Tutaj prezentujemy protokół oceny przeżywalności nasion, kiełkowania i spoczynku w warunkach polowych przy użyciu zakopanych, oznakowanych pasków nasion i testowania żywotności chlorku tetrazolu (TZ).
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wiarygodna metoda oceny kiełkowania, spoczynku i śmiertelności nasion w warunkach polowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opisujemy techniki przybliżania dynamiki banku nasion w czasie, używając Helianthus annuus jako przykładowego gatunku badawczego. Paski przepuszczalnej tkaniny poliestrowej i kleju można składać i sklejać, aby utworzyć pasek przegródek, w których znajdują się nasiona i informacje identyfikacyjne, umożliwiając jednocześnie kontakt z odciekami glebowymi, wodą, mikroorganizmami i temperaturą otoczenia. Paski mogą być konstruowane z szerokim zakresem numerów i rozmiarów kompartmentów i pozwalają badaczowi na przechowywanie różnych genotypów w obrębie jednego gatunku, różnych gatunków lub nasion, które zostały poddane różnym zabiegom. W przeciwieństwie do pojedynczych pakietów nasion, paski są łatwiej pobierane jako jednostka. Podczas gdy pakiety replikacji mogą być zawarte w pasku, różne paski mogą działać jako bloki lub mogą być pobierane w różnym czasie w celu obserwacji zachowania nasion w czasie. Użyliśmy pistoletu do klejenia wysokotemperaturowego do wyznaczenia przegródek i uszczelnienia pasków po włożeniu nasion i znaczników identyfikujących blok i czas usuwania. Paski nasienne zostały następnie zakopane na polu na żądanej głębokości, z zaznaczonym miejscem do późniejszego usunięcia. Grzebiące w ziemi drapieżniki zostały skutecznie wyeliminowane dzięki zastosowaniu pokrycia z metalowej siatki na powierzchni gleby. Po wybranym przedziale czasu do pochówku wykopywano paski i oceniano nasiona pod kątem kiełkowania, spoczynku i śmiertelności. Podczas gdy wyraźnie martwe nasiona można często odróżnić od niekiełkujących żywych na oko, uśpione nasiona zostały ostatecznie zidentyfikowane za pomocą standardowego testu kolorymetrycznego chlorku tetrazolu pod kątem żywotności nasion.
Wprowadzenie
Ogólnym celem tej metody jest wiarygodna ocena przeżywalności nasion w czasie w warunkach polowych.
Banki nasion gleby to rezerwa rozproszonych, żywotnych, ale niekiełkujących nasion rozmieszczonych albo na powierzchni gleby, albo w ściółce powierzchniowej, albo w profilu glebowym, które mogą utrzymywać się przejściowo lub przez wiele lat1,2. Gdy w 17-letnim badaniu z udziałem kilkudziesięciu gatunków zastosowano metody zakopywania nasion podobne do przedstawionych tutaj, wwielu badanych gatunkach znaleziono żywotne nasiona. Spis nasion jest przeszkodą w kiełkowaniu nasion do momentu wystąpienia odpowiedniej kombinacji warunków dla przetrwania siewki4. Pozostawanie w stanie uśpienia może pozwolić nasionom przetrwać trudne warunki, takie jak niskie temperatury zimą, ograniczenie składników odżywczych lub sezonowa susza, dopóki zewnętrzny wyzwalacz uwalniania w stanie spoczynku nie pozwoli na kiełkowanie. Czynniki wywołujące uwolnienie w stanie spoczynku mogą być różne, od ekspozycji na długotrwałe zimno, związków pozostawionych przez ogień lub fizycznego ataku na okrywę nasienną poprzez ścieranie lub kontakt z kwasami żołądkowymi zwierząt5. Ponieważ sygnały kiełkowania mogą być specyficzne dla rodzajów lub gatunków i często wynikają z przeszłej selekcji naturalnej, nieadaptacyjne kiełkowanie nasion to takie, które zachodzi w nieodpowiednim czasie i może skutkować śmiertelnością nasion lub sadzonek lub słabym wzrostem siewek. Podczas gdy spoczynek został podzielony na wiele typów w oparciu o mechanizmy uwalniania spoczynku (np. spoczynek fizyczny, spoczynek fizjologiczny),6 spoczynek nasion pozostaje jednym z najmniej poznanych tematów w biologii roślin. W związku z tym badania terenowe, które pozwalają na ocenę stanu poszczególnych nasion lub grup nasion w odpowiednich warunkach ekologicznych, mają większą moc wyjaśniającą niż te, które opierają się po prostu na standardowych testach kiełkowania w laboratorium.
Wykorzystanie znanych cech nasion może dostarczyć informacji na temat mechanizmów spoczynku. Kontrola spoczynku nasion jest złożona, obejmuje genetyczną kontrolę czynników fizjologicznych i morfologicznych. Chociaż pełne zrozumienie zakresu mechanizmów uśpienia nie zostało jeszcze wyjaśnione, pojawił się ogólny model, obejmujący zależność sprzężenia zwrotnego między dwoma hormonami roślinnymi, kwasem giberelinowym (GA) i kwasem abscysynowym (ABA)7. W tym uogólnionym modelu dla nasion z fizjologicznym komponentem ich spoczynku, GA służy jako sygnał do uwolnienia w stanie spoczynku, podczas gdy ABA służy do utrzymania stanu uśpienia. Genetyczne skutki matki, jak również środowisko wzrostu matki, mogą wpływać na spoczynek i inne cechy nasion, takie jak wielkość, poprzez tkanki generowane przez matkę i sygnały rozwojowe8. Struktury zewnętrzne wytworzone przez matkę (lub okrywy nasienne) mogą utrzymywać stan spoczynku, czasami w połączeniu ze wskazówkami fizjologicznymi. Ponieważ okrywy nasienne pochodzące od matki są kontrolowane przez geny rośliny matecznej, mogą one nie odzwierciedlać rzeczywistego jądrowego składu genetycznego nasion. Użyliśmy niełupek Helianthus annuus z szeregu krzyżówek hybrydowych z dzikimi roślinami uprawnymi, aby wydobyć te genetyczne skutki matki i zarodka na cechy nasion9,10. W związku z tym projekty badań, które obejmują różne gatunki, typy krzyżówek lub genotypy, mogą zbierać informacje na temat ekologii i genetyki spoczynku, kiełkowania i przetrwania nasion.
Ważny przykład tego, jak fenotypy kiełkowania i przeżywalności nasion mogą wpływać na dynamikę populacji, można zobaczyć w strefach hybrydowych roślin uprawnych i dzikich. Selekcja podczas udomowienia roślin uprawnych eliminuje większość spoczynku i zmniejsza zdolność nasion do przetrwania poza sezonem wegetacyjnym. Jednak przepływ genów lub hybrydyzacja między typami uprawnymi i dzikimi w strefach hybrydowych roślin uprawnych i dzikich może ponownie wprowadzić allele roślin uprawnych (lub warianty genetyczne) do dzikiej populacji, co może mieć wpływ na dynamikę banku nasion. Hybrydy między krewnymi hodowlanymi i dzikimi, potencjalnie występujące w strefach hybrydowych roślin uprawnych i dzikich, mogą posiadać różne fenotypy pośredniego spoczynku, przy czym oczekuje się, że tylko kilka fenotypów przetrwa warunki poza uprawą (np. miesiące zimowe)11.
Celem tego manuskryptu jest pokazanie, w jaki sposób, korzystając z metody zakopywania nasion, możemy ocenić kiełkowanie, spoczynek i przeżywalność różnych typów nasion w różnych okresach czasu, aby zbadać ich naturalną zmienność w warunkach polowych. W naszym przykładzie zastosowaliśmy nasiona słonecznika z 15 krzyżówek hybrydowych roślin uprawnych i dziko żyjących, ponieważ interesuje nas genetyczny wpływ matki i zarodka na cechy nasion.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Pozyskanie nasion od wielu gatunków lub z kontrolowanych krzyżówek jednego gatunku
Uwaga: W tym przykładzie wykorzystano nasiona z 15 typów krzyżówek w obrębie gatunku Helianthus annuus (słonecznik), stosując typy dzikie, hybrydowe i uprawne jako rodzica żenego (produkującego nasiona).
- Pod koniec sezonu wegetacyjnego zebrać dojrzałe główki nasienne do opisanych woreczków. Oczyścić nasiona z plew i umieścić je w kopertach opisanych typem krzyżowania rodziców w standardowym formacie (t.j. mateczny x ojcowiczny).
- Zgrupować nasiona w dużych kopertach, używając równych ilości nasion z tej samej liczby identycznych typów krzyżowania rodziców. Na przykład 10 nasion z 10 typów krzyżowania z tymi samymi rodzicami matecznymi i ojcowicznymi. Opisać koperty informacjami identyfikacyjnymi (typ krzyżowania). Te duże koperty stanowią zapasy nasion (seed masters) służące do wypełniania pasów zasiewu w Sekcji 2.
| Rodzic żeński | |||
| Rodzic ojciec | Dziki: WxW | F1WxC | Kadrowanie: CxC |
| Dziki: WxW | 0% WxW | 25% F1xW † | 50% CxW † |
| BC: WxF1 lub F1xW | 12,5% WxBC | 37,5% F1xBC | 62,5% CxBC |
| F1WxC | 25% WxF1 † | 50% F1xF1 | 75% CxF1 † |
| F2F1xF1 | 25% WxF2 | 50% F1xF2 | 75% CxF2 |
| Kadrowanie: CxC | 50% WxC † | 75% F1xC † | 10% CxC |
Tabela 1. Typy krzyżówek rodzicielskich uzyskane poprzez zapylanie ręczne. Typy krzyżówek hybryd uprawno-dzikich słonecznika zostały wytworzone poprzez zapylanie ręczne do wykorzystania w eksperymencie z zakopywaniem nasion. Dla wszystkich typów krzyżówek rodzic żeński wymieniony jest pierwszy, a rodzic męski drugi. Typy krzyżówek oznaczone znakiem † stanowią część recyprokalnych par krzyżówek o tym samym % alleli uprawnych, ale różnych rodzicach żeńskich. Tabela została wcześniej opublikowana w: Pace, B. A. et al. (2015)15.
2. Przygotowanie niestandardowych pasków do zasiewu nasion
UWAGA: W tym przykładzie zastosowano trzy warianty dat usunięcia oraz 15 powtórzeń, co wymagało łącznie 45 pasków. W tym przykładzie zastosowano 15 przegród na pasek, zatem wymagana była odpowiednia ilość drobnooczkowej tkaniny poliestrowej lub moskitiery do wykonania 15 przegród o wymiarach 7 x 10 cm. Patrz Rysunek 1.
- Zacznij od wycięcia paska tkaniny o wymiarach 20 x 105 cm dla każdego paska nasion.
- Odlicz i zaznacz przedziały, a następnie złóż tkaninę na pół. Używając pistoletu z klejem na gorąco, zaklej jeden krótki koniec (10 cm). Gdy klej lekko ostygnie, ale nie całkowicie, dociśnij brzegi tkaniny do siebie, aby stworzyć uszczelnienie.
UWAGA: Klej o wysokiej temperaturze oraz końcówki pistoletu do klejenia mogą spowodować oparzenia w przypadku przedłużonego kontaktu ze skórą. - Nanieś linie kleju od złożonej krawędzi do otwartego krótkiego końca na każdym zaznaczonym przedziale. Dociśnij obie strony tkaniny wzdłuż linii kleju, aby zapewnić szczelność bez otworów między przedziałami. Migracja nasion między przedziałami prowadzi do błędów eksperymentalnych.
UWAGA: Po utworzeniu przedziałów niezłożona krawędź powinna pozostać otwarta i gotowa do wsypania nasion oraz dodania informacji identyfikacyjnych (nazwy typu krzyżówki). - Losowo przypisz typy krzyżówek nasion do przedziałów dla każdego paska.
- Wypełnij przedziały jednolitym numerem nasion (w tym przykładzie zastosowano 20 nasion na każdy przedział). Do etykietowania użyj przemysłowych markerów permanentnych na przyciętych do rozmiaru plastikowych palikach ogrodowych, aby były one odporne na zakopanie.
UWAGA: Można zastosować alternatywne metody etykietowania. - Po wypełnieniu każdego przedziału nasionami i umieszczeniu etykiety, niezwłocznie zaklej przedział pistoletem z klejem na gorąco. Kontynuuj, aż cały pasek nasion zostanie całkowicie zaklejony. W pierwszym przedziale oznacz cały pasek informacjami o powtórzeniu, bloku i/lub wariancie badawczym.
UWAGA: W naszym badaniu, ze względu na czasowe usuwanie, bloki oraz paski powtórzeń w obrębie bloków, uwzględniliśmy wszystkie te informacje. - Przed przejściem do następnego paska sprawdź, czy między przedziałami nie ma szczelin i w razie potrzeby uzupełnij klej punktowo.
- Wypełnij przedziały jednolitym numerem nasion (w tym przykładzie zastosowano 20 nasion na każdy przedział). Do etykietowania użyj przemysłowych markerów permanentnych na przyciętych do rozmiaru plastikowych palikach ogrodowych, aby były one odporne na zakopanie.
Rysunek 1. Schemat siewu w rzędach zakopanych. Przykład paska siewu przedstawiający identyfikację typów krzyżówek dla poszczególnych komórek. Rodzic żeński wymieniony jest jako pierwszy, a rodzic męski jako drugi. Kolory wskazują różne pochodzenie ze strony matki: żółty dla dzikiego, niebieski dla F11 hybryda, a czerwony dla kadrowania. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
3. Zasiewanie pasków nasion w polu
- Wykop doły w działkach do określonej głębokości, aby umieścić w nich pasy. Przypisz pasy do poszczególnych bloków, w których pasy są rozmieszczone losowo, aby data usunięcia mogła służyć jako główna działka, a tożsamość przedziału (w tym przykładzie typ krzyżówki) jako poddziałka w analizie.
- Przykryj pasy ziemią. Dotnij metalową siatkę sprzętową tak, aby była o 10 cm większa od działek, i połóż ją nad zakopanymi pasami. Użyj szpilek w kształcie litery U do zabezpieczenia krawędzi i przykryj brzegi siatki ziemią.
UWAGA: To przykrycie służy do wykluczenia drapieżników nasion kopiących nory. Jako alternatywę Mercer et al.13 skonstruowali i zakopali skrzynki z siatki sprzętowej otaczające pasy nasion ze względu na silną presję ze strony sutków w ich lokalizacji terenowej.) - Umieść kolorowe flagi geodezyjne, aby odróżnić lokalizację pasów oraz daty usunięcia, co będzie uzupełnieniem przejrzystych zapisów pisemnych.
4. Wykopanie pasów i ocena nasion
- Wykop paski nasion przypisane do danej daty usunięcia. Przechowuj paski w chłodnym i wilgotnym środowisku aż do momentu dostarczenia ich do laboratorium, w którym odbędzie się ocena nasion. Można to osiągnąć, owijając paski mokrym papierem gazetowym i umieszczając je w lodówce transportowej na czas transportu lub wysyłki nocnej.
- Płucz paski w wodzie, aby usunąć błoto i glebę, aż będą one wystarczająco czyste, by zanieczyszczenia zewnętrzne nie zasłaniały nasion.
- Za pomocą nożyczek rozcinaj po jednej przegrodzie na raz. Policz wykiełkowane nasiona i usuń je. Policz nasiona ewidentnie martwe (np. gnijące lub zepsute). Umieść niewykiełkowane nasiona na oznakowanym, mokrym papierze filtracyjnym o rozmiarze płytki Petriego, aby dalej rozróżnić nasiona niewykiełkowane, uśpione i martwe.
- Umieść płytki Petriego z niewykiełkowanymi nasionami w komorze wzrostu ustawionej na standardowe warunki kiełkowania: 25 °C /10 °C 12 godz. dzień/noc. Pozostaw nasiona na tydzień w celu wykiełkowania. Wszelkie nasiona, które wykiełkują, uznaj za żywotne, lecz niewykiełkowane, ponieważ nie wykiełkowały w warunkach polowych.
- Po zabiegu w komorze wzrostu sprawdź żywotność pozostałych niewykiełkowanych nasion, używając chlorku tetrazoliu (TZ)13. Aby to zrobić, przygotuj roztwór TZ o stężeniu procentowym odpowiednim dla badanego gatunku, korzystając z podręcznika AOSA Tetrazolium Testing Handbook14. W niniejszym przykładzie zastosowano roztwór 1%.
- Przeciąć niewykiełkowane nasiona na pół i umieścić jedną połowę, w której widoczny jest embrion i endosperm, w płytce Petriego zawierającej wystarczającą ilość roztworu TZ, aby przykryć nasiono (nasiona mogą pływać, jest to dopuszczalne).
- Umieść płytki Petriego z TZ w inkubatorze ustawionym na 30 °C i odczekaj 3 godz. Uwaga: Wyższe temperatury przyspieszą reakcję, jeśli jest to pożądane, jednak istnieje ryzyko nadmiernego wybarwienia.
- Wyjmij płytki Petriego z inkubatora i dokonaj oceny. Nasiona, których embriony wybarwiły się na czerwono, są zdolne do kiełkowania, natomiast nasiona niewybarwione są martwe. Szczegółowe informacje na temat rozróżniania przypadków granicznych i konkretnych gatunków znajdują się w podręczniku AOSA Tetrazolium Testing Handbook.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Krzyżówki o zróżnicowanym pochodzeniu matczynym i różnym procencie alleli rośliny uprawnej (Tabela 1) wykazywały różnice w zależności od daty usunięcia w odniesieniu do procentu nasion wykiełkowanych, niewykiełkowanych oraz martwych (Rys. 2 i 3). Przeprowadzenie testu TZ niewykiełkowanych nasion pozwoliło stwierdzić obecność nasion rzeczywist게 dormantnych podczas drugiego usunięcia (wczesna wiosna) (Tabela 2), natomiast w...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu przedstawiamy metody wykorzystania pasów do zakopywania nasion do obserwacji kiełkowania, spoczynku i śmiertelności różnych stad nasiennych w wybranych okresach czasu na polu. Zalety stosowania pasków zamiast pojedynczych pakietów polegają na (1) szybkości budowy pasków i przedziałów w porównaniu z tworzeniem pojedynczych pakietów; oraz (2) łatwość i szybkość wyjmowania wielu przegródek jednym ruchem bez niebezpieczeństwa pominięcia pakietu lub niezamierzonego usunięcia jednego. Ponieważ dwie daty usunięcia...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Program Grantowy Oceny Ryzyka Biotechnologicznego (Biotech Risk Assessment Grant Program) nr 2006-39454-17438 dla A. Snow, K. Mercera i H. Alexandra z Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa. Eksperymenty z wykorzystaniem tej metody zostały przeprowadzone i wspierane przez University of Kansas Field Station, jednostkę badawczą Kansas Biological Survey i University of Kansas. Autorzy pragną podziękować P. Jourdanowi i E. Regnierowi za pomocne recenzje wcześniejszych wersji tego manuskryptu. Ponadto praca ta została wsparta wkładem pracowników University of Kansas Field Station, Waterman Farm na Uniwersytecie Stanowym Ohio (OSU), Centrum Plazmy Zarodkowej Roślin Ozdobnych USDA w OSU oraz Laboratorium Biologii Nasion na Wydziale Ogrodnictwa i Nauk o Uprawach w OSU, zwłaszcza E. Renze, S. Stieve, A. Evans, oraz E. Grassbaugh za wsparcie techniczne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Małe koperty na monety | Dowolne | ||
| Duże koperty na monety | Dowolna | ||
| moskitiera poliestrowa o drobnych oczkach | Dowolny | ||
| pistolet do kleju wysokotemperaturowego | Wszelkie | ||
| wkłady w sztyfcie kleju wysokotemperaturowego | Dowolne | ||
| Trwałe markery przemysłowe | Dowolna | ||
| plastikowe etykiety ogrodowe | Dowolne | ||
| nożyczki | Dowolna | ||
| łopata | Dowolna | ||
| metalowa siatka twarda tkanina | Dowolna | ||
| flagi geodezyjne, wiele kolorów | Dowolna | ||
| mokra gazeta | Dowolna | ||
| chłodnica | Dowolna | ||
| bibuła bibułkowa | Dowolne | ||
| temp. kontrolowana komora wzrostu | Dowolne | ||
| żyletki | Dowolne | ||
| szalki Petriego | Dowolny | ||
| chlorek tetrazolu | Dowolna woda Dowolne | ||
| ciepło inkubator | Dowolny |
Bibliografia
- Walck, J. L., Baskin, J. M., Baskin, C. C., Hidayati, S. N. Defining transient and persistent seed banks in species with pronounced seasonal dormancy and germination patterns. Seed Sci Res. 15 (3), 189-196 (2005).
- Alexander, H. A., Schrag, A. M. Role of soil seed banks and newly dispersed seeds in population dynamics of the annual sunflower. Helianthus annuus. J Ecol. 91, 987-998 (2003).
- Burnside, O. C., Wilson, R. G., Weiseberg, S., Hubbard, K. Seed longevity of 41 weed species buried 17 years in eastern and western. Weed Sci. 44 (1), 74-86 (1996).
- Baskin, C. C., Baskin, J. M. Seeds: Ecology, biogeography, and evolution of dormancy and Germination. , Academic Press. San Diego, CA. (2001).
- Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. Seed dormancy and the control of germination. New Phytol. 171, 501-523 (2006).
- Baskin, J. M., Baskin, C. C. A classification system for seed dormancy. Seed Sci Res. 14 (1), 1-16 (2004).
- Donohue, K., et al. Environmental and genetic influences on the germination of Arabidopsis thaliana in the field. Evolution. 54 (4), 740-757 (2005).
- Roach, D. A., Wulff, R. D. Maternal effects in plants. Ann Rev Ecol Syst. 18, 209-235 (1987).
- Pace, B. A., Alexander, H. M., Emry, J. D., Mercer, K. L. Seed fates in crop-wild hybrid sunflower: crop allele and maternal effects. Evol Appl. 8 (2), 121-132 (2015).
- Alexander, H. M., Emry, D. J., Pace, B. A., Kost, M. A., Sparks, K. A., Mercer, K. L. Roles of maternal effects and nuclear genetic composition change across the life cycle of crop-wild hybrids. Am J Bot. 101 (7), 1176-1188 (2014).
- Stewart, N. C., Matthew, J., Halfhill, D., Warwick, S. I. Transgene introgression from genetically modified crops into their wild relatives. Genetics. 4, 806-817 (2003).
- Mercer, K. L., Shaw, R. G., Wyse, D. L. Increased germination of diverse crop-wild hybrid sunflower seeds. Ecol Appl. 16, 845-854 (2006).
- Delouche, J. C., Still, T. W., Rapset, M., Lienhard, M. The tetrazolium test for seed viability. Mississippi Sta Uni Ag Exp Sta Techn Bull. 51, 1-63 (1962).
- Association of Official Seed Analysts. Tetrazolium Testing Handbook. , 653 Constitution Avenue NE, Washington, DC 20002, USA. (2010).
- Alexander, H. M., Emry, D. J., Pace, B. A., Kost, M. A., Sparks, K. A., Mercer, K. L. Roles of maternal effects and nuclear genetic composition change across the life cycle of crop-wild hybrids. Am J Bot. 10 (7), 1176-1188 (2014).
- Weiss, A. N., Primer, S. B., Pace, B. A., Mercer, K. L. Maternal effects and embryo genetics: germination and dormancy of crop-wild sunflower hybrids. Seed Sci Res. 23, 241-255 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
