Artykuł metodologiczny

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu oczyszczenia plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

DOI:

10.3791/54641

⸱

4 listopada 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences and Pathobiology, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University, 2Flow Cytometry Laboratory, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine, Virginia Polytechnic Institute and State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgłaszamy protokół wykorzystujący sortowanie komórek aktywowane fluorescencją do izolowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) o wysokiej czystości ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń do badań funkcjonalnych pDC.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) to technika oczyszczania określonych populacji komórek na podstawie fenotypów wykrytych przez cytometrię przepływową. Metoda ta umożliwia naukowcom lepsze zrozumienie charakterystyki pojedynczej populacji komórek bez wpływu innych komórek. W porównaniu z innymi metodami wzbogacania komórek, takimi jak sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MCS), FACS jest bardziej elastyczny i dokładny w separacji komórek ze względu na możliwość wykrywania fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej. Ponadto FACS jest zwykle zdolny do separacji wielu populacji komórek jednocześnie, co poprawia wydajność i różnorodność eksperymentów. Chociaż FACS ma pewne ograniczenia, jest szeroko stosowany do oczyszczania komórek do badań funkcjonalnych zarówno in vitro, jak i in vivo. Tutaj przedstawiamy protokół wykorzystujący sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu wyizolowania bardzo rzadkiej populacji komórek odpornościowych, plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC), o wysokiej czystości ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń do badań funkcjonalnych in vitro pDC.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczne oddzielenie wybranej populacji komórek od innych komórek umożliwia badania populacji, które w inny sposób mogłyby nie być możliwe. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) to metoda wzbogacania interesującej populacji komórek o wysokiej czystości. 1,2 Różne typy komórek zwykle wyrażają unikalne cząsteczki lub unikalną kombinację kilku cząsteczek na błonie plazmatycznej, które mogą odróżnić jedną populację komórek od drugiej. Po związaniu tych cząsteczek na powierzchni komórki przez specyficzne przeciwciała sprzężone z fluorescencją, maszyna wykrywająca zwana cytometrem przepływowym / sorterem jest w stanie wzbudzić i wykryć sygnały świetlne różnych barwników fluorescencyjnych, które reprezentują różne markery molekularne na komórkach na poziomie pojedynczej komórki. Połączona informacja składająca się z obecności sygnału świetlnego (reprezentującego dodatnią ekspresję odpowiedniej cząsteczki powierzchniowej) lub braku sygnału świetlnego (reprezentującego ujemną ekspresję cząsteczki) określa fenotyp komórki. Po przejściu przez detektor komórki o tym samym fenotypie zainteresowania są kierowane do wyznaczonej rurki zbiorczej opartej na ładunku elektrycznym.

FACS jest szeroko stosowany w różnych badaniach, o ile populacja, która ma być wzbogacona, jest znakowana fluorescencją. 3-7 Zastosowano go do oddzielenia bakterii pokrytych immunoglobuliną (Ig)A od bakterii niepokrytych IgA w mikrobiocie jelitowej 8 i sortowania genetycznie modyfikowanych populacji komórek wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych. 9 Co ważne, ma zdolność do jednoczesnego oddzielania więcej niż jednej populacji, co nie tylko oszczędza czas i odczynniki, ale także pozwala na bardziej wyrafinowane projekty badań. 10 FACS ma jednak również swoje ograniczenia. Jeśli populacja będąca przedmiotem zainteresowania jest bardzo rzadka (mniej niż 1%), wydajność sortowania może być zmniejszona, powodując znaczną utratę komórek. Ponadto pewne wiązanie przeciwciał może aktywować wewnątrzkomórkową transdukcję sygnału, która indukuje zmiany funkcjonalne posortowanej populacji komórek. 11 W związku z tym fenotyp używany do sortowania powinien być starannie wybrany.

Oprócz FACS istnieją inne metody, które również opierają się na markerach powierzchni komórek do wzbogacania określonych populacji komórek, takie jak sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MCS). 12 Podobnie jak FACS, przeciwciała sprzężone z kulkami magnetycznymi mogą celować w określone cząsteczki na powierzchni komórki. W wyniku interakcji przeciwciało-antygen komórki pokryte kulkami magnetycznymi można oddzielić od komórek niepowlekanych po przejściu przez pole magnetyczne. Jednak tylko ograniczona liczba cząsteczek może być celem MCS, ponieważ kulki magnetyczne są, w przeciwieństwie do różnych kolorów fluorescencyjnych w FACS, nierozróżnialne. W związku z tym MCS ma trudności z określeniem fenotypu komórki za pomocą skomplikowanej kombinacji markerów powierzchniowych. 13,14 Ponadto MCS jest również w stanie powodować niezamierzoną aktywację komórek docelowych.

W naszych badaniach mysiego modelu tocznia rumieniowatego układowego (SLE), 15 zamierzaliśmy oczyścić plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC) w celu zbadania ich zmian funkcjonalnych wraz z postępem choroby. Po raz pierwszy użyliśmy MCS do wzbogacenia pDC ze szpiku kostnego, celując w PDCA-1, cząsteczkę o wysokiej i unikalnej ekspresji na mysim pDC w stanie stacjonarnym. 16 Jednak czystość komórek była nieoczekiwanie niska, prawdopodobnie z powodu regulacji w górę PDCA-1 w innych populacjach komórek w środowisku zapalnym, takim jak TRU. 16 Ostatecznie użyliśmy FACS z kombinacją czterech markerów powierzchniowych (CD11c, CD11b, B220 i PDCA-1) do oddzielenia pDC o wysokiej czystości jako populacji CD11c+CD11b-B220+PDCA-1+. Mysz pDC ma inny specyficzny znacznik powierzchniowy Siglec-H. Zdecydowaliśmy się nie używać Siglec-H, ponieważ wiązanie przeciwciał w tej cząsteczce hamuje funkcję pDC do produkcji IFNα. 11

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Myszy podatne na toczeń MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) były hodowane i utrzymywane w określonym obiekcie wolnym od patogenów zgodnie z wymaganiami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w Virginia Tech (numer gwarancji dobrostanu zwierząt: A3208-01). Badanie to zostało przeprowadzone w ścisłej zgodności z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem IACUC #12-062.

1. Pożywka do hodowli komórkowych i bufor sortujący

  1. Przygotować kompletną pożywkę do hodowli komórkowych (C10) przy użyciu RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 1 mM pirogronianem sodu, 1% 100 aminokwasów endogennych MEM, 10 mM HEPES, 55 μM 2-merkaptoetanolu, 2 mM L-glutaminy i 100 U/ml penicyliny-streptomycyny.
  2. Przygotować bufor sortujący (pełny HBSS) przy użyciu 1x Zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) uzupełnionego 10 mM HEPES, 2,5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 0,05 mM MgCl2 i 0,2 U/ml DNazy I.

2. Sekcja myszy

  1. Przygotuj dwie naczynia o średnicy 6 cm zawierające 4 ml C10. Ułóż naczynia na lodzie.
  2. Poddaj mysz eutanazji przez wdychanie CO2 .
  3. Zbierz śledzionę i trzymaj ją w naczyniu z C10 na lodzie.
    1. Przygwoźdź mysz brzuchem do góry na płycie preparcyjnej. Wysterylizuj ciało, rozpylając 70% etanolu.
    2. Przetnij skórę i oddziel skórę od ściany mięśniowej pod spodem wzdłuż brzusznej linii środkowej od spojenia łonowego do szyi.
    3. Przetnij skórę wzdłuż tylnej kończyny od pierwszego nacięcia do kostki.
    4. Przypnij skórę z powrotem po bokach i przetnij ścianę mięśniową wzdłuż boków od pierwszego miejsca nacięcia do przepony.
    5. Przypnij ścianę mięśniową z powrotem po prawej stronie głowy.
    6. Zlokalizuj śledzionę po prawej stronie myszy pod jelitem cienkim i obok żołądka. Podnieś jeden koniec śledziony i oddziel go od żołądka.
  4. Wytnij obie tylne kończyny, w tym kość udową i piszczelową, i usuń wszystkie mięśnie tak bardzo, jak to możliwe.
    1. Przetnij mięśnie wzdłuż tylnej kończyny od stawu miednicznego/biodrowego do kostki ostrymi nożycami, starając się unikać naczyń krwionośnych.
    2. Oddziel tylną kończynę, przecinając staw miednicy/biodrowy i staw skokowy/stopowy bez odsłaniania zawartości szpiku kostnego.
    3. Oczyść pozostałe mięśnie na kościach, wielokrotnie drapiąc żyletką i przecinając mięśnie w punktach stawowych.
  5. Kości należy przechowywać na lodzie w naczyniu o średnicy 6 cm zawierającym 4 ml C10. Przejdź do analizowania następnej myszy.

3. Izolacja splenocytów

  1. Delikatnie homogenizować śledzionę za pomocą tłoka strzykawki na sitku do komórek o średnicy 70 μm umieszczonym na górze naczynia zawierającego 4 ml C10, aż nie będą widoczne żadne czerwone kawałki.
  2. Dodać dodatkowe 6 ml C10 do naczynia przez sitko, a następnie przenieść całe 10 ml zawiesiny komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  3. Odwirować stożkową probówkę o masie 800 x g przez 5 minut, 4 °C.
  4. Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml 1 x bufor do lizy krwinek czerwonych (RBC). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  5. Po inkubacji odwirować stożkową probówkę o sile 800 x g przez 5 minut, 4 °C.
  6. Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml C10. Wyrzuć wszelkie duże grudki (martwe komórki) i trzymaj probówkę na lodzie na później.
    UWAGA: Jeśli jest wiele małych grudek, użyj sitka do komórek o średnicy 70 μm, aby raz przefiltrować zawiesinę komórek.
  7. Policz liczbę komórek za pomocą trypana niebieskiego za pomocą automatycznego licznika komórek.

4. Izolacja komórek szpiku kostnego

  1. Przenieść kości z 4 ml C10 do moździerza i dodać 6 ml C10, aby uzyskać objętość 10 ml C10.
  2. Delikatnie rozbij kości w moździerzu za pomocą tłuczka.
  3. Delikatnie wymieszaj tłuczkiem, aby uwolnić szpik kostny do C10.
  4. Przenieść 10 ml C10 zawierający szpik kostny do stożkowej probówki o pojemności 50 ml na lodzie przez sitko o średnicy 70 μm. Dodać 10 ml świeżego C10 do moździerza zawierającego jeszcze kości.
    UWAGA: Kilkakrotnie odpipetować roztwór zawierający szpik kostny w górę i w dół przed przejściem przez sitko, jeśli widoczne są czerwone grudki.
  5. Powtórz kroki od 4.2 do 4.4 dwukrotnie. Po ostatnim praniu kości powinny wydawać się białe.
  6. Odwirować stożkową probówkę o pojemności 50 ml przy 800 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C. W międzyczasie należy przygotować 5 ml gotowej do użycia pożywki o gradientce gęstości w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml w temperaturze pokojowej.
  7. Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml C10.
  8. Powoli ułóż 10 ml zawiesiny komórek na wierzchu 5 ml gradientu gęstości, zachowując wyraźny interfejs między dwiema fazami. Następnie odwirować stożkową probówkę o pojemności 15 ml o masie 1,363 g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (20 °C) z przyspieszeniem ustawionym na 9 i opóźnieniem ustawionym na 0 (lub hamulec wyłączony).
  9. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć górne 8 ml roztworu i zebrać 2 ml kożucha na granicy faz (warstwa komórek jednojądrzastych) do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  10. Dodać 12 ml lodowatego C10 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej jednojądrzaste komórki szpiku kostnego, kilkakrotnie zakryć i odwrócić do góry dnem do dobrego wymieszania, a następnie odwirować probówkę o sile 800 x g przez 10 minut, 4 °C.

5. Barwienie powierzchni komórek dla FACS

  1. Barwienie próbki
    1. Przygotować roztwór przeciwciała przeciwko myszom CD16/32 (rozcieńczenie 1 do 100 w pełnym HBSS, końcowe stężenie 5 μg/ml).
    2. Po odwirowaniu w kroku 4.10 odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl roztworu przeciwciała anty-mysiego CD16/32 w celu zablokowania receptora Fc na komórkach jednojądrzastych. Inkubować na lodzie przez 10 minut.
    3. Przygotować mieszaninę przeciwciał sprzężonych z fluorescencją (rozcieńczenie anty-mysie CD11c-PE 1:40, rozcieńczenie anty-mysie CD11b-APC-CY7 rozcieńczenie 1:80, rozcieńczenie anty-mysie PDCA-1-FITC 1:40 i rozcieńczenie anty-mysie B220-V500 1:40 w HBSS-full zgodnie z zaleceniami producenta w 100 μl końcowej objętości na próbkę).
      UWAGA: Ważne jest, aby miareczkować przeciwciała przed użyciem.
    4. Po 10 minutach inkubacji w kroku 5.1.2 dodać 4 ml lodowatego pełnego HBSS i odwirować przy 800 x g przez 5 minut, 4 °C w celu usunięcia niezwiązanego CD16/32 przeciwko myszy.
    5. Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl mieszaniny przeciwciał sprzężonych z fluorescencją. Inkubować na lodzie przez 15 minut w ciemności.
    6. Po 15 minutach inkubacji dodać 4 ml lodowatego HBSS i wirować przy 800 x g przez 5 minut, 4 °C w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał sprzężonych z fluorescencją.
    7. Przygotować roztwór ładujący FACS (500 ng/ml DAPI w pełnym HBSS).
    8. Po odwirowaniu w kroku 5.1.6 odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w roztworze ładującym FACS o stężeniu 500 μl. Przenieś zawiesinę komórek do okrągłej probówki dennej o wymiarach 12 x 75 mm (probówka FACS) i trzymaj probówkę na lodzie w ciemności do momentu sortowania w ciągu 1 godziny.
  2. Barwienie w celu kompensacji
    1. Oznacz 6 probówek FACS jako PE, APC-CY7, FITC, V500, DAPI lub niebarwione. Porcję splenocytów w ilości 1 x 106 komórek/probówkę do probówek FACS i przemyć 4 ml HBSS-full przy 800 x g przez 5 min, 4 °C.
      UWAGA: Użyj barwnika fluorescencyjnego wiążącego DNA, DAPI, aby odróżnić żywe komórki od martwych. DAPI może przenikać przez błonę plazmatyczną martwych komórek (ale nie żywych komórek) i wiązać chromosomowe DNA.
    2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl HBSS-full.
    3. W każdej odpowiedniej probówce FACS dodać jedno z następujących przeciwciał: rozcieńczenie anty-mysie CD19-PE 1:40, rozcieńczenie anty-mysie CD11b-APC-CY7 1:80, rozcieńczenie anty-mysie PDCA-1-FITC 1:40 lub rozcieńczenie anty-mysie B220-V500 1:40 zgodnie z zaleceniami producenta. Pozostaw5-tą (DAPI) i6-tą (niebarwioną) probówkę FACS bez zmian. Dobrze wymieszaj, wstrząsając i inkubuj wszystkie probówki FACS na lodzie w ciemności przez 15 minut.
    4. Po inkubacji dodać 4 ml lodowatego HBSS do każdej probówki i odwirować probówki FACS przy 800 x g przez 5 minut, 4 °C.
    5. Po odwirowaniu odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl lodowato zimnym HBSS, z wyjątkiem osadu w probówce oznaczonej DAPI, który jest ponownie zawieszany w 500 μl roztworu ładującego FACS. Trzymanie wszystkich 6 probówek na lodzie w ciemności do momentu sortowania.

6. Sortowanie w sortowniku komórek

UWAGA: Działanie procedury sortowania na cytometrze i oprogramowaniu jest ustandaryzowane ze szczegółową instrukcją dostarczoną przez firmę. Krótko mówiąc, używamy dyszy 100 mikronów przy 20 psi, ustawiamy docelowe stężenie komórek w zakresie 5 - 10 milionów na ml i dostosowujemy wydajność do 70% lub więcej (tj. konflikty utrzymywane poniżej 30%).

  1. Przygotować probówki do zbierania FACS z 500 μl FBS/probówkę zawierającą 100 j./ml penicyliny-streptomycyny.
  2. Dostosuj parametry kompensacji sortera komórek za pomocą pojedynczych probówek kompensacyjnych z punktu 5.2.
    1. Nagraj 10 000 komórek w niebarwionej probówce, aby ustawić ujemną bramkę dla każdej intensywności fluorescencji.
    2. Nagraj 10 000 komórek w innych probówkach do kompensacji pojedynczego zabarwienia, aby ustawić dodatnią bramkę dla każdej intensywności fluorescencji.
      UWAGA: Oprogramowanie automatycznie oblicza parametry kompensacji.
  3. Użyj jednej próbki z kroku 5.1, aby ustawić bramki posortowanych populacji komórek, rejestrując 3 000 komórek. Używając intensywności fluorescencji jako parametrów wykresu osi X i Y, ręcznie bramkuj populację komórek docelowych jako grupę kropek pozornie oddzielonych od innych kropek.
    UWAGA: Ten zestaw bramkowania jest elastyczny i arbitralny w zależności od wymagań badaczy. Jeśli badacze spodziewają się wyższej czystości na podstawie jednego lub więcej markerów, przesuń bramkę wyżej w oparciu o odpowiednią intensywność fluorescencji.
  4. Załaduj probówkę zbiorczą i zacznij sortować docelową populację komórek.
  5. Po posortowaniu trzymaj probówkę zbiorczą na lodzie, aż wszystkie probówki z próbkami będą gotowe.
  6. Dodaj lodowaty C10 do probówki zbiorczej o pojemności do 4 ml, zakręć i odwróć do wymieszania.
  7. Odwirować probówkę zbiorczą o stężeniu 800 x g przez 5 minut, 4 °C, a następnie odessać supernatant, pozostawiając około 200 μl z nietkniętym osadem komórkowym.
  8. Dodać 1 ml lodowatego C10, aby ponownie zawiesić osad komórkowy i przenieść całą zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  9. Odwirować probówkę o pojemności 1,5 ml o stężeniu 800 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C i odessać supernatant, pozostawiając 100 μl z nietkniętym osadem komórkowym.
  10. Posortowane populacje komórek należy przechowywać na lodzie do czasu użycia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naszym celem było wzbogacenie pDC szpiku kostnego o wysoką czystość i bez wpływu innych typów komórek, od myszy podatnych na toczeń MRL/lpr, zarówno w młodym wieku, jak i w starszym wieku, aby zbadać funkcjonalne zmiany pDC dotyczące ich zdolności do wytwarzania IFNα. Pierwszą zastosowaną strategią oczyszczania był MCS, który, jak pokazuje rysunek 1, doprowadził do zaledwie 7,75% czystości po wzbogaceniu. W porównaniu do MCS, FACS wzbogacił pDC o czystość sięgającą 96,4%....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany w tym manuskrypcie służy do wzbogacania o wysoką czystość żywych pDC, które zachowują zdolność do wytwarzania IFNα. Zastosowania tego protokołu obejmują między innymi oczyszczanie pDC i/lub innych komórek jednojądrzastych ze szpiku kostnego MRL/lpr i wszelkich innych szczepów myszy do badań funkcji komórkowych i molekularnych. Kilka krytycznych kroków w tym protokole ma na celu zapewnienie wysokiej żywotności i czystości posortowanego pDC. Pierwszym kluczowym krokiem jest uwolnienie szpiku kostnego z koś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów w związku z publikacją niniejszej pracy.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Laboratorium Cytometrii Przepływowej w Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine za korzystanie z podstawowego urządzenia do cytometrii przepływowej. Prace te były wspierane przez fundusze startowe XML. XL jest stypendystą Stamps Fellow w programie dla absolwentów nauk biomedycznych i weterynaryjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMI 1640gibco firmy life technologies11875-093
Surowica bydlęcapłodu HyCloneSH30396.03
Pirogronian sodugibco firmy life technologies11360-070
MEM aminokwasy endogennegibco firmy life technologies11140-050
HEPESgibco firmy life technologies15630-080
2-merkaptoetanolgibco firmy life technologies21985-023
L-glutamina gibco by life technologies25030-164
Penicylina-Streptomycynagibco by life technologies15140-122
1x Hank' s Zrównoważony roztwór soli gibco by life technologies14175-079
MACS BSA Roztwór podstawowyMiltenyi Biotec130-091-376
MgCl2SIGMAM8266
DNaza ISIGMAD4527
Bufor do lizy czerwonych krwinek (RBC) eBioscience00-4300-54
Gradient gęstości średniGE Healthcare17-1440-02Ficoll-Paque Plus 
przeciw myszom CD19-PEBD Pharmingen 553786
anty-mysie CD11c-PEeBioscience12-0114-82
przeciw myszom CD11b-APC-CY7BD Pharmingen557657
przeciw myszom PDCA-1-FITCeBioscience11-3172-81
przeciw myszom B220-V500 BD Pharmingen561226
DAPIinvitrogenD3571
Zestaw do izolacji komórek sendrytycznych plazmocytoidu II, myszMiltenyi Biotec130-092-786
Cytometr przepływowy BD FACSAria I BD Biosciences643178
BD FACS Diva wersja 6BD Biosciences

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bonner, W. A., Hulett, H. R., Sweet, R. G., Herzenberg, L. A. Fluorescence activated cell sorting. Rev Sci Instrum. 43 (3), 404-409 (1972).
  2. Herzenberg, L. A., et al. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
  3. Brown, M., Wittwer, C. Flow cytometry: principles and clinical applications in hematology. Clin Chem. 46 (8 Pt 2), 1221-1229 (2000).
  4. Laerum, O. D., Farsund, T. Clinical application of flow cytometry: a review. Cytometry. 2 (1), 1-13 (1981).
  5. Alvarez-Barrientos, A., Arroyo, J., Canton, R., Nombela, C., Sanchez-Perez, M. Applications of flow cytometry to clinical microbiology. Clin Microbiol Rev. 13 (2), 167-195 (2000).
  6. Mattanovich, D., Borth, N. Applications of cell sorting in biotechnology. Microb Cell Fact. 5 (12), (2006).
  7. Aldahlawi, A. M., Elshal, M. F., Damiaiti, L. A., Damanhori, L. H., Bahlas, S. M. Analysis of CD95 and CCR7 expression on circulating CD4(+) lymphocytes revealed disparate immunoregulatory potentials in systemic lupus erythematosus. Saudi J Biol Sci. 23 (1), 101-107 (2016).
  8. Cullender, T. C., et al. Innate and adaptive immunity interact to quench microbiome flagellar motility in the gut. Cell Host Microbe. 14 (5), 571-581 (2013).
  9. Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1502-1510 (2012).
  10. Cai, M., et al. DC-SIGN expression on podocytes and its role in inflammatory immune response of lupus nephritis. Clin Exp Immunol. 183 (3), 317-325 (2016).
  11. Blasius, A., et al. A cell-surface molecule selectively expressed on murine natural interferon-producing cells that blocks secretion of interferon-alpha. Blood. 103 (11), 4201-4206 (2004).
  12. Welzel, G., Seitz, D., Schuster, S. Magnetic-activated cell sorting (MCS) can be used as a large-scale method for establishing zebrafish neuronal cell cultures. Sci Rep. 5, 7959(2015).
  13. Valli, H., et al. Fluorescence- and magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and enrich human spermatogonial stem cells. Fertil Steril. 102 (2), 566-580 (2014).
  14. Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69 (5), 698-704 (2001).
  15. Apostolidis, S. A., Lieberman, L. A., Kis-Toth, K., Crispin, J. C., Tsokos, G. C. The dysregulation of cytokine networks in systemic lupus erythematosus. J Interferon Cytokine Res. 31 (10), 769-779 (2011).
  16. Asselin-Paturel, C., Brizard, G., Pin, J. J., Briere, F., Trinchieri, G. Mouse strain differences in plasmacytoid dendritic cell frequency and function revealed by a novel monoclonal antibody. J Immunol. 171 (12), 6466-6477 (2003).
  17. Liao, R., et al. Tacrolimus Protects Podocytes from Injury in Lupus Nephritis Partly by Stabilizing the Cytoskeleton and Inhibiting Podocyte Apoptosis. PLoS One. 10 (7), e0132724(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fluorescence activated Cell SortingPlasmacytoid Dendritic CellsBone Marrow IsolationCell Surface StainingForward Scatter AnalysisSide Scatter AnalysisMagnetic Activated Cell SortingLupus prone MiceIFNalpha ProductionCell Purity Analysis

Powiązane artykuły