Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie związku uwalniającego etylen, kwasu 2-chloroetylofosfonowego, jako narzędzia do badania reakcji etylenu u bakterii

7.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54682

⸱

10 listopada 2016

 ,  , 
1Molecular Microbial Biochemistry Laboratory, Faculty of Science (Applied Bioscience Program), University of Ontario Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawione tutaj protokoły ułatwiają wygodne badanie reakcji bakteryjnych etylenu poprzez wykorzystanie kwasu 2-chloroetylofosfonowego (). Etylen jest wytwarzany in situ w wyniku rozkładu w wodnym pożywce bakteryjnej, co pozwala obejść wymóg stosowania czystego gazu etylenowego.

Streszczenie

Etylen (C2H4) to gazowy fitohormon, który bierze udział w wielu aspektach rozwoju roślin, odgrywając dominującą rolę w starzeniu się i dojrzewaniu owoców. Egzogenny etylen stosowany we wczesnym okresie rozwoju roślin wyzwala fenotyp potrójnej odpowiedzi; Krótszy i grubszy hipokotyl z przesadnym haczykiem wierzchołkowym. Pomimo ścisłego związku między roślinami a bakteriami, wpływ egzogennego etylenu na bakterie został w znacznym stopniu przeoczony. Wynika to częściowo z trudności w kontrolowaniu gazowego etylenu w laboratorium bez specjalistycznego sprzętu. Kwas 2-chloroetylofosfonowy () to związek, który po rozpuszczeniu w środowisku wodnym o pH 3,5 lub wyższym rozkłada się na etylen, chlor i fosforan w stosunku molowym 1:1:1:1. W tym miejscu opisujemy zastosowanie do produkcji etylenu in situ do badania odpowiedzi etylenu u bakterii przy użyciu związanej z owocami, wytwarzającej celulozę bakterii Komagataeibacter xylinus jako organizmu modelowego. Protokoły opisane w niniejszym dokumencie obejmują zarówno weryfikację produkcji etylenu z za pomocą testu potrójnej odpowiedzi Arabidopsis thaliana, jak i wpływ egzogennego etylenu na produkcję celulozy K. xylinus, właściwości błonki i morfologię kolonialną. Protokoły te można dostosować do badania wpływu etylenu na inne drobnoustroje przy użyciu odpowiednich pożywek wzrostowych i analiz fenotypowych. Zastosowanie zapewnia naukowcom prostą i wydajną alternatywę dla czystego gazu etylenowego do rutynowego określania odpowiedzi bakterii na etylen.

Wprowadzenie

Etylen olefinowy (C2H4) został po raz pierwszy odkryty jako hormon roślinny w 1901 roku, kiedy zaobserwowano, że siewki grochu, uprawiane w laboratorium, które używało lamp gazowych na węgiel, wykazywały nieprawidłową morfologię, w której łodygi (hipokotyle) były krótsze, grubsze i wygięte na boki w porównaniu do normalnych sadzonek grochu; fenotyp później nazwany potrójną odpowiedzią1,2. Kolejne badania wykazały, że etylen jest niezbędnym fitohormonem, który reguluje wiele procesów rozwojowych, takich jak wzrost, reakcja na stres, dojrzewanie owoców istarzenie się. Arabidopsis thaliana, organizm modelowy do badań nad biologią roślin, został dobrze przebadany pod kątem jego reakcji na etylen. Kilka mutantów odpowiedzi etylenu wyizolowano poprzez wykorzystanie fenotypu potrójnej odpowiedzi obserwowanego w ciemno rosnących siewkach A. thaliana w obecnościetylenu 1,4,5. Biosyntetycznym prekursorem do produkcji etylenu w roślinach jest kwas 1-aminocyklopropanowokarboksylowy (ACC)6 i jest powszechnie stosowany podczas testu potrójnej odpowiedzi w celu zwiększenia endogennej produkcji etylenu, która prowadzi do fenotypupotrójnej odpowiedzi 1,4,5.

Chociaż reakcja etylenu jest szeroko badana u roślin, wpływ egzogennego etylenu na bakterie jest znacznie niedostatecznie zbadany, pomimo bliskiego związku bakterii z roślinami. Jedno z badań wykazało, że niektóre szczepy Pseudomonas mogą przetrwać przy użyciu etylenu jako jedynego źródła węgla i energii7. Jednak tylko dwa badania wykazały, że bakterie reagują na etylen. Pierwsze badanie wykazało, że szczepy Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida i P. syringae były chemotaktyczne w stosunku do etylenu przy użyciu testu czopa agarozowego, w którym stopiona agaroza została zmieszana z buforem chemotaksji zrównoważonym czystym gazem etylenowym8. Jednakże, zgodnie z naszą wiedzą, nie ma dalszych doniesień o zastosowaniu czystego gazu etylenowego do scharakteryzowania reakcji bakterii na etylen, prawdopodobnie ze względu na trudności w obchodzeniu się z gazami w laboratorium bez specjalistycznego sprzętu. Drugi raport dotyczący odpowiedzi bakterii na etylen wykazał, że etylen zwiększa produkcję celulozy bakteryjnej i wpływa na ekspresję genów w bakterii związanej z owocami, Komagataeibacter (dawniej Gluconacetobacter) xylinus9. W tym przypadku związek uwalniający etylen, kwas 2-chloroetylofosfonowy (), został użyty do produkcji etylenu in situ w pożywce bakteryjnej, z pominięciem konieczności stosowania czystego gazu etylenowego lub specjalistycznego sprzętu.

wytwarza etylen w stosunku molowym 1:1 powyżej pH 3,510,11 poprzez katalizowaną zasadą, reakcję pierwszego rzędu12-14. Degradacja jest dodatnio skorelowana z pH i temperaturą13,14 i prowadzi do produkcji etylenu, chlorku i fosforanu. zapewnia naukowcom zainteresowanym badaniem reakcji bakterii na etylen wygodną alternatywę dla gazowego etylenu.

Ogólnym celem poniższych protokołów jest dostarczenie prostej i efektywnej metody badania odpowiedzi bakterii na etylen i obejmuje walidację fizjologicznie istotnych poziomów produkcji etylenu z rozkładu w pożywce bakteryjnej, analizę pH hodowli w celu zapewnienia, że rozkład nie jest zaburzony podczas wzrostu bakterii, oraz ocenę wpływu etylenu na morfologię i fenotyp bakterii. Demonstrujemy te protokoły za pomocą K. xylinus, jednak protokoły te można dostosować do badania odpowiedzi etylenu u innych bakterii przy użyciu odpowiedniej pożywki wzrostowej i analiz fenotypowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Odczynniki

  1. Przygotować roztwór 500 mM CEPA (144,49 g/mol) oraz roztwór zawierający zarówno 500 mM NaCl (58,44 g/mol), jak i 500 mM NaH2PO4·H2O (137,99 g/mol) w zakwaszonej (pH 2,5) wodzie ultra-czystej lub 0,1 N HCl. Mieszać za pomocą wortexa aż do uzyskania klarownych roztworów.
  2. Rozcieńczyć szeregowo (10x) roztwory 500 mM w tym samym rozpuszczalniku, aby uzyskać roztwory zapasowe o stężeniu 5 mM i 50 mM.
  3. Przygotować 10 mM roztwór kwasu 1-aminocyklopropano-karboksylowego (ACC; 101,1 g/mol) w wodzie ultra-czystej.
  4. Przefiltrować roztwory zapasowe w celu sterylizacji i przechowywać alikwoty w temperaturze -20 °C.
  5. Przefiltrować celulazę w celu sterylizacji. Przechowywać alikwoty w temperaturze 4 °C.

2. Weryfikacja produkcji etylenu podczas rozkładu kwasu 2-chloroetylofosfonowego: Potrójny test odpowiedzi

  1. Sterylizacja powierzchniowa nasion Arabidopsis thaliana ekotypu Columbia metodą fazy gazowej:
    OSTRZEŻENIE: Następujący krok powoduje wydzielanie toksycznego chloru. Sterylizację nasion należy przeprowadzać w dygestorium.
    1. Przygotować szczelny pojemnik o wystarczającej głębokości, aby pomieścił on zlew szklany o pojemności 250 ml do sterylizacji nasion, i umieścić go w dygestorium.
    2. Przenieść nasiona A. thaliana do probówki do mikrocentryfugi i umieścić probówkę w statywie. Statyw z otwartą probówką włożyć do szczelnego pojemnika.
      Uwaga: Nie napełniać poszczególnych probówek powyżej połowy ich objętości, aby gazowy chlor mógł dotrzeć do nasion znajdujących się na dnie.
    3. Włożyć do szczelnego pojemnika zlew o pojemności 250 ml zawierający 100 ml handlowego wybielacza. Ostrożnie dodać 3 ml stężonego HCl do wybielacza i natychmiast zamknąć pojemnik pokrywą.
      OSTRZEŻENIE: Wybielacz i HCl reagują, tworząc toksyczny chlor, który służy do sterylizacji powierzchniowej nasion.
    4. Inkubować nasiona w obecności chloru przez 4 hr w dygestorium.
      Uwaga: Dłuższy czas sterylizacji obniży efektywność kiełkowania.
    5. Po sterylizacji pozwolić na odgazowanie chloru w dygestorium przez co najmniej 1 hr, a następnie zamknąć probówkę do mikrocentryfugi. Pozostawić mieszaninę wybielacza i HCl w dygestorium przez co najmniej 24 hr przed utylizacją.
      Uwaga: Sterylne nasiona można przechowywać w temperaturze pokojowej do natychmiastowego użycia.
    6. Nasiona do długoterminowego przechowywania trzymać w temperaturze 4 °C. Przed otwarciem probówki do mikrocentryfugi doprowadzić nasiona do temperatury pokojowej, aby zapobiec kondensacji. Przechowywać nasiona w ciemności.
  2. Przygotowanie płytek agarowych w podzielonych na 4 sektory szalkach Petriego (90 x 15 mm):
    1. Przygotować 110 ml pożywki wzrostowej dla siewek A. thaliana: podstawowa pożywka 1x Murashige and Skoog (MS)15 (4,33 g/L) zawierająca 1% (w/v) sacharozy i 0,8% (w/v) agaru. Dostosować pH pożywki MS do wartości 6 za pomocą NaOH.
    2. Przygotować 100 ml pożywki do wzrostu bakterii do rozkładu CEPA: pożywka Schramm and Hestrin (SH)16 zawierająca 1,5% (w/v) agaru. Dostosować pH pożywki SH do wartości 7 za pomocą NaOH.
    3. Sterylizować pożywki w autoklawie, a następnie schłodzić w kąpieli wodnej o temperaturze 55 °C.
    4. Po ostygnięciu agaru MS, przelać 40 ml do sterylnej kolby. Aby przygotować pożywkę dla kontroli pozytywnej siewek A. thaliana, uzupełnić 40 ml porcję agaru MS o 40 µl 10 mM ACC, aby uzyskać końcowe stężenie 10 µM ACC.
    5. Wlać 5 ml pożywki do odpowiednich kwadrantów podzielonych szalek Petriego (Figura 1) i pozwolić agarowi zastygnąć. Wszystkie płytki przygotować w trzech powtórzeniach.
      Uwaga: CEPA nie jest dodawana do pożywki wzrostowej aż do późniejszego etapu protokołu.

Schemat szalki Petriego i wyniki; wzrost roślin w warunkach pożywek MS i SH z zastosowaniem ACC/CEPA.
Rysunek 1: Układ płytek agarowych użytych do testu potrójnej odpowiedzi z CEPA. Schemat przedstawia kwadranty specyficzne dla kontroli negatywnej (A), kontroli pozytywnej (B) oraz płytek eksperymentalnych (C). Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Augimeri i Strap9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Stratyfikacja nasion A. thaliana w celu zapewnienia synchronicznej kiełkowania:
    1. Na każdy kwadrant zawierający agar MS lub MS+ACC nanieść około pięćdziesięciu nasion A. thaliana. Nasiona powinny być rozmieszczone równomiernie, aby ułatwić późniejsze usuwanie i analizę siewek.
    2. Płytki z nasionami inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 3-4 dni.
  2. Rozkład CEPA na pożywce bakteryjnej (SH) i przeprowadzenie testu potrójnej odpowiedzi:
    1. Po stratyfikacji naświetlać nasiona światłem fluorescencyjnym przez 2 h.
    2. Na kwadranty płytek eksperymentalnych zawierających agar SH (pH 7; Rysunek 1) nanieść 10 µl roztworu zapasu CEPA o stężeniu 500 mM, aby uzyskać końcowe stężenie CEPA wynoszące 1 mM.
    3. Uszczelnić płytki folią laboratoryjną i przykryć folią aluminiową, aby stworzyć ciemne środowisko dla nasion.
    4. Kiełkować nasiona, inkubując płytki w ciemności w temperaturze 23 °C przez 3 dni, stroną z agarem skierowaną w dół.
      Uwaga: Płytki można układać w stosy, jednak kontrole negatywne powinny znajdować się na spodzie, ponieważ etylen jest lżejszy od powietrza.
  3. Analiza danych z testu potrójnej odpowiedzi:
    1. Za pomocą wysterylizowanych płomieniem pincet wyjmować pojedyncze siewki z płytki odpowiadającej każdej serii badawczej i oglądać pod mikroskopem stereoskopowym lub cyfrowym USB. Upewnić się, że dolne części siewek są wyrównane, a następnie wykonać zdjęcie.
    2. Wyjąć 30 siewek z każdego kwadrantu (60 siewek na powtórzenie biologiczne i 180 siewek na serię badawczą). Ułożyć je na powierzchni z czarnym tłem i sfotografować wraz z linijką.
    3. Zmierzyć długość podykotylu (mm) siewek z powtórzeń, używając oprogramowania ImageJ17. Ustawić skalę, klikając i przeciągając narzędzie *Straight* w celu zaznaczenia odległości 10 mm. Wybrać opcję „Set Scale” w zakładce „Analyze” i ustawić znaną odległość na 10. Używając narzędzia *Segmented*, zaznaczyć długość podykotylu i nacisnąć klawisz M, aby zmierzyć odległość. Porównać średnie z powtórzeń biologicznych za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem wielokrotnych porównań Tukeya. Różnice uznaje się za istotne, jeśli p < 0.05.

3. Analiza pH w trakcie wzrostu bakterii

  1. Hodowla i miareczkowanie kultur startowych Komagataeibacter xylinus w trzech powtórzeniach:
    1. Zaszczep pojedynczą kolonię K. xylinus do 5 ml pożywki SH (pH 5) uzupełnionej o 0,2% (v/v) wysterylizowanej przez filtr celulazy. Inkubować kultury w temperaturze 30 °C przy mieszaniu 150 rpm aż do osiągnięcia OD600 na poziomie 0,3 do 0,4 (około 72 h).
    2. Zebrać kultury startowe poprzez wirowanie (2 000 x g; 4 °C; 10 min). Komórki przemyć dwukrotnie 5 ml sterylnego 0,85% (w/v) roztworu NaCl i resuspendować osad komórkowy. Przechowywać komórki w lodzie.
    3. Określić liczbę komórek za pomocą komory liczbowej Petroffa-Haussera.
  2. Zaszczepianie kultur do analizy pH:
    1. Do dwunastu kolb o pojemności 500 ml z foliiowymi pokrywkami dodać 150 ml bulionu SH (pH 7) uzupełnionego o 0,2% (v/v) wysterylizowanej przez filtr celulazy. Zaszczepić kolby kulturami startowymi K. xylinus w stężeniu 105 komórek/ml. Wykorzystując trzy kultury startowe, przygotować trzy repliki biologiczne dla każdej próby.
    2. Uzupełnić kultury o 300 µl roztworów stokowych CEPA o stężeniach 5, 50 lub 500 mM, aby uzyskać końcowe stężenia CEPA wynoszące odpowiednio 0,01, 0,1 i 1,0 mM. Kultury kontrolne nie traktowane uzupełnić o 300 µl rozpuszczalnika użytego do rozpuszczenia CEPA.
    3. Uszczelnić kolby, mocno przyklejając folie do ścianek, i inkubować kultury przez 14 dni w temperaturze 30 °C przy mieszaniu 150 rpm.
  3. Codziennie, w sposób aseptyczny, pobierać z każdej kolby próbki o objętości 5 ml i osadzać komórki przez wirowanie (2 000 x g; 4 °C; 10 min). Przenieść nadfiltr do czystej probówki i zmierzyć pH każdej repliki biologicznej za pomocą pH-metru.
  4. Przeanalizować dane z przebiegu czasowego, wykreślając średnie pH replik biologicznych.
    Uwaga: Ważne jest, aby pH kultury nie spadło poniżej 3,5; pH kultury równe 5 znacznie redukuje uwalnianie etylenu z CEPA, a pH poniżej 3,5 całkowicie hamuje uwalnianie etylenu.
  5. W celu kontroli poziomu chloru i fosforanów przeprowadzić identyczny eksperyment, stosując 0,01, 0,1 i 1,0 mM roztworu NaCl-NaH2PO4, korzystając odpowiednio z roztworów stokowych 5, 50 i 500 mM.

4. Morfologia kolonii

  1. Hodowla kultur startowych K. xylinus w trzech powtórzeniach:
    1. Pojedynczą kolonię K. xylinus zaszczepić do 5 ml podłoża SH (pH 5) uzupełnionego o 0,2% (v/v) sterilizowanej filtrem celulazy. Kultury inkubować w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 150 rpm do momentu osiągnięcia OD600 na poziomie od 0,3 do 0,4 (około 72 h).
    2. Kultury startowe zebrać poprzez wirowanie (2,000 x g; 4 °C; 10 min). Komórki przemyć 5 ml sterylnej soli fizjologicznej, a następnie resuspender osad komórkowy. Komórki przechowywać w lodzie.
  2. Przygotować 24 płytki z agarem zawierające 25 ml podłoża SH (pH 7) z dodatkiem 1,5% (w/v) agaru.
  3. Po zastygnięciu agaru, nanieść 50 µl roztworów stokowych CEPA o stężeniach 5, 50 i 500 mM na agar, aby uzyskać końcowe stężenia CEPA wynoszące odpowiednio 0,01, 0,1 i 1,0 mM. Przygotować płytki kontrolne nieleczone oraz kontrolne z rozpuszczalnikiem, które nie zawierają dodatków lub zawierają naniesione 50 µl rozpuszczalnika użytego do rozpuszczenia badanych związków.
  4. Na płytkach wyizolować pojedyncze kolonie, nakładając pętlą ok. 5 μl kultury startowej K. xylinus, a następnie uszczelnić je folią parafinową. Wszystkie płytki zaszczepić w trzech powtórzeniach. Płytki inkubować przez pięć dni w temperaturze 30 °C.
  5. Wykonać zdjęcia kolonii przy 20-krotnym powiększeniu za pomocą cyfrowego mikroskopu USB i jakościowo ocenić morfologię kolonii oraz produkcję celulozy na podłożu stałym.
    Uwaga: Celuloza objawia się jako mętna substancja wzdłuż brzegu kolonii.
  6. W celu kontroli poziomu chloru i fosforanów przeprowadzić identyczny eksperyment, stosując roztwór NaCl-NaH2PO4 o stężeniach 0,01, 0,1 i 1,0 mM, wykorzystując odpowiednio roztwory stokowe 5, 50 i 500 mM.

5. Analizy błony (pellicle)

  1. Wysiew i kwantyfikacja kultur startowych K. xylinus w trzech powtórzeniach:
    1. W trzech powtórzeniach zaszczep pojedynczą kolonię K. xylinus do 5 ml pożywki SH (pH 5) uzupełnionej o 0,2% (v/v) sterylizowanej przez filtr celulazy. Inkubować kultury w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 150 rpm do osiągnięcia OD600 na poziomie 0,3 do 0,4 (około 72 h).
    2. Zebrać kultury startowe poprzez wirowanie (2,000 x g; 4 °C; 10 min). Przemyć komórki dwukrotnie 5 ml sterylnej soli fizjologicznej i resuspender osad komórkowy. Przechowywać komórki w lodzie.
    3. Kwantyfikować komórki przy użyciu komory licznikowej Petroffa-Haussera.
  2. Przygotowanie mieszanin głównych (Master Mixes) do szczepienia płytek 24-dołkowych:
    1. Uzupełnić 60 ml pożywki SH (pH 7) o 120 µl roztworów stokowych CEPA o stężeniach 5, 50 i 500 mM, aby uzyskać końcowe stężenia CEPA wynoszące odpowiednio 0,01, 0,1 i 1,0 mM. Kolejne 60 ml pożywki SH (pH 7) uzupełnić o 120 µl rozpuszczalnika użytego do rozpuszczenia CEPA. Wymieszać za pomocą voretexa.
    2. Podzielić każde 60 ml pożywki zawierającej CEPA na cztery aliquoty po 14 ml. Trzy z aliquotów 14 ml zaszczepić biologicznymi powtórzeniami kultury startowej w stężeniu 105 komórek/ml. Przechowywać probówki z komórkami w lodzie, aby zapobiec produkcji celulozy.
      Uwaga: Pozostały aliquot 14 ml zostanie wykorzystany do sterylnych dołków kontrolnych.
  3. Szczepienie płytek 24-dołkowych:
    1. Każdą próbę przetestować na oddzielnej płytce z trzema rzędami powtórzeń biologicznych i jednym rzędem kontroli sterylnych (Rysunek 2).

Schemat eksperymentu z hodowlą drobnoustrojów; metoda: wysiew komórek, inkubacja, analiza błon.
Rysunek 2: Schemat blokowy ilustrujący protokół stosowany w teście i analizie błon. Roztwór treściwy medium SH o pH 7 uzupełniony o CEPA (60 ml) jest rozdzielany na trzy oddzielne powtórzenia biologiczne oraz kontrolę sterylną (po 14 ml na każdą próbkę). Następnie kultury te są rozdzielane na sześć powtórzeń technicznych (po 2 ml) do płytki 24-dołkowej i uszczelniane folią parafinową. Po inkubacji przez 7 dni w temperaturze 30 °C błony są zbierane i charakteryzowane poprzez oznaczenie masy mokrej, grubości, masy suchej oraz krystaliczności za pomocą FT-IR. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku

  1. Z 14 ml master mixu odmierzyć po 2 ml do każdego z sześciu dołków sterylnej płytki 24-dołkowej. Powtórzyć czynność dla trzech powtórzeń biologicznych oraz kontroli sterylnej (Rysunek 2). Powtórzyć dla każdej grupy badawczej.
  2. Uszczelnić płytki folią parafinową i inkubować w warunkach statycznych przez 7 dni w temperaturze 30 °C.
  1. Zbiór i pomiar masy mokrej, grubości, masy suchej (wydajności celulozy) oraz krystaliczności błony (Rysunek 2):
    1. Naciśnij jeden bok błony, aby unieść przeciwległą krawędź, a następnie usuń poszczególne błony za pomocą pęsety. Trzymając je, połóż na świeżym ręczniku papierowym na 3 sec, aby usunąć nadmiar pożywki przed zważeniem w celu określenia masy mokrej.
    2. Ułóż błony obok linijki i sfotografuj je z boku, używając cyfrowego aparatu o wysokiej rozdzielczości.
    3. Za pomocą oprogramowania ImageJ17 zmierz grubość błony na lewym ramieniu, prawym ramieniu oraz w centrum każdej błony. Wyciągnij średnią ze wszystkich powtórzeń technicznych dla każdego powtórzenia biologicznego.
    4. Przenieś poszczególne błony do studzienek płytki 6-dołkowej. Poddaj błony działaniu 12 ml 0.1 N NaOH w temperaturze 80 °C przez 20 min w celu lizy komórek.
    5. Usuń NaOH i zneutralizuj błony, przemywając je ultra-czystą wodą przez 24 hr z mieszaniem. Wymieniaj wodę co 6 hr.
      Uwaga: Po zakończeniu etapu przemywania błony powinny być białe.
    6. Umieść błony na matach silikonowych i susz w temperaturze 50 °C przez 48 hr do uzyskania stałej masy. Po wysuszeniu zdejmij je z mat i zmierz masę błon na wadze analitycznej, aby określić wydajność celulozy bakteryjnej.
    7. Przeanalizuj krystaliczność błon za pomocą spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR), wykonując 32 skany z rozdzielczością 4 cm-1 w zakresie od 4,000 do 650 cm-1. Oblicz wskaźnik krystaliczności, CI(IR), korzystając z A1437/A895; stosunku absorbancji „pasma krystalicznego” do „pasma amorficznego”, zgodnie z wcześniejszym opisem18.
  2. Aby kontrolować poziomy chloru i fosforanów, przeprowadź identyczny eksperyment, stosując roztwór NaCl-NaH2PO4 o stężeniach 0.01, 0.1 oraz 1.0 mM, używając odpowiednio roztworów stokowych 5, 50 i 500 mM.
  3. Analiza danych dotyczących błon:
    1. Oblicz stopień hydratacji błony, wyznaczając różnicę między masą mokrą a masą suchą błony.
    2. Wyciągnij średnią z wartości wszystkich powtórzeń technicznych, aby uzyskać pojedynczą wartość dla każdego powtórzenia biologicznego do analizy statystycznej. Porównaj grupy badawcze za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA z testem wielokrotnych porównań Tukeya. Różnice uznaje się za istotne, gdy p <0.05.
    3. Znormalizuj dane jako procent kontroli nieleczonej i przedstaw średnie z powtórzeń biologicznych na wykresie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schematyczny układ płytek do weryfikacji uwalniania etylenu z CEPA w podłożu SH (pH 7) za pomocą testu potrójnej odpowiedzi przedstawiono na Rysunku 1A-C. Schemat blokowy ilustrujący protokół otrzymywania pellikli przedstawiono na Rysunku 2. Siewki A. thaliana hodowane w ciemności wykazują fenotyp potrójnej odpowiedzi (krótszy i grubszy podhipokotyl z wyraźnie zaznaczoną zakrzywioną wierzchołkową częścią) w obecności ACC oraz w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane tutaj metody przedstawiają produkcję in situ etylenu z do badania odpowiedzi bakterii na etylen przy użyciu organizmu modelowego K. xylinus. Ta metoda jest bardzo przydatna, ponieważ etylen można wytwarzać poprzez uzupełnienie dowolnego środowiska wodnego o pH większym niż 3,510,11 , negując potrzebę stosowania czystego gazu etylenowego lub specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego. Metoda ta nie ogranicza się do badania wpływu etylenu pochodzącego z na bakterie, ale może być również ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Dr. Dario Bonetty za dostarczenie nasion Arabidopsis thaliana i za pomoc techniczną w odniesieniu do testu potrójnej odpowiedzi, a także Simone Quaranta za pomoc z FT-IR. Prace te były wspierane przez grant Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC-DG) dla JLS, stypendium dla absolwentów Ontario (OGS) dla RVA oraz stypendium dla absolwentów Queen Elizabeth II w dziedzinie nauki i technologii (QEII-GSST) dla AJV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas 1-aminocyklopropanowo-karboksylowy (ACC)SigmaA3903Biosyntetyczny prekursor etylenu w roślinach
4-sektorowa szalka PetriegoPhoenix BiomedicalCA73370-022Do testowania potrójnej odpowiedzi
AgarBioShopAGR001.1Do zestalania podłoża
Aparat Canon Rebel T1i DLSRCanon3818B004Do zdjęć błonek
Celulaza z Trichoderma reesei ATCC 26921 SigmaC2730Roztwór wodny
Kwas cytrynowyBioShopCIT002.500Dla SH medium
Wybielacz komercyjnyLife Marka57800861874Wybielacz do sterylizacji nasion
Skoncentrowany HClBioShopHCL666.500Kwas solny do regulacji pH
Cyfrowy mikroskop USBPodłączanyNie dotyczy Dozdjęć kolonii
Etefon (≥ 96%; Kwas 2-chloroetylofosfonowy)SigmaC0143Związek uwalniający etylen
GlukozaBioBasicGB0219Dla podłoża SH
Komagataeibacter xylinus ATCC 53582ATCC53582Bakteryjna rurka do mikrowirówki alfaproteobacterium wytwarzająca celulozę
LifeGeneLMCT1.7B1,7 ml probówka do mikrowirówki
Murashige i Skoog (MS) podstawowa Średnie SigmaM5519Pożywka wzrostowa Arabidopsis thaliana
Na2HPO4· 7H2O BioShopSPD579.500Fosforan dwuzasadowy siedmiowodny do podłoża SH
NaClBioBasicSOD001.1Chlorek sodu do roztworu soli fizjologicznej i kontrolnego
NaH2PO4· H2O BioShopSPM306.500Fosforan sodu, monozasadowy monohydrat do roztworu kontrolnego
NaOHBioShopSHY700.500Wodorotlenek sodu do regulacji pH
Folia parafinowaParafilmPM996Do uszczelniania płyt i kolb
Pepton (bakteriologiczny)BioShopPEP403.1Do podłoża SH
Studzienka licząca Petroff-HausserHausser naukowy3900Komora do liczenia komórek bakteryjnych
Filtr sterylizacyjny z polieterosulfonu 0,2 i mikro; mVWR28145-501Do sterylizacji celulazy
SacharozaBioShopSUC600.1Sacharoza na pożywkę MS
Ekstrakt drożdżowyBioBasicG0961Do podłoża SH

Bibliografia

  1. Guzmán, P., Ecker, J. R. Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).
  2. Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. History of research on the plant hormone ethylene. J. Plant Growth Regul. 34 (4), 809-827 (2015).
  3. Schaller, G. E. Ethylene and the regulation of plant development. BMC Biol. 10 (1), (2012).
  4. Hua, J., Sakai, H., et al. EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (8), 1321-1332 (1998).
  5. Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. Insensitivity to ethylene conferred by a dominant Mutation in Arabidopsis thaliana. Science. 241 (4869), 1086-1089 (1988).
  6. Hamilton, A. J., Bouzayen, M., Grierson, D. Identification of a tomato gene for the ethylene-forming enzyme by expression in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (16), 7434-7437 (1991).
  7. Kim, J. Assessment of ethylene removal with Pseudomonas strains. J. Hazard. Mater. 131 (3), 131-136 (2006).
  8. Kim, H. E., Shitashiro, M., Kuroda, A., Takiguchi, N., Kato, J. Ethylene chemotaxis in Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species. Microbes Environ. 22 (2), 186-189 (2007).
  9. Augimeri, R. V., Strap, J. L. The phytohormone ethylene enhances bacterial cellulose production, regulates CRP/FNRKx transcription and causes differential gene expression within the cellulose synthesis operon of Komagataeibacter (Gluconacetobacter) xylinus ATCC 53582. Front. Microbiol. 6, 1459(2015).
  10. Zhang, W., Wen, C. K. Preparation of ethylene gas and comparison of ethylene responses induced by ethylene, ACC, and ethephon. Plant Physiol. Biochem. 48 (1), 45-53 (2010).
  11. Zhang, W., Hu, W., Wen, C. K. Ethylene preparation and its application to physiological experiments. Plant Signal. Behav. 5 (4), 453-457 (2010).
  12. Warner, H. L., Leopold, A. C. Ethylene evolution from 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 44 (1), 156-158 (1969).
  13. Biddle, E., Kerfoot, D. G. S., Kho, Y. H., Russell, K. E. Kinetic studies of the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid in aqueous solution. Plant Physiol. 58 (5), 700-702 (1976).
  14. Klein, I., Lavee, S., Ben-Tal, Y. Effect of water vapor pressure on the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 63 (3), 474-477 (1979).
  15. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
  16. Schramm, M., Hestrin, S. Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum. J. Gen. Microbiol. 11 (1), 123-129 (1954).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Ciolacu, D., Ciolacu, F., Popa, V. I. Amorphous cellulose-structure and characterization. Cellul. Chem. Technol. 45 (1), 13-21 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Celuloza bakteryjnarozk ad CEPAtest potr jnej odpowiedziformowanie pelleliinterakcje ro lina mikrobprzygotowanie po ywki wzrostowejpomiar hipokotyluspektroskopia transformaty Fourieramonitorowanie niskiego pH
Wykorzystanie związku uwalniającego etylen, kwasu 2-chloroetylofosfonowego, jako narzędzia do badania reakcji etylenu u bakterii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.