez Kohlbrechera et al. w analogicznym badaniu mającym na celu przetestowanie oryginalnego modelu celi ciśnieniowej skonstruowanej w tamtejszym ośrodku^{17, 18}. Dzięki KWS-2 pozyskano dalsze dane, osiągając ciśnienie 5,000 bar. Ewolucja intensywności rozpraszania w przód białka wykazuje zachowanie liniowe, co zaobserwowano w badaniu w PSI w Szwajcarii¹⁸.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
ciężka woda D2O	Sigma-Aldrich	151882
ciężka woda D2O/H2O	Sigma-Aldrich	151882	90% D2O i 10% H2O
Standardy rozmiaru nanosfery serii 3000 (polistyren)	Thermo Scientific	3030A	90% D2O i 10% H2O
Standardy rozmiaru nanospher serii 3000 (polistyren)	Thermo Scientific	3070A	90% D2O i 10% H2O
Standardy rozmiaru nanosfery serii 3000 (polistyren)	Thermo Scientific	3100A	90% D2O i 10% H2O
Rozmiar nanospher serii 3000 Standardy (polistyren)	Thermo Scientific	3200A	90% D2O i 10% H2O
Standardy rozmiaru nanosfery serii 3000 (polistyren)	Thermo Scientific	3800A	90% D2O i 10% H2O
Kopolimer diblokowy C28H57-PEO5k	syntetyzowany we własnym zakresie		w D2O
Ogniwa kwarcowe 110-QX	Hellma analytics	110-1-46
Aluminiowy uchwyt na kuwetę	wyprodukowany we własnym zakresie		do pomiarów w temperaturze otoczenia
śrubokręt
imbusowy klucze imbusowe