Metoda pomiaru modyfikacji RNA N 6-metyloadenozyny w komórkach i tkankach

Summary

Opisana jest zmodyfikowana metoda northern blot do pomiaru modyfikacji N 6-metylodenozyny (m⁶A) w RNA. Obecna metoda może wykrywać modyfikacje w różnych RNA i kontrolach w ramach różnych projektów eksperymentalnych.

Abstract

N 6-metylodenozyna (m⁶A) modyfikacje RNA są zróżnicowane i wszechobecne wśród eukariontów. Występują w mRNA, rRNA, tRNA i mikroRNA. Ostatnie badania wykazały, że te odwracalne modyfikacje RNA wpływają na splicing, translację, degradację i lokalizację RNA. Wiele procesów fizjologicznych, takich jak rytmy okołodobowe, pluripotencja komórek macierzystych, zwłóknienie, metabolizm trójglicerydów i otyłość, jest również kontrolowanych przez modyfikacje m^6A. Immunoprecypitacja/sekwencjonowanie, spektrometria mas i zmodyfikowane northern blotting to tylko niektóre z metod powszechnie stosowanych do pomiaru modyfikacji m⁶A. W niniejszym artykule przedstawiamy technikę blottingu północno-wschodniego do pomiaru modyfikacji m⁶A. Obecny protokół zapewnia dobrą separację wielkości RNA, lepszą akomodację i standaryzację dla różnych projektów eksperymentalnych oraz jasne rozgraniczenie modyfikacji m⁶A w różnych źródłach RNA. Chociaż wiadomo, że modyfikacje m⁶A mają kluczowy wpływ na fizjologię człowieka w odniesieniu do rytmów okołodobowych i otyłości, ich rola w innych stanach (pato)fizjologicznych jest niejasna. W związku z tym badania nad modyfikacjami m⁶A mają ogromne możliwości, aby dostarczyć kluczowych informacji na temat fizjologii molekularnej.

Introduction

Dynamiczne i odwracalne modyfikacje RNA odgrywają ważną rolę w homeostazie RNA. Czterdzieści lat temu stwierdzono, że modyfikacje N 6-metyloadenozyny (m⁶A) są obfite w transkryptomach eukariotycznych¹. Pełnią one różne funkcje w informacyjnym RNA (mRNA), rybosomalnym RNA (rRNA), małym jąderkowym RNA, transferowym RNA i mikroRNA². Modyfikacje^m6AmRNA wpływają na ich splicing³, translację⁴, degradację⁵ i lokalizację². Ponadto wpływają na biogenezę rybosomów i funkcję mikroRNA⁶. Ewolucyjne zachowanie modyfikacji m⁶A RNA obserwuje się u bakterii jednokomórkowych do wielokomórkowych ludzi⁷. Określenie ról modyfikacji m⁶A jest obecnie przedmiotem szeroko zakrojonych badań. Oczekuje się, że wysiłki te dostarczą nowych informacji na temat kontroli transkrypcji. Ostatnie badania pokazują, że inne modyfikacje chemiczne mRNA⁸ również odgrywają kluczową rolę w metabolizmie RNA.

Rytmy okołodobowe⁹, pluripotencja komórek macierzystych¹⁰, metabolizm trójglicerydów⁴, zwłóknienie¹¹, otyłość¹² i duża depresja¹³ to tylko kilka przykładów procesów, w których modyfikacje m⁶A kontrolują wyniki. Wiele transkryptów genów zegara okołodobowego ma miejsca m⁶A¹⁴. Modulacja metylazy m⁶A lub demetylazy wywołuje zmiany w okresie okołodobowym¹⁵. Mettl3, transferaza m⁶A, jest regulatorem pluripotencji komórek macierzystych. Niedobór Mettl3 prowadzi do wczesnej śmiertelności zarodka i nieprawidłowego przygotowania linii w stadium^{poimplantacyjnym 10}. Niedobór demetylazy m⁶A związanej z masą tłuszczową i otyłością (FTO), w adipocytach, wpływa na mobilizację kwasów tłuszczowych i masę ciała poprzez posttranskrypcyjną regulację Angptl4⁴. Badania te ujawniają, że m^6Anie tylko kontroluje przetwarzanie mRNA, ale także odgrywa kluczową rolę w rozwoju embrionalnym i patofizjologii. Funkcja modyfikacji m⁶A ma implikacje dla rozważań terapeutycznych w przyszłości.

Dostępnych jest kilka metod pomiaru modyfikacji m⁶A RNA^16-18. Tradycyjnie, chromatografia cienkowarstwowa (TLC) i wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) są stosowane do badania rozkładu m⁶A w kilku RNA^19,20. Spektrometria mas jest czułym narzędziem do wykrywania modyfikacji^m6Aw RNA. Jednak RNA musi zostać wycięte przez RNazę na krótkie fragmenty przed analizą za pomocą spektrometrii mas²¹. Immunoprecypitacja i sekwencjonowanie metylo-RNA (m⁶A-Seq)²² immunoprecypituje pofragmentowane RNA przeciwciałami specyficznymi dla m⁶A i przeprowadza równoległe sekwencjonowanie RNA. Ta metoda generuje krajobrazy m⁶A dla całego transkryptomu. Mapowanie w wysokiej rozdzielczości sieciowania i immunoprecypitacji^m6A w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu (miCLIP) dodatkowo mapuje modyfikacje m⁶A w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu²³. Obie metody dostarczają szczegółowych informacji na temat modyfikacji m⁶A w całym transkryptomie, z informacjami o specyficznych genach. Jednak kwantyfikacja i standaryzacja w obu metodach są trudne, jeśli eksperymenty wymagają porównania wielu warunków. Co więcej, fragmentacja RNA dla m⁶A-Seq zmienia oryginalną strukturę RNA, co może wpływać na natywne poziomy m⁶A. Aby wykryć globalne modyfikacje^m6ARNA i ich zmiany w różnych warunkach eksperymentalnych, przedstawiamy metodę, która wykorzystuje zmodyfikowany protokół northern blot. Metoda ta polega na rozdzieleniu RNA według masy cząsteczkowej przy użyciu elektroforezy żelowej¹⁸. Ta procedura zapewnia lepszą standaryzację i kwantyfikację dla eksperymentów, które obejmują wiele warunków lub próbek. Dostarcza również specyficznych informacji o modyfikacji^m6Adla różnych RNA, niezależnie od tego, czy jest to rRNA, mRNA czy mikroRNA.

Protocol

UWAGA: Całkowity poziom RNA^{m 6}A obejmuje rRNA, mRNA i inne małe RNA. Ponieważ rybosomalne RNA ma liczne modyfikacje^m6A, pomiar poziomów m⁶A będzie musiał uwzględniać ten fakt.

1. Izolacja RNA

1. Za pomocą roztworu do odkażania rybonukleazy (rozpylonego na ręczniki papierowe) przetrzyj pipety i powierzchnie stołu laboratoryjnego. Zwilż ręczniki papierowe wodą bez nukleaz i ponownie wytrzyj pipety i powierzchnie stołu laboratoryjnego.
2. Ekstrakcja RNA
   1. Całkowita izolacja RNA
      1. Za pomocą mieszadła górnego homogenizować 50-100 mg tkanki lub 5-10 x 10⁶ komórek w 1 ml roztworu do izolacji RNA utrzymywanego w temperaturze 4 °C.
         UWAGA: Do próbek tkanki tłuszczowej od myszy może być wymagane więcej tkanki (100-150 mg) ze względu na niższe stężenia RNA w niej. Próbki pochodzące z serca, wątroby, mięśni szkieletowych, płuc, mózgu i makrofagów myszy zostały wykorzystane wcześniej⁴.
      2. Inkubować homogenaty próbki przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      3. Dodać 100 μl 1-bromo-3-chloropropanu (BCP) na 1 ml homogenatu próbki. Potrząsaj energicznie probówkami przez 15 s i przystąp do izolacji całkowitego RNA zgodnie z instrukcjami producenta²⁴.
   2. Oczyszczanie poliadenylowanego mRNA z wyizolowanego całkowitego RNA
      1. Oczyść poliadenylowane mRNA przy użyciu dostępnych zestawów lub protokołów.
         1. Dokładnie wstrząśnij, aby ponownie zawiesić każdy z następujących roztworów: 2x roztwór wiążący, kulki polistyrenowe oligo(dT) i roztwór do mycia. Przed użyciem upewnij się, że koraliki oligo(dT) ogrzewają się do temperatury pokojowej.
         2. Przenieść 120 μl roztworu elucyjnego na preparat do probówki i podgrzać do temperatury 70 °C w bloku grzewczym.
         3. Pobrać pipetę do 500 μg całkowitego RNA do probówki mikrowirówkowej. W przypadku wody bez nukleaz dostosuj objętość do 250 μl.
         4. Dodaj 250 μl 2x roztworu wiążącego do całkowitego roztworu RNA i krótko zwiruj, aby wymieszać zawartość.
         5. Dodaj 15 μl kulek oligo(dT) i dokładnie wymieszaj.
         6. Inkubować mieszaninę w temperaturze 70 °C przez 3 minuty.
         7. Wyjmij próbkę z bloku grzewczego i pozostaw w temperaturze pokojowej na 10 minut.
         8. Wirować przy 15 000 x g przez 2 min.
         9. Ostrożnie usunąć supernatant, pozostawiając około 50 μl.
         10. Dodać 500 μl roztworu myjącego, aby ponownie zawiesić osad przez pipetowanie.
         11. Odpipetować zawiesinę do zestawu z filtrem wirowym/probówką zbiorczą.
         12. Wirować przy 15 000 x g przez 2 min. Wyjąć kolumnę z probówki zbiorczej i wyrzucić przepływ. Zwróć kolumnę do probówki zbiorczej.
         13. Odpipetować 500 μl roztworu myjącego na filtr wirowy.
         14. Wirować przy 15 000 x g przez 2 min.
         15. Przenieś filtr wirowy do świeżej probówki zbiorczej.
         16. Odpipetować 50 μl roztworu elucyjnego podgrzanego do temperatury 70 °C na środek filtra wirowego.
         17. Inkubować przez 2-5 minut w temperaturze 70 °C. Wirować przy 15 000 x g przez 1 min.
         18. Odpipetować dodatkowe 50 μl roztworu elucyjnego podgrzanego do temperatury 70 °C na środek filtra wirowego.
         19. Powtórz krok 1.2.2.1.18.
      2. Dodać 100 μg/ml glikogenu, 0,1 objętości 3 M buforu octanu sodu (pH 5,2) i 2,5 objętości bezwzględnego etanolu. Wytrącać przez noc w temperaturze -80 °C.
      3. Wirować przy 15 000 x g przez 25 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
      4. Umyj granulat 1 ml 75% etanolu. Wirować przy 15 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć etanol.
      5. Suszyć na powietrzu przez 3-5 min.
      6. Dodaj 10 μl wody wolnej od nukleaz, aby rozpuścić osad.
      7. Przechowywać w temperaturze -70 °C.
3. Kwalifikacja i kwantyfikacja RNA
   1. Za pomocą spektrofotometru oznaczyć stężenie RNA, odnotowując absorbancję przy 260 nm i 280 nm. Stosunek A₂₆₀/A₂₈₀ powinien wynosić 1,8-2,2.
   2. Sprawdź jakość próbki RNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym^{0,8% 25},
      UWAGA: Nienaruszone eukariotyczne całkowite RNA powinno wykazywać intensywne prążki 28S i 18S rRNA. Stosunek intensywności pasma 28S do 18S rRNA dla dobrego preparatu RNA wynosi ~2.

2. Elektroforeza i transfer żelu

UWAGA: Protokoły przygotowania buforu podano w tabeli 1.

1. Preparat żelu formaldehydowego (1%)
   1. Wypłucz wszystkie urządzenia do elektroforezy wodą z węglanu dietyloironianu (DEPC).
   2. Rozpuść 2,5 g agarozy w 215 ml wody DEPC całkowicie w kuchence mikrofalowej.
   3. Dodać 12,5 ml 10 kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (MOPS) i 22,5 ml 37% formaldehydu.
   4. Wlej go do aparatu do elektroforezy za pomocą grzebienia o grubości 1,5 mm.
   5. Wyeliminuj bąbelki lub wepchnij je na krawędzie żelu czystym grzebieniem.
   6. Pozwól żelowi zestalić się w temperaturze pokojowej.
2. Przygotowanie próbki
   1. Wymieszać 1-10 μg całkowitego RNA i 11,3 μl buforu próbki.
   2. Zmieszać 2 μg markera RNA (1 μg/μl) z 11,3 μl buforu próbki.
   3. Do próbek z ppkt 2.2.1 i 2.2.2 dodać wodę wolną od nukleaz do całkowitej objętości 16 μl.
   4. Podgrzewać w temperaturze 60 °C przez 5 minut, a następnie schłodzić na lodzie.
   5. Zmieszać 16 μl próbki z ppkt 2.2.3 z 4 μl barwnika śledzącego, który zawiera 0,1 μg/μl bromku etydyny na lodzie.
      UWAGA: Bromek etydyny jest prawdopodobnie teratogenny i toksyczny w przypadku wdychania. Przeczytaj kartę charakterystyki bromku etydyny.
3. Elektroforezy
   1. Dodaj 200 ml buforu 10x MOPS do 1,800 ml ddH₂O, aby utworzyć bufor do pracy 1x MOPS.
   2. Użyj bufora do biegania 1x MOPS, aby przepłukać dołki żelu.
   3. Uruchom żel pod napięciem 20 V przez 5 minut.
   4. Załaduj próbki RNA do studzienek żelu.
   5. Przykryj folią, aby uniknąć ekspozycji na światło. Praca pod napięciem 35 V przez około 17 godzin (noc)
   6. Zbadaj i sfotografuj żel w świetle UV.
4. przelać
   1. Pokrój żel, aby usunąć niewykorzystaną porcję.
   2. Przygotuj 500 ml 10x buforu SSC (250 ml 20x buforu SSC i 250 ml wody DEPC).
   3. Przemyć żel dwukrotnie 10x buforem SSC przez 20 minut z wytrząsaniem przy 50 obr./min.
   4. Wytnij 1 arkusz bibuły filtracyjnej wystarczająco duży, aby służył jako bibuła knotowa, która pochłania bufor transferowy z tacy transferowej (Rysunek 1).
   5. Wytnij 4 kawałki bibuły filtracyjnej do tego samego rozmiaru co żel.
   6. Wytnij 1 arkusz dodatnio naładowanej membrany nylonowej do tego samego rozmiaru co żel.
   7. Zaznacz nacięcie na żelu i membranie jako znacznik, aby zapewnić prawidłową orientację.
   8. Namocz membranę w 2x buforze SSC na 15 minut.
   9. Wlej 500 ml buforu 10x SSC do tacki transferowej.
   10. Połóż duży arkusz bibuły filtracyjnej na szklanej płycie i zwilż bibułę filtracyjną buforem transferowym.
   11. Rozwałkuj bąbelki za pomocą pipety.
   12. Namocz 2 kawałki wstępnie pociętej bibuły filtracyjnej w buforze transferowym i umieść je na środku bibuły filtracyjnej z kroku 2.4.5. Usuń wszelkie bąbelki.
   13. Połóż żel górną stroną do dołu na bibule filtracyjnej.
   14. Połóż membranę na żelu. Wyrównaj nacięcia żelu i membrany.
   15. Umieść 2 kawałki wstępnie przyciętej bibuły filtracyjnej na wierzchu membrany i zwilż bibułę filtracyjną buforem transferowym.
   16. Usuń wszelkie bąbelki między warstwami.
   17. Nałóż folię na żel, aby upewnić się, że ręczniki wchłaniają tylko bufor przechodzący przez żel i membranę.
   18. Ułóż ręczniki papierowe na bibule filtracyjnej.
   19. Umieść duży szklany talerz na ręcznikach.
   20. Umieść ciężarek na wierzchu stosu.
   21. Przechowywać przez noc, aby umożliwić przeniesienie RNA z żelu do błony.

3. Wykrywanie N 6-metyladenozyny

1. Sieciowanie membranowe
   1. Utrzymuj membranę wilgotną w buforze 2x SSC.
   2. Umieść 2 arkusze bibuły filtracyjnej zanurzone w 10-krotnym buforze SSC w sieciowniku UV.
   3. Umieść membranę na bibule filtracyjnej, stroną zaadsorbowaną przez RNA skierowaną do góry.
   4. Wybierz "tryb automatycznego sieciowania" (120 000 μJ) i naciśnij przycisk "Start", aby rozpocząć naświetlanie.
   5. Zbadaj membranę i żel za pomocą łapacza obrazu żelu UV, aby potwierdzić transfer RNA z żelu do membrany.
2. Immunoblotting (Immunoblotting)
   1. Zablokuj membranę w 5% beztłuszczowym mleku w soli fizjologicznej buforowanej trisem z buforem Tween 20 (TBST) w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
   2. Przemyć trzykrotnie buforem TBST przez 15 min.
   3. Inkubować błonę przez noc w roztworze przeciwciała m⁶A (N 6-metyloadenozyny) (1:1 000 w 5% buforze TBST z mleka beztłuszczowego) w temperaturze 4 °C.
   4. Przemyć membranę trzykrotnie buforem TBST przez 15 minut.
   5. Inkubować błonę w sprzężonym z HRP roztworze przeciwciała przeciwko królikowi osła (1:2 000 w 5% buforze TBST z mleka beztłuszczowego) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   6. Przemyć membranę trzykrotnie buforem TBST przez 15 minut.
   7. Nałożyć ulepszone podłoże chemiluminescencyjne (0,125 ml na^cm2 membrany).
   8. Uchwyć chemiluminescencję przy optymalnych ustawieniach imagera cyfrowego, zgodnie z instrukcjami producenta²⁶.
3. m⁶A Kwantyfikacja
   1. Zmierz względną intensywność chemiluminescencyjną m⁶A za pomocą oprogramowania ImageJ.
      1. W menu oprogramowania ImageJ wybierz opcję "Plik", aby otworzyć odpowiedni plik.
      2. Wybierz narzędzie "Prostokąt" z ImageJ i narysuj ramkę wokół sygnałów.
      3. Jeśli rybosomalne RNA nie jest przedmiotem eksperymentów, należy unikać prążków rybosomalnego RNA 18S i 28S m⁶A do obliczeń.
      4. Kliknij "Command" i "1", aby potwierdzić wybrany pas ruchu.
      5. Naciśnij "Command" i "3", aby wyświetlić wybraną działkę.
      6. Kliknij narzędzie "Proste" i narysuj linie, aby oddzielić podzielony na segmenty obszar.
      7. Kliknij narzędzie "Różdżka", aby zarejestrować pomiary.
      8. Eksportuj dane.
      9. Znormalizuj poziomy m⁶A za pomocą pasma rybosomalnego RNA 18S z barwienia bromkiem etydyny.

Results

Po 14 dniach w normalnej fazie okołodobowej jasnego i ciemnego, myszy dzikiego typu zostały umieszczone w ciągłej ciemności. Próbki RNA z wątroby pobierano w odstępach 4-godzinnych i badano za pomocą zmodyfikowanego northern blot. Metylacja rRNA, mRNA i małych RNA została wyraźnie wykryta (ryc. 2). Porównanie różnych czasów okołodobowych (CT) można dokładnie obliczyć za pomocą standardu 18S rRNA. Stwierdzono silne oscylacje okołodobowe poziomów^m6Aw rRNA, mRNA i małych RNA.

Aby uniknąć zakłóceń oferowanych przez rRNA, poliadenylowane RNA mogą być oczyszczane, jak w kroku 1.2.2. Po oczyszczeniu rRNA można w dużej mierze wyeliminować, aby umożliwić lepszą wizualizację innych RNA (ryc. 3).

Rysunek 1: Montaż jednostki przenoszenia blotów. Pokazano jednostkę przenoszenia kapilar do osuszania RNA do błony. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Rytm okołodobowy poziomów m⁶A u myszy C57BL / 6J. Rysunek ten przedstawia m⁶A blot całkowitego RNA z wątroby myszy typu dzikiego uśmierconych pierwszego dnia fazy ciemnej i ciemnej po 14 dniach normalnej fazy jasno-ciemnej w odstępach 4 godzin. Kwantyfikację przeprowadzono przy użyciu różnicy gęstości obrazu m⁶A między 18S i 28S rRNA. Obfitość m⁶A znormalizowano do pasma 18S rRNA z żelu formaldehydowego na dole. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: M⁶A kleksy z rRNA lub bez. Pokazano reprezentatywne m⁶A bloty całkowitego RNA i poliadenylowanego RNA z wątroby myszy typu dzikiego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

zł pkt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. szt. szt. szt.

1	10x bufor MOPS (pH 7,0, chronić przed światłem)
	MOPS			Z dnia 41,85	g	0,2 mln
	Octan sodu			4.1	g	0,05 mln
	EDTA, sól disodowa			3.7	g	0,01 mln
	DEPC wody
	Razem			1	L
	Mieszać w temperaturze pokojowej
cyfra arabska	20x bufor SSC (pH 7,0)
	Chlorek sodu			175,3	g	3 mln
	Cytrynian trisodowy			88,3	g	0,3 mln
	DEPC wody
	Razem			1	L
	Mieszaj w temperaturze pokojowej, a następnie autoklaw
3	Śledzenie barwnika
	10x bufor MOPS			500	μL	1x
	Ficoll 400			0,75	g	15%
	Niebieski bromofenol			0,01	g	0,2 %
	Ksylen Cyanol			0,01	g	0,2 %
	DEPC wody
	Razem			5	Ml
	Przechowywać w temperaturze -20 °C
4	DEPC wody
	Stosunek rozcieńczenia w stosunku 1:1,000 DEPC w ddH2O
	Mieszaj przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie autoklaw
5	Bufor próbki (chronić przed światłem)
	10x bufor MOPS			200	μL
	37% formaldehydu			270	μL
	Formamid			660	μL
	Przechowywać w temperaturze -20 °C

Tabela 1: i rozwiązania.

Discussion

Modyfikacje RNA odgrywają ważną rolę w funkcjonowaniu i fizjologii komórek. Obecna wiedza na temat regulacji, funkcji i homeostazy tych modyfikacji jest nadal badana i poszerzana⁸. Dlatego potrzebna jest precyzyjna i złota metoda oceny modyfikacji RNA. Zmodyfikowana metoda northern blotting zapewnia precyzyjną kwantyfikację modyfikacji RNA i wyraźne rozgraniczenie modyfikacji w różnych RNA. Chociaż metoda wymaga co najmniej 3 dni, można ją ustandaryzować i stosować w różnych projektach eksperymentalnych. Co więcej, przy użyciu różnych przeciwciał może wykrywać różne modyfikacje RNA²⁷.

Ważne jest, aby oddzielić różne RNA podczas analizy modyfikacji RNA. Rybosomalny RNA stanowi dużą część całkowitej ilości RNA^28,29. Wyniki analizy modyfikacji RNA tylko w całkowitym RNA będą reprezentować głównie zmiany rRNA. Metylacja i inne tego typu modyfikacje rRNA mogą potencjalnie maskować zmiany w innych RNA. Dzięki procedurze separacji żelu modyfikacje mRNA i innych małych RNA mogą być dokładniej analizowane.

Mapowanie całego transkryptomu z immunoprecypitacją i sekwencjonowaniem m⁶A zapewnia szczegółowy wgląd w modyfikację każdego typu RNA²². Dostarcza informacji o konkretnych RNA i rozdzielczości około 80-120 pz. Chociaż m⁶A-Seq może porównywać modyfikacje między różnymi warunkami eksperymentalnymi, wybór odpowiednich standardów i kontroli dla takich eksperymentów jest trudny¹⁸. Immunoprecypitacja jest trudna do odtworzenia, często powoduje znaczne różnice między powtórzeniami. Ponadto m⁶A-Seq wymaga fragmentacji próbek RNA przed immunoprecypitacją i sekwencjonowaniem³⁰. Proces fragmentacji może potencjalnie wywoływać nadmierne wpływy na pierwotne modyfikacje RNA. Jeśli eksperyment nie wymaga informacji o konkretnym genie, ale wymaga różnych warunków do porównania, obecna metoda zapewnia lepszą wizualizację i kontrolę dla różnych konfiguracji eksperymentalnych.

Modyfikacja RNA jest ważnym krokiem w regulacji kontroli transkrypcji³¹. Jednak homeostaza i mechanizmy regulacyjne różnych modyfikacji RNA w różnych sferach fizjologicznych są nadal niejasne. Korzystając z obecnej zmodyfikowanej metody northern blot, można określić ilościowo i porównać różne modyfikacje RNA. Co więcej, zmiany i regulacje modyfikacji RNA mogą być badane bardziej szczegółowo. W przyszłości możliwe będzie również połączenie danych eksperymentalnych zarówno z klasycznego protokołu northern blotting, jak i zmodyfikowanego northern blotting, co zapewni lepszy wgląd w biologię RNA.

Najważniejszym czynnikiem decydującym o powodzeniu zmodyfikowanego protokołu northern blotting jest integralność próbki RNA. RNA z pewną dozą degradacji może dawać dobre wyniki klasycznego northern blot, ale może to potencjalnie mieć znaczący wpływ na zmodyfikowane wyniki northern blot. Modyfikacje RNA w różnych tkankach lub liniach komórkowych mogą się również znacznie różnić. Ważne jest, aby przed wykonaniem ostatecznych eksperymentów przetestować odpowiednie ładunki próbek RNA dla różnych tkanek.

Ponieważ procedury blottingu zostały tradycyjnie nazwane na cześć dr Southern i różnych kierunków geograficznych, proponujemy nazwę "northeastern" blotting dla obecnej techniki.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roztwór RNaseZap	Protokół Ambion	AM9782	1.1
Roztwór odczynnika TRI	Protokół Ambion	AM9738	1.2.1.1
1-bromo-3-chloropropan (BCP)	Sigma	B9673	Protokół 1.2.1.3
Etanol	JTbaker	8006	Protokół 1.2.1.3
Isopropanol	Sigma	I9516	Protokół 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit	Sigma	MRN70	Protokół 1.2.2.1
Glycogen	Ambion	AM9510	Protokół 1.2.2.2
Octan sodu	Fluka	71183	Protokół 1.2.2.2
Woda wolna od nukleaz	Ambion	AM9930	Protokół 1.2.2.6
DEPC	Sigma	D5758	Protokół 2.1.1
Agaroza	JT Baker	A426	Protokół 2.1.2
MOPS	Sigma	M1254	Protokół 2.1.3
37% roztwór formaldehydu	Sigma	F8775	Protokół 2.1.3
EDTA, sól disodowa	JT Baker	8993	Protokół 2.1.3 10x Bufor MOPS
formamid	Sigma	F7503	Protokół 2.2.1
RNA Marker Millennium	Ambion	AM7150	Protokół 2.2.2
Bromek etydyny	Amresco	X328	Protokół 2.2.5
Ficoll PM400	GE Healthcare	17-0300-10	Protokół 2.2.5 barwnik śledzący
Błękit bromofenolowy	Sigma	114391	Protokół 2.2.5 barwnik śledzący
Ksylen Cyanol FF	Sigma	X4126	Protokół 2.2.5 barwnik śledzący
Dwuwodny chlorek sodu	JT Baker	3624	Protokół 2.4.2 20x bufor SSC
Cytrynian trisodowy	Sigma	S1804	Protokół 2.4.2 20x bufor SSC
Bibuła Hybond Protokół	RPN6101M	GE Healthcare	2.4.4
Membrana GE Hybond-N+	GE Healthcare RPN303B Protokół 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400	Stratagene	400075	Protokół 3.1.2
Gel Catcher 1500	Technologia ANT	Gel Catcher 1500	Protokół 3.1.5
Anty-m6A (N6-metyloadenozyna)	Układy synaptyczne	202003	Protokół 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd całe Ab	GE Healthcare	NA934	Protokół 3.2.5
ChemiDoc MP System	BIO-RAD	1708280	Protokół 3.2.8