Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Donerkowe wstrzyknięcie Escherichia coli w szczurzym modelu odmiedniczkowego zapalenia nerek

7.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54649

⸱

18 lipca 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Case Western Reserve University, 3Department of Urology, Case Western Reserve University, 4Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje szczurzy model chirurgiczny odmiedniczkowego zapalenia nerek wykorzystujący bezpośrednie zakażenie wewnątrznerkowe przez Escherichia coli do miedniczki nerkowej. Procedura eksperymentalna może być wykorzystana do badania patogenezy odmiedniczkowego zapalenia nerek, a także związanego z nim stanu zapalnego i zwłóknienia.

Streszczenie

Odmiedniczkowe zapalenie nerek jest infekcją bakteryjną nerek i najczęściej wywoływane przez Escherichia coli. Nawracające infekcje mogą powodować znaczne zapalenie i zwłóknienie nerek, co ostatecznie prowadzi do pogorszenia czynności nerek. Zanim będzie można wprowadzić ulepszone postępowanie kliniczne i profilaktykę odmiedniczkowego zapalenia nerek, należy stworzyć wiarygodny model zwierzęcy w celu zbadania mechanizmów progresji, nawrotu i skuteczności terapeutycznej. Model infekcji przezcewkowej ściśle naśladuje ludzkie odmiedniczkowe zapalenie nerek, ale wykazuje znaczną zmienność ze względu na zależność od refluksu cewki moczowej w celu transportu bakterii do nerki. W tym artykule przedstawiono szczegółowy protokół chirurgiczny wykonywania iniekcji bakteryjnych do miedniczki nerkowej szczura, który został potwierdzony za pomocą nieinwazyjnego rezonansu magnetycznego (MRI). Korzystając z tego protokołu, zwierzęta są bezpośrednio narażone na pożądane stężenie bakterii E. coli i mogą w pełni wyzdrowieć po zabiegu chirurgicznym przy odpowiedniej opiece pooperacyjnej. Ułatwia to późniejsze podłużne oceny MRI eksperymentalnych modeli zwierzęcych w celu porównania z kontrolami z solą fizjologiczną (pozorowanymi). Dzięki temu podejściu do bezpośredniego dostarczania, nasilenie infekcji jest kontrolowane i ma zastosowanie w mechanistycznych badaniach progresji, a także w opracowywaniu nowych strategii leczenia.

Wprowadzenie

Modele gryzoni zostały wykorzystane do badania licznych objawów chorób u ludzi, w tym odmiedniczkowego zapalenia nerek i infekcji dróg moczowych (ZUM). Zakażenia układu moczowego są globalnym problemem zdrowotnym i mogą dotykać dzieci, mężczyzn i kobiety w każdym wieku. 1,2,3 Początkowa manifestacja ZUM obejmuje zapalenie pęcherza moczowego, a jeśli infekcja wznosi się wzdłuż moczowodu, może dojść do infekcji nerek (odmiedniczkowe zapalenie nerek). W tym samym czasie częstość występowania cukrzycy zbliża się do 400 milionów ludzi na całym świecie. 4,5 Co ważne, częstość występowania ZUM może być do 4 razy wyższa u pacjentów otyłych lub z cukrzycą typu 2, co skutkuje zwiększonym ryzykiem nawrotu infekcji ZUM (rUTI), sepsy, zwłóknienia nerek z powodu odmiedniczkowego zapalenia nerek i dysfunkcji pęcherza moczowego. 6,7,8 Modele gryzoni są ważne w badaniu ZUM, ponieważ obecne terapie antybiotykowe wywołują trwałą, prewencyjną odpowiedź tylko u podgrupy pacjentów z ZUM. Aby poprawić kliniczną opiekę nad pacjentami z ZUM, kluczowymi krokami jest zrozumienie mechanizmu zakażenia dróg moczowych i jego procesów patofizjologicznych od ostrej infekcji, przez stan zapalny, aż po zwłóknienie, a także wpływ cukrzycy typu 2.

Celem ulepszania modeli zwierzęcych jest opracowanie technik, które pozwalają na dokładniejszą ocenę postępu choroby i interwencji terapeutycznych. Zastosowano kilka różnych podejść do wywołania odmiedniczkowego zapalenia nerek u szczurów i/lub myszy w celu zbadania patofizjologii uszkodzenia nerek, wpływu leczenia antybiotykami i innych aspektów naturalnego przebiegu ZUM. Powszechnym podejściem do ustalenia wstecznego ZUM jest cewnikowanie przezcewkowe. 10,11,12,13 Ta metoda wprowadza bakterie przez cewkę moczową do pęcherza moczowego znieczulonych zwierząt. Chociaż technika ta ściśle symuluje odmiedniczkowe zapalenie nerek u ludzi, rzeczywista częstość występowania i wielkość zakażenia odmiedniczkowym zapaleniem nerek może być bardzo zmienna z powodu wielu czynników, w tym braku spontanicznego refluksu moczowodu lub oddawania moczu podczas lub bezpośrednio po inokulacji. 11 W rezultacie, eksperymentalna zmienność w wywoływaniu narastającego odmiedniczkowego zapalenia nerek może ograniczyć użyteczność tego modelu do badania infekcji nerek, jak również strategii terapeutycznych.

Ten raport opisuje szczurzy model chirurgicznego odmiedniczkowego zapalenia nerek, w którym E. coli jest bezpośrednio wstrzykiwana do nerki szczura. Pomimo tego, że ten szczurzy model jest inwazyjny, ilość E. coli dostarczanej do nerki może być skutecznie kontrolowana, co umożliwia silną infekcję nerek i stan zapalny. 14 W ramach tej procedury opisujemy również, w jaki sposób te indukowane infekcje nerek mogą być monitorowane podłużnie za pomocą rezonansu magnetycznego in vivo (MRI).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) na Uniwersytecie Case Western Reserve. Czas trwania opisanego poniżej zabiegu chirurgicznego wynosi około 45-60 min. Sama procedura rezonansu magnetycznego trwa około 15 minut dla każdego punktu czasowego.

1. Znieczulenie

  1. Znieczulij szczura w komorze izofluranu z 2% izofluranem zmieszanym z tlenem, aby ułatwić obsługę i krępowanie zwierząt przed podaniem znieczulenia dootrzewnowego.
  2. Po 3-5 minutach ekspozycji na izofluran sprawdź, czy zwierzę jest znieczulone i nie reaguje na szczypanie palca
    3. .
  3. Dalej uspokoić szczura za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego mieszaniny ksylazyny i ketaminy: 75 mg/kg ketaminy/10 mg/kg ksylazyny. Podczas wykonywania wstrzyknięć dootrzewnowych należy cofnąć igłę, aby upewnić się, że części jelita lub innych ważnych narządów nie zostały nakłute.
  4. Należy wstrzyknąć 2 mg/kg bupiwakainy podskórnie w miejsce nacięcia, aby zapewnić miejscową ulgę w bólu.

2. Przygotowanie pola operacyjnego

  1. Wysterylizuj narzędzia i materiały chirurgiczne przed użyciem ich do operacji i ułóż na podkładce chirurgicznej, aby zapewnić sterylność. Większość instrumentów i materiałów eksploatacyjnych można sterylizować w autoklawie i ponownie używać.
  2. Do wszystkich zabiegów chirurgicznych należy używać sterylnych rękawiczek.
  3. Użyj elektrycznej maszynki do golenia, aby zgolić sierść z prawej strony zwierzęcia. Ogol zwierzę od dołu klatki piersiowej do górnej części tylnej nogi, zapewniając duży obszar wolny od włosów na nacięcie.
  4. Umieść zwierzę na sterylnej podkładce chirurgicznej, aby odizolować zdezynfekowany obszar od otaczających obszarów.
  5. Szoruj skórę środkiem dezynfekującym, takim jak powidon, jod lub betadyna. Rozpocznij szorowanie od środka pola operacyjnego i przesuwaj się na zewnątrz w sposób okrężny. Powtórz co najmniej trzy razy z nowym wacikiem jodu powidonu lub betadyny.
  6. Wyszoruj miejsce operacji wacikami nasączonymi 70% alkoholem, aż skóra będzie czysta, ponieważ jod może być toksyczny po wchłonięciu.

3. Zabieg chirurgiczny

  1. Utrzymuj tę procedurę w warunkach aseptycznych.
  2. Ułóż znieczulone zwierzę na ciepłym łóżku grzewczym w lewej bocznej pozycji odleżynowej z prawym bokiem skierowanym do góry.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 35-37 °C, aby zapobiec hipotermii. To łóżko grzewcze powinno być również sterylizowane w razie potrzeby, aby utrzymać warunki aseptyczne.
  3. Wyczuj klatkę piersiową i wykonaj małe 2-3 cm prawe nacięcie grzbietowe zaotrzewnowe za pomocą sterylnego ostrza skalpela w rozmiarze 10, zaczynając od dołu klatki piersiowej.
  4. Umieść sterylną gazę wzdłuż obu stron nacięcia.
  5. Wypreparuj tkankę podskórną, tłuszcz i mięśnie, aby uwidocznić i uzyskać dostęp do jamy brzusznej. Użyj nożyczek Mayo z zakrzywionym ostrzem, aby umożliwić głębszą penetrację rany i przeciąć grube tkanki.
  6. Gdy wątroba jest wyraźnie widoczna i dostępna, użyj kleszczy, aby cofnąć wątrobę do góry.
  7. Używając drugiej pary kleszczy w drugiej ręce, odsłoń prawą nerkę tak, aby znajdowała się tuż poza jamą brzuszną.
  8. Użyj palca wskazującego i kciuka lewej ręki, aby utrzymać nerkę na miejscu. Prawą ręką powoli i równomiernie wstrzyknij 0,1 ml roztworu UTI89 E. coli (stężenie między 1 x 108-1 x 109) ze sterylnej strzykawki do miedniczki nerkowej (która wygląda jak biały pęcherzyk)15.
    UWAGA: Przygotuj miano bakterii zgodnie z opisem w reference15.
  9. Umieścić pasek wchłanialnego hemostatu na igle, aby zapobiec odpływowi inokulum do otrzewnej. Powoli wyciągnąć igłę z miedniczki nerkowej.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby nie przekłuć ani nie zainfekować otaczających tkanek, powodując zakażenia poza celem i/lub powikłania.
  10. Użyj większej strzykawki, aby dokładnie przepłukać nerkę zwykłą solą fizjologiczną przed umieszczeniem jej z powrotem w jamie brzusznej.

4. Szwy

Uwaga: Szew, który będzie zakopany w tkankach, powinien być 4-0 niewchłanialnymi szwami plecionymi. Do powierzchni ciała można stosować szwy wchłanialne lub monofilamentowe.

  1. Umieść szwy równomiernie i jak najbliżej krawędzi tkanki, aby zapobiec utrudnieniu przepływu krwi; zazwyczaj nie jest konieczne więcej niż 0,3 cm od krawędzi.
  2. Chwyć skórę i lekko ją naciągnij za pomocą kleszczy o drobnych zębach, a następnie obróć uchwyt igły do pozycji pronacji, przygotowując się do przekłucia skóry.
  3. Przebić igłę przez całą grubość skóry, supinując nadgarstek, aby obrócić igłę i przeciągnąć ją przez skórę.
  4. Powtórz ten proces dla krawędzi skóry znajdującej się najbliżej osoby wykonującej zabieg.
  5. Zaciśnij szwy na tyle, aby przeciwstawiły krawędzie tkanki. Każde ściślejsze utrudni dopływ krwi, spowolni gojenie się ran i może spowodować rozejście się.
  6. Zawiąż szew za pomocą kwadratowych węzłów, tak jakby był to zwykły przerywany ścieg, z wyjątkiem tego, że odcinane jest tylko krótkie pasmo, pozostawiając ogon o długości około 3-4 mm.
  7. Po zawiązaniu pierwszego ściegu przygotuj się do umieszczenia drugiego ściegu w odległości około 3 mm od pierwszego i kontynuuj szew bieżący.
  8. Po osiągnięciu końca nacięcia nie przeciągaj całkowicie ostatniego szwu. Zamiast tego użyj pętli, która jest trzymana z uchwytem igły, jako krótkiego pasma, aby związać dystalny koniec zamknięcia szwu.
  9. Za pomocą opasek na instrumenty zawiąż szew za pomocą kwadratowych węzłów. Powoduje to, że 3 pasma wystają z zakończonego węzła na dystalnym końcu.

5. Odzyskiwanie zwierząt

  1. Wstrzyknąć 2.1 mg / kg Johimbina dootrzewnowo po zabiegu w celu odwrócenia znieczulenia. Oczekuje się, że zwierzęta w pełni wyzdrowieją po zabiegu chirurgicznym po 3-5 godzinach.
  2. Po operacji trzymaj zwierzę na poduszce grzewczej (aby uniknąć hipotermii) i chłonnej miękkiej pościeli.
  3. Nawadniaj go płynami doustnymi lub pozajelitowymi do czasu, aż będzie mógł wrócić do normalnego karmienia (w ciągu 24 godzin). Natychmiast po zabiegu należy wstrzyknąć około 0,6 ml normalnego roztworu soli fizjologicznej, aby ograniczyć skutki odwodnienia.
  4. Zapewnij analgezję zgodnie z opisem w zatwierdzonym przez IACUC Protokole Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania. Wstrzyknąć podskórnie 5 mg/kg karprofenu w celu leczenia bólu.
  5. Regularnie monitoruj nacięcia pod kątem obrzęku, wysięku, bólu lub rozejścia się.

6. Walidacja za pomocą rezonansu magnetycznego

  1. Przeprowadzanie eksperymentów MRIin vivo na skanerach MRI dla małych zwierząt o dużym polu.
  2. Wywołać znieczulenie 3% izofluranem w tlenie i ustawić zwierzę z prawą nerką w izocentrum w skanerze MRI i odpowiedniej cewce o częstotliwości radiowej. Zapewnić zwierzętom 1-2% znieczulenie izofluranem w sposób ciągły przez cały proces obrazowania za pomocą stożka nosowego.
    UWAGA: W przypadku obrazów MRI in vivo pokazanych na rysunku 1 wykorzystano cewkę objętościową wielkości szczura (średnica wewnętrzna = 72 mm).
  3. Stosować system monitorowania i kontroli zwierząt, aby utrzymać częstość oddechów każdego zwierzęcia (40-60 oddechów/min) i temperaturę ciała (35 ± 1 °C).
  4. Użyj wielowarstwowej, wieloechowej akwizycji MRI z echem spinowym, aby uzyskać wysokiej rozdzielczości, osiowe obrazy T2 zarówno zakażonych, jak i kontrolnych nerek. Typowe parametry akwizycji MRI to czas powtarzania = 5 000 ms, czas echa = 40 ms, grubość warstwy = 2,0 mm, rozdzielczość przestrzenna w płaszczyźnie = 200 μm, 3 średnie sygnały i czas akwizycji 8 min.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Techniki obrazowania medycznego dają możliwość nieinwazyjnej oceny ZUM oraz skuteczności terapeutycznej. W związku z tym wykorzystano MRI do walidacji indukcji ostrej infekcji po wstrzyknięciu 1-2 x 107 UTI89 E. coli oraz do wizualizacji zmian w nerce przed i po operacji. Rysunek 1a-b przedstawia progresywnie powiększający się obszar infekcji nerki (żółte strzałki). Obrazy MRI uzyskane dla każdego zwierzęcia w 1. i 4. dobie po zakażeniu pomagają schara...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wstępujące ostre odmiedniczkowe zapalenie nerek u gryzoni (tj. myszy i szczurów) może być wywołane przez cewnikowanie przezcewkowe. 16,17,18 Ta metoda infekcji przezcewkowej jest korzystna, ponieważ jest nieinwazyjna i naśladuje ludzką patofizjologię infekcji wstępującej. 17,18,19,20 Jednak metoda ta może również cierpieć z powodu nieregularnych wskaźników infekcji i zmiennego dawkowania <...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych innych ujawnień.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować za wsparcie NIH/NIDDK K12 DK100014 (Lan Lu), Case Comprehensive Cancer Center (NIH/NCI P30 CA43703) oraz Clinical and Translation Science Collaborative of Cleveland (NIH/NCATS UL1 TR000439).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Podkładka absorbującaFisher14-127-47
Sterylna bawełniana gazaFisher22-415-469
Lateksowe rękawice chirurgiczneHenry Schein Animal Health21540
Zakrzywione nożyczki majonezoweFisherS17341
Proste przodkiFisher08-895
Rękojeść skalpela Fisher08-913-5
Sterylne ostrza skalpelaFisher53220
1 ml Strzykawka Luer-LokBD Biosciences309628Do iniekcji bakteryjnych
20 ml Strzykawka Luer-Lok BD Biosciences301031Do mycia solą fizjologiczną
HemostatSeneca Medical240267
23 G 3/4 cala. Igła BD Biosciences305143
30 G 1 cal. Igła BD Biosciences305128
Strzykawka insulinowa U-100Exel International 25846Do wstrzykiwań leków
IsofluraneHenry Schein Animal Health050033
XylazineHenry Schein Animal Health33197Inject IP
KetaminaPatterson Vetrinary 07-881-9413Wstrzyknięcie
johimbiny IP (Atipamezol)Patterson Vetrinary 07-867-7097Wstrzyknięcie IP po zabiegu
Bupiwakaina (Marcaine)Patterson Vetrinary 07-890-4584Wstrzyknąć SQ w miejsce nacięcia 
4-0 Chromowy szew jelitowyEthicon Inc.U203H
4-0 Pleciony szew VicrylEthicon Inc.J304H
1 ml SubQ StrzykawkaBD Biosciences309597
E. coli  UTI89 lub CFT073 ATCC700928
Surgicel Wchłanialny hemostatEthicon Inc.ETH1951CS 
Rezonans magnetyczny Biospec 9.4T Bruker 94/20 USR

Bibliografia

  1. Saliba, W., Barnett-Griness, O., Rennert, G. The association between obesity and urinary tract infection. Eur J Intern Med. 24 (2), 27-31 (2012).
  2. Semins, M., Shore, A., Makary, M., Weiner, J., Matlaga, B. The impact of obesity on urinary tract infection risk. Urology. 79 (2), 266-269 (2011).
  3. Zilberberg, M., Shorr, A. Secular trends in gram-negative resistance among urinary tract infection hospitalizations in the United States, 2000-2009. Infect Control Hosp Epidemiol. 34 (9), 940-946 (2013).
  4. Whiting, D., Guariguata, L., Weil, C., Shaw, J. IDF diabetes atlas: global estimates of the prevalence of diabetes for 2011 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 94 (3), 311-321 (2011).
  5. Wild, S., Roglic, G., Green, A., Sicree, R., King, H. Global prevalence of diabetes: estimates for the year 2000 and projections for 2030. Diabetes Care. 27 (5), 1047-1053 (2004).
  6. Ma, D., Gulani, V., Seiberlich, N., Liu, K., Sunshine, J., Duerk, J., et al. Magnetic resonance fingerprinting. Nature. 495 (7440), 187-192 (2013).
  7. Lu, L., Sedor, J., Gulani, V., Schelling, J., O'Brien, A., Flask, C. A., et al. Use of diffusion tensor MRI to identify early changes in diabetic nephropathy. Am J Nephrol. 34 (5), 476-482 (2011).
  8. Rosen, D., Hooton, T., Stamm, W., Humphrey, P., Hultgren, S. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329(2007).
  9. Torine, L. A. Urinary tract infection: diabetic women's strategies for prevention. Br J Nurs. 20 (13), 791-792 (2011).
  10. Rosen, D., Hung, C., Kline, K., Hultgren, S. Streptozocin-induced diabetic mouse model of urinary tract infection. Infect Immun. 76 (9), 4290-4298 (2008).
  11. Larsson, P., Kaijser, B., Mattsby-Baltzer, I., Olling, S. An experimental model for ascending acute pyelonephritis caused by Escherichia coli or proteus in rats. J Clin Pathol. 33 (4), 408-412 (1980).
  12. Gupta, R., Ganguly, N., Ahuja, V., Joshi, K., Sharma, S. An ascending non-obstructive model for chronic pyelonephritis in BALB/c mice. J. Med. Microbiol. 43 (1), 33-36 (1995).
  13. Fernandes, P., Shipkowitz, N., Bower, R. Murine models for studying the pathogenesis and treatment of pyelonephritis. Adv. Exp. Med. Biol. 224, 35-51 (1987).
  14. Kaye, D. The effect of water diuresis on spread of bacteria through the urinary tract. J. Infect. Dis. 124 (3), 297-305 (1971).
  15. Fierer, J., Tainer, L., Braude, A. Bacteremia in the pathogenesis of retrograde E. coli pyelonephritis in the rat. Am. J. Pathol. 64 (2), 443-456 (1971).
  16. Nickel, J., Olson, M., Costerton, J. Rat model of experimental bacterial prostatitis. Infection. 19 (3), S126-S130 (1991).
  17. Hagberg, L., Engberg, I., Freter, R., Olling, S., Eden, C. Ascending, unobstructed urinary tract infection in mice caused by pyelonephritogenic Escherichia coli of human origin. Am Soc Microbiol. 40 (1), 273-283 (1983).
  18. Kurosaka, Y., Ishida, Y., Yamamura, E., Takase, H., Otani, T., Kumon, H. A non-surgical rat model of foreign body-associated urinary tract infection with Pseudomonas aeruginosa. Microbiol. Immunol. 45 (1), 9-15 (2001).
  19. Anderson, B., Jackson, G. Pyelitis, an important factor in the pathogenesis of retrograde pyelonephritis. J Exp Med. 114 (3), 375-384 (1961).
  20. Anderson, J. Vesico-ureteric reflux. J R Soc Med. 55 (6), 419-426 (1962).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Model odmiedniczkowego zapalenia nerekwstrzykni cie Escherichia colimiednica nerkowa szczuraprotok chirurgicznyobrazowanie rezonansem magnetycznyminfekcja bakteryjnazapalenie nerekterapia antybiotykowanawracaj ca infekcjaopieka pooperacyjna
Donerkowe wstrzyknięcie Escherichia coli w szczurzym modelu odmiedniczkowego zapalenia nerek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.