Przedstawione tutaj protokoły ułatwiają wygodne badanie reakcji bakteryjnych etylenu poprzez wykorzystanie kwasu 2-chloroetylofosfonowego (). Etylen jest wytwarzany in situ w wyniku rozkładu w wodnym pożywce bakteryjnej, co pozwala obejść wymóg stosowania czystego gazu etylenowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wykorzystanie związku uwalniającego etylen, kwasu 2-chloroetylofosfonowego, jako narzędzia do badania reakcji etylenu u bakterii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Etylen (C2H4) to gazowy fitohormon, który bierze udział w wielu aspektach rozwoju roślin, odgrywając dominującą rolę w starzeniu się i dojrzewaniu owoców. Egzogenny etylen stosowany we wczesnym okresie rozwoju roślin wyzwala fenotyp potrójnej odpowiedzi; Krótszy i grubszy hipokotyl z przesadnym haczykiem wierzchołkowym. Pomimo ścisłego związku między roślinami a bakteriami, wpływ egzogennego etylenu na bakterie został w znacznym stopniu przeoczony. Wynika to częściowo z trudności w kontrolowaniu gazowego etylenu w laboratorium bez specjalistycznego sprzętu. Kwas 2-chloroetylofosfonowy () to związek, który po rozpuszczeniu w środowisku wodnym o pH 3,5 lub wyższym rozkłada się na etylen, chlor i fosforan w stosunku molowym 1:1:1:1. W tym miejscu opisujemy zastosowanie do produkcji etylenu in situ do badania odpowiedzi etylenu u bakterii przy użyciu związanej z owocami, wytwarzającej celulozę bakterii Komagataeibacter xylinus jako organizmu modelowego. Protokoły opisane w niniejszym dokumencie obejmują zarówno weryfikację produkcji etylenu z za pomocą testu potrójnej odpowiedzi Arabidopsis thaliana, jak i wpływ egzogennego etylenu na produkcję celulozy K. xylinus, właściwości błonki i morfologię kolonialną. Protokoły te można dostosować do badania wpływu etylenu na inne drobnoustroje przy użyciu odpowiednich pożywek wzrostowych i analiz fenotypowych. Zastosowanie zapewnia naukowcom prostą i wydajną alternatywę dla czystego gazu etylenowego do rutynowego określania odpowiedzi bakterii na etylen.
Wprowadzenie
Etylen olefinowy (C2H4) został po raz pierwszy odkryty jako hormon roślinny w 1901 roku, kiedy zaobserwowano, że siewki grochu, uprawiane w laboratorium, które używało lamp gazowych na węgiel, wykazywały nieprawidłową morfologię, w której łodygi (hipokotyle) były krótsze, grubsze i wygięte na boki w porównaniu do normalnych sadzonek grochu; fenotyp później nazwany potrójną odpowiedzią1,2. Kolejne badania wykazały, że etylen jest niezbędnym fitohormonem, który reguluje wiele procesów rozwojowych, takich jak wzrost, reakcja na stres, dojrzewanie owoców istarzenie się. Arabidopsis thaliana, organizm modelowy do badań n....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Odczynniki
- Przygotować roztwór 500 mM CEPA (144,49 g/mol) oraz roztwór zawierający zarówno 500 mM NaCl (58,44 g/mol), jak i 500 mM NaH2PO4·H2O (137,99 g/mol) w zakwaszonej (pH 2,5) wodzie ultra-czystej lub 0,1 N HCl. Mieszać za pomocą wortexa aż do uzyskania klarownych roztworów.
- Rozcieńczyć szeregowo (10x) roztwory 500 mM w tym samym rozpuszczalniku, aby uzyskać roztwory zapasowe o stężeniu 5 mM i 50 mM.
- Przygotować 10 mM roztwór kwasu 1-aminocyklopropano-karboksylowego (ACC; 101,1 g/mol) w wodzie ultra-czystej.
- Przefiltrować roztwory zapasowe w celu sterylizacji i przechowywać alikwoty w t....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Schematyczny układ płytek do weryfikacji uwalniania etylenu z CEPA w podłożu SH (pH 7) za pomocą testu potrójnej odpowiedzi przedstawiono na Rysunku 1A-C. Schemat blokowy ilustrujący protokół otrzymywania pellikli przedstawiono na Rysunku 2. Siewki A. thaliana hodowane w ciemności wykazują fenotyp potrójnej odpowiedzi (krótszy i grubszy podhipokotyl z wyraźnie zaznaczoną zakrzywioną wierzchołkową częścią) w obecności ACC oraz w .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisane tutaj metody przedstawiają produkcję in situ etylenu z do badania odpowiedzi bakterii na etylen przy użyciu organizmu modelowego K. xylinus. Ta metoda jest bardzo przydatna, ponieważ etylen można wytwarzać poprzez uzupełnienie dowolnego środowiska wodnego o pH większym niż 3,510,11 , negując potrzebę stosowania czystego gazu etylenowego lub specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego. Metoda ta nie ogranicza się do badania wpływu etylenu pochodzącego z na bakterie, ale może być również .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Dr. Dario Bonetty za dostarczenie nasion Arabidopsis thaliana i za pomoc techniczną w odniesieniu do testu potrójnej odpowiedzi, a także Simone Quaranta za pomoc z FT-IR. Prace te były wspierane przez grant Kanadyjskiej Rady ds. Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC-DG) dla JLS, stypendium dla absolwentów Ontario (OGS) dla RVA oraz stypendium dla absolwentów Queen Elizabeth II w dziedzinie nauki i technologii (QEII-GSST) dla AJV.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kwas 1-aminocyklopropanowo-karboksylowy (ACC) | Sigma | A3903 | Biosyntetyczny prekursor etylenu w roślinach |
| 4-sektorowa szalka Petriego | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | Do testowania potrójnej odpowiedzi |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | Do zestalania podłoża |
| Aparat Canon Rebel T1i DLSR | Canon | 3818B004 | Do zdjęć błonek |
| Celulaza z Trichoderma reesei ATCC 26921 | Sigma | C2730 | Roztwór wodny |
| Kwas cytrynowy | BioShop | CIT002.500 | Dla SH medium |
| Wybielacz komercyjny | Life Marka | 57800861874 | Wybielacz do sterylizacji nasion |
| Skoncentrowany HCl | BioShop | HCL666.500 | Kwas solny do regulacji pH |
| Cyfrowy mikroskop USB | Podłączany | Nie dotyczy Do | zdjęć kolonii |
| Etefon (≥ 96%; Kwas 2-chloroetylofosfonowy) | Sigma | C0143 | Związek uwalniający etylen |
| Glukoza | BioBasic | GB0219 | Dla podłoża SH |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | Bakteryjna rurka do mikrowirówki alfaproteobacterium wytwarzająca celulozę |
| LifeGene | LMCT1.7B | 1,7 ml probówka do mikrowirówki | |
| Murashige i Skoog (MS) podstawowa Średnie | Sigma | M5519 | Pożywka wzrostowa Arabidopsis thaliana |
| Na2HPO4· 7H2O | BioShop | SPD579.500 | Fosforan dwuzasadowy siedmiowodny do podłoża SH |
| NaCl | BioBasic | SOD001.1 | Chlorek sodu do roztworu soli fizjologicznej i kontrolnego |
| NaH2PO4· H2O | BioShop | SPM306.500 | Fosforan sodu, monozasadowy monohydrat do roztworu kontrolnego |
| NaOH | BioShop | SHY700.500 | Wodorotlenek sodu do regulacji pH |
| Folia parafinowa | Parafilm | PM996 | Do uszczelniania płyt i kolb |
| Pepton (bakteriologiczny) | BioShop | PEP403.1 | Do podłoża SH |
| Studzienka licząca Petroff-Hausser | Hausser naukowy | 3900 | Komora do liczenia komórek bakteryjnych |
| Filtr sterylizacyjny z polieterosulfonu 0,2 i mikro; m | VWR | 28145-501 | Do sterylizacji celulazy |
| Sacharoza | BioShop | SUC600.1 | Sacharoza na pożywkę MS |
| Ekstrakt drożdżowy | BioBasic | G0961 | Do podłoża SH |
Bibliografia
- Guzmán, P., Ecker, J. R. Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).
- Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. History of research on the plant hormone ethylene. J. Plant Growth Regul....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
