Artykuł metodologiczny

Testy do badania roli witronektyny w adhezji bakterii i oporności surowicy

DOI:

10.3791/54653

⸱

16 października 2018

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Microbiology, Department of Translational Medicine, Lund University, 2Department of Molecular Biology, Umea University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten raport opisuje protokoły charakteryzujące interakcje między białkami zewnętrznej błony bakteryjnej a ludzkim regulatorem dopełniacza, witronektyną. Protokoły mogą być wykorzystywane do badania reakcji wiązania i funkcji biologicznej witronektyny w dowolnym gatunku bakterii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakterie wykorzystują regulatory dopełniacza jako sposób na uniknięcie odpowiedzi immunologicznej gospodarza. W tym miejscu opisujemy protokoły oceny roli, jaką odgrywa pozyskiwanie witronektyny na powierzchni komórki bakteryjnej w odporności na układ odpornościowy gospodarza. Eksperymenty z wykorzystaniem cytometrii przepływowej pozwoliły zidentyfikować witronektynę z ludzkiego osocza jako ligand dla białka H błony zewnętrznej receptora bakteryjnego Haemophilus influenzae typu f. Zastosowano test immunoenzymatyczny w celu scharakteryzowania interakcji białko-białko między oczyszczonym rekombinowanym białkiem H a witronektyną, a powinowactwo wiązania oceniono za pomocą interferometrii warstwy biologicznej. Biologiczne znaczenie wiązania witronektyny z białkiem H na powierzchni komórki bakteryjnej w unikaniu odpowiedzi immunologicznej gospodarza potwierdzono za pomocą testu oporności surowicy z normalną i zubożoną w witronektynę surowicą ludzką. Znaczenie witronektyny w adherencji bakteryjnej analizowano przy użyciu szkiełek podstawowych z powłoką witronektyny i bez niej, a następnie barwienia metodą Grama. Na koniec zbadano adhezję bakteryjną do monowarstw komórek nabłonka wyrostka zębodołowego człowieka. Opisane tutaj protokoły można łatwo dostosować do badania dowolnych gatunków bakterii, które są przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Witronektyna (Vn) jest ważną ludzką glikoproteiną zaangażowaną w utrzymanie homeostazy poprzez regulację systemu fibrynolitycznego. Vn działa również jako regulator dopełniacza poprzez hamowanie końcowego szlaku dopełniacza podczas tworzenia kompleksu C5b6-7 i polimeryzacji C9. Wykazano, że kilka patogenów bakteryjnych rekrutuje Vn na powierzchnię komórki jako sposób na odporność na osadzanie się dopełniacza1,2,3. Ponadto Vn funkcjonuje jako cząsteczka "warstwowa" między bakteriami a receptorami komórek nabłonka gospodarza, promując w ten sposób przyleganie i internalizację patogenów2,4,5. Wiązanie Vn z powierzchnią komórki bakteryjnej odbywa się za pośrednictwem innych, obecnie niezidentyfikowanych białek. Pełne wyjaśnienie funkcjonalnej roli wiązania Vn w unikaniu odpowiedzi immunologicznej węża będzie zatem wymagało identyfikacji białek rekrutujących Vn.

Pierwszym krokiem w identyfikacji białek wiążących Vn jest sprawdzenie, czy interesujący patogen może związać oczyszczony Vn. Cytometria przepływowa jest wygodną i prostą metodą do określenia, czy Vn jest związany z komórkami patogenu. W tym badaniu oceniliśmy wiązanie Vn z różnymi izolatami klinicznymi Haemophilus influenzae typu f (Hif)6. Opisana tutaj metoda ma charakter ilościowy i może być stosowana do rozróżniania zdolności wiązania wielu różnych szczepów bakterii. W poprzednim badaniu scharakteryzowaliśmy białko H (PH) Hif jako białko wiążące Vn7. W związku z tym w niniejszym badaniu porównano potencjał wiązania Vn mutantów Hif i Hif M10Δlph typu dzikiego (WT) przy użyciu opisanych protokołów.

Po ustaleniu, że patogen wiąże Vn, drugim krokiem jest scharakteryzowanie proteomu powierzchniowego w celu zidentyfikowania potencjalnych białek wiążących Vn. W tym celu można zastosować różne podejścia8,9, ale te metodologie nie są opisane w tym raporcie. Metodą najbardziej odpowiednią do badania interakcji białko-białko jest rekombinowana ekspresja wybranych białek powierzchniowych bakterii w E. coli i oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa. Tutaj używamy PH i jego interakcji molekularnej z Vn, aby zilustrować metodę. Interakcje między rekombinowanymi PH i Vn scharakteryzowano za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA)7 oraz niedawno opracowanej techniki bezznacznikowej znanej jako interferometria warstwy biologicznej (BLI)10,11. Podczas gdy testy ELISA mogą być stosowane do potwierdzania interakcji białko-białko, BLI dostarcza szczegółowych danych dotyczących parametrów kinetycznych oddziaływań.

Aby zbadać funkcjonalną rolę Vn w przyleganiu bakterii, można wykorzystać dwa różne testy. Pierwszy opisany tutaj test polega na bezpośrednim pomiarze przylegania bakterii do powierzchni szklanych pokrytych Vn, podczas gdy drugi test bada przyleganie do powierzchni komórek nabłonka. W pierwszym teście szkiełka podstawowe pokryto Vn, a wiązanie WT lub zmutowanych szczepów Hif oceniano za pomocą barwienia metodą Grama i mikroskopii. Ta technika pozwala łatwo rozróżnić bakterie na podstawie zdolności do wiązania Vn12. Adhezja bakterii do komórek ssaków została następnie przeanalizowana poprzez dodanie hodowanych bakterii do monowarstwy komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu II; przywiązanie bakterii oceniano, zliczając liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU). Bakterie przylegające i zinternalizowane można odróżnić na podstawie obecności lub braku Vn4,13.

Rola pozyskiwania Vn w oporności bakterii w surowicy została oceniona za pomocą testu zabijania surowicy (tj. aktywności bakteriobójczej surowicy). Aby ocenić znaczenie nabycia Vn w oporności surowicy, porównano aktywność bakteriobójczą surowicy zubożonej w Vn (VDS) z aktywnością normalnej surowicy ludzkiej (NHS). Zastosowana metoda pozwala na łatwe rozróżnienie bakterii wiążących Vn i niewiążących na podstawie oporności surowicy. Użyliśmy tej metody do zbadania roli Vn w oporności surowicy na kilka patogenów bakteryjnych4,12.

Opisano liczne metody badania interakcji gospodarz-patogen. W tym miejscu opisujemy zestaw protokołów, które można łatwo dostosować do badania dowolnego patogenu w celu oceny roli Vn w patogenezie. Przetestowaliśmy te protokoły przy użyciu różnych patogenów, a Hif został wybrany jako przykład do tego raportu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Analiza Vn jako bakteryjnego liganda białek powierzchniowych

  1. Wykrywanie wiązania Vn na powierzchni bakterii za pomocą cytometrii przepływowej
    UWAGA: W cytometrii przepływowej użyliśmy rozpraszania bocznego i rozpraszania do przodu do bramowania zdarzeń dodatnich. Aby zbadać interakcje z Vn, izolaty kliniczne Hif (n = 10) 7 zostały wybrane razem z E. coli BL21 (DE3) jako kontrola negatywna (Rysunek 1A).
    1. Kultura Hif izoluje klinicznie w pożywce do infuzji mózgowo-sercowej (BHI) uzupełnionej 10 μg/ml NAD i heminą w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Użyj pożywki Luria-Bertani do hodowli E. coli14. Zebrać Hif w połowie fazy logarytmicznej (OD600 = 0,3)15, i ponownie zawiesić bakterie w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS), pH 7,2, zawierającej 1% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (bufor blokujący; PBS-BSA). Dostosować zawiesinę do 109 jtk/ml.
    2. Przenieść podwielokrotności zawierające 5 x 106 CFU do probówek okrągłodennych z polistyrenu o pojemności 5 ml (12 x 75 mm2) i dodać 1 ml buforu blokującego. Odwirować zawiesinę w stężeniu 3 500 × g w temperaturze pokojowej (RT)16 przez 5 minut, aby osad bakterii, a następnie ostrożnie zassać, aby usunąć supernatant bez naruszania osadu.
    3. Zawiesić osady bakteryjne w 50 μl buforu blokującego zawierającego 250 nM Vn i inkubować próbki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej bez wstrząsania. Po inkubacji osadzać bakterie przez odwirowywanie przy 3,500 x g przez 5 minut, a następnie umyć granulki trzykrotnie za pomocą PBS i podobnych etapów wirowania.
    4. Do osadu bakteryjnego dodać 50 μl pierwotnych owczych przeciwciał poliklonalnych przeciwko ludzkiemu Vn (pAbs) w rozcieńczeniu 1:100 w PBS-BSA. Inkubować zawiesinę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie trzykrotnie przemyć bakterie PBS w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał (jak opisano w kroku 1.1.3).
    5. Następnie dodać 50 μl PBS-BSA zawierającego sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) pAb przeciwko owcom osła (rozcieńczenie 1:100) i inkubować w temperaturze suchej atk przez 1 godzinę w ciemności.
    6. Przygotować ślepą próbę kontrolną poprzez inkubację bakterii z samym buforem blokującym i pAb bez Vn.
    7. Przemyć bakterie trzykrotnie 1 ml buforu blokującego i osadzić zawiesinę przez odwirowanie, jak opisano w ppkt 1.1.2. Na koniec ponownie zawiesić osad bakteryjny za pomocą 300 μl PBS i przeanalizować za pomocą cytometrii przepływowej7.
  2. Analiza ELISA interakcji między rekombinowanym PH a Vn
    UWAGA: Należy dołączyć kontrolki, aby wykluczyć niespecyficzne powiązania. Ludzki czynnik H (FH) lub białko wiążące C4b (C4BP) są stosowane odpowiednio jako kontrole pozytywne i ujemne.
    1. Rozcieńczyć każde z ludzkich białek (Vn, FH i C4BP) oddzielnie do 50 nM w Tris-HCl, pH 9,0 (bufor otoczkowy). Dozować 100 μl roztworu białkowego do każdego dołka płytki do mikromiareczkowania Polysorp. Zamknąć płytki pokrywką i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc (16 godzin), aby ułatwić unieruchomienie białka na dołkach na płytkach do mikromiareczkowania.
    2. Wylać roztwór z płytki do mikromiareczkowania, przechylając ją do góry nogami nad zlewem i umyć studzienki trzykrotnie 300 μl PBS/studzienkę. Zatkać powlekane studzienki na 1 godzinę w temperaturze pokojowej z PBS zawierającym 2,5% (w/v) BSA (PBS-BSA).
    3. Po usunięciu roztworu blokującego przemyć studzienki trzykrotnie 300 μl PBS zawierającego 0,05% (v/v) Tween 20 (PBST) na studzienkę. Dodać 100 μl rekombinowanego pH znakowanego His o stężeniu 50 nM do każdej studzienki próbki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze suchej. W studzienkach kontrolnych dodać tylko 100 μl PBS-BSA.
      UWAGA: Gen lph kodujący PH z Hif został amplifikowany metodą PCR i sklonowany do wektora ekspresyjnego pET26b, który dodaje znacznik 6× Hisa na C-końcu eksprymowanego białka. Wektor rekombinowany przekształcono w E. coli BL21(DE3) w celu ekspresji. Żywica Ni-NTA została użyta do oczyszczenia rekombinowanego białka15.
    4. Odrzucić roztwór białkowy i usunąć niezwiązane białka, przemłukując studzienki trzykrotnie 300 μl PBST na studzienkę. Dodać 100 μl PBS-BSA zawierającego anty-His pAbs sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) (rozcieńczenie 1:10 000) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    5. Przygotować 20 mM roztwór A, rozpuszczając tetrametylobenzydynę w roztworze 5% acetonu i 45% metanolu. Aby przygotować roztwór B, rozpuść 19,2 g kwasu cytrynowego w 1000 mlH2O, dostosuj pH do 4,25 przez dodanie KOH, a następnie dodaj 230 μl 30%H2O2. Przechowuj oba roztwory w ciemności w RT. Tuż przed użyciem wymieszaj 500 μl roztworu B z 9,5 ml roztworu A, aby przygotować odczynnik do wykrywania ELISA.
    6. Przemyć studzienki trzykrotnie 300 μl PBST na studzienkę i wykryć kompleksy antygen-przeciwciało, dodając 100 μl odczynnika wykrywającego ELISA do każdej studzienki.
    7. Dodać 50 μl 1 M H2SO4 / studzienkę, aby zatrzymać reakcję. Zmierzyć gęstość optyczną studzienek przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
  3. Badanie kinetyki oddziaływań rekombinowanych PH i Vn za pomocą BLI
    1. Unieruchomić ludzkiego Vn na czujnikach reagujących aminami za pomocą metody sprzężenia aminowego, zgodnie z wytycznymi producenta11.
    2. Za pomocą PBS seryjnie rozcieńczyć ligand (rekombinowany PH) od 0 do 4 μM i przenieść otrzymane roztwory na 96-dołkową czarną płytkę do mikromiareczkowania z płaskim dnem. Przeprowadź eksperyment w temperaturze 30 °C za pomocą instrumentu BLI17.
    3. Załaduj folder danych do oprogramowania do analizy danych BLI. Wybierz opcję "wybór czujnika". Następnie wybierz "studnię referencyjną" (czujnik z powłoką Vn w PBS) do odejmowania.
    4. Wybierz opcję "wyrównaj oś Y do linii bazowej" i wybierz opcję "korekcja międzyetapowa i wyrównaj do asocjacji". Naciśnij "przetwarzaj dane", co automatycznie otworzy zakładkę analizy.
    5. Na karcie analizy wybierz opcję "asocjacja i dysocjacja" w obszarze dopasowania krzywej. Wybierz model 'Wiązanie 1:1 i mocowanie globalne'. Naciśnij 'dopasuj krzywą' i wyeksportuj dane dopasowania17.

2. Charakterystyka roli Vn w adherencji bakteryjnej

  1. Badanie przylegania bakterii do powierzchni szklanych powlekanych Vn
    1. Przygotować roztwór Vn o stężeniu 2 μg/ml w PBS i odpipetować 10 μl tego roztworu na szklane szkiełko mikroskopowe w postaci pojedynczej kropli. Pozostaw kroplę do wyschnięcia na szkiełku przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Pokryj szkiełko albuminą surowicy ludzkiej (HSA) jako kontrolą ujemną.
    2. Umyć szkiełka szklane pokryte białkiem trzy razy, zanurzając je na dwie sekundy w zlewce zawierającej PBS w celu usunięcia nadmiaru niepowlekanego białka. Dodać 20 ml świeżej kultury Hif (opisanej w kroku 1.1.1) do sterylnej plastikowej płytki Petriego i zanurzyć szkiełka podstawowe pokryte Vn/HSA w pożywce hodowlanej. Inkubować szalki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z wytrząsaniem przy 20 obr./min.
      UWAGA: Hif M10 i Hif M10Δlph uprawiano w płynnym podłożu BHI lub na czekoladowych płytkach agarowych. Pożywkę dla mutanta lph uzupełniono o 10 μg/ml kanamycin15.
    3. Po inkubacji usunąć wszelkie niezwiązane bakterie, zanurzając szkiełka trzykrotnie w zlewce wypełnionej PBS. Wizualizacja bakterii za pomocą barwienia metodą Grama, zgodnie z opisem.
      1. Usuń nadmiar PBS z każdego szkiełka, przechylając je i dotykając krawędzią bibuły. Suszyć szkiełka na powietrzu przez 3-5 minut w temperaturze pokojowej i naprawić przylegające bakterie, przesuwając każde szkiełko trzy razy nad płomieniem.
      2. Przytrzymaj szkiełko dwoma palcami za krawędzie na tacy barwiącej, a następnie dodaj 3–4 krople (200–300 μl) 2,3% roztworu fioletu krystalicznego. Odczekaj 60 sekund, a następnie umyj szkiełka pod delikatnym strumieniem wody z kranu przez 3–4 sekundy.
      3. Dodaj 3-4 krople 0,33% roztworu jodu na szkiełka. Odczekaj 1 minutę, a następnie spłucz szkiełko pod delikatnym strumieniem wody z kranu. Ostrożnie osusz szkiełka bibułą.
      4. Na szkiełko podstawowe dodaj 3–4 krople roztworu odbarwiającego zawierającego 75% alkoholu izopropylowego i 25% acetonu. Po 5–10 s umyj szkiełko pod delikatnym strumieniem wody z kranu.
      5. Dodać 3-4 krople (200-300 μl) zasadowego roztworu karbolfuksyny. Odczekaj 1 minutę, a następnie spłucz szkiełka pod delikatnym strumieniem wody z kranu. Osuszyć szkiełka za pomocą bibuły.
      6. Wizualizuj bakterie pod mikroskopem świetlnym, wybierając soczewkę obiektywu z olejem o powiększeniu 100X18. Porównaj przyleganie Hif WT i zmutowanych bakterii do powierzchni szklanych pokrytych Vn i HSA.
  2. Badanie zależnego od Vn przylegania bakterii do komórek nabłonka
    UWAGA: Ten skuteczny test przylegania został użyty w naszych poprzednich badaniach4,7.
    1. Hodowla komórek A549 (komórki nabłonka pęcherzyków płucnych typu II) w kolbie do hodowli tkankowej o długości 75cm2 z pożywką F12 uzupełnioną 10% (obj./obj.) płodową surowicą cielęcą (FCS) (kompletna pożywka) i 5 μg/ml gentamycyny. Inkubować kolbę w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 3 dni, aż do uzyskania 80% konfluencji (konfluencję można oszacować, wizualizując pokrycie powierzchni komórek za pomocą mikroskopu odwróconego). Poniższe cztery kroki opisują, jak przygotować komórki nabłonkowe do testu19,20.
      1. Przemyć monowarstwę komórek w kolbie dwukrotnie 20 ml PBS, delikatnie obracając. Aby oderwać komórki od powierzchni kolby, dodać 2 ml roztworu enzymu oddzielającego komórki i inkubować kolbę przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Postukać w kolbę dłonią, aby oderwać wszystkie komórki od plastikowej powierzchni. Pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby rozproszyć grudki komórek.
      2. Dodać 18 ml kompletnej pożywki F12 do kolby i przenieść całą zawiesinę komórek do sterylnej probówki Falcon o pojemności 50 ml. Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut przy 200 x g w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml kompletnej pożywki F12.
      3. Usunąć 10 μl zawiesiny komórek i umieścić ją w probówce Eppendorfa, a następnie dodać 90 μl roztworu błękitu trypanowego. Załadować próbkę do hemocytometru (głębokość 0,1 mm) po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego.
      4. Policz wszystkie żywe komórki w obszarach A, B, C i D (każde pole składa się z 16 kwadratów, a każdy kwadrat ma powierzchnię 0,0025 mm2), a następnie oblicz średnią liczbę komórek ([A+B+C+D]/4). Oblicz liczbę komórek na mililitr, korzystając z następującego równania:
        Żywe komórki/ml = średnia liczba komórek × 104 × współczynnik rozcieńczenia20.
        UWAGA: W tym przypadku współczynnik rozcieńczenia wynosi 10.
      5. Rozcieńczyć zawiesinę komórek do 5,0 x 103 komórek/ml za pomocą kompletnej pożywki zawierającej 5 μg/ml gentamycyny. Dozować 500 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli komórek. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w 5% CO2 aż do 90% zlewania się komórek.
    2. Przed zakażeniem bakteryjnym należy usunąć pożywkę z dołków i dodać pożywkę F12 (bez FCS), a następnie inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
    3. Przemyć monowarstwę komórek trzykrotnie 500 μl PBS w temperaturze pokojowej temperatury. Umieścić płytkę na lodzie i dodać 100 μl wstępnie schłodzonej pożywki F12 zawierającej 10 μg/ml Vn. Inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. W przypadku studzienek kontrolnych dodaj tylko pożywkę F12.
    4. Po inkubacji odrzucić roztwór, pipetując i dwukrotnie przemyć warstwę komórkową 1 ml PBS w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić kulturę świeżo wyhodowanego Hif M10 (krok 1.1.1) w pożywce F12 (2×108 jtk/ml). Dodać 100 μl tej zawiesiny bakteryjnej do każdej studzienki i inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Każda studzienka zawiera około 2 x 105 komórek A549. W przypadku infekcji dodano 2 x 107 bakteryjnych CFU, co odpowiada wielokrotności infekcji wynoszącej 100.
    5. Usunąć pożywkę przez pipetowanie i trzykrotnie przemyć komórki nabłonkowe A549 PBS. Dodać 50 μl/basenik roztworu oddzielającego komórki i inkubować płytkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    6. Następnie dodaj 50 μl kompletnej pożywki F12 do dołka, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Przenieść komórki nabłonkowe (≈100 μl [tj. całą objętość]) z każdej studzienki do szklanej probówki o pojemności 6 ml zawierającej cztery szklane kulki. Lizuj komórki w temperaturze pokojowej, wirując przez 2 minuty.
    7. Rozcieńczyć 10 μl lizatu komórkowego 100-krotnie, dodając 10 μl lizatu do 990 μl pożywki F12. Umieścić 10 μl rozcieńczonej próbki na płytce z agarem czekoladowym.
    8. Inkubować płytkę z agarem czekoladowym w temperaturze 37 °C przez noc, a następnie policzyć kolonie. Każda kolonia reprezentuje jedną jtk.

3. Analiza zależnej od Vn odporności na bakteriobójcze działanie ludzkiej surowicy

  1. Kup NHS ze źródła komercyjnego. Przygotuj VDS zgodnie z wcześniejszym opisem12. Uzupełnij VDS o 180 nM Vn, co odpowiada Vn obecnemu w NHS.
  2. Przygotować surowicę inaktywowaną termicznie (HIS) poprzez ogrzewanie NHS w temperaturze 56 °C przez 30 minut w celu inaktywacji białek dopełniacza.
    UWAGA: Optymalne stężenie w surowicy (5%) i czas inkubacji (15 min) dla testu opisanego w krokach 3.3–3.7 określono empirycznie dla Hif15; Parametry te mogą się różnić w przypadku innych patogenów bakteryjnych.
  3. Hodowla bakterii (w tym przypadku Hif M10 i zmutowany Hif M10Δlph) do środkowej fazy logarytmicznej (OD600 = 0,3). Bakterie osadkowe przez odwirowanie w stężeniu 3.500 x g przez 10 min.
  4. Zawiesić osad bakteryjny z 1 objętością żelatyny dekstrozowej Bufor weronalny (DGVB++; pH 7,3) zawierający 2,5% (w/v) glukozy, 2 mM MgCl2, 0,15 mM CaCl2 i 0,1% (wt/vol) żelatyny.
  5. Dodać 1,5 x 103 jtk bakterii do 100 μl DGVB++ zawierającego 5% surowicy (NHS, HIS, VDS lub VDS+180 nM Vn). Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 15 minut, wytrząsając przy 300 obr./min.
  6. Usunąć 10 μl podwielokrotności z mieszaniny reakcyjnej po 0 min (próbka T0) i 15 min (Tt próbka) i ułożyć na płytce na agarze czekoladowym. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc.
  7. Po inkubacji policz kolonie pojawiające się na talerzu. Oblicz procent zabitych bakterii12, używając następującego równania: (CFU przy Tt)/(CFU przy T0) × 100.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiązanie Vn do powierzchni bakterii określono za pomocą cytometrii przepływowej. Wszystkie badane w niniejszym badaniu izolaty kliniczne Hif rekrutowały Vn na powierzchnię komórki. Nie zaobserwowano oddziaływania Vn z powierzchnią komórki w przypadku szczepu kontrolnego E. coli (Rycina 1A). Jak pokazano na Rycini 1B, PH jest głównym białkiem wiążącym Vn na powierzchni komórek Hif. Wiązan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patogeny bakteryjne rekrutują Vn na powierzchnię komórki i wykorzystują ten regulator dopełniacza, aby zapobiec odkładaniu się czynników dopełniacza i zakończeniu kompleksu ataku błony2. Vn funkcjonuje również jako cząsteczka pomostowa między białkami powierzchniowymi bakterii a receptorami powierzchniowymi komórek gospodarza, umożliwiając w ten sposób patogenom przyleganie do powierzchni komórek nabłonkowych, a następnie pośredniczenie w internalizacji. W tym badaniu opisujemy protokoły, które mo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w finansowym konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez granty Fundacji Anny i Edwina Bergerów, Larsa Hierty, Fundacji O.E. i Edla Johansson, Szwedzkiej Rady Badań Medycznych (numer grantu K2015-57X-03163-43-4, www.vr.se), Fundacji Raka w Szpitalu Uniwersyteckim w Malmö, Towarzystwa Fizjograficznego (Fundacji Forssmana) oraz Fundacji Badawczo-Rozwojowej Rady Hrabstwa Skåne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml thermomixterEppendorf5355suchy blok wytrząsarka grzewczo-chłodząca
5 ml polistyrenowa probówka okrągłodenna Inkubator BD Falcon60819-13812 & 75 mm typ
5% CO2 Thermo Scientific 
6 ml probówka okrągłodenna z polistyrenu VWR89000-47812 i 75 mm z nasadką
24-dołkowe płytkiBD Falcon08-772-1HKlasa hodowli komórkowych
30% Roztwór nadtlenku wodoru (H2O2)Sigma-AldrichH1009-100MLKlasa do analizy laboratoryjnej
75 cm2 kolba do hodowli tkankowychBD FalconBD353136wentylowany
96-dołkowa płaska płyta dolnaGreiner Bio-One655090Hodowla tkankowa poddana obróbce i mikro; Przezroczyste czarne płytki
A549 Linia komórkowa ludzkaSigma-Aldrich86012804-1VL
Enzym odłączania komórek (Accutase) Sigma-AldrichA6964-500MLklasy do hodowli komórkowych
Pall Life Science18-5095Czujnik do unieruchomionego białka przez sprzężenie aminowe 
AcetonVWR97064-786Klasa analityczna
Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA2058Nadaje się do hodowli komórkowych
Bibulous paper VWR28511-007
Interferometr biowarstwowyPall Life ScienceFB-50258Dwuwarstwowe urządzenie pomiarowe interferometryczne
Roztwór fioletu krystalicznegoSigma-AldrichHT90132-1L
C4BP (białko wiążące C4b)Complement Technology, Inc.A109Kupiony jako mrożona postać płynna
Chlorek wapnia (CaCl2)Sigma-AldrichC5670-500G
Roztwór karbolowo-fuksynowySigma-AldrichHT8018-250ML
Kwas cytrynowySigma-Aldrich251275-500Gklasy Amerykańskiego Towarzystwa Chemicznego (ACS)
Sigma-Aldrich75482-250ML-F
E. coli gospodarz (E. coli BL21)Novagen69450-3Ekspresja białka
gospodarza F12 PożywkaSigma-AldrichD6421klasy hodowli komórkowej
 BD Biosciences651154Klasa analizy komórek do zastosowań badawczych 
Surowica cielęca płodu (FCS)Sigma-Aldrich12003CNadaje się do hodowli komórkowych
Normalna surowica ludzka (NHS)Complement Technology, Inc.NHSPooled human surowica
sprzężona z FITC przeciwciała przeciwko owcom osła AbD SerotecSTAR88FPoliklonalna
gentamycynaSigma-AldrichG1397Klasa hodowli komórkowej
GlukozaSigma-AldrichG8270-1KG
ŻelatynaSigma-AldrichG9391Nadaje się do hodowli komórkowych
HemocytometrMarienfeld640210
Przeciwciała anty-znacznikowe HRP sprzężone Abcamab1269Poliklonalny
czynnik ludzki HTechnologia dopełniacza, Inc.A137Zakupiony jako zamrożony płyn od
C4BPComplement Technology, Inc.A109Mrożony roztwór
Albumina surowicy ludzkiejSigma-AldrichA1653-10GLiofilizowany proszek
Kolumna żywicy powinowactwa do histydyny (HisTrap HP)GE Health Care Life Science17-5247-01Kolumny wstępnie wypełnione Sefarozą
Ni Oznaczone przez niego PHRekombinowane wyrażane i oczyszczane w naszym laboratorium
Roztwór joduSigma-AldrichHT902-8FOZ
MetanolVWRBDH1135-1LPKlasa analizy
  MikroskopOlympusIX73Mikroskop odwrócony
Szkiełka mikroskopoweSigma-AldrichS8902gładkie, rozmiar 25 mm i czasy 75 mm 
Chlorek magnezu (MgCl2)Sigma-AldrichM8266-1KG
Plazmid zawierający końcówkę C 6x His-tag na szkielecie (pET26(b))Novagen69862-3Wektor DNA
Płytki do mikromiareczkowania Polysorb Sigma-AldrichM9410Do ELISA
Wodorotlenek potasu (KOH)Sigma-Aldrich6009Amerykańskie Towarzystwo Chemiczne (ACS)
klasa Owce przeciwciała anty-ludzkie VnAbD SerotecAHP396Wytrząsarka poliklonalna
 Stuart ScientificSTR6Wytrząsarka platformowa
Kolba do hodowli tkankowychBD Falcon317516775 cm2
  Termomikser Sigma-AldrichT3317Wytrząsarka do ogrzewania i chłodzenia z suchym blokiem
TetrametylobenzydynaSigma-Aldrich860336-100MG
Witronektyna (Vn) klasy ELISA z ludzkiego osoczaSigma-AldrichV8379-50UGklasa hodowli komórkowej
BBD6220 Czujniki AR2G Roztwór odbarwiający Cytometr przepływowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
  2. Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709(2016).
  3. Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
  4. Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
  5. Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
  6. Onelli, E., Citterio, S., O'Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
  7. Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
  8. Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615(2017).
  9. Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
  10. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  11. Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
  12. Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
  13. Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
  14. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  15. Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
  16. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  17. Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
  18. McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , Chapter 4 Unit 4 4(2005).
  19. Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
  20. Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
  21. Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
  22. Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
  23. Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
  24. Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wi zanie witronektynycytometria przep ywowaELISAinterferometria warstw biologicznychbia ko HHaemophilus influenzaesurowica pozbawiona witronektynypowlekanie szkie ek przedmiotowych

Powiązane artykuły