Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Neurofarmakologiczna manipulacja skrępowanych i swobodnie latających pszczół miodnych, Apis mellifera

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54695

⸱

26 listopada 2016

 ,  ,  , 
1Department of Science and Mathematics, Volda University College, 2Department of Biology, Washington University in St. Louis, 3Department of Biological Sciences, Macquarie University, 4Department of Biology, University of Konstanz, 5Research Center on Animal Cognition, CNRS, Universite de Toulouse

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje kilka protokołów podawania środków farmakologicznych pszczołom miodnym, w tym proste nieinwazyjne metody dla pszczół swobodnie latających, a także bardziej inwazyjne warianty, które pozwalają na precyzyjne, miejscowe leczenie krępowanych pszczół.

Streszczenie

Pszczoły miodne wykazują zadziwiające zdolności uczenia się oraz zaawansowane zachowania społeczne i komunikację. Ponadto ich mózg jest mały, łatwy do wizualizacji i badania. Dlatego pszczoły od dawna są ulubionym modelem wśród neurobiologów i neuroetologów do badania neuronalnych podstaw zachowań społecznych i naturalnych. Ważne jest jednak, aby techniki eksperymentalne stosowane do badania pszczół nie kolidowały z badanymi zachowaniami. Z tego powodu konieczne było opracowanie szeregu technik farmakologicznej manipulacji pszczołami miodnymi. W artykule przedstawiono metody leczenia pszczół miodnych trzymanych przez uwięzi lub swobodnie latających za pomocą szerokiej gamy środków farmakologicznych. Należą do nich zarówno metody nieinwazyjne, takie jak leczenie doustne i miejscowe, jak i metody bardziej inwazyjne, które pozwalają na precyzyjne dostarczanie leków zarówno w sposób ogólnoustrojowy, jak i miejscowy. Na koniec omawiamy zalety i wady każdej metody oraz opisujemy typowe przeszkody i sposoby ich pokonania. Kończymy dyskusją na temat tego, jak ważne jest dostosowanie metody eksperymentalnej do zagadnień biologicznych, a nie na odwrót.

Wprowadzenie

Odkąd Karl von Frisch wyjaśnił ich język tańca1, pszczoły miodne pozostały popularnym gatunkiem badawczym dla badaczy zajmujących się zachowaniem zwierząt i neurobiologią. W ostatnich latach na przecięciu tych dwóch dziedzin pojawiło się mnóstwo nowych dyscyplin, a obok nich powstało kilka innych dyscyplin (np. biologia molekularna, genomika i informatyka). Doprowadziło to do szybkiego rozwoju nowych teorii i modeli pozwalających zrozumieć, w jaki sposób zachowanie wynika z aktywności w obrębie układu nerwowego. Ze względu na unikalny styl życia, bogaty repertuar zachowań oraz łatwość manipulacji eksperymentalnej i farmakologicznej, pszczoły pozostały na czele tej rewolucji.

Pszczoły miodne są wykorzystywane do badania podstawowych zagadnień neurobiologicznych, takich jak te leżące u podstaw uczenia się i pamięci2,3, podejmowania decyzji4, węchu5 lub przetwarzania wzrokowego6. W ostatnich latach pszczoła miodna została nawet wykorzystana jako model do badania tematów zwykle zarezerwowanych dla badań medycznych, takich jak skutki działania uzależniającychleków 7-11, sen12, starzenie się13 lub mechanizmy leżące u podstaw znieczulenia14.

W przeciwieństwie do klasycznych organizmów modelowych (np. D. melanogaster, C. elegans, M. musculus), dostępnych jest bardzo niewiele narzędzi genetycznych do manipulowania funkcjami neuronalnymi u pszczół miodnych, chociaż obecnie to się zmienia15. Zamiast tego badania nad pszczołami miodnymi opierały się przede wszystkim na manipulacjach farmakologicznych. Odniosło to duży sukces; Jednak różnorodność badań nad pszczołami jest tak duża, że potrzebny jest szereg metod podawania farmakologicznego. Badania z udziałem pszczół miodnych dotyczą bardzo zróżnicowanych kwestii, są badane przez naukowców z różnych dyscyplin i środowisk oraz wykorzystują różne podejścia eksperymentalne. Wiele pytań badawczych wymaga, aby pszczoły albo latały swobodnie, swobodnie wchodziły w interakcje ze swoją kolonią, albo jedno i drugie. Może to utrudnić śledzenie poszczególnych zwierząt doświadczalnych i uniemożliwić ograniczenie lub kaniulację.

Aby dostosować się do różnorodności badań nad pszczołami miodnymi, potrzebne są różne metody dostarczania leków, pozwalające na solidne i elastyczne podawanie, jednocześnie zapewniając, że profile farmakokinetyczne i farmakodynamiczne, inwazyjność metody i jej niezawodność, pasują do omawianego paradygmatu. Ze względu na te zróżnicowane potrzeby, większość grup badawczych opracowała własne, unikalne metody podawania leków. Do tej pory była to siła społeczności badawczej zajmującej się pszczołami; Doprowadziło to do opracowania szeregu metod pozwalających na podawanie tego samego leku w różnych okolicznościach. Naszym celem nie jest opracowanie jednej ustandaryzowanej metody farmakologicznych manipulacji pszczołami, ale raczej zwrócenie uwagi na metody, które okazały się szczególnie skuteczne i pomoc naukowcom w ich przyjęciu. Omawiamy podstawowe zasady ich działania, a także ich zalety i wady.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Drug Administration for Harnessed Bees (Administracja Leków dla Pszczół Okiełznanych

)
  1. Leczenie doustne
    1. Przygotuj 1,5 M roztwór sacharozy, mieszając 257 g sacharozy z 500 ml wody (łatwiej jest rozpuścić tę ilość sacharozy we wrzącej wodzie). Roztwór sacharozy przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Roztwór sacharozy stanowi bardzo gościnne środowisko dla niektórych mikroorganizmów, a tym samym łatwo ulega skażeniu i staje się niesmaczny dla pszczół. Roztwór sacharozy luzem może być porcjowany i przechowywany w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
    2. Zdecyduj o odpowiedniej dawce leku (jak ją osiągnąć, omówiono w sekcji dyskusji poniżej) i przygotuj roztwór tak, aby preferowana dawka leku została rozpuszczona w 20 μl roztworu sacharozy (np. aby dostarczyć 20 μg, rozcieńczyć lek w stosunku 1 mg/ml). Uprząż pszczół według Felsenberga i in. (2011)16. Wykonaj ten krok co najmniej 12 godzin przed leczeniem farmakologicznym, aby upewnić się, że pszczoły nie są już zestresowane zaprzęganiem po przedstawieniu roztworu leku.
      UWAGA: Aby uzyskać bardziej spójne wyniki, najlepiej jest zagłodzić pszczoły (umieszczając pszczoły zaprzężone w inkubatorze w temperaturze 34 °C i wilgotności 70%) O/N.
    3. Za pomocą mikropipety przyłóż kroplę 1,5 M wody z sacharozą do anteny zaprzęgniętej pszczoły. Gdy trąba jest wysunięta, należy przyłożyć 20 μl kropli 1,5 M sacharozy zawierającej lek bezpośrednio do trąbki pszczoły. Upewnij się, że pszczoła zjada wszystko. Jako kontrolę pojazdu należy użyć 1,5 M roztworu sacharozy bez dodatku leków.
      UWAGA: Ilość roztworu sacharozy może wymagać dostosowania na podstawie planów eksperymentalnych. Jeśli zamierzone jest warunkowanie apetytywne, karmienie pszczół tuż przed treningiem będzie zakłócać reakcję pszczół.
    4. Wyrzuć lub odłóż na bok pszczoły, które nie spożywają całej sacharozy.
      UWAGA: Jeśli duża liczba pszczół nie wypije roztworu sacharozy, może być konieczne dostosowanie harmonogramu karmienia.
  2. Wstrzyknięcie w klatkę piersiową
    1. Przygotuj lek w pszczole miodnej Ringer17w następujący sposób:
      1. Wymieszaj i autoklaw 7,45 g NaCl, 0,448 g KCl, 0,812 g MgCl2, 0,735 g CaCl2, 54,72 g sacharozy, 4,95 g D-glukozy i 2,48 g HEPES w 1,000 ml wody. Zachowaj ostrożność podczas przechowywania Ringera, ponieważ łatwo ulega zanieczyszczeniu. Porcję i przechowywać Ringer w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
      2. Lek rozpuścić w roztworze Ringera, a następnie rozcieńczyć tak, aby pożądana ilość była obecna w 5 μl. Na przykład, jeśli pszczoły mają być leczone 5 μg leku, 1 g można najpierw rozpuścić w 1 ml w Ringer, a następnie rozcieńczyć w stosunku 1:1000 w Ringerze do końcowego roztworu 1 μg/μl.
        UWAGA: Alternatywnie, zamiast roztworu Ringera można użyć dostępnego w handlu PBS (Phosphate-buffered Salin).
    2. Zrób mikroskalpel, odłamując róg obosiecznej żyletki za pomocą uchwytu na ostrze. Przymocuj fragment ostrza do uchwytu ostrza, aby tworzył ładne ostrze z ostrym końcem.
    3. Pod mikroskopem stereoskopowym ostrożnie użyj mikroskalpela, aby wyciąć 2-milimetrowy otwór tuż nad tarczką, obok wyrostka tylnego skrzydła klatki piersiowej pszczoły. Unikaj zbyt głębokiego cięcia, ponieważ może to zranić mięśnie lotu, i uważaj, aby uniknąć zawiasów skrzydła. Najlepiej przyciąć tylko trzy boki, aby płat naskórka można było później odchylić do tyłu, aby zamknąć miejsce urazu.
    4. Za pomocą mikropipety umieść 5 μll Ringera (lub PBS) zawierającego lek na górze otworu w klatce piersiowej. Uważnie monitoruj pod mikroskopem, aby upewnić się, że cała kropla została wchłonięta przez hemolimfę. Użyj Ringer (lub PBS) jako kontrolki pojazdu.
    5. Jeśli to możliwe, przesuń płatek skórki z powrotem nad otwór. Po 5-10 godzinach ponownie się przymocuje i uszczelni.
      UWAGA: Jako alternatywę dla tej techniki wstrzyknąć 1 μl bezpośrednio w klatkę piersiową za pomocą szklanej strzykawki, po otwarciu małego otworu w środku wędzidełka (linia poprzeczna w tylnej części tarczki) za pomocą igły strzykawkowej (średnica: 0,6 mm, G: 23). Pozwala to uniknąć konieczności uprzedniego przecięcia klatki piersiowej skalpelem, a miejsce wstrzyknięcia jest mniejsze, ale ta metoda pozostawi miejsce wstrzyknięcia odsłonięte.
  3. Iniekcja do celulo<br /> UWAGA: Jest to metoda odpowiednia do dostarczania cząsteczek przez torebkę główną, do hemolimfy.
    1. Przygotować leki jak w ppkt 1.2.1, ale dostosować stężenia leku tak, aby pożądana dawka zawierała się w 1 μl Ringera lub PBS (mniejsza objętość może zostać wchłonięta przez otwór w ocellus niż przez klatkę piersiową).
    2. Przygotować mikroskalpel jak w ppkt 1.2.2. Pod mikroskopem stereoskopowym zablokuj głowę zaprzęgniętej pszczoły na miejscu, wypełniając szczelinę szyi woskiem. Używaj wosku topliwego w niskiej temperaturze (np. wosku dentystycznego), aby uniknąć uszkodzenia receptorów węchowych czułków lub innych komórek, które mogą być ważne dla oceny zachowania (np. uczenia się węchu). Następnie ostrożnie wyjmij soczewkę z środkowego ocellusa, wkładając końcówkę mikroskalpela pod soczewkę i delikatnie oderwij soczewkę od torebki głowy.
      UWAGA: Możliwe jest również ostrożne nałożenie wosku na anteny, aby zapobiec ruchom.
    3. Ostrożnie pipetować lek na otwór ocellus. Poczekaj, aż wszystko zostanie wchłonięte do kapsułki na głowę. Usuń woskowinę dentystyczną z czułków i pozwól pszczole odpocząć przez chwilę przed kontynuowaniem procedury eksperymentalnej. Użyj Ringer (lub PBS) jako kontrolki pojazdu.
  4. Wstrzyknięcie do dróg oddechowych
    UWAGA: Przewód oczny zawiera duże włókna, łączące się z większością obszarów centralnego mózgu18. Ta metoda leczenia umożliwia stosowanie związków tylko do mózgu, ale nie jest ukierunkowane na określone podregiony mózgu.
    1. Przygotować pszczołę jak w 1.3.2 i usunąć soczewkę środkowego oka za pomocą końcówki mikroskalpela, jak w 1.3.3.
      UWAGA: Można to zrobić do 2 godzin przed wstrzyknięciem. Z naszego doświadczenia wynika, że karmione pszczoły lepiej radzą sobie z tą operacją niż pszczoły zagłodzone
    2. Napełnić szklaną strzykawkę o pojemności 10 μl wyposażoną w igłę o małej wielkości (np. 33, średnica: 210 μm) roztworem leku przygotowanym w sposób opisany w ppkt 1.3.1.
    3. Za pomocą ręcznego mikromanipulatora wprowadzić końcówkę strzykawki przez siatkówkę oka do kapsułki głowy na głębokość 50 μm i wstrzyknąć 250 nl roztworu.
    4. Po użyciu strzykawkę należy przepłukać 3 razy wodą destylowaną, a następnie 3 razy 75% etanolem.
  5. Mikroiniekcja w określone struktury mózgu
    UWAGA: Oprócz wymienionych powyżej systematycznych zabiegów, możliwe jest wykonywanie mikroiniekcji w poszczególne struktury mózgu. Pozwala to na farmakologiczną manipulację jednym lub kilkoma obszarami mózgu, pozostawiając inne nienaruszone. Działa to najlepiej w przypadku obszarów mózgu, które są łatwe do rozpoznania z przedniej powierzchni mózgu (np. płaty antenowe, kielichy ciała grzyba lub płaty pionowe lub płaty wzrokowe), ale inne regiony zostały ukierunkowane. Należy pamiętać, że orientacja (przednia/tylna, grzbietowa/brzuszna) odnosi się raczej do osi ciała, a nie do neuraxis19.
    1. Przygotować lek w Ringer lub PBS w taki sam sposób, jak w ppkt 1.2.1, dodając barwnik fluorescencyjny (np. 0,5 mg/ml Dextran, Alexa 546 lub 568 fluor) lub niefluorescencyjny (np. 1 mM błękitu metylenowego).
      UWAGA: Dodanie barwnika fluorescencyjnego pozwoli na weryfikację miejsca wstrzyknięcia po zakończeniu eksperymentu (przy użyciu mikroskopii konfokalnej, po wypreparowaniu mózgu), podczas gdy barwniki niefluorescencyjne pozwolą na bezpośrednie monitorowanie podczas eksperymentu.
    2. Aby wykonać szklane pipety do wstrzykiwań, należy włożyć szklane kapilary o odpowiedniej średnicy do zacisków uchwytu ściągacza elektrod (1,0 mm dla standardowego uchwytu dołączonego do mikrowtryskiwacza wymienionego w wykazie materiałów). Dostosuj ustawienia ciągnięcia i podgrzewania, aby uzyskać końcówkę o długości około 0.5 cm (ustawienia będą różne dla każdego ściągacza, nawet jeśli używany jest ten sam model).
      UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby dwie pipety wyciągnięte z jednej szklanki miały tę samą długość i kształt, tak aby można było używać obu.
    3. Pod mikroskopem stereoskopowym połam końcówki, aby uzyskać średnicę zewnętrzną około 10-15 μm, na podstawie oceny wizualnej za pomocą skali na siatce wprowadzonej do okularu. Kroki na skali są definiowane przez producenta i mogą być korygowane w zależności od zastosowanego powiększenia.
    4. Następnie napełnić szklane pipety roztworem do wstrzyknięcia. Jeśli używane są szklane kapilary z włóknami, napełnij pipetę, umieszczając tylną stronę w roztworze leku, w przeciwnym razie napełnij końcówkę za pomocą końcówek do mikroładowania.
    5. Włóż napełnioną szklaną pipetę do uchwytu kapilarnego mikrowtryskiwacza, który jest sterowany przez ręczny lub elektroniczny mikromanipulator.
    6. Skalibrować mikrowstrzykiwacz, aby wstrzyknąć żądaną objętość (0,5-2 nl, w zależności od wielkości docelowej struktury mózgu). W tym celu należy wstrzyknąć bezpośrednio do małej szalki Petriego zawierającej olej mineralny i zmierzyć średnicę kropli za pomocą siatki. Zmieniaj ustawienia, aż zostanie osiągnięta żądana głośność.
    7. Umocować głowę zaprzęgniętej pszczoły za pomocą miękkiego wosku dentystycznego, jak w ppkt 1.3.2, przed wycięciem otworu w przedniej części torebki głowy, za pomocą mikroskalpela, z trzema nacięciami: jednym tuż poniżej środkowego ocellusa (brzusznego), jednym na granicy prawego lub lewego oka i jednym powyżej łodyg czułków (grzbietowych). Użyj kawałka wosku dentystycznego, aby przytrzymać otwartą klapkę na miejscu.
    8. Ostrożnie odepchnij gruczoły i tchawicę leżące na wierzchu mózgu za pomocą cienkich kleszczy, a następnie wykonaj małe pęknięcie w nerwilemie (bardzo cienka błona wokół mózgu) powyżej docelowej struktury mózgu.
      UWAGA: Jeśli ma być leczonych wiele pszczół jednocześnie, procedurę tę można wykonać wcześniej; Należy jednak uważać, aby nie pozostawiać pszczół w tym stanie zbyt długo (nie dłużej niż 30 minut), ponieważ ich mózgi mogą wyschnąć.
    9. Włóż końcówkę do żądanego obszaru mózgu i dostosuj głębokość prostopadłą do powierzchni mózgu (np. 60 μm dla kielichów grzybowych). Wstrzyknij zaprogramowaną głośność. W przypadku bocznych obszarów mózgu należy wstrzykiwać obustronnie (tj. wykonać jedno wstrzyknięcie do każdej półkuli). Jeśli używany jest barwnik niefluorescencyjny, upewnij się, że wstrzyknięcie nastąpiło we właściwym obszarze podczas obserwacji podczas wstrzykiwania. Jeśli używany jest barwnik fluorescencyjny, zrób to samo w świetle fluorescencyjnym za pomocą mikroskopu stereoskopowego z fluorescencyjnym systemem view.
    10. Następnie umieść otwartą klapę z powrotem na głowie pszczoły. Rozpuść kryształ eikozanu o średnicy około 1 mm za pomocą cienkiego drutu owiniętego wokół końcówki mikrolutownicy (temperatura topnienia wynosi 35-37°C) i uszczelnij nacięcia. To znacznie zmniejszy śmiertelność.
    11. Uwolnij pszczołę z uprzęży w celu analizy behawioralnej (ale patrz dyskusja) lub trzymaj w uprzęży do eksperymentów na skrępowanych pszczołach – np. testów odruchu wyprostu trąbki (PER)20.
    12. Jeśli użyto barwnika fluorescencyjnego, upewnij się, że wstrzyknięcie uderzyło w obszar zainteresowania po zakończeniu eksperymentu za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (ryc. 1).
      UWAGA: Jest to szczególnie przydatne w przypadku celowania w głębsze obszary mózgu (gdzie trudno byłoby zobaczyć barwnik niefluorescencyjny podczas fazy wstrzykiwania).

2. Metody podawania leków dla pszczół swobodnie latających

  1. Leczenie doustne
    1. Przygotuj lek w taki sam sposób, jak w krokach 1.1.1-1.1.2. Dodaj roztwór leku do karmnika i umieść w lodówce do przechowywania.
      UWAGA: Wystarczy dowolny karmnik, taki jak odwrócona do góry nogami nakrętka od butelki lub słoik odwrócony na bibułce.
    2. Trenuj pszczoły do karmnika grawitacyjnego zawierającego 1 M lub 0,5 M roztworu sacharozy, umieszczając karmnik w pobliżu ula. Gdy pszczoły zaczną żerować przy karmniku, stopniowo odsuwaj go dalej, aż znajdzie się w wygodnej odległości, aby uniknąć użądlenia (minimum 5 m).
    3. Oznaczaj pszczoły farbą, aby śledzić poszczególne pszczoły miodne. Sporządź listę wszystkich kombinacji kolorów, które zostaną użyte. Kiedy pszczoła wyląduje przy karmniku, ostrożnie zaznacz jej brzuch dwoma kolorami i zanotuj na liście, że kombinacja została pobrana.
    4. Zamień podajnik grawitacyjny na podajnik zawierający roztwór leku/sacharozy. Zwróć uwagę na oznaczone pszczoły, które odwiedzają karmnik. Złap każdą nieoznakowaną pszczołę odwiedzającą karmnik, ponieważ pszczoły są płodnymi rekruterami, a liczba pszczół odwiedzających karmnik z narkotykami może szybko wymknąć się spod kontroli. Jest to szczególnie problematyczne, jeśli ten sam eksperyment ma być przeprowadzany w kolejnych dniach, ponieważ naiwne pszczoły mogą już nie być naiwne.
      UWAGA: Jako alternatywę dla szkolenia pojedynczych pszczół do karmnika, poprzedni autorzy z powodzeniem podawali wodę z sacharozą z dodatkiem leków do całego ula21-23.
  2. Leczenie miejscowe
    UWAGA: Celem jest rozpuszczenie interesującego związku w rozpuszczalniku, który może przeniknąć przez woskowy naskórek owada. W tym celu można stosować różne rozpuszczalniki. Do najczęściej stosowanych należą aceton, dimetyloformamid (DMF) i dimetylosulfotlenek (DMSO).
    1. Oceń, który rozpuszczalnik najlepiej sprawdza się w przypadku danego związku. Jeśli spodziewany jest silny fenotyp w wyniku przedawkowania (np. paraliżu lub śmierci), należy potraktować pszczoły (krok 2.2.2) wysoką dawką (np. 20 μg kokainy7) rozpuszczoną w każdym z różnych rozpuszczalników i uważnie monitorować czas do paraliżu lub śmierci.
    2. Za pomocą mikrokapilary o pojemności 1 μl (lub mikrostrzykawki, która może być zamontowana na odpowiednim dozowniku powtarzalnym) i uchwytu mikrokapilarnego, pobrać 1 μl roztworu leku (np. 3 μg/μl kokainy) do kapilary. Wyrzuć kroplę i ostrożnie pomaluj ją na klatce piersiowej oznaczonej pszczoły. Przykryj roztworem jak największy obszar, zamiast pozostawiać stałą kroplę, ponieważ pszczoła prawdopodobnie ją wtedy oczyści. Uważaj, aby związek nie zetknął się z zawiasami skrzydeł, ponieważ może to odciągnąć go od klatki piersiowej i wzdłuż skrzydeł, gdzie wyparuje bez wchłonięcia przez hemolimfę.
      UWAGA: W zależności od celu badawczego, metoda ta może być również stosowana do podawania leków do brzucha pszczoły. Jednak leki docierają do OUN szybciej i w większych ilościach, gdy są stosowane na klatkę piersiową24. Ta metoda działa równie dobrze w przypadku pszczół zaprzężonych, jak i swobodnie latających.
  3. Leczenie ulatniające się
    1. Rozpuścić narkotyki (wcześniej metoda ta była stosowana do dostarczania kokainy pszczołom miodnym10) w 100% etanolu. Aby zapewnić rozpuszczalność, nie należy używać chlorowodorku ani innych form soli leku, jeśli to możliwe. Przygotowując rozcieńczenie, przygotuj je tak, aby ilość, która ma być dostarczona pszczole, znajdowała się w 100 μl. Używaj czystego etanolu jako kontroli pojazdu.
    2. Aby utworzyć filament, użyj tej samej procedury, co McClung i Hirsh25.
      1. Krótkie wyjaśnienie: owiń drut nichromowy ciasno wokół gwoździa i przymocuj do dwóch przewodów elektrycznych (po jednym na każdym końcu żarnika). Usuń paznokieć. Pozostała cewka nichromowa jest określana jako żarnik.
      2. Przełóż dwa druty przez starannie wywiercone otwory w pokrywie probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, która powinna być odporna na wybraną temperaturę. Przyklej druty płynnym silikonem.
        UWAGA: Spowoduje to, że rurka będzie szczelna. Jest to niezbędne, aby uniknąć wtórnego kontaktu z eksperymentatorem i zapewnić, że pszczoły są leczone odpowiednią dawką.
    3. Podłącz przewody prowadzące do żarnika do źródła zasilania. Używając termopary do pomiaru temperatury żarnika, eksperymentuj z różnymi kombinacjami napięcia/prądu, aż uzyskasz taki, który zapewni odpowiedni profil temperatury dla danego leku, najlepiej taki, który pozwala na 10 sekund ogrzewania lub mniej. Jest to bardzo ważne, należy zapoznać się z odpowiednią literaturą (np. aby kokaina mogła się ulatniać, musi zostać podgrzana do temperatury co najmniej 200 °C, ale w temperaturach powyżej 350 °C jest rozkładana na związki wtórne26).
    4. Ostrożnie nanieść pipetą 100 μl roztworu leku zawierającego etanol na filament. Rozprowadź płyn na jak największej powierzchni filamentu, ponieważ zwiększy to wydajność parowania. Pozostaw żarnik wystawiony na działanie promieni słonecznych w temperaturze pokojowej, aż cały etanol wyparuje.
      UWAGA: Jeśli etanol nie zostanie wystarczająco odparowany, pszczoły będą leczone zarówno wybranym lekiem, jak i etanolem. Pszczoły są niezwykle wrażliwe na etanol, a niektóre leki mają synergistyczne interakcje z etanolem, co wpływa na wyniki eksperymentalne.
    5. Gdy etanol całkowicie odparuje (osad leku można zwykle zobaczyć na suchym włóknie pod mikroskopem), złap swobodnie latającą pszczołę w probówce o pojemności 50 ml. Ostrożnie zamknij pokrywę zawierającą filament.
    6. Włącz zasilanie na 10 sekund, wyłącz zasilanie i odczekaj kolejne 50 sekund (aby ulatniający się związek ostygł, a tym samym skroplił się lub osadził). Uwolnij bee.
      UWAGA: Chociaż ta metoda leczenia działa doskonale w przypadku pszczół swobodnie latających, może być równie skutecznie stosowana w przypadku pszczół zaprzęgniętych. Wystarczy umieścić zaprzężoną pszczołę w tubce o pojemności 50 ml. Załadować żarnik zgodnie z opisem w ppkt 2.3.4 między pszczołami. Aby uzyskać większą przepustowość, można używać kilku filamentów równolegle.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiono wybór reprezentatywnych wyników dla opisanych powyżej metod, przede wszystkim w celu wykazania, że metody te umożliwiają dotarcie czynników farmakologicznych do mózgu i wpływanie na zachowanie pszczoły miodnej.

Specyficzne efekty w procesach mózgowych można łatwo uzyskać po iniekcji w klatkę piersiową.

Ponieważ środki farmakologiczne wstrzykiwane przez klatk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane powyżej metody pozwalają na proste, skuteczne i solidne leczenie pszczół miodnych swobodnie latających lub zaprzęgniętych. Metody te są zgodne z wieloma paradygmatami eksperymentalnymi i pytaniami biologicznymi (Tabela 1). Wszystkie metody swobodnego latania można łatwo zastosować do pszczół zaprzęgniętych. Odwrotna sytuacja jest jednak mniej skuteczna, ponieważ tymczasowe ograniczenie i inwazyjne metody leczenia mogą często zagrozić zdolności pszczół do latania.

Metod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten projekt został sfinansowany przez DP0986021 grantowe ARC i 585442 grantowe NHMRC. ABB jest wspierana przez ARC Future Fellowship (FT140100452). jest wspierany przez stypendium iMQRES przyznawane przez Macquarie University oraz przez DAAD-Doktorandenstipendium przyznawane przez Niemiecką Centralę Wymiany Akademickiej. JMD jest wspierany przez CNRS i University Paul Sabatier.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SacharozaSigma-AldrichS8501Każdy dostawca zrobi
Chlorek soduSigma-AldrichS7653
Chlorek potasuSigma-AldrichP9333 
Chlorek magnezu sześciowodnySigma-AldrichM2670
Chlorek wapnia dwuwodnySigma-AldrichC8106
Monohydrat dekstrozySigma-Aldrich49159
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)Sigma-AldrichP4417
Wosk ochronnyDentaurum124-305-00
HEPESSigma-AldrichH3375
dimetyloformamidSigma-AldrichD4551
95% etanolSigma-Aldrich493511
Szklana kapilaraWPI1B100F-3
23 G NanoFil igłaWPINF33BV-2
Bardzo drobna elektroda ForscepsDumont0208-55-PO
ściągaczSRI2001
Mikrowtryskiwacz FemtoJetEppendorf5247 000.01
EicosaneSigma-Aldrich219274
mikromanipulator ręcznyBrinkmann InstrumentenbauMM-33
mikromanipulator elektronicznyLuigs & Neumann Feinmechanik + ElektortechnikJunior unit XYZ
lutownicaLeica
Dextran, Alexa Fluor 546, 10 000 MWThermoFisher ScientificD-22911
Dextran, Alexa Fluor 568, 10 000 MWThermoFisher ScientificD-22912
Sigma-AldrichP5481
Sigma-AldrichM5904
50 ml Probówka wirówkowaThermoFisher Scientific339652
Australijskie Zaopatrzenie
Uchwyt i łamaczAustralijskie Zaopatrzenie EntomologiczneE130
Pióro obosieczne żyletkaThermoFisher Scientific50-949-135
nichromowyKażdy dostawca zrobi
Każdy dostawca zrobiFarba modelowa
Tamiya USAZależy od koloru
Dozownik powtarzalnyFirma HamiltonPB-600-1
Szklana strzykawkaWPINANOFIL
system podglądu fluorescencjiSiatka NightseaSFR-GR
ProSciTechS8014-24
mikrokapilara z uchwytemDrummond1-000-0010
Płynny silikonKażdy dostawca zrobi
TermoparaDigitechQM-1324
MikropipetaEppendorf
M80 lutownica Weller WESD51 mała szalka Petriego Olej mineralny EntomologiczneDrut Przewody elektryczne

Bibliografia

  1. Frisch, K. . von B. ees Their Vision, Chemical Senses, and Language. , Cornell University Press. Itacha, NY. (1971).
  2. Giurfa, M. The amazing mini-brain: lessons from a honey bee. Bee World. 84 (1), 5-18 (2003).
  3. Giurfa, M. Behavioral and neural analysis of associative learning in the honeybee: a taste from the magic well. J. Comp. Physiol. 193 (8), 801-824 (2007).
  4. Perry, C. J., Barron, A. B. Honey bees selectively avoid difficult choices. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (47), 19155-19159 (2013).
  5. Giurfa, M., Sandoz, J. -C. Invertebrate learning and memory: Fifty years of olfactory conditioning of the proboscis extension response in honeybees. Learn. Mem. 19 (2), 54-66 (2012).
  6. Srinivasan, M. V. Honey bees as a model for vision, perception, and cognition. Annu. Rev. Entomol. 55, 267-284 (2010).
  7. Søvik, E., Cornish, J. L., Barron, A. B. Cocaine tolerance in honey bees. PLoS One. 8 (5), e64920(2013).
  8. Søvik, E., Barron, A. B. Invertebrate models in addiction research. Brain. Behav. Evol. 82 (3), 153-165 (2013).
  9. Søvik, E. Reward processing and responses to drugs of abuse in the honey bee, Apis mellifera. , Macquarie University. Australia. November (2013).
  10. Søvik, E., Even, N., Radford, C. W., Barron, A. B. Cocaine affects foraging behaviour and biogenic amine modulated behavioural reflexes in honey bees. Peer J. 2, e662(2014).
  11. Abramson, C. I., Stone, S. M., et al. The development of an ethanol model using social insects I: behavior studies of the honey bee (Apis mellifera L.). Alcohol. Clin. Exp. Res. 24, 1153-1166 (2000).
  12. Sauer, S., Kinkelin, M., Herrmann, E., Kaiser, W. The dynamics of sleep-like behaviour in honey bees. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 189 (8), 599-607 (2003).
  13. Münch, D., Kreibich, C. D., Amdam, G. V. Aging and its modulation in a long-lived worker caste of the honey bee. J. Exp. Biol. 216 (Pt 9), 1638-1649 (2013).
  14. Cheeseman, J. F., Winnebeck, E. C., et al. General anesthesia alters time perception by phase shifting the circadian clock. Proc. Natl. Acad. Sci. , (2012).
  15. Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (24), 9003-9008 (2014).
  16. Felsenberg, J., Gehring, K. B., Antemann, V., Eisenhardt, D. Behavioural pharmacology in classical conditioning of the proboscis extension response in honeybees (Apis mellifera). J. Vis. Exp. (47), e2282(2011).
  17. Burger, H., Ayasse, M., Dötterl, S., Kreissl, S., Galizia, C. G. Perception of floral volatiles involved in host-plant finding behaviour: Comparison of a bee specialist and generalist. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 199 (9), 751-761 (2013).
  18. Pan, K. C., Goodman, L. J. Ocellar projections within the central nervous system of the worker honey bee, Apis mellifera. Cell Tissue Res. 176 (4), 505-527 (1977).
  19. Ito, K., Shinomiya, K., et al. A systematic nomenclature for the insect brain. Neuron. 81, 755-765 (2014).
  20. Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schäfer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). J. Comp. Psychol. 97 (2), 107-119 (1983).
  21. Barron, A. B., Robinson, G. E. Selective modulation of task performance by octopamine in honey bee (Apis mellifera) division of labour. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 191 (7), 659-668 (2005).
  22. Schulz, D. J., Sullivan, J. P., Robinson, G. E. Juvenile Hormone and Octopamine in the Regulation of Division of Labor in Honey Bee Colonies. Horm. Behav. 42 (2), 222-231 (2002).
  23. Schulz, D. J., Elekonich, M. M., Robinson, G. E. Biogenic amines in the antennal lobes and the initiation and maintenance of foraging behavior in honey bees. J. Neurobiol. 54 (2), 406-416 (2003).
  24. Barron, A. B., Vander Meer, R. K., Maleszka, J., Robinson, G. E., Maleszka, R. Comparing injection, feeding and topical application methods for treatment of honeybees with octopamine. J. Insect Physiol. 53 (2), 187-194 (2007).
  25. McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr. Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
  26. Martin, B. R., Lue, L. P., Boni, J. P. Pyrolysis and volatilization of cocaine. J. Anal. Toxicol. 13 (3), 158-162 (1989).
  27. Lefer, D., Perisse, E., Hourcade, B., Sandoz, J. -C., Devaud, J. -M. Two waves of transcription are required for long-term memory in the honeybee. Learn. Mem. 20 (1), 29-33 (2012).
  28. Urlacher, E., Soustelle, L., et al. Honey Bee Allatostatins Target Galanin/Somatostatin-Like Receptors and Modulate Learning: A Conserved Function? PLoS One. 11 (1), e0146248(2016).
  29. Stollhoff, N., Menzel, R., Eisenhardt, D. Spontaneous recovery from extinction depends on the reconsolidation of the acquisition memory in an appetitive learning paradigm in the honeybee (Apis mellifera). J. Neurosci. 25 (18), 4485-4492 (2005).
  30. Barron, A. B., Maleszka, R., Helliwell, P. G., Robinson, G. E. Effects of cocaine on honey bee dance behaviour. J. Exp. Biol. 212 (2), 163-168 (2009).
  31. Devaud, J. -M., Papouin, T., Carcaud, J., Sandoz, J. -C., Grünewald, B., Giurfa, M. Neural substrate for higher-order learning in an insect: Mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proc. Natl. Acad. Sci. , 1-9 (2015).
  32. Vergoz, V., Roussel, E., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Aversive learning in honeybees revealed by the olfactory conditioning of the sting extension reflex. PLoS One. 2 (3), e288(2007).
  33. Henry, M., Béguin, M., et al. A common pesticide decreases foraging success and survival in honey bees. Science. 336 (6079), 348-350 (2012).
  34. Søvik, E., Perry, C. J., LaMora, A., Barron, A. B., Ben-Shahar, Y. Negative impact of manganese on honeybee foraging. Biol. Lett. 11 (3), 20140989(2015).
  35. Farooqui, T., Vaessin, H., Smith, B. H. Octopamine receptors in the honeybee (Apis mellifera) brain and their disruption by RNA-mediated interference. J. Insect Physiol. 50 (8), 701-713 (2004).
  36. Guo, X., Su, S., et al. Recipe for a Busy Bee: MicroRNAs in Honey Bee Caste Determination. PLoS One. 8 (12), e81661(2013).
  37. Cristino, A. S., Barchuk, A. R., et al. Neuroligin-associated microRNA-932 targets actin and regulates memory in the honeybee. Nat. Commun. 5, 5529(2014).
  38. Vargaftig, B. B., Coignet, J. L., de Vos, C. J., Grijsen, H., Bonta, I. L. Mianserin hydrochloride: Peripheral and central effects in relation to antagonism against 5-hydroxytryptamine and tryptamine. Eur. J. Pharmacol. 16 (3), 336-346 (1971).
  39. Beggs, K. T., Tyndall, J. D. A., Mercer, A. R. Honey bee dopamine and octopamine receptors linked to intracellular calcium signaling have a close phylogenetic and pharmacological relationship. PLoS One. 6 (11), (2011).
  40. Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. -C., Giurfa, M. Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures. J. Neurosci. Methods. 211 (1), 159-167 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Farmakologia pszczół miodnychmetody podawania lekówiniekcja w klatkę piersiowąiniekcja w ocelliiniekcja do szlaku ocellarnegotechnika ulatnianiaprzygotowanie mikroskalpelauchwyt z wosku dentystycznegomikroskopia konfokalnametody neuroetologiczne
Neurofarmakologiczna manipulacja skrępowanych i swobodnie latających pszczół miodnych, Apis mellifera
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.