Wizualizacja częstotliwości zrębu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Summary

Opisane są protokoły badania dynamiki zrębów chloroplastowych, kanalików wypełnionych zrębem, które rozciągają się od powierzchni chloroplastów.

Abstract

Stromule, czyli "kanaliki wypełnione zrębem", to wąskie, rurkowate przedłużenia od powierzchni chloroplastu, które są powszechnie obserwowane w komórkach roślinnych, ale których funkcje pozostają tajemnicze. Wraz z rosnącym zainteresowaniem rolą chloroplastów w koordynowaniu reakcji roślin na stres, w ostatnich latach wzrosło zainteresowanie zrębami i ich związkiem z dynamiką sygnalizacji chloroplastów, do czego przyczyniły się postępy w mikroskopii fluorescencyjnej i fluoroforach białkowych, które pozwalają na szybką i dokładną wizualizację dynamiki zrębu. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe protokoły do oznaczania częstości występowania zrębu w chloroplastach naskórka Nicotiana benthamiana, doskonałego systemu modelowego do badania biologii zrębu chloroplastów. Udostępniamy również metody wizualizacji zrębów chloroplastów in vitro poprzez ekstrakcję chloroplastów z liści. Na koniec przedstawiamy strategie pobierania próbek i podejścia statystyczne do analizy różnic w częstości występowania zrębułów w odpowiedzi na bodźce, takie jak stres środowiskowy, zabiegi chemiczne lub wyciszanie genów. Naukowcy mogą wykorzystać te protokoły jako punkt wyjścia do opracowania nowych metod innowacyjnych eksperymentów w celu zbadania, w jaki sposób i dlaczego chloroplasty tworzą zręble.

Introduction

Chloroplasty to dynamiczne organelle w komórkach roślinnych odpowiedzialne za fotosyntezę i wiele innych procesów metabolicznych. Szlaki sygnałowe z chloroplastu wywierają również znaczący wpływ na fizjologię i rozwój roślin, koordynując reakcje roślin na stres środowiskowy, patogeny, a nawet kształt liści^1-6. Ostatnio biolodzy zainteresowali się słabo poznanym aspektem struktury chloroplastów: stromulami, bardzo cienkimi kanalikami wypełnionymi zrębem, które rozciągają się od powierzchni chloroplastu⁷.

Biologiczne funkcje stromuli pozostają nieznane, chociaż wiadomo, że częstotliwość stromuli zmienia się w odpowiedzi ....

Protocol

UWAGA: W tym protokole skupiliśmy się na ocenie częstości występowania stromuli w naskórku liści N. benthamiana. Wygenerowano kilka stabilnych linii transgenicznych, które można wykorzystać do tego celu, w tym 35S_PRO:FNRtp:EGFP¹³ i NRIP1:Cerulean⁶. Obie te linie wykazują silną ekspresję fluoroforów w zrębie chloroplastów liści uprawianych w szerokim zakresie warunków. Alternatywnie, fluorofory ukierunkowane na chloroplasty mogą ulegać przejściowej ekspresji w N. benthamiana przy użyciu przemian Agrobacterium ¹³. Jest to mniej idealne rozwiązanie niż w przypadku linii transgeniczny....

Results

Ten protokół został wykorzystany do wizualizacji częstotliwości występowania stromuli w dzień i w nocy u liścieni młodych siewek N. benthamiana. Plasterki ze stosu z osi z zostały scalone w jeden obraz (Rysunek 1A). Dla celów wizualnych obraz ten został następnie zdesaturowany i odwrócony tak, że zrąb wydaje się (ryc. 1B). Chloroplasty zostały oznaczone jako nieposiadające zrębułek (zielona gwiazdka) lub mające co najmniej jedną stromulę.......

Discussion

Podczas badania zrębów należy wziąć pod uwagę trzy ważne czynniki: (i) manipulacja tkanką roślinną musi być ograniczona do absolutnego minimum, (ii) system doświadczalny musi być spójny oraz (iii) strategie pobierania próbek muszą być starannie zaplanowane, aby zapewnić analizę solidnych, powtarzalnych danych.

Zręble są niezwykle dynamiczne: mogą się szybko wysuwać i chować na oczach obserwatora pod mikroskopem. Co więcej, częstotliwość zrębułek różni się znacznie w odpowiedzi na szeroki zakre.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny	Carl Zeiss Inc	Model: LSM710
Dioctan karboksyfluoresceiny (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	EMD	MX1458-6
Waring blender	Waring	Model: 31BL92
Fidżi	fiji.sc		source do analizy obrazów biologicznych