Charakterystyka wielopodjednostkowych kompleksów białkowych ludzkiego MxA przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej poliakryloamidu

Summary

Ten artykuł opisuje prosty i szybki protokół oceny oligomerycznego stanu białka GTPase MxA podobnego do dynaminy z lizatów komórek ludzkich przy użyciu kombinacji niedenaturującego PAGE z analizą western blot.

Abstract

Tworzenie kompleksów oligomerycznych jest kluczowym warunkiem dla prawidłowej struktury i funkcji wielu białek. Indukowane interferonem przeciwwirusowe białko efektorowe MxA wywiera szerokie działanie przeciwwirusowe przeciwko wielu wirusom. MxA jest GTPazą podobną do dynaminy i ma zdolność tworzenia struktur oligomerycznych wyższego rzędu. Jednak to, czy oligomeryzacja MxA jest wymagana dla jego aktywności przeciwwirusowej, jest kwestią dyskusyjną. Opisujemy tutaj prosty protokół oceny stanu oligomerycznego endogennie lub ektopowo wyrażanego MxA we frakcji cytoplazmatycznej ludzkich linii komórkowych za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym bez denaturacji (PAGE) w połączeniu z analizą Western blot. Kluczowym etapem protokołu jest wybór detergentów, które zapobiegną agregacji i/lub wytrącaniu się białek szczególnie związanych z błonami komórkowymi, takimi jak MxA, bez zakłócania ich aktywności enzymatycznej. Innym kluczowym aspektem protokołu jest nieodwracalna ochrona wolnych grup tiolowych reszt cysteiny przez jodoacetamid, aby zapobiec sztucznym interakcjom białka. Protokół ten nadaje się do prostej oceny stanu oligomerycznego MxA, a ponadto umożliwia bezpośrednią korelację aktywności przeciwwirusowej mutantów interfejsu MxA z ich odpowiednimi stanami oligomerycznymi.

Introduction

Czwartorzędowa struktura białka odgrywa kluczową rolę w wielu procesach komórkowych. Szlaki sygnałowe, ekspresja genów oraz aktywacja/dezaktywacja enzymów zależą od prawidłowego składania kompleksów białkowych ^1-4. Proces ten, znany również jako homo- lub heterooligomeryzacja, jest spowodowany nieodwracalnymi kowalencyjnymi lub odwracalnymi elektrostatycznymi i hydrofobowymi oddziaływaniami białko-białko. Oligomeryzacja nie tylko różnicuje różne procesy komórkowe bez zwiększania rozmiaru genomu, ale także zapewnia białkom strategię budowania stabilnych kompleksów, które są bardziej odporne na denaturację i degradację ⁵. Defekty oligomeryzacji mają wpływ na funkcję białek i mogą prowadzić do rozwoju chorób. Na przykład enzym hydroksylaza fenyloalaniny tworzy kompleks tetrameryczny. Niektóre mutacje w kompleksie białkowym mogą osłabiać tworzenie tetramerów i prowadzić do choroby fenyloketonurii ⁶.

Ludzkie białko MxA jest indukowanym przez interferon (IFN) przeciwwirusowym białkiem efektorowym, wywierającym szerokie działanie przeciwwirusowe przeciwko różnym wirusom RNA oraz DNA ⁷. Należy do nadrodziny dużych GTPaz podobnych do dynaminy i ma zdolność do tworzenia dużych struktur oligomerycznych in vitro ⁸. Sugeruje się, że oligomeryzacja chroni MxA przed szybką degradacją ^9,10. Pomimo intensywnych wysiłków wielu grup badawczych, molekularny mechanizm działania pozostaje w dużej mierze nieuchwytny, a rola stanu oligomeryzacji MxA dla jego funkcji przeciwwirusowej jest przedmiotem dyskusji ^9,11,12. W związku z tym Gao i współpracownicy zaproponowali model, w którym MxA wywiera swoją aktywność przeciwwirusową poprzez interakcję z nukleoproteinami wirusa w postaci dużych, przypominających pierścienie struktur oligomerycznych ¹¹. Jednak niedawno wykazaliśmy, że dimery MxA wykazują działanie przeciwwirusowe i oddziałują z nukleoproteiną wirusa grypy ^{A 12}. Opierając się na strukturze krystalicznej MxA, Gao i współpracownicy zidentyfikowali kilka reszt aminokwasowych w regionach interfejsu, które są krytyczne dla jego oligomeryzacji in vitro i funkcji przeciwwirusowej ^11,13. Dlatego, aby wyjaśnić, który stan oligomeryczny MxA wywiera aktywność przeciwwirusową, staraliśmy się ustalić prosty protokół szybkiego określenia stanu oligomerycznego mutantów interfejsu MxA ulegających ekspresji w komórkach ludzkich, a także endogennego MxA ulegającego ekspresji po stymulacji IFNα.

Chociaż istnieje wiele technik, które są powszechnie używane do badania interakcji między białkami, takich jak test komplementacji rozszczepionego zielonego białka fluorescencyjnego (split-GFP) ¹⁴, powierzchniowy rezonans plazmonów ¹⁵ i rezonansowy transfer energii rezonansu Förstera (FRET) ¹⁶, nie dostarczają one informacji o dokładnej stechiometrii oligomerycznego kompleksu białkowego. Do zbadania tego konkretnego aspektu bardzo przydatne są techniki takie jak rozpraszanie światła pod wieloma kątami (MALS) ¹⁷ i ultrawirowanie analityczne ¹⁸ . Zazwyczaj białka analizowane tymi metodami są białkami oczyszczonymi. Procesy oligomeryzacji mogą również zależeć od innych czynników komórkowych. Jeśli te czynniki są nieznane, analiza jest trudniejsza. Ponadto niektóre białka są trudne do ekspresji w E. coli i do oczyszczenia. Dlatego metody te nie są optymalnym wyborem do analizy oligomeryzacji białek w środowisku komórkowym. Ponadto techniki te wymagają drogich instrumentów, które nie są łatwo dostępne.

Niedenaturująca elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE), chromatografia wykluczania wielkości lub chemiczne sieciowanie, a następnie konwencjonalny dodecylosiarczan sodu (SDS)-PAGE są użytecznymi narzędziami do charakterystyki powstawania oligomerów z lizatów komórkowych ^2,19,20. Metody te nie wymagają specjalistycznego sprzętu i można je łatwo wykonać w standardowym laboratorium. Początkowo oceniliśmy różne protokoły chemicznego sieciowania, które niezmiennie prowadziły do niespecyficznej agregacji i wytrącania MxA. W związku z tym przetestowaliśmy następnie protokoły PAGE, które nie podlegają denaturacji. Ponieważ niedenaturujący PAGE wyklucza stosowanie SDS, migracja białek zależy od ich natywnego ładunku. Niebieski natywny PAGE wykorzystuje coomassie brilliant blue G250 do ładowania białek ogólnym ładunkiem ujemnym, podobnym do SDS, ale nie denaturuje białka ²¹. Niestety, błękit brylantowy coomassie wytrąca się w obecności wysokich soli i kationów dwuwartościowych (np. Mg²⁺), które często są zawarte w do lizy. W zależności od zastosowanych, analiza próbki może być trudna bez dalszej optymalizacji kroków, które mogłyby mieć wpływ na oligomeryczny kompleks białkowy.

Tutaj prezentujemy prosty protokół oparty na wcześniej opublikowanej metodzie ²² do określenia oligomeryzacji ludzkiego białka MxA pochodzącego z lizatów komórkowych za pomocą niedenaturującego PAGE.

Protocol

UWAGA: Ten protokół jest oparty na poprzednio opublikowanym niedenaturującym protokole PAGE ¹². W tym badaniu stan oligomeryczny białka MxA oceniano przy użyciu komórek Vero z nadekspresją MxA lub komórek A549 stymulowanych przez IFN-α eksprymujących endogenne MxA. Opisany poniżej protokół może być wykorzystany do analizy stanu oligomerycznego dowolnego białka oprócz MxA. Może być jednak konieczna dalsza optymalizacja.

1. Przygotowanie lizatu komórkowego do niedenaturacji STRONA

UWAGA: Aby przeanalizować stan oligomeryczny ludzkiego białka MxA w komórkach Vero lub A549, pobrano 1,0 x 10⁶ komórek. W zależności od typu komórki lub obfitości analizowanego białka należy dostosować liczbę komórek. Ważne jest również, aby chronić bufor do lizy przed ekspozycją na światło, gdy tylko zostanie dodany światłoczuły jodoacetamid.

1. Wysiew 0,3 x 10⁶ komórek A549 lub Vero na studzienkę do 6 dołków. Przechowywać komórki w 2 ml pożywki wzrostowej na studzienkę (patrz Tabela 1). Inkubować komórki przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO₂ ).
2. Zebrać komórki, przemłukując 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i odłączyć, dodając 0,5 ml 0,25% roztworu kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) 1x przez około 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Jak tylko komórki oderwą się od naczynia, dodaj 0,5 ml pożywki wzrostowej i ostrożnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół.
4. Przenieść komórki każdej studzienki do jednej probówki o pojemności 2 ml i granulować je za pomocą wirówki stołowej (5 000 x g, 4 °C, 5 min).
5. Ostrożnie usunąć sklarowany nad osadem przez pipetowanie, nie naruszając osadu komórkowego.
6. Przemyć komórki 1 ml lodowatego PBS, ostrożnie pipetując zawiesinę komórek w górę i w dół.
7. Granulki w wirówce stołowej (5 000 x g, 4 °C, 5 min).
8. Ostrożnie usunąć sklarowany osad przez pipetowanie, nie odrywając osadu komórkowego.
9. Zawiesić komórki w 200 μl lodowatego buforu do lizy (patrz Tabela 1), pipetując w górę i w dół, a następnie umieścić na lodzie.
10. Natychmiast chronić lizat przed światłem, przykrywając probówki folią aluminiową i inkubować przez 30 minut na lodzie.
    UWAGA: Po inkubacji przez 30 minut na lodzie nie jest już konieczna ochrona lizatu przed ekspozycją na światło, ponieważ ochrona wolnych grup tiolowych jest nieodwracalna.
11. Usunąć resztki komórek przez odwirowanie we wstępnie schłodzonej wirówce stołowej (13 000 x g, 4 °C, 20 min).
12. Wyrównać kolumny dializacyjne w buforze dializacyjnym (tabela 1) w chłodni w temperaturze 4 °C przez 20 minut na etapie wirowania. Użyj kolumny o masie cząsteczkowej odciętej 10 000.
    1. Przymocuj kolumny do boi pływakowej i umieść je w zlewce wypełnionej buforem do dializy. Aby zapewnić delikatne mieszanie, użyj mieszadła magnetycznego. Nie dotykaj membrany.
       UWAGA: Kolumny dializacyjne można zakupić lub przygotować z probówek o pojemności 1,5 ml zgodnie z protokołem opisanym przez Fialę i współpracowników ¹⁹.
13. Usunąć kolumny z buforu dializacyjnego i pławy pływakowej. Przenieść oczyszczone lizaty do przygotowanej kolumny dializacyjnej za pomocą pipetowania bez dotykania membrany. Przymocować kolumny do boi pływakowej i włożyć je z powrotem do zlewki wypełnionej buforem do dializy.
14. Dializować lizat w zlewce zawierającej lodowaty bufor do dializy (tabela 1) przez co najmniej 4 godziny (lub najlepiej przez noc) w temperaturze 4 °C, ostrożnie mieszając przy użyciu mieszadła magnetycznego. Użyć co najmniej 100 ml buforu dializacyjnego na 200 μl lizatu.
15. Przenieść pobraną próbkę do probówki o pojemności 1,5 ml. Usunąć osady przez odwirowanie w wirówce stołowej (13 000 x g, 4 °C, 20 min). Aby zapobiec dysocjacji oligomerycznych kompleksów białkowych, należy postępować zgodnie z protokołem (punkt 2) bezpośrednio po dializie. Nie zamrażaj przygotowanych lizatów.

2. Elektroforeza

UWAGA: Elektroforeza została przeprowadzona zgodnie z wcześniejszym opisem z pewnymi modyfikacjami ²². W opisanym poniżej protokole zastosowano prefabrykowane żele gradientowe (gradient 4-15%). Alternatywnie żele można przygotować w laboratorium. Bardzo ważne jest, aby wykluczyć wszelkie czynniki denaturujące, takie jak SDS, aby zapobiec dysocjacji oligomerycznych kompleksów białkowych. Czas elektroforezy został zoptymalizowany pod kątem różnych stanów oligomerycznych ludzkiego białka MxA. Jednak może się różnić w przypadku innych białek, w zależności od wielkości kompleksu oligomerycznego, a także zakresu separacji, który ma zostać osiągnięty w celu analizy kompleksu. Dlatego optymalny czas elektroforezy należy określić empirycznie. Dla optymalnej rozdzielczości analizowanych oligomerów prąd nie powinien przekraczać 25 mA.

1. Zmontuj niedenaturujący żel PAGE w komorze żelu. Napełnić komorę wewnętrzną i zewnętrzną wstępnie schłodzonym buforem roboczym (Tabela 1).
2. Żel należy wstępnie uruchomić za pomocą wstępnie schłodzonego buforu bieżącego o natężeniu 25 mA na żel przez 15 minut w chłodni w temperaturze 4 °C.
3. Zmieszać 15 μl wyżej przygotowanych lizatów z 5 μl 4 x buforu do próbki (tabela 1). Nie gotować próbki.
4. Załaduj 15 μl próbki i wybrany natywny wzorzec białka na żel. Uruchom żel w temperaturze 25 mA przez 4 godziny w chłodni w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: W przypadku analiz półilościowych można przeprowadzić protokół oznaczania ilościowego białka (np. test białka Bradforda ²³) w celu zapewnienia obciążenia równych ilości białka całkowitego na pas
.

3. Western Blot

UWAGA: Poniżej opisany jest protokół systemu wet western blot. Można użyć dowolnej membrany bibułowej. Aktywuj membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) w 100% metanolu przed zrównoważeniem w buforze bibułkowym. Technika półsuchych western blot może być stosowana alternatywnie, ale musi być zoptymalizowana pod kątem dużych kompleksów oligomerycznych.

1. Zdemontuj żel i ostrożnie przenieś go do bufora SDS (Tabela 1).
2. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie wstrząsając.
3. Przygotuj 2 gąbki, 4 arkusze celulozowej bibuły filtracyjnej i membranę bibułową na żel. Namocz je w buforze bibułkowym (tabela 1).
4. Złóż kanapkę w następujący sposób (od dołu do góry): 1 gąbka, 2 arkusze celulozowej bibuły filtracyjnej, membrana, żel, 2 arkusze celulozowej bibuły filtracyjnej, 1 gąbka.
5. Włóż kanapkę do bibułki. Upewnij się, że membrana jest skierowana w stronę bieguna dodatniego, podczas gdy żel jest skierowany w stronę bieguna ujemnego.
6. Napełnij zbiornik bibuły wstępnie schłodzonym buforem do bibuły.
7. Osusz w 90 mA przez noc w temperaturze 4 °C, aby uzyskać najlepsze wyniki transferu białka.
8. Zdemontuj kanapkę i zwizualizuj wzorzec białka, inkubując membranę w roztworze Ponceau S przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
9. Odbarwić membranę, ostrożnie zmywając Ponceau S wodą dejonizowaną, aż będzie wyraźnie widać pasma wzorca białkowego.
10. Zaznacz pasma wzorca białka za pomocą pisaka.
    UWAGA: Resztki Ponceau S mogą zakłócać barwienie immunologiczne. Aby tego uniknąć, membranę można dalej odbarwiać poprzez inkubację w 0,1 M NaOH przez 1 minutę, a następnie mycie wodą dejonizowaną.
11. Zablokować membranę za pomocą buforu blokującego (patrz tabela 1) przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
12. Wizualizacja białka będącego przedmiotem zainteresowania poprzez barwienie immunologiczne przy użyciu przeciwciał skierowanych przeciwko białku, które ma być analizowane.
    UWAGA: Ludzkie białko MxA wizualizowano przy użyciu króliczego przeciwciała poliklonalnego specyficznego dla ludzkiego Mx1 rozcieńczonego w stosunku 1:1,000 w buforze blokującym (Tabela 1). Roztwór przeciwciała inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C. Alternatywnie można użyć przeciwciała monoklonalnego anty-MxA (klon 143) (dane nie pokazane) ²⁴.

Results

Korzystając z niedenaturującego PAGE, przeanalizowaliśmy stan oligomeryczny ludzkiego dzikiego typu MxA, dimerycznych mutantów interfejsu MxA(R640A) i MxA(L617D), a także monomerycznego mutanta interfejsu MxA(M527D) z lizatów komórkowych ¹². Komórki poddano lizie w buforze zawierającym 1% oktylofenoksypolietylenu (NP-40) i jodoacetamid, aby zapewnić solubilizację białek i ochronę wolnych grup tiolowych (patrz ryc. 1). Jak opisano wcześniej, sól i małe metabolity zostały usunięte przez dializę ...

Discussion

W tym miejscu opisujemy prostą metodę, która pozwala na szybkie określenie stanu oligomerycznego białek ulegających ekspresji w komórkach ssaków za pomocą niedenaturującego PAGE, a następnie analizę Western blot. Główną zaletą tego podejścia jest to, że stan oligomeryczny danego białka można określić na podstawie lizatów całokomórkowych bez wcześniejszego oczyszczania białka. Może to być ważne w przypadku białek, które oligomeryzują lub pełnią swoją funkcję w połączeniu z czynnikami pomocniczymi. Ponadto białka są nadal ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Jednostki dializacyjne Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0,5 ml	Thermo Fisher Scientific	69570	Wstępna równowaga w buforze dializacyjnym (jeśli pożądane jest usunięcie glicerolu) Może być wykonany samodzielnie zgodnie z Fiala et al. 2011
4– 15% prefabrykowane żele białkowe Mini-PROTEAN TGX, 10-dołkowe,	Bio-Rad	456-1083	Wstępny przebieg w buforze do pracy w celu dostosowania systemu buforowego
cKompletne, Mini, wolne od EDTA	Roche	11836170001	stosować 1 tabletkę na 50 ml
PBS, pH 7,4  butelka 500 ml Gibco	Thermo Fisher Scientific	14190-094
Ponceau S roztwór	Sigma-Aldrich	P7170	TOKSYCZNY nosić rękawice i chronić oczy
NativeMark Unstained Protein Standard  50 &mikro; l	Invitrogen	P/N 57030	obciążenie 5 i mikro; l / dołek
Komórki A549	ATCC ATCC	CCL185	Rosną w pożywce wzrostowej (patrz Tabela 1)
Komórki Vero	ATCC	ATCC CCL81	Wzrost w pożywce wzrostowej (patrz Tabela 1)przeciwciało
anty-Mx1	Novus Biologicals	H00004599_D01P	Stosować w rozcieńczeniu 1:1 000
ECL Przeciwciało przeciw królikowi IgG, całe przeciwciało połączone z peroksydazą chrzanową (od osioł)	GE-Healthcare	NA934V	Stosować w rozcieńczeniu 1:10 000
0,5% Trypsyna-EDTA (1x)              Life Technologies	Thermo Fisher	15400-054
Jodoacetamid    5 g	Sigma-Aldrich	I-6125	stock  100 mM
Bromphenolblue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
DMEM +4,5g/l Gluc,+L-Glut,+Pirogronian life technologies	Thermo Fisher Scientific	41966-029
Pen  Paciorkowiec 100 x        100ml                            life technologies	Thermo Fisher Scientific	15140 - 130
Glutamax 100x Stock, 100 ml        Technologie życiowe	Thermo Fisher Scientific	350500-038
Surowica bydlęca płodowa, dializowana, pochodzenie z USA 500 ml Gibco Partia: 42G9552K	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Bibuła filtracyjna z celulozy	Bio-Rad	1703965
Membrana PVDF	GE-Healthcare	10600022
Tris(hydroksymetylo)aminometan	Biosolve	0020092391BS
fluorek sodu (NaF)	Sigma Aldrich	S-7920
NP-40	Calbiochem	492015
cKompletne, Mini, wolne od EDTA	Roche
Tween 20	Calbiochem	6555204
CHAPS 10% roztwór	Amresco	N907
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	43819
Glycine	Biosolve	0007132391BS
orthovanadan sodu (Na3VO4)	Sigma Aldrich	450243
Glycerol	Sigma Aldrich	G7757
β-Glycerophospate	Sigma Aldrich	G9422
Mleko w proszku	Migros/Szwajcaria
Metanol	Millipore	1.06009
kloryd sodu (NaCl)	Sigma Aldrich	71380
chlorek magnezu (MgCl2)	Amresco	288
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	Sigma Aldrich	L4509
wodorotlenek sodu (NaOH)	Sigma Aldrich	S-8045