Artykuł metodologiczny

Charakterystyka transportu elektronów przez żywe biofilmy

DOI:

10.3791/54671

⸱

1 czerwca 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Bio/Molecular Science and Engineering, Naval Research Laboratory, 2George Mason University, 3Chemistry Division, Naval Research Laboratory, 4Departments of Physics, Biological Sciences, and Chemistry, University of Southern California, 5Department of Chemical Engineering and Materials Science, Michigan State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół pomiaru przewodnictwa elektrycznego żywych biofilmów mikrobiologicznych w fizjologicznie istotnych warunkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj demonstrujemy metodę bramkowania elektrochemicznego używaną do charakteryzowania przewodnictwa elektrycznego biofilmów mikrobiologicznych hodowanych na elektrodach w fizjologicznie istotnych warunkach. 1 Te pomiary są wykonywane na żywych biofilmach w środowisku wodnym za pomocą elektrod źródłowych i drenujących wzorowanych na powierzchni szkła w specjalistycznej konfiguracji określanej jako układ elektrod międzypalcowych (IDA). Hodowany jest biofilm, który rozciąga się w poprzek szczeliny łączącej źródło i dren. Potencjały są przykładane do elektrod (E, S i E,D), generując prąd źródłowo-drenujący (ISD) przez biofilm między elektrodami. Zależność przewodności elektrycznej od potencjału bramki (średnia potencjałów źródła i drenu, EG = [ED + ES]/2) jest określana poprzez systematyczną zmianę potencjału bramki i pomiar wynikowego prądu źródło-dren. Zależność przewodnictwa od potencjału bramki dostarcza mechanistycznych informacji na temat procesu pozakomórkowego transportu elektronów leżącego u podstaw przewodnictwa elektrycznego badanego biofilmu. Opisana tutaj metoda pomiaru bramkowania elektrochemicznego jest bezpośrednio oparta na metodzie używanej przez M. S. Wrighton2,3 i współpracowników oraz R. W. Murraya4,5,6 i współpracowników w latach 1980-tych do badania cienkowarstwowych polimerów przewodzących.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zewnątrzkomórkowy transport elektronów (EET) to proces, który umożliwia niektórym mikroorganizmom transport elektronów między wewnątrzkomórkowymi procesami metabolicznymi a nierozpuszczalnymi akceptorami lub donorami elektronów, które znajdują się poza komórką, począwszy od naturalnych minerałów po elektrody. W niektórych przypadkach EET umożliwia mikroorganizmom tworzenie przewodzących elektrycznie wielokomórkowych grubych biofilmów na powierzchniach elektrod, w których komórki niemające bezpośredniego kontaktu z elektrodą mogą nadal wykorzystywać ją jako metaboliczny akceptor lub donor elektronów. Istnieje duże zainteresowanie takimi biofilmami, jak katalizatory elektrodowe do różnych zastosowań, takich jak elektrosynteza mikrobiologiczna, wykrywanie/usuwanie zanieczyszczeń oraz zdalne wytwarzanie i magazynowanie energii,7,8,9,10,11,12,13,14 ze względu na różnorodność procesów metabolicznych przeprowadzanych przez mikroorganizmy oraz trwałość biofilmów mikrobiologicznych w porównaniu do bioelektrod opartych na enzymach. 15,16 Ponadto, szlaki EET mogą być potencjalnie wykorzystywane do elektrycznego sterowania lub sygnalizowania zmian w naturalnie występujących lub genetycznie modyfikowanych mikrobiologicznych procesach metabolicznych zaangażowanych na przykład w produkcję pożądanego produktu lub wykrywanie docelowego analitu lub bodźca. Przewodność elektryczna biofilmów elektrokatalitycznych, która odróżnia je od innych materiałów biologicznych, jest centralnym aspektem ich właściwości elektrokatalitycznych, jednak niewiele wiadomo na temat procesu leżącego u podstaw EET w środowisku elektrod, a to, co wiadomo, jest wysoce kwestionowane. 17,18,19,20,21,22,23,24

Opisana tutaj jest metoda pomiaru przewodności przez żywe, hodowane na elektrodach biofilmy przy użyciu międzypalcowych matryc elektrod (IDA). IDA składają się z równoległych prostokątnych elektrod umieszczonych na płaskiej powierzchni szkła w taki sposób, że co drugie pasmo jest połączone po przeciwnych stronach matrycy, co daje 2 elektrody (źródło i dren). Dokładne zbadanie IDA (patrz na przykład Rysunek 6.12b w odnośniku #1) ujawnia, że przerwy oddzielające sąsiednie pasma są również połączone w taki sposób, że tworzą pojedynczą przerwę, która przeplata się tam i z powrotem w poprzek układu oddzielającego dwie elektrody. Rezultatem jest długa i wąska szczelina oddzielająca elektrody źródłowe i drenowe, wytwarzająca bardzo wysokie prądy źródłowo-drenowe, gdy materiał przewodzący jest formowany, odlewany, polimeryzowany lub hodowany (w przypadku rozważanego tutaj rodzaju biofilmów) na matrycy. Ponadto mały rozmiar elektrod powoduje mały prąd tła spowodowany ładowaniem pojemnościowym i zmianą stopnia utlenienia materiału przewodzącego ze zmianą potencjału bramki, ponieważ ilość materiału potrzebnego do wykonania pomiarów przewodności za pomocą IDA jest tak mała. Opisana tutaj technika bramkowania elektrochemicznego oparta na IDA, opracowana w celu scharakteryzowania cienkowarstwowych polimerów przewodzących,2,3,4,25 dopiero niedawno została zastosowana w żywych systemach. 18 Inna technika używana do pomiaru przewodnictwa żywych biofilmów wykorzystywała wielkoformatowe elektrody rozdzielające źródło i drenaż oraz mierniki źródła do ustawiania potencjału bramki. 26,27 Jednak obawy dotyczące tych metod zostały szczegółowo opisane wcześniej. 18

Poniższy protokół podsumowuje nasze doświadczenie w pomiarach przewodności żywych biofilmów siarkowych Geobacter i biokatodowych MCL. G. sulfurreducens jest modelowym organizmem redukującym elektrody, zdolnym do wykorzystywania materiałów nierozpuszczalnych, w tym elektrod, jako jedynego metabolicznego akceptora elektronów. Dodatkowo tworzy grube biofilmy, które są w stanie transportować elektrony na wielu długościach komórek, co czyni go idealnym organizmem modelowym do badania anodowego zewnątrzkomórkowego transferu elektronów na duże odległości. Dołączamy również szczegóły dotyczące badania biokatody MCL, tlenowego, autotroficznego mieszanego biofilmu wyizolowanego z katody bentosowego mikrobiologicznego ogniwa paliwowego. Biokatoda MCL (nazwana tak na cześć trzech głównych składników – Marinobacter, Chromatiaceaea i Labrenzia) jest zdolna do utleniania elektrody jako jej jedynego donora elektronów i transportu elektronów na wielu długościach komórek, co czyni go interesującym systemem katodowym do badania. Ponadto biokatoda MCL ma najwyższą odnotowaną do tej pory przewodność dla żywego systemu przy użyciu tych metod. Włączenie tych różnorodnych biofilmów elektroaktywnych do tego protokołu ma na celu podkreślenie, że technika ta ma zastosowanie do pomiaru transportu elektronów przez dowolny żywy biofilm zdolny do elektrycznej interakcji z elektrodami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie międzypalcowej matrycy mikroelektrod (IDA)

  1. Zaopatrz się w dostępne na rynku elektrody IDA wzorowane na podłożu nieprzewodzącym lub zsyntetyzuj je przy użyciu standardowych metod litograficznych. 28
    UWAGA: Wymiary i/lub materiały IDA mogą być zmieniane w zależności od pożądanych warunków dla różnych eksperymentów. Zastosowane tutaj IDA zostały uzyskane komercyjnie i składały się z dwóch międzypalcowych złotych mikroelektrod wzorowanych na szklanym podłożu połączonych z dużymi elektrodami na przeciwległych końcach matrycy. Elektrody są odsłonięte, podczas gdy linie magistrali łączące elektrody z dużymi podkładkami kontaktowymi są pokryte cienkim materiałem izolacyjnym. Zastosowane tutaj IDA składają się z dwóch zestawów złotych pasm mikroelektrod o szerokości 10 μm i długości 2 mm (źródło i dren) rozmieszczonych w odległości 5 μm od siebie, wzorowanych na płaskiej powierzchni szkła. Zastosowane tu IDA miały 65 par elektrod (łącznie 130 pasm międzypalcowych). Naprzemienne pasma są połączone z elektrodami na przeciwległych końcach matrycy.
  2. Drut i izolacja IDA
    1. Przymocuj drut do każdej dużej elektrody za pomocą przewodzącej srebrnej żywicy epoksydowej.
      1. Przygotuj przewodzącą żywicę epoksydową zgodnie z instrukcjami producenta dla konkretnej używanej żywicy epoksydowej z prętem do mieszania lub końcówką pipety (instrukcje mogą się różnić w zależności od producenta).
      2. Umieść drut na każdej złotej podkładce, zabezpiecz ją taśmą laboratoryjną. Przykryj drut i podkładkę srebrną żywicą epoksydową za pomocą pręta mieszającego lub końcówki pipety.
      3. Ostrożnie przenieś do pieca o temperaturze 80 °C na 1 godzinę w celu utwardzenia lub utwardzenia w oparciu o zalecenia producenta dotyczące konkretnej zastosowanej przewodzącej żywicy epoksydowej ze srebra.
      4. Po utwardzeniu żywicy epoksydowej użyj multimetru, aby zapewnić łączność elektryczną między końcem drutu a podkładkami. Rezystancja między drutem a podkładką powinna wynosić < 5 Ω. Użyj również multimetru, aby sprawdzić, czy żadna przewodząca żywica epoksydowa nie łączy wielu elektrod, ponieważ może to spowodować zwarcie matrycy. Jeśli przewodząca żywica epoksydowa łączy wiele przewodów, użyj rysika, aby odizolować przewody.
    2. Zaizoluj połączenie epoksydowe, pokrywając je termicznym, elektrycznym i wodoodpornym materiałem izolacyjnym. Często odpowiednie są ognioodporne żywice poliuretanowe.
      1. Usuń końcówkę stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml (w przybliżeniu na znaku 2.5 ml) jako formę dla materiału izolacyjnego. Wykonaj dwa małe otwory w dnie, aby przewody wystawały za pomocą igły 21g.
      2. Włóż IDA do formy i przewody przez otwory w dolnej części formy.
      3. Przygotuj konkretny materiał izolacyjny. Postępuj zgodnie z instrukcjami dołączonymi do konkretnej uzyskanej żywicy.
      4. Odpipetować izolator do formy tak, aby srebrna żywica epoksydowa była całkowicie pokryta (~2,5 ml) i pozostawić do wyschnięcia zgodnie ze specyfikacją producenta.

2. Konfiguracja reaktora elektrochemicznego, testowanie i inokulacja

  1. Skonfiguruj ogniwo elektrochemiczne.
    1. Włóż IDA, elektrodę przeciwstawną i elektrodę odniesienia do ogniwa elektrochemicznego.
      UWAGA: Zastosowany reaktor elektrochemiczny może się znacznie różnić, o ile wszystkie elektrody mieszczą się w środku. Jedną z kwestii jest to, że elektroda referencyjna powinna znajdować się jak najbliżej elektrody roboczej, biorąc pod uwagę praktyczne ograniczenia reaktora. Tutaj używamy reaktora jednokomorowego z elektrodą odniesienia ~2-3 cm od elektrod roboczych. Ponadto przeciwelektroda powinna być większa niż elektroda robocza, aby zapewnić, że nie ogranicza systemu.
    2. Jeśli pracujesz z czystą kulturą, wysterylizuj reaktor z przeciwelektrodą w środku. Wysterylizuj elektrodę referencyjną, mocząc ją w wybielaczu przez 10 minut i sterylnej wodzie dejonizowanej przez 10 minut. Wysterylizuj IDA, zanurzając go w wybielaczu na 5 s, a następnie sterylną wodą dejonizowaną przez 10 s przed włożeniem do reaktora.
    3. Napełnij ogniwo elektrochemiczne sterylnym podłożem odpowiednim do wzrostu biofilmu. Dla G. sulfurreducens17,18, użyj podłoża słodkowodnego z wyłączeniem fumaranu. W przypadku biokatody MCL,9 użyj sztucznego medium z wodą morską. 9
    4. Podłącz elektrody do bipotencjostatu. Podłącz jedną elektrodę IDA do przewodu roboczego 1, drugą elektrodę IDA do przewodu roboczego 2, elektrodę odniesienia do przewodu odniesienia, a przeciwelektrodę do przewodu przeciwnego.
  2. Badania elektrochemiczne IDA.
    UWAGA: Głównym celem tego testu jest upewnienie się, że dwie elektrody są elektrycznie odizolowane. Wszystkie techniki elektrochemiczne są dostępne w oprogramowaniu służącym do sterowania bipotencjostatem.
    1. Wykonaj kontrolne testy przewodności (przed wzrostem biofilmu) w celu zapewnienia prawidłowego działania IDA za pomocą bipotencjostatu.
      1. Zmierz potencjał obwodu otwartego każdej elektrody przez 1 min.
        UWAGA: W niektórych przyrządach potencjał obwodu otwartego należy osiągnąć za pomocą programu do zbierania galwanostatyków i ustawiając prąd na 0 mA.
      2. Zmierz potencjał obwodu otwartego elektrody 2 podczas wykonywania cyklicznej woltamperometrii na elektrodzie 1 w zakresie od +0,2 V do +0,6 V (w porównaniu z SHE) przy 20 mV/s.
        UWAGA: W razie potrzeby można zastosować inne limity i wskaźniki skanowania dla CV. Należy jednak unikać potencjałów, które spowodują wytwarzanie wodoru lub tlenu.
      3. Sprawdzić, czy potencjał obwodu otwartego mierzony na elektrodzie 2 nie odzwierciedla potencjału elektrody 1 podczas CV za pomocą oprogramowania potencjostatu.
        UWAGA: Potencjał obwodu otwartego elektrody 2 może się zmieniać, ale powinien być niezależny od potencjału elektrody 1.
      4. Powtórzyć kroki od 2.2.1.1 do 2.2.1.3, z wyjątkiem kontroli potencjału elektrody 2 i pomiaru potencjału obwodu otwartego elektrody 1.
    2. Ustaw potencjał elektrod roboczych na pożądany potencjał wzrostu odpowiedniego biofilmu elektroaktywnego za pomocą oprogramowania bipotencjostatu. Na przykład użyj +0,5 V (w porównaniu z SHE) dla Geobacter sulfurreducens lub +0,31 V (w porównaniu z SHE) dla biokatody MCL.
  3. Wyhodować odpowiedni biofilm elektroaktywny
    1. Zaszczepić reaktor elektrochemiczny z kultury podstawowej/wzbogacenia pożądanych elektrochemicznie aktywnych mikroorganizmów przy użyciu standardowych aseptycznych technik mikrobiologicznych. W przypadku standardowych testów, zaszczepić w stosunku 1:20 (objętość inokulum do reaktora) kultury OD600 = 0,5.
    2. Ustaw mieszanie w reaktorze na żądany poziom (~200 obr./min), a inkubator/łaźnię wodną na żądaną temperaturę w oparciu o warunki wzrostu interesującego nas biofilmu. W przypadku G. sulfurreducens należy stosować 30 °C dla optymalnego wzrostu.
    3. Inkubować system w oparciu o specyficzne wymagania mikroorganizmu lub mikroorganizmów będących przedmiotem zainteresowania, aż biofilm wypełni lukę oddzielającą dwie elektrody. W przypadku stacjonarnego biofilmu G. sulfurreducens inkubować przez ~ 7-10 dni. W przypadku biokatody MCL inkubować ~ 7 dni. W każdym przypadku należy kontrolować temperaturę na poziomie 30 °C.

3. Eksperymenty z bramkowaniem elektrochemicznym

  1. Wybierz parametry eksperymentalne, które zostaną użyte do określenia zależności prąd-potencjał dla pomiarów bramkowania.
    1. Określ zakres potencjałów bramki, które zostaną zastosowane do IDA w celu uzyskania krzywej prądu przewodzonego (ISD) w funkcji potencjału bramki (EG) dla systemu.
      UWAGA: Zakres badanych potencjałów bramek powinien obejmować wszystkie potencjały z możliwą aktywnością redoks. Jeśli nie są dostępne żadne informacje o interesującym nas systemie, należy zastosować szeroki zakres potencjału (od -0,55 do +0,6 V w porównaniu z SHE). Podejście oparte na próbach i błędach można zastosować w celu precyzyjnego dostrojenia zakresu w oparciu o badany system. Potencjał bramki jest zdefiniowany jako:
      figure-protocol-1
      gdzie ED jest potencjałem elektrody drenowej, a ES jest potencjałem elektrody źródłowej. Zakres stosowanych potencjałów bramek jest ograniczony wymaganiami i ograniczeniami konkretnego systemu będącego przedmiotem zainteresowania. 18
      UWAGA: Należy unikać potencjałów źródłowych i drenowych, które spowodują wydzielanie tlenu i wodoru, ponieważ procesy te mogą uszkodzić biofilm.
    2. Określ napięcie źródło-dren (VSD), które będzie używane jako siła napędowa transportu elektronów przez folię ze źródła do drenu. Napięcie źródło drenu jest zdefiniowane jako:
      figure-protocol-2
      UWAGA: Napięcie drenu źródła powinno być na tyle małe, aby ISD skalowało się liniowo z VSD. 17
    3. Wybierz szybkość skanowania (v), przy której EG zmienia się liniowo w czasie, który jest niezależny od ISD, tak aby można było w przybliżeniu ustawić system w stanie ustalonym dla każdego potencjału bramki.
      UWAGA: Szybkość skanowania mniejsza niż 0,002 V/s jest często stosowana w systemach biologicznych. 29,30
    4. Skonfiguruj oprogramowanie bipotencjostatu, aby wykonywać pomiary bramkowania (tj. przemiatać potencjał bramki) w wybranym zakresie, przy wybranym napięciu drenu źródła i z żądaną szybkością skanowania w oparciu o powyższe rozważania.
      UWAGA: Dla poprzednich pomiarów bramkowania przy użyciu G. sulfurreducens,17,19 EG = -0,55 V do 0,6 V (w porównaniu z SHE), VSD = 0,01 V lub 0,1 V, v = 0,001 V/s. Dla biokatody MCL, EG = 0,25 V do 0,7 V (w porównaniu z SHE), VSD = 0,002 V, v = 0,0002 V/s.
      1. Dodatkowo należy wykonać pomiar podstawowy przy VSD = 0,000 V (tj. CV na każdej elektrodzie z osobna pobranej jednocześnie) przy tym samym v wybranym w kroku 3.1.3.
    5. Wykonać pomiary bramkowania stosując warunki określone w ppkt 3.1.4 zarówno w warunkach obrotu (z obecnym rozpuszczalnym donorem lub akceptorem elektronów), jak i bez obrotu (bez rozpuszczalnego donora lub akceptora elektronów).
      UWAGA: Warunki bez obrotu są korzystne, ponieważ pomiary nie są przesłonięte przez utlenianie lub redukcję rozpuszczalnych związków dla metabolizmu komórkowego, chociaż podobne wyniki należy uzyskać niezależnie od tego, który warunek jest używany po odjęciu prądów tła (szczegółowo w 3.1.8).
      1. Osiągnij warunki obrotu, używając tego samego medium reaktorowego, które jest używane do rozwoju bakterii na elektrodzie. To podłoże zawiera rozpuszczalny donor elektronów, taki jak octan dla G. sulfurreducens,17 lub akceptor, taki jak tlen dla Biokatody MCL.
      2. Osiągnij warunki bez obrotu, tworząc na elektrodzie tę samą pożywkę reaktora, która jest używana do wzrostu bakterii, z wyjątkiem pominięcia rozpuszczalnego donora lub akceptora elektronów. Po upewnieniu się, że potencjostat jest wyłączony, usunąć pożywkę w sposób aseptyczny i dodać świeżą pożywkę bez donora elektronów w przypadku systemów anodowych lub akceptora w przypadku systemów katodowych. Alternatywnie można skonfigurować system ciągłego przepływu, aby powoli wymieniać medium na pożądane medium w warunkach bez obrotu.
        UWAGA: Jeśli tlen jest rozpuszczalnym akceptorem elektronów (jak w przypadku biokatody MCL), należy spryskać układ mieszaniną ~15% CO2 i 85% N2 (lub mieszaniną gazów, która utrzyma prawidłowe pH w pożywce).
    6. Po zakończeniu pomiarów bramkowania, należy użyć oprogramowania potencjostatu, aby ustawić potencjał każdej elektrody z powrotem na potencjał wzrostu, aby umożliwić ponowną stabilizację systemu (przy użyciu tych samych wartości, co w ppkt 2.2.2).
    7. Jeśli wszystkie warunki opisane powyżej są spełnione (ISD jest niezależne od v i skaluje się liniowo za pomocą VSD), przelicz wartości ISD na przewodność, korzystając z następujących równań, jak opisano wcześniej31
      figure-protocol-3
      figure-protocol-4
    8. gdzie G jest przewodnością, a S jest współczynnikiem skalującym, który jest zależny od systemu i uwzględnia zmienne, takie jak rozmiar elektrody, rozmiar szczeliny i wysokość biofilmu. W przypadku niektórych układów S można wyznaczyć na podstawie wstępnie określonych równań. 31 Alternatywnie, S można obliczyć numerycznie za pomocą oprogramowania do modelowania, jak opisano wcześniej. 17
    9. Odejmij prądy tła, aby określić kształt i wielkość przewodzonego prądu. Albo odejmij prąd generowany przy VSD = 0,00 V od prądu generowanego przy VSD = 0,01 V, albo odejmij prąd drenu od prądu źródłowego generowanego przy VSD = 0,01 V. Każda metoda usuwa prądy tła, pozostawiając tylko prąd przewodzony.
  2. Pomiary elektrochemiczne wpinningu zależne od temperatury
    1. Określ zakres temperatur będących przedmiotem zainteresowania. Zakres ten jest w dużym stopniu zależny od badanego systemu, jednak należy stosować temperatury istotne fizjologicznie.
      UWAGA: W poprzednich badaniach wykorzystano zakres temperatur od 10 °C do 30 °C do zbadania transportu elektronów w fizjologicznie istotnych warunkach dla mikroorganizmów mezofilnych. 17
    2. Zaopatrz się w recyrkulacyjną łaźnię wodną lub inkubator do regulacji temperatury reaktora oraz reaktor kontrolny, aby upewnić się, że nastawa i rzeczywista temperatura medium są takie same.
      1. Umieść termometr lub termoparę w reaktorze kontrolnym, w którym znajdowałaby się IDA.
    3. Wykonać pomiaryI SD (patrz ppkt 3.1.4) w zakresie temperatur wybranych w warunkach obrotu i braku obrotu (opisanych w kroku 3.1.5) przy użyciu bipotencjostatu, postępując zgodnie z jedną z dwóch procedur opisanych poniżej.
      1. Wygeneruj krzywe ISD w funkcji EG, jak opisano powyżej (patrz ppkt 3.1), dla każdej temperatury w interesującym nas zakresie temperatur. W przypadku materiałów, które wykazują przewodność redoks, takich jak G. sulfurreducens i Biocathode MCL, prąd szczytowy z każdej temperatury jest używany do określenia zależności ISD i T.
        UWAGA: Ta metoda służy do generowania pełnej krzywej ISD w stosunku do EG dla każdej temperatury, ale wymaga więcej czasu niż druga opcja.
      2. Alternatywnie, ustawić i utrzymać IDA na potencjale bramki, który daje maksymalny prąd przewodzony za pomocą bipotencjostatu (uzyskany z krzywej ISD vs EG, krok 3.1.4) i zarejestrować maksymalny prąd przewodzony za pomocą bipotencjostatu, podczas gdy temperatura jest cyklicznie zmieniana między zakresem temperatur wybranych za pomocą pokładowych elementów sterujących łaźni wodnej lub inkubatora.
        UWAGA: Przy zastosowanej tutaj geometrii elektrody/reaktora, ISD i T mogą stabilizować się przez co najmniej 20 minut, a dla każdej temperatury stosuje się średnią stabilną ISD. W zależności od konkretnego systemu może być wymagany dłuższy lub krótszy czas stabilizacji. Ta metoda jest szybsza niż pierwsza i powoduje mniejsze obciążenie biofilmu. Jednak pełne krzywe bramkowania nie są generowane.
      3. Zmieniaj temperaturę od jednej wartości zadanej do drugiej i z powrotem, korzystając z pokładowych elementów sterujących inkubatora lub łaźni wodnej, aby określić odwracalność reakcji, aby upewnić się, że cykliczne zmiany temperatury nie uszkadzają biofilmu.
    4. Zresetuj temperaturę z powrotem do normalnej temperatury wzrostu za pomocą wbudowanych elementów sterujących inkubatora lub łaźni wodnej i poczekaj, aż system się ustabilizuje.
      UWAGA: W przypadku przewodnika redoks dane ISD w funkcji 1/T można dopasować do wyrażenia szybkości Arrheniusa, które umożliwia obliczenie energii aktywacji w następujący sposób:
      figure-protocol-5
      figure-protocol-6
      gdzie Ea jest energią aktywacji dla transferu elektronów między sąsiednimi kofaktorami redoks, a k jest stałą Boltzmanna.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IDA zostały okablowane, zaizolowane i przetestowane, aby upewnić się, że dwie elektrody są od siebie elektrycznie odizolowane (Rysunek 1). Reaktory zmontowano, zaszczepiono G. sulfurreducens i inkubowano, aż biofilm wypełni lukę między elektrodami. Można wizualnie zobaczyć, że biofilm G. sulfurreducens pokrywa matrycę. Inne biofilmy mogą wymagać od badacza wykonania pomiarów bramkowania elektrochemicznego, aby sprawdzić, czy dwie elektrody zostały poł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas konfiguracji IDA ważne jest, aby sprawdzić, czy źródło i drenaż nie są ze sobą zwarte przed pomiarami bramkowania elektrochemicznego, ponieważ zmieni to krzywą ISD w stosunku do EG i może prowadzić do błędnych wyników i interpretacji. Bardzo ważne jest również wybranie V, SD i v w taki sposób, aby prąd był liniowo zależny od VSD i niezależny od v. Jeśli tak nie jest, równania opisane powyżej nie mogą być wykorzystane do obliczenia przewodności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.D.Y, S.M.G-S. i L.M.T. uznają Biuro Badań Marynarki Wojennej (Nagroda #N0001415WX01038 i N0001415WX00195), Laboratorium Badawcze Marynarki Wojennej oraz Instytut Nanonauk Laboratorium Badawczego Marynarki Wojennej; M.Y.E.-N. jest wspierany przez Departament Energii Stanów Zjednoczonych w ramach grantu DE-FG02-13ER16415.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IDAsCH Instruments012125Wyprodukowano przez ALS-Japan; sprzedawane przez CH Instruments
DrutDigikeyW7-ND
Przewodzący srebrny epoksydMikroskopia elektronowa nauki12670-EE
Materiał izolacyjny3M2131-BScotchast Związek zmniejszający palność
15 ml stożkowa rurka wirówkowaVWR89004-368
Igła 21 gVWRBD-305165
Końcówki do pipet 5 mlVWR82018-842
Pikier 5 mlVWR89079-976
Składniki do pożywki słodkowodnejSigma AldrichWszystkie standardowe chemikalia laboratoryjne
      Chlorek
      Fosforan sodu jednozasadowy
      Wodorowęglan
Składniki sztucznej wody morskiejSigma AldrichWszystkie standardowe chemikalia laboratoryjne
      Chlorek
      Chlorek magnezu sześciowodny
      Siarczan magnezu siedmiowodny
      Chlorek
      Wodorowęglan
      Chlorek wapnia dwuwodny
      Chlorek
      Fosforan potasu dwuzasadowy
Ag/AgCl elektroda referencyjnaBasiMF-2079
Grafitowa elektroda przeciwprętowaMikroskopia elektronowa nauki70230
Łaźnia recyrkulacyjnaThermo Scientific152-5256
BipotencjostatInstrumenty sosnoweWD-20http://www.voltammetry.net/pine/aftermath/user
MieszadłaVWR58947-114
G. sulfurreducens kulturaATCC51573
Reaktor z płaszczemPine InstrumentsRRPG085
amonusodu sodu potasu sodu amonu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyd, D. A., et al. Biofilms in Bioelectrochemical Systems. , John Wiley & Sons, Inc. 177-210 (2015).
  2. Natan, M. J., Wrighton, M. S. Chemically modified microelectrode arrays. Prog Inorg Chem. 7, 391-494 (1990).
  3. Paul, E. W., Ricco, A. J., Wrighton, M. S. Resistance of polyaniline films as a function of electrochemical potential and the fabrication of polyaniline-based microelectronic devices. J Phys Chem-US. 89, 1441-1447 (1985).
  4. Dalton, E. F., et al. Charge transport in electroactive polymers consisting of fixed molecular redox sites. Chem Phys. 141, 143-157 (1990).
  5. Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Electroactive Polymers and Macromolecular Electronics. Science. 231, 25-31 (1986).
  6. Chidsey, C. E. D., Murray, R. W. Redox capacity and direct current electron conductivity in electroactive materials. J Phys Chem-US. 90, 1479-1484 (1986).
  7. Gregoire, K. P., Glaven, S. M., Hervey, J., Lin, B., Tender, L. M. Enrichment of a High-Current Density Denitrifying Microbial Biocathode. J Electrochem Soc. 161, H3049-H3057 (2014).
  8. Siegert, M., Yates, M. D., Spormann, A. M., Logan, B. E. Methanobacterium dominates biocathodic Archaeal communities in methanogenic microbial electrolysis cells. ACS Sus Chem Eng. 3, 1668-1676 (2015).
  9. Wang, Z., et al. A previously uncharacterized, nonphotosynthetic member of the Chromatiaceae is the primary CO2-fixing constituent in a self-regenerating biocathode. Appl Environ Microbiol. 81, 699-712 (2015).
  10. Marshall, C. W., Ross, D. E., Fichot, E. B., Norman, R. S., May, H. D. Long-term Operation of Microbial Electrosynthesis Systems Improves Acetate Production by Autotrophic Microbiomes. Environ Sci Technol. 47, 6023-6029 (2013).
  11. Strik, D. P. B. T. B., Picot, M., Buisman, C. J. N., Barrière, F. pH and Temperature Determine Performance of Oxygen Reducing Biocathodes. Electroanalysis. 25, 652-655 (2013).
  12. Strycharz, S. M., et al. Reductive dechlorination of 2-chlorophenol by Anaeromyxobacter dehalogenans with an electrode serving as the electron donor. Environ Microbiol Report. 2, 289-294 (2010).
  13. Yates, M. D., et al. Microbial Electrochemical Energy Storage and Recovery in a Combined Electrotrophic and Electrogenic Biofilm. Environ Sci Technol Lett. 4, 374-379 (2017).
  14. Tender, L. M., et al. Harnessing microbially generated power on the seafloor. Nature Biotechnology. 20, 821-825 (2002).
  15. Yates, M. D., Siegert, M., Logan, B. E. Hydrogen evolution catalyzed by viable and non-viable cells on biocathodes. Int J Hydrogen Energ. 39, 16841-16851 (2014).
  16. Fokina, O., Eipper, J., Winandy, L., Kerzenmacher, S., Fischer, R. Improving the performance of a biofuel cell cathode with laccase-containing culture supernatant from Pycnoporus sanguineus. Bioresource Technol. 175, 445-453 (2015).
  17. Yates, M. D., et al. Thermally activated long range electron transport in living biofilms. Phys Chem Chem Phys. 17, 32564-32570 (2015).
  18. Yates, M. D., et al. Measuring conductivity of living Geobacter sulfurreducens biofilms. Nat Nano. 11, 910-913 (2016).
  19. Snider, R. M., Strycharz-Glaven, S. M., Tsoi, S. D., Erickson, J. S., Tender, L. M. Long-range electron transport in Geobacter sulfurreducens biofilms is redox gradient-driven. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 15467-15472 (2012).
  20. Strycharz-Glaven, S. M., Snider, R. M., Guiseppi-Elie, A., Tender, L. M. On the electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms. Energ Environ Sci. 4, 4366-4379 (2011).
  21. Malvankar, N. S., Tuominen, M. T., Lovley, D. R. Comment on "On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms" by S. M. Strycharz-Glaven, R. M. Snider, A. Guiseppi-Elie and L. M. Tender, Energy Environ. Sci., 2011, 4, 4366. Energy Environ. Sci. 5, 6247-6249 (2012).
  22. Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nanotechnol. 6, 573-579 (2011).
  23. Strycharz-Glaven, S. M., Tender, L. M. Reply to the 'Comment on "On electrical conductivity of microbial nanowires and biofilms"' by N. S. Malvankar, M. T. Tuominen and D. R. Lovley, Energy Environ. Sci., 2012, 5. Energy Environ. Sci. 5, 6250-6255 (2012).
  24. Strycharz-Glaven, S. M., et al. Electron Transport through Early Exponential-Phase Anode-Grown Geobacter sulfurreducens Biofilms. Chem Electro Chem. 1, 1957-1965 (2014).
  25. Chidsey, C. E., Feldman, B. J., Lundgren, C., Murray, R. W. Micrometer-spaced platinum interdigitated array electrode: fabrication, theory, and initial use. Anal Chem. 58, 601-607 (1986).
  26. Li, C., Lesnik, K. L., Fan, Y., Liu, H. Redox Conductivity of Current-Producing Mixed Species Biofilms. PLOS ONE. 11, e0155247(2016).
  27. Malvankar, N. S., et al. Tunable metallic-like conductivity in microbial nanowire networks. Nat Nano. 6, 573-579 (2011).
  28. Ing, N. L., Nusca, T. D., Hochbaum, A. I. Geobacter sulfurreducens pili support ohmic electronic conduction in aqueous solution. Phys Chem Chem Phys. 19, 21791-21799 (2017).
  29. Fricke, K., Harnisch, F., Schröder, U. On the use of cyclic voltammetry for the study of anodic electron transfer in microbial fuel cells. Energ Environ Sci. 1, 144-147 (2008).
  30. Marsili, E., Rollefson, J. B., Baron, D. B., Hozalski, R. M., Bond, D. R. Microbial biofilm voltammetry: direct electrochemical characterization of catalytic electrode-attached biofilms. Appl Environ Microbiol. 74, 7329-7337 (2008).
  31. Kankare, J., Kupila, E. -L. In-situ conductance measurement during electropolymerization. J Electroanal Chem. 322, 167-181 (1992).
  32. Byun, H. S., Pirbadian, S., Nakano, A., Shi, L., El-Naggar, M. Y. Kinetic Monte Carlo Simulations and Molecular Conductance Measurements of the Bacterial Decaheme Cytochrome MtrF. Chem Electro Chem. 1, 1932-1939 (2014).
  33. El Kasmi, A., Wallace, J. M., Bowden, E. F., Binet, S. M., Linderman, R. J. Controlling interfacial electron-transfer kinetics of cytochrome c with mixed self-assembled monolayers. J Am Chem Soc. 120, 225-226 (1998).
  34. Bortolotti, C. A., et al. The Reorganization Energy in Cytochrome c is Controlled by the Accessibility of the Heme to the Solvent. J Phys Chem Lett. 2, 1761-1765 (2011).
  35. Gallaway, J. W., Calabrese Barton, S. A. Kinetics of Redox Polymer-Mediated Enzyme Electrodes. J Am Chem Soc. 130, 8527-8536 (2008).
  36. Thackeray, J. W., White, H. S., Wrighton, M. S. Poly(3-methylthiophene)-coated electrodes: optical and electrical properties as a function of redox potential and amplification of electrical and chemical signals using poly(3-methylthiophene)-based microelectrochemical transistors. J Phys Chem-US. 89, 5133-5140 (1985).
  37. Jugnet, Y., Tourillon, G., Duc, T. M. Evidence of Intrinsic Extended π-Bonding Band and Metalliclike Behavior in Undoped and Doped Electropolymerized Poly (3-methylthiophene) Films. Phys Rev Lett. 56, 1862-1865 (1986).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bramkowanie elektrochemicznemacierz elektrod przerywnie rozmieszczonychpozakom rkowy transport elektron wbiofilmy mikrobiologicznebipotencjostatGeobacter sulfurreducensprzewodz ce filmy polimerowepr d r d o drenpotencja bramkicykle temperaturowe

Powiązane artykuły