Artykuł metodologiczny

Trwałe podawanie mitogenów z komórek β do nienaruszonych wysepek myszy ex vivo przy użyciu biodegradowalnych mikrosfer poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego)

5.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54664

⸱

5 listopada 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2School of Engineering, Vanderbilt University, 3Department of Veterans Affairs, Tennessee Valley Health Authority

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy metodologię generowania i podawania mikrosfer z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA) do nienaruszonych mysich wysp trzustkowych w hodowli, a następnie analizy immunofluorescencyjnej proliferacji komórek β. Metoda ta jest odpowiednia do określania skuteczności kandydujących mitogenów β-komórkowych.

Streszczenie

Rozwój biomateriałów znacznie zwiększył potencjał celowanego dostarczania leków do różnych typów komórek i tkanek, w tym do komórek β trzustki. Ponadto cząsteczki biomateriałów, hydrożele i rusztowania zapewniają również wyjątkową możliwość dostarczania leków, które można kontrolować, do komórek β w hodowli i w przeszczepionych modelach tkankowych. Technologie te umożliwiają badanie potencjalnych czynników proliferacji komórek β przy użyciu nienaruszonych wysp trzustkowych i systemu istotnego pod względem translacyjnym. Co więcej, określenie skuteczności i wykonalności czynników kandydujących do stymulowania proliferacji komórek β w systemie hodowli ma kluczowe znaczenie przed przejściem do modeli in vivo. W niniejszym artykule opisujemy metodę wspólnej hodowli nienaruszonych wysepek mysich z biodegradowalnymi mikrosferami poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA) obciążonymi biodegradowalnymi związkami zainteresowania (COI) w celu oceny wpływu długotrwałego uwalniania czynników mitogennych in situ na proliferację komórek β. Technika ta opisuje szczegółowo, w jaki sposób generować mikrosfery PLGA zawierające pożądany ładunek przy użyciu dostępnych na rynku odczynników. Chociaż opisana technika wykorzystuje jako przykład rekombinowany ludzki czynnik wzrostu tkanki łącznej (rhCTGF), z łatwością można zastosować szeroką gamę COI. Dodatkowo metoda ta wykorzystuje płytki 96-dołkowe, aby zminimalizować ilość odczynników niezbędnych do oceny proliferacji komórek β. Protokół ten można łatwo dostosować do wykorzystania alternatywnych biomateriałów i innych cech komórek endokrynnych, takich jak przeżywalność komórek i status różnicowania.

Wprowadzenie

Komórki β trzustki są jedynymi komórkami produkującymi insulinę w organizmie i są niezbędne do utrzymania homeostazy glukozy we krwi. Podczas gdy zdrowe osoby mają wystarczającą masę i funkcję komórek β, aby prawidłowo regulować poziom glukozy we krwi, osoby z cukrzycą charakteryzują się niewystarczającą masą i/lub funkcją komórek β1,2. Zaproponowano, że indukowanie proliferacji komórek β może ostatecznie zwiększyć masę komórek β i przywrócić homeostazę glukozy u osób z cukrzycą3. Jednak ocena i walidacja potencjalnych związków proliferacyjnych komórek β w nienaruszonych wyspach trzustkowych jest konieczna, zanim będzie można opracować skuteczne terapie. Przeszczepienie ludzkich wysp trzustkowych u osób z cukrzycą przywraca homeostazę stężenia glukozy we krwi na pewien czas, ale dostępność i powodzenie tej eksperymentalnej procedury jest utrudnione przez niedobór ludzkich wysp trzustkowych dostępnych do przeszczepu oraz śmierć β komórek w wyspach trzustkowych po przeszczepie4. Nawet po odkryciu czynników, które indukują namnażanie się komórek produkujących insulinę, nadal istnieje poważne wyzwanie związane z dostarczeniem tych czynników do odpowiednich miejsc in vivo. Jedną ze strategii trwałego miejscowego dostarczania związków proliferacyjnych komórek β jest kwas poli(mlekowo-koglikolowy) (PLGA). PLGA ma historię stosowania w produktach do dostarczania leków zatwierdzonych przez FDA ze względu na wysokie bezpieczeństwo, biodegradowalność i kinetykę przedłużonego uwalniania5. W szczególności PLGA jest kopolimerem laktydu i glikolidu, który ulega degradacji w wyniku hydrolizy z wodą in vivo lub w hodowli do kwasu mlekowego i kwasu glikolowego, które są naturalnie występującymi metabolitami w organizmie. Zamknięty w kapsułkach związek leczniczy może być uwalniany do otaczającego środowiska zarówno przez mechanizmy uwalniania kontrolowane dyfuzją, jak i degradacją. Kapsułkowanie COI zapewnia ochronę przed degradacją enzymatyczną, poprawiając biodostępność odczynnika w porównaniu z niekapsułkowanym COI5. Sugerujemy, że mikrosfery PLGA mogą być używane do podawania związków kandydujących do nienaruszonych wysepek w hodowli, a ostatecznie in vivo. Testowanie skuteczności PLGA w podawaniu mitogenów z komórek β do wysp trzustkowych ex vivo ma kluczowe znaczenie przed zbadaniem protokołów transplantacji.

Obecnie nie ma techniki pomiaru proliferacji komórek β u żywych zwierząt. Eksperymenty mające na celu ocenę skuteczności potencjalnych związków proliferacyjnych in vivo wymagają zatem podawania tych związków żywym zwierzętom, a następnie preparacji i przetwarzania trzustki w celu znakowania odpornościowego. Takie protokoły są kosztowne i pracochłonne, a także wymagają podawania związku ogólnoustrojowo, bez żadnej gwarancji, że dotrą do wysp trzustkowych. I odwrotnie, kilka unieśmiertelnionych linii komórek β jest dostępnych do badania komórek produkujących insulinę w hodowli, ale te linie komórkowe nie mają architektury wysp trzustkowych i środowiska występującego w organizmach żywych6. Unieśmiertelnione linie komórek β charakteryzują się również znacznie wyższym stopniem replikacji niż endogenne komórki β in vivo, co komplikuje analizę związków indukujących proliferację. W tym badaniu opisujemy protokół, który wykorzystuje nienaruszone wysepki wyizolowane od dorosłych myszy. W przeciwieństwie do linii β-komórkowych, nienaruszone wysepki zachowują normalną architekturę wysp. Podobnie, w przeciwieństwie do eksperymentów przeprowadzanych in vivo, podawanie związków proliferacyjnych bezpośrednio do hodowanych nienaruszonych wysp trzustkowych znacznie zmniejsza ilość odczynników, które są niezbędne do dokładnego pomiaru proliferacji komórek β.

Obecne badanie wykorzystuje PLGA do podawania COI, w tym przykładzie rekombinowanego ludzkiego czynnika wzrostu tkanki łącznej (rhCTGF). Opisana tutaj metoda daje znaczną przewagę nad podawaniem surowego związku do hodowanych wysp trzustkowych, ponieważ pozwala na ciągłe uwalnianie związku do pożywki. Warto zauważyć, że test ten można zmodyfikować w celu podawania szerokiej gamy białek i przeciwciał będących przedmiotem zainteresowania dla nienaruszonych wysp trzustkowych. Można również analizować wpływ na inne typy komórek endokrynnych, w tym komórki α.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone i wykonane zgodnie z Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Etykietowanie COI za pomocą fluoroforu (opcjonalnie)

  1. Wybierz barwnik fluorescencyjny, który będzie reagował z wolną aminą pierwszorzędową (np. na białku), taki jak estry sukcynimidylu lub pochodne fluoresceiny, aby uwidocznić ładunek mikrosferyczny. Rozpuścić 8x molowy nadmiar (w stosunku do moli COI) fluoroforu w 200 μl dimetylosulfotlenku (DMSO).
  2. Zawiesić 50 mg COI do końcowej objętości 800 μl w roztworze nośnika (końcowe stężenie 62,5 ng/μl). Rozwiązanie dla pojazdu będzie się różnić w zależności od źródła COI.
    UWAGA: Typowe roztwory dla pojazdów obejmują sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) lub DMSO.
  3. Dodać cały roztwór fluoroforu/DMSO z kroku 1.1 i ponownie zawiesić COI. Wirować przez noc w temperaturze 4 °C. Alternatywnie, mieszać mieszaninę reakcyjną w temperaturze pokojowej (RT) przez 4 godziny.
  4. Po reakcji znakowania usuń nadmiar fluoroforu za pomocą kolumny odsalającej.
    1. Opróżnij bufor magazynowy z kolumny odsalającej i spłucz 16 ml wody dejonizowanej. Odrzuć cały przepływ.
    2. Dodaj fluorescencyjnie oznakowany COI do kolumny odsalającej. Eluować 1,2 ml wody dejonizowanej i zebrać przepływ.
    3. Powtórzyć etap elucji dodatkowo cztery razy, za każdym razem dodając 1,2 ml wody dejonizowanej i zbierając przepływ jako oddzielną próbkę.
    4. Cały pobrany przepływ przez próbki zamrozić w temperaturze -80 °C i poddać liofilizacji zgodnie z instrukcjami producenta przez 24 godziny.

2. Przygotowanie mikrosfery z ładunkiem COI metodą odparowywania rozpuszczalnika emulsyjnego typu woda w oleju w wodzie

  1. Dodać 1 mg znakowanego fluorescencyjnie COI do 100 μl wody dejonizowanej, aby utworzyć pierwszą fazę wodną (W1).
  2. Rozpuścić 65 mg poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (50:50 Laktyd: Glikolid, masa cząsteczkowa 54 000 - 69 000) w 750 μl dichlorometanu w probówce do mikrowirówki. Ultradźwięki przez 10 - 30 sekund (przy 160 W), aby całkowicie rozpuścić PLGA. W ten sposób powstaje faza olejowa (O).
  3. Dodaj całą fazę W1 wygenerowaną w kroku 2.1 do fazy O w sposób kroplowy. Emulgować za pomocą ręcznego homogenizatora przy 20 000 obr./min przez 30 sekund, aby utworzyć fazę W1/O.
  4. Dodać całą fazę W1/O kroplami do 15 ml 1% (wagowo-objętościowo) wodnego roztworu poli(alkoholu winylowego) (PVA) i emulgować za pomocą ręcznego homogenizatora przy 20 000 obr./min przez 30 sekund.
  5. Przenieść całą emulsję wytworzoną w kroku 2.4 do kolby okrągłodennej o pojemności 200 ml i poddać próżni 635 mm Hg za pomocą wyparki obrotowej przez 1 godzinę w celu usunięcia rozpuszczalnika i wytworzenia fazy wodnej.
  6. Podwielokrotność 1 ml fazy wodnej wytworzonej w kroku 2,5 do czternastu probówek mikrowirówek. Odwirowywanie roztworu wodnego w probówkach do mikrowirówek o sile 7 500 x g przez 8 min.
    UWAGA: Na tym etapie mikrosfery są obecne w pozostałym roztworze wodnym i są skoncentrowane na dnie probówki mikrowirówkowej.
  7. Ostrożnie usunąć 900 μl roztworu wodnego z probówek do mikrowirówek za pomocą mikropipety, pipetując tak, aby nie naruszyć mikrosfer znajdujących się na dnie probówki do mikrowirówki.
    1. Umyj mikrosfery z nadmiaru PVA, dodając 1 ml wody dejonizowanej do każdej probówki mikrowirówki. Odwirować przy 7 500 x g przez 8 minut i ponownie ostrożnie usunąć 900 μl roztworu wodnego z probówek do mikrowirówek za pomocą mikropipety, pipetując tak, aby nie naruszyć mikrosfer na dnie probówki do mikrowirówki.
      UWAGA: Pozostałe 100 μl roztworu wodnego zawiera wytworzone mikrosfery.
  8. Wodny roztwór mikrosfery wytworzony w kroku 2.7 zamrozić w temperaturze -80 °C.
  9. Liofilizować mikrosfery za pomocą liofilizatora zgodnie z zaleceniami producenta i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Zmierz wydajność ładowania COI, całkowicie rozpuszczając mikrosfery PLGA i określając stężenie białka w stosunku do krzywej standardowej wolnego białka7.
  10. Jako kontrolę ujemną należy wytworzyć partię "ślepych" mikrosfer (zwanych dalej mikrosferami kontrolnymi).
    UWAGA: Wytwarzanie mikrosfer kontrolnych jest identyczne z wytwarzaniem hydrofilowych mikrosfer obciążonych COI, bez dodatku COI do 800 μl roztworu nośnika w kroku 1.2. Dopasuj cząstki kontrolne pod względem stężenia masowego PLGA w stosunku do mikrosfer PLGA obciążonych COI do testu mitogenu β komórek.

3. Przygotowanie pożywek do hodowli wysp trzustkowych i pożywek do testów wstępnych

  1. Przygotować 200 ml pożywki do hodowli nienaruszonych wysp trzustkowych myszy: pożywka RPMI 1640 uzupełniona 11 mM glukozy, 10% surowicy końskiej, 100 U/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny (zwanych dalej pożywką do hodowli wysp trzustkowych).
    UWAGA 1: W przeciwieństwie do płodowej surowicy bydlęcej (FBS), surowica końska nie zawiera laktogenu łożyskowego, induktora proliferacji komórek β, co zakłóca analizę w teście proliferacji.
    UWAGA 2: Ponieważ mikrosfery PLGA nie są sterylizowane przed użyciem, dodanie antybiotyków do pożywki hodowlanej ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia zanieczyszczenia mikrobiologicznego.
  2. Usunąć 25 ml pożywki do hodowli wysp trzustkowych za pomocą pipetora elektronicznego i umieścić w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Uzupełnić 25 ml pożywki do hodowli wysp trzustkowych w stożkowej probówce o pojemności 50 ml o końcowym stężeniu 0,2 mM EGTA, aby uzyskać pożywkę do testu wstępnego.
    UWAGA: Dodatek EGTA łagodnie rozluźnia kontakty komórka-komórka w wysepkach bez zmiany architektury wysp. Pomaga to zapewnić, że COI może dotrzeć do wewnętrznych komórek wysepki i pomaga zapobiegać martwicy centralnej wysepki.

4. Hodowla nienaruszonych wysepek myszy

  1. Wyizolować nienaruszone wyspy trzustkowe z wcześniej wybranego szczepu, płci, wieku i genotypu myszy po rutynowym trawieniu trzustkikolagenazą 8,9. Połączyć ze sobą wysepki z podobnych próbek.
  2. Podwielokrotność 40 wysepek do jednego dołka z 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej w 200 μl pożywki do hodowli wysp trzustkowych. Wizualnie dopasowane pod względem wielkości wysepek na studzienkę (dokładna ocena równoważności wysepek (IEQ) między próbkami nie jest konieczna). Puste studnie bezpośrednio przylegające do studni z wysepkami należy napełnić sterylną wodą o objętości 200 μl, aby zapewnić bufor do odparowywania. Hodowla wysepek w pożywkach przez noc w temperaturze 37 °C w atmosferze 95% powietrza i 5% CO2 .

5. Ponowne zawieszenie mikrosfer PLGA z ładunkiem COI i kontrolą

  1. Po całonocnym odzyskaniu wysp trzustkowych, ponownie zawiesić mikrosfery, dodając pożywkę do testu wstępnego do jednej podwielokrotności liofilizowanych mikrosfer PLGA obciążonych COI tak, aby końcowe stężenie COI w probówce mikrowirówki wynosiło 10 ng / μl (ilość COI obecna w danej ilości wygenerowanych mikrosfer została określona w kroku 2.9). Sonikować zawieszone mikrosfery obciążone COI w lodowatej łaźni wodnej przez 10 minut przy 160 W z 10-sekundowymi impulsami w temperaturze 4 °C.
  2. Ponownie zawiesić kontrolne mikrosfery PLGA, dodając tę samą objętość pożywki do testu wstępnego do równej masy liofilizowanych kontrolnych mikrosfer PLGA. Sonikować zawieszone mikrosfery kontrolne PLGA w lodowatej łaźni wodnej przez 10 minut przy 160 W z 10-sekundowymi impulsami w temperaturze 4 °C.
  3. Wizualnie potwierdzić, że mikrosfery są rozproszone przez pipetowanie 2 μl zawieszonych mikrosfer między dwoma szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Wizualizacja mikrosfer za pomocą obiektywu 40X w mikroskopie epifluorescencyjnym lub jasnego pola.
  4. Jeśli znaczna agregacja mikrosfer jest nadal widoczna, należy poddać sonikację w lodowatej kąpieli wodnej przez dodatkowe 10 minut przy 160 W z 10-sekundowymi impulsami w temperaturze 4 °C i powtórzyć wizualizację zawieszonych mikrosfer.

6. Traktowanie wysepek za pomocą mikrosfer PLGA obciążonych COI lub kontrolnych PLGA

  1. Dla każdej studzienki, która ma być poddana działaniu mikrosfer obciążonych COI, należy przygotować pożywkę do oznaczania, rozcieńczając 10 ng/μl ponownie zawieszonych mikrosfer COI pożywką do wstępnego oznaczania do końcowej objętości 100 μl i wcześniej ustalonego stężenia końcowego.
    UWAGA: Optymalne końcowe stężenie białka będzie się różnić dla każdego COI użytego w tym teście. Idealnie byłoby, gdyby badany był zakres stężeń końcowych.
  2. Dla każdej studzienki, która ma być użyta jako kontrola, należy przygotować pożywkę do oznaczania kontrolnego, rozcieńczając ponownie zawieszone kontrolne mikrosfery PLGA wygenerowane w kroku 5.2 taką samą objętością rozcieńczenia, jaka została użyta do rozcieńczenia mikrosfer obciążonych COI w kroku 6.1.
    UWAGA: Wysepki poddane działaniu pożywki do oznaczania kontrolnego będą służyć jako kontrola ujemna, aby umożliwić wykrycie jakiegokolwiek wpływu, jaki ślepa próba mikrosfery może mieć na wyniki doświadczalne.
  3. Ostrożnie usunąć 100 μl pożywki do hodowli wysp trzustkowych z każdej studzienki za pomocą mikropipety, tak aby żadne wysepki nie zostały usunięte z dołków. Delikatnie dodać 100 μl pożywki do oznaczania lub 100 μl pożywki kontrolnej do każdej studzienki.
  4. Wysepki inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 95% powietrza i 5%CO2 przez trzy dni.

7. Rozpraszanie nienaruszonych wysepek na szkiełkach mikroskopowych

  1. Po trzech dniach za pomocą mikropipety ostrożnie usunąć i wyrzucić pożywkę testową ze wszystkich studzienek, aby nie usunąć wysepek. Delikatnie dodać 200 μl PBS do wysepek, aby umyć je z podłoża do oznaczania. Ostrożnie usunąć i wyrzucić PBS za pomocą mikropipety i delikatnie umyć wysepki dodatkowymi 200 μl PBS.
  2. Usunąć i wyrzucić PBS za pomocą mikropipety i dodać 100 μl 0,025% trypsyny, 2 mM roztworu EDTA. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Pipetuj wyspy trzustkowe w roztworze trypsyny-EDTA w górę i w dół co 2 minuty, aż wizualnie potwierdzi się, że wyspy są rozproszone na pojedyncze komórki (należy pamiętać, że niektóre małe skupiska komórek mogą być nadal obecne) za pomocą mikroskopu świetlnego. Przenieś całą objętość każdej studzienki indywidualnie do oznakowanych probówek do mikrowirówek.
  3. Dodaj 400 μl pożywki do hodowli wysp trzustkowych do każdej probówki mikrowirówkowej, aby zatrzymać dysocjację komórek za pośrednictwem trypsyny.
  4. Odwirować próbki przez 5 minut przy 100 x g w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek wysepek na dnie probówek do mikrowirówek.
  5. Delikatnie usunąć supernatant za pomocą mikropipety i ponownie zawiesić osad w 200 μl świeżej pożywki do hodowli wysp trzustkowych.
  6. Za pomocą cytowirówki odwirować zdysocjowane wysepki o masie 140 x g przez 3 minuty na naładowane szkiełka mikroskopowe.
  7. Suszenie na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie narysuj ramkę wokół zdysocjowanych wysepek za pomocą hydrofobowego pisaka do znakowania.
  8. Napraw komórki za pomocą 75 μl 4% paraformaldehydu (PFA) w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Usuń 4% PFA i delikatnie umyj komórki w 75 μl PBS dwa razy. Po umyciu przepuszczaj komórki 75 μl 0,2% Triton X-100 w PBS przez 10 min. Następnie umyć komórki 75 μl PBS.
    Uwaga: PFA jest znany jako alergizujący, rakotwórczy i toksyczny.

8. Immunofluorescencyjne znakowanie zdysocjowanych wysp trzustkowych dla insuliny i markera proliferacji komórek, Ki67

  1. Przygotuj wilgotną komorę, umieszczając dwa mokre ręczniki papierowe na dnie pudełka na szkiełka mikroskopowe o pojemności 100 szkiełek.
  2. Umieść szkiełka płasko w dół (komórki skierowane do góry) w wilgotnej komorze. Przygotować próbki do etykietowania, odsysając PBS z poprzedniego etapu płukania za pomocą mikropipety i dodając 75 μl roztworu blokującego (5% normalnej surowicy osła (NDS) w PBS) do każdego szkiełka w celu zablokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał z próbkami. Inkubować szkiełka w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Delikatnie odessać roztwór blokujący za pomocą mikropipety i dodać 75 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego zawierającego przeciwciała antyinsulinowe świnki morskiej i przeciwciała anty-Ki67 królika, rozcieńczonego 1 μg/ml w 5% NDS w PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godz.
    UWAGA: Alternatywne markery proliferacji komórek obejmują proliferujący antygen jądrowy komórki (PCNA) i fosfohiston H3 (PH3),
  4. Delikatnie odessać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego za pomocą mikropipety i przepłukać komórki 75 μl PBS. Odessać PBS za pomocą mikropipety i przepłukać komórki jeszcze dwa razy, za każdym razem 75 μl PBS. Inkubować każdą próbkę z 75 μl przeciwciała drugorzędowego Cy5 przeciwko śwince morskiej i przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi Cy3 rozcieńczonego do 2 μg/ml w roztworze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze RT.
    UWAGA: Nie należy używać przeciwciał drugorzędowych znakowanych tym samym lub spektralnie nakładającym się fluoroforem, który był już używany do znakowania mikrosfer.
  5. Odessać roztwór przeciwciała wtórnego za pomocą mikropipety i inkubować w 75 μl 300 nM DAPI w PBS przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać DAPI za pomocą mikropipety i płukać w wodzie dejonizowanej przez 5 minut.
  6. Delikatnie odessać wodę z próbek za pomocą mikropipety. Umieść kroplę (około 100 μl) szybkoschnącego roztworu montażowego zawierającego odczynnik zapobiegający blaknięciu na szklanym szkiełku nakrywkowym. Odwróć szkiełko mikroskopu próbka stroną do dołu, na roztwór montażowy. Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe do szkiełka za pomocą końcówki pipety, aby usunąć pęcherzyki i zetrzyj nadmiar płynu miękką chusteczką czyszczącą. Pozostaw szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.

9. Akwizycja i analiza obrazu

  1. Do akwizycji obrazu należy użyć mikroskopu epifluorescencyjnego z dołączoną kamerą. Dla każdego fluoroforu określ optymalny czas ekspozycji (zwykle 20 ms dla DAPI, 40 - 80 ms dla insuliny i 250 ms dla Ki67). Upewnij się, że parametry akwizycji obrazu są równe dla wszystkich próbek.
  2. Dla każdej próbki należy ręcznie policzyć 3,000 komórek insulinododatnich, a ile z nich jest również Ki67-dodatnich. Licz tylko komórki insulinododatnie, które mają dobrze zdefiniowane i wyraźnie widoczne jądro. Obliczyć procent proliferujących komórek β dla każdej próbki, dzieląc liczbę komórek Ki67-dodatnich/insulino-dodatnich przez całkowitą liczbę komórek insulinododatnich i mnożąc przez 100.
  3. Po określeniu procentu proliferujących komórek β dla każdej próbki, określ, czy istnieje statystycznie istotna różnica w proliferacji komórek β między próbkami kontrolnymi i eksperymentalnymi, analizując wyniki za pomocą jednoczynnikowej ANOVA przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania statystycznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia mikrosfery otrzymane zgodnie z powyższym protokołem. Opisany tutaj protokół pozwala na uzyskanie mikrosfer obciążonych rhCTGF o różnych rozmiarach. Największa frakcja mikrosfer będzie miała średnicę od 1 do 10 µm, choć niektóre mikrosfery mogą być większe (Rysunek 2). W razie potrzeby rozmiar mikrosfer można dostroić i zoptymalizować w oparciu o parametry wytwarzania, takie jak prędkość i czas homogenizacji, stężenie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie proliferacji komórek β w hodowli jest zwykle utrudnione przez kilka trudności. Po pierwsze, unieśmiertelnione linie komórek β charakteryzują się wyższym stopniem proliferacji niż te, które znajdują się w endogennych komórkach β w żywych wyspach trzustkowych. Ponadto te unieśmiertelnione linie komórkowe nie mają normalnej architektury krytycznej dla normalnego funkcjonowania komórek β. Te dwa fakty utrudniają określenie, czy wyniki uzyskane przy użyciu unieśmiertelnionych linii komórek β będą prawdziwe w testach <...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Bethany Carboneau (Vanderbilt University) za krytyczną lekturę tego rękopisu. Dziękujemy również Anastasii Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) za izolację wysp trzustkowych oraz dr Alvinowi C. Powersowi (Vanderbilt University Medical Center) i dr Davidowi Jacobsonowi (Vanderbilt University) za korzystanie z wirówki i urządzenia do hodowli tkankowych. Badania te obejmowały wykorzystanie Islet Procurement and Analysis Core Centrum Badań i Szkoleń nad Cukrzycą Vanderbilt wspieranego przez DK20593 grantu NIH. Praca ta była wspierana przez stypendium podoktoranckie American Heart Association (14POST20380262) dla RCP oraz granty z Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592) i Departamentu Spraw Weteranów (1BX00090-01A1) dla M.A.G.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Oregon Green 488 Kwas karboksylowy, ester sukcynimidylowy, 6-izomerThermoFisher ScientificO6149Do oznaczania COI za pomocą fluoroforu
DMSO Dimethyl SulfoxideFisher BioReagentsBP231-1 Dorozpuszczania fluoroforu w kroku 1
Jednorazowe kolumny odsalające PD-10GE Healthcare17-0851-01Kolumna odsalająca używana w kroku 1
Resomer RG 505, poli(D,L-laktyd-ko-glikolid), zakończony estrem, masa cząsteczkowa 54 000 - 69 000Sigma-Aldrich739960Stosowany do wytwarzania mikrosfer w kroku 2
Poli(alkohol winylowy) masa cząsteczkowa 89 000 - 98 000341584 Sigma-AldrichaStosowany do wytwarzania mikrosfer w kroku 2
RPMI 1640Thermo Scientific11879-020Do hodowli wysp trzustkowych
Dekstroza bezwodnaFisher BioReagents200-075-1Suplement do podłoża z wysp trzustkowych
Penicylina-StreptomycynaSigma-AldrichP4333Antybiotyki na podłoże wysp trzustkowych
Normalna surowica koniaJackson ImmunoResearch008-000-121Suplement do podłoża z wysp trzustkowych
96-dołkowa płytka do hodowliCorning3603Do hodowli wysepek
Kwas gliko-bi(2-aminoetyloetero)-N,N,N',N',N'-tetraoctowySigma-AldrichE4378Suplement do pożywki z wysepek przed testem
Cytospin 4 CytotrifugeThermo ScientificA78300003Do przędzenia komórek na szkiełkach mikroskopowych
EZ Single CytofunnelThermo ScientificA78710020Do obracania komórek na szkiełkach mikroskopowych
Kwas etylenodiaminotetraoctowyFisher BioReagentsBP118-500Stosowany w dysocjacji wysepek
paraformaldehydSigma-AldrichP6148Do mocowania komórek
Triton  X-100Fisher BioReagentsBP151Do przepuszczalności komórek Normalna
surowica osłaJackson ImmunoResearch017-000-121Odczynniki blokujące do immunofluorescencji
Przeciwciało anty-Ki67abcamab15580Do immunofluorescencji Ki67
Poliklonalny antyinsulinowy antyinsulinowy świnka morskaDakoA0564Do immunofluorescencji insuliny
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-RabbitJackson ImmunoResearch711-165-152Dla immunofluorescencji Ki67
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea PigJackson ImmunoResearch706-175-148Do immunofluorescencji insuliny
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dichlorowodorek)ThermoFisher ScientificD1306Do wizualizacji jąder w immunofluorescencji
Aqua-MountLerner Laboratories13800Szybkoschnące media montażowe
FreeZone -105 ° C 4,5-litrowy kaskadowy stołowy system liofilizacjiLabconco7382020Do liofilizacji mikrosfer
wysepek

Bibliografia

  1. Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
  2. Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).
  3. Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
  4. McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823(2012).
  5. Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).
  6. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
  7. Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
  8. Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
  9. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255(2007).
  10. Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).
  11. Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).
  12. Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).
  13. Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).
  14. Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).
  15. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
  16. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
  17. Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).
  18. Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
  19. Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).
  20. Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).
  21. Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).
  22. Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
  23. Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).
  24. Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikrosfery PLGAproliferacja kom rek betanienaruszone wyspyprzed u one uwalnianieadowanie zwi zkugenerowanie mikrosferhodowla wyspimmunoznakowaniekwantyfikacja Ki67cyto wir wka

Powiązane artykuły