Artykuł metodologiczny

Transdukcja retrowirusowa limfocytów T pomocniczych jako genetyczne podejście do badania mechanizmów kontrolujących ich różnicowanie i funkcję

11.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54698

⸱

4 listopada 2016

 ,  ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, The Royal Veterinary College, 2Institute of Physiology I, Cardiology & Vascular Medicine, Eberhard Karls University of Tuebingen, 3Department of Clinical Science and Services, The Royal Veterinary College

W tym artykule

Podsumowanie

Wiele eksperymentalnych systemów zostało wykorzystanych do zrozumienia mechanizmów regulujących rozwój i funkcję limfocytów T w odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano podejście genetyczne wykorzystujące transdukcję retrowirusową, które jest ekonomiczne, efektywne czasowo, a co najważniejsze, bardzo pouczające w identyfikacji szlaków regulacyjnych.

Streszczenie

Rozwój i funkcja limfocytów T pomocniczych musi być ściśle regulowana, aby wywołać odpowiednią odpowiedź immunologiczną, która eliminuje określone patogeny, a jednocześnie zapobiega autoimmunizacji. Wykorzystano wiele podejść obejmujących różne organizmy modelowe, aby zrozumieć mechanizmy kontrolujące rozwój i funkcję limfocytów T pomocniczych. Jednak badania z wykorzystaniem modeli mysich okazały się bardzo pouczające ze względu na dostępność systemów genetycznych, komórkowych i biochemicznych. Jedno z podejść genetycznych u myszy stosowanych przez wiele laboratoriów obejmuje transdukcję retrowirusową pierwotnych limfocytów T pomocniczych. Jest to potężne podejście ze względu na jego względną łatwość, dzięki czemu jest dostępne dla prawie każdego laboratorium z podstawowymi umiejętnościami w zakresie biologii molekularnej i immunologii. W związku z tym wiele genów w formach dzikich lub zmutowanych można łatwo przetestować pod kątem funkcji w limfocytach T pomocniczych, aby zrozumieć ich znaczenie i mechanizmy działania. Zoptymalizowaliśmy to podejście i opisaliśmy tutaj protokoły produkcji retrowirusów o wysokim mianie, izolacji pierwotnych mysich limfocytów T pomocniczych oraz ich transdukcji przez retrowirusy i różnicowania w kierunku różnych podzbiorów pomocniczych. Wreszcie, zastosowanie tego podejścia opisano w odkrywaniu mechanizmów wykorzystywanych przez mikroRNA (miRNA) do regulacji szlaków kontrolujących rozwój i funkcję limfocytów T pomocniczych.

Wprowadzenie

Odpowiedź immunologiczna musi być wysoce regulowana, aby wyeliminować infekcje, ale zapobiec atakom na własne tkanki, które prowadzą do autoimmunizacji. Limfocyty T pomocnicze odgrywają zasadniczą rolę w regulacji odpowiedzi immunologicznej i podjęto wiele wysiłków, aby zrozumieć ich rozwój i funkcję (zilustrowane w kilku ostatnich przeglądach 1-3). Jednak pozostaje wiele pytań i wykorzystano wiele podejść do badania mechanizmów kontrolujących rozwój i funkcję limfocytów T pomocniczych. Obejmowały one zarówno systemy hodowli komórkowych in vitro, jak i całe zwierzęta. Systemy hodowli komórkowych, zwłaszcza te wykorzystujące linie komórkowe, oferują korzyści w postaci łatwości użycia i możliwości generowania dużej ilości materiału do przeprowadzania zaawansowanych analiz biochemicznych. Cierpią jednak z powodu ograniczonej zdolności do reprodukcji rzeczywistych warunków występujących w odpowiedzi immunologicznej. W przeciwieństwie do tego, eksperymenty na całych zwierzętach oferują korzyść w postaci trafności, ale mogą cierpieć z powodu trudności w manipulacji i zdolności do przeprowadzania precyzyjnych kontroli, a także z powodu dużych kosztów i implikacji etycznych. Niemniej jednak zdecydowana większość badań nad pomocniczymi limfocytami T nadal wymaga wykorzystania doświadczeń na całych zwierzętach z udziałem pierwotnych limfocytów T ze względu na niezdolność linii komórkowych do powielania dokładnych etapów zachodzących u całego zwierzęcia. Dlatego ważne jest, aby stosować opłacalne podejścia, które są wysoce pouczające.

Genetyka jest potężnym narzędziem do badania rozwoju i funkcji limfocytów T pomocniczych, jednak tradycyjne metody obejmujące nokautowanie genów lub transgeny są czasochłonne i kosztowne, więc często są poza zasięgiem małych laboratoriów. Jednak transdukcja retrowirusowa oferuje potężne, szybkie i opłacalne podejście genetyczne do badania mechanizmów działania określonych produktów genowych. Dlatego jest powszechnie stosowany w pracach badających rozwój i funkcję limfocytów T pomocniczych.

Zoptymalizowaliśmy procedurę transdukcji retrowirusowej limfocytów T pomocniczych. Wykorzystuje retrowirusowy wektor ekspresyjny pMIG (mysi wirus komórek macierzystych - wewnętrzne miejsce wejścia rybosomalnego - zielone białko fluorescencyjne), w którym interesujący gen może zostać sklonowany, a tym samym ulegnięty ekspresji z długiego końcowego powtórzenia retrowirusa (LTR) 4. Ponadto za wprowadzonym genem będącym przedmiotem zainteresowania znajduje się wewnętrzna sekwencja wejściowa rybosomu (IRES), po której następuje gen białka zielonej fluorescencji (GFP), dzięki czemu transdukowane komórki mogą łatwo śledzić ich ekspresję GFP. Wektor został pierwotnie uzyskany z wektorów wirusa mysich komórek macierzystych (MSCV), które zawierają mutacje w miejscach wiązania represorów w LTR, dzięki czemu są one odporne na wyciszanie, a tym samym dają wysoką ekspresję w wielu typach komórek, w tym w pomocniczych limfocytach T 5,6. Produkcja retrowirusa o wysokim mianie wymaga prostego protokołu transfekcji przejściowej komórek 293T ludzkiej embrionalnej nerki (HEK) z wektorem MIG i wektorem wirusa pomocniczego, który wyraża retrowirusowe geny GAG, Pol i Env. W tym celu wirus pomocniczy pCL-Eco vector 7 dobrze sprawdza się w wytwarzaniu niekompetentnych retrowirusów o wysokim mianie replikacji.

Tutaj opisane są te protokoły produkcji retrowirusowej i transdukcji pierwotnych mysich limfocytów T, oprócz niektórych naszych wyników, wykorzystując to podejście do badania regulacji miRNA ekspresji genów kontrolujących różnicowanie limfocytów T pomocniczych. miRNA to małe RNA o długości około 22 nukleotydów, które po transkrypcji regulują ekspresję genów, celując w homologiczne sekwencje w białku kodującym informacyjne RNA oraz hamując translację i indukcję Niestabilność wiadomości 8,9. miRNA odgrywają kluczową rolę w rozwojowej regulacji genów. Są one niezbędne na najwcześniejszych etapach rozwoju, ponieważ zarodki, które nie są w stanie wytwarzać miRNA, umierają na bardzo wczesnym etapie 10. Ponadto miRNA są ważne w późniejszym rozwoju wielu tkanek. Uważa się, że działają one poprzez precyzyjne dostrojenie ekspresji genów wymaganych do programów rozwojowych 1. W pomocniczych limfocytach T miRNA odgrywają wiele ról i są niezbędne do rozwoju regulatorowych limfocytów T (Treg) 11-14. Zastosowaliśmy transdukcję retrowirusową jako sposób na przeanalizowanie mechanizmów regulacji różnicowania limfocytów Treg 15 przez miRNA. Dzięki takim badaniom ważne indywidualne miRNA zostały określone przez nadekspresję za pośrednictwem retrowirusa. Następnie zidentyfikowano odpowiednie geny regulowane przez te miRNA, aby zrozumieć szlaki molekularne regulowane przez miRNA w różnicowaniu limfocytów T pomocniczych.

Protokół

Wszystkie prace na myszach wykonane w tych protokołach zostały wykonane zgodnie z brytyjską ustawą o procedurach naukowych dotyczących zwierząt na podstawie licencji na projekty zwierzęce 70/6965.

1. Produkcja retrowirusowa

Przed przystąpieniem do dalszych działań należy uzyskać wszystkie wymagane zezwolenia na produkcję organizmów modyfikowanych genetycznie i stosowanie retrowirusów w komórkach ssaków.

  1. Wzrost komórek HEK 293T
    1. Hoduj komórki HEK 293T na 10-centymetrowych szalkach do hodowli tkankowych w pożywce HEK 293T (zmodyfikowana pożywka Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 jednostek/ml penicyliny, 0,1 mg/ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy). W celu ogólnego pasażu komórkowego należy podzielić komórki w stosunku 1:10, gdy osiągną zbieg, usuwając pożywkę i pipetując komórki z płytki za pomocą świeżej pożywki HEK 293T.
      UWAGA: Komórki powinny osiągnąć konfluencję w ciągu 2-3 dni. Komórki 293T HEK luźno przylegają do płytki, więc trypsynizacja nie jest wymagana.
    2. 24 godziny przed transfekcją podziel zlewającą się płytkę komórek 1:10 na płytkę o długości 10 cm (jedna płytka na transfekcję), tak aby następnego dnia komórki były zlewające się w ~50%.
  2. Transfekcja przez wytrącanie fosforanu wapnia
    1. Około 1 godzinę przed transfekcją należy usunąć pożywkę z komórek i ostrożnie dodać 9 ml świeżej pożywki HEK 293T, aby zapobiec odrywaniu się komórek od płytki.
    2. Przygotować 2x Hepes buforowany roztwór soli fizjologicznej (2x HBS) i świeży 2,5 M roztwór CaCL2 zgodnie z opisem w Tabeli 1. Rozmrozić zapasy DNA. Aby uzyskać najbardziej efektywne transfekcje, należy użyć DNA o jakości przygotowania plazmidu.
    3. Do 6 ml okrągłego dna lub 15 ml stożkowej probówki dodać 5 μg retrowirusowego DNA (pMIG)4, 5 μg DNA wirusa pomocniczego (pCL-Eco)7 iH2Odo 420 μl. Dodać 80 μl 2,5 M CaCl2, zwiększając końcową objętość do 500 μl.
      Uwaga: To, wraz z następnym krokiem (dodanie 2x HBS) można wykonać na zwykłej stole, o ile stosowana jest ogólna technika sterylna.
    4. Powoli dodawaj 500 μl 2x HBS kropla po kropli do powyższej mieszaniny DNA, delikatnie wirując, tak aby roztwór był stale mieszany, a CaPO4 wytrącał się w równych kryształach.
    5. Przenieść do kaptura do hodowli tkankowej i powoli dodawać mieszaninę DNA CaPO4 (1 ml) kroplami do 9 ml pożywki pokrywającej komórki, stale i delikatnie obracając płytkę. Jeszcze raz należy uważać, aby nie oderwać komórek od płytki. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze.
      UWAGA: W tym momencie osad CaPO4 będzie łatwo widoczny pod mikroskopem jako małe kryształy o wielkości bakterii. Są one łatwo widoczne po 30-60 minutach, kiedy kryształy miały szansę osiąść na dnie płytki.
  3. Zbiór wirusów w supernatantach kulturowych.
    1. Następnego dnia (w dowolnym miejscu od 12 do 24 godzin po transfekcji) usunąć pożywkę i ponownie nakarmić komórki 10 ml świeżej pożywki HEK 293T, uważając, aby nie usunąć komórek z płytki.
      UWAGA: To rozcieńcza substancje hamujące limfocyty, które komórki HEK 293T wydzielają do pożywki podczas transfekcji.
    2. Wieczorem drugiego dnia (~24 godziny po transfekcji) nakarmić komórki 3,5 ml świeżej pożywki HEK 293T. Należy uważać, aby płytka była umieszczona dokładnie poziomo w inkubatorze, tak aby jedna strona nie pozostała sucha.
    3. Zebrać pożywkę ~12 godzin później (przechowywać w temperaturze 4 °C) i nakarmić 3,5 ml świeżej pożywki HEK 293T. Powtórzyć pobieranie jeszcze 2 razy w odstępach około 12 godzin, tak aby zebrać około 10 ml pożywki. To jest zapas wirusa.
    4. Wszelkie resztki komórek HEK 293T i resztki komórkowe należy odwirować przy 600 x g przez 5 minut. Alternatywnie, przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego o niskiej zawartości wiązania białek o średnicy 0,45 μm. Wirus należy przechowywać w temperaturze 4 °C, a w celu uzyskania najlepszych mian należy zużyć w ciągu dnia lub dwóch, ponieważ miano będzie powoli zmniejszać się w temperaturze 4 °C. Nie zamrażać, ponieważ znacznie zmniejsza to miano.

2. Izolacja pierwotnych naiwnych limfocytów T CD4+

  1. Izolacja komórek leukocytów
    1. Eutanazja myszy przez zwichnięcie szyjki macicy, uduszenie CO2 lub inny humanitarny protokół odpowiedni do zasad obchodzenia się ze zwierzętami w instytucji.
    2. Wypreparuj świeżo uśpione myszy i usuń śledzionę oraz pożądane węzły chłonne 15. Umieść narządy w studzienkach 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej zawierającej pożywkę R10 (pożywka RPMI z 10% inaktywowanym termicznie FBS, 100 jednostek/ml penicyliny, 0,1 mg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy i 0,1% β-merkaptoetanolu). Użyj kaptura do hodowli komórkowych do sekcji myszy i wszystkich późniejszych manipulacji, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia w hodowlach.
      UWAGA: Utrzymuj podłoże R10 w niskiej temperaturze i wykonaj wszystkie dalsze etapy oczyszczania w temperaturze 4 °C.
    3. Umieścić sitko do hodowli komórkowych o wielkości 70 μm w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej około 5 ml pożywki R10. Użyj jednego sitka do śledziony i węzłów chłonnych maksymalnie trzech myszy.
    4. Dodać śledzionę i węzły chłonne do sitka do komórek i zmacerować za pomocą końcówki tłoka strzykawki o pojemności 5 ml. Spłukać 1-2 ml pożywki R10.
    5. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i zwiększyć objętość do 14 ml za pomocą R10. Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, wylewając go jednym czystym ruchem, aby zapobiec naruszeniu osadu komórkowego.
    6. Dodać 2 ml zimnego (4 °C) buforu do lizy krwinek czerwonych (Tabela 1) do każdej probówki. Delikatnie mieszaj przez 3,5 minuty, trzymając probówkę na lodzie.
      UWAGA: Czas lizy krwinek czerwonych ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania śmierci limfocytów. Dlatego dokładny czas każdej partii buforu do lizy krwinek czerwonych będzie musiał zostać zoptymalizowany.
    7. Dodać ≈12-13 ml pożywki R10. Natychmiast odwirować i odrzucić supernatant, jak w kroku 2.1.5. Wykonaj etapy płukania 2 razy więcej za pomocą pożywki R10, aby usunąć resztki buforu do lizy krwinek czerwonych z komórek i uniknąć śmierci limfocytów.
    8. Policz komórki w hemocytometrze rozcieńczając 1:20 w błękitu trypanowym, aby określić wydajność żywotnych komórek. Spodziewaj się około 8-10 x 107 komórek na mysz.
  2. Izolacja limfocytów T CD4 + za pomocą zestawu kulek magnetycznych do usuwania komórek CD8 +, CD11b +, CD16 / 32 +, CD45R +, MHC klasy II+ i ter-119 +.
    1. Podwielokrotność 8-10 x 107 komórek z etapu 2.1.8 na 15 ml probówki stożkowej i odwirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odlać supernatant jednym czystym ruchem, aby zapobiec naruszeniu osadu komórkowego. Ponownie zawiesić komórki w każdej probówce w 100 μl inaktywowanego termicznie FBS, a następnie dodać 100 μl mieszanki przeciwciał z zestawu. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając na wałku.
    2. Podczas gdy powyższe komórki wysiadują, przygotuj koraliki.
      1. Ponownie zawiesić kulki w fiolce, wirując przez >30 sekund, a następnie przenieść 1 ml kulek na 8-10 x10 7 przygotowanych komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodać 2 ml pożywki R10 na ml kulek i delikatnie wymieszać.
      2. Umieść probówkę w magnesie na 1 minutę, a następnie wyrzuć supernatant. Wyjmij probówkę z magnesu i ponownie zawieś kulki w 4 ml podłoża R10. Taka ilość koralików wystarcza na dwie rundy inkubacji.
    3. Umyć komórki pod koniec inkubacji przeciwciał (etap 2.2.1), dodając 10 ml pożywki R10 na probówkę. Delikatnie wymieszać z wirowaniem probówki i odwirować komórki o stężeniu 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odlać supernatant jednym czystym ruchem, aby zapobiec naruszeniu osadu komórkowego. Zawiesić komórki w 1 ml pożywki R10.
    4. Dodać 2 ml przemytych kulek z etapu 2.2.2.2 (1/2 ilości przygotowanej dla każdej probówki) do każdej probówki z komórkami traktowanymi przeciwciałami i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając na walcu.
    5. Zawiesić mieszaninę komórek i kulek, delikatnie pipetując 5 razy pipetą z wąskim otworem na końcówkę. Unikaj pienienia. Umieść probówkę w magnesie kulkowym na 2 minuty, a następnie przenieś supernatant zawierający ujemnie wybrane komórki do nowej probówki. Zachowaj te komórki, ponieważ stanowią one populację CD4+.
    6. Powtórz wybór negatywny jeszcze raz. Wirować komórki z etapu 2.2.5 w temperaturze 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odlać supernatant jak w kroku 2.2.3 i ponownie zawiesić w 1 ml pożywki R10. Ponownie wykonaj kroki 2.2.4 i 2.2.5. Po ostatecznej selekcji kulek magnetycznych policz komórki, aby określić odzysk (typowa wydajność to 15-20 x 106 komórek na 108 leukocytów).
  3. Izolacja naiwnych limfocytów T CD4 + (wysoki poziom CD25 i CD62L) za pomocą kolumn separacji komórek
    1. Odwirować limfocyty T CD4+ przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C i ponownie zawiesić w 150-200 μl pożywki R10 na 10-8 komórek. Dodać 2 μl podstawowego biotynylowanego przeciwciała monoklonalnego CD25 (klon 7D4). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4°C, delikatnie mieszając na wałku.
    2. Przemyć komórki, dodając 10 ml buforu kolumny do separacji komórek (tabela 1). Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć jak najwięcej supernatantu i oszacować objętość pozostałego buforu/komórek. Zawiesić do końcowej objętości około 90 μl na 10-7 komórek.
    3. Dodaj 20 μl kulek streptawidyny na 107 komórek i wymieszaj delikatnymi ruchami. Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Podczas inkubacji komórek przygotuj kolumny separacji komórek pośrednich (MS) do podejścia ręcznego. Każda kolumna MS zawiera 107 komórek, a ponieważ komórki CD25 + zwykle stanowią około 10% wszystkich komórek CD4 +, użyj 1 kolumny na 108 komórek T CD4 +. Dodać 500 μl buforu kolumny do separacji komórek do kolumny i pozostawić do przepłynięcia. Powtórz jeszcze 2 razy.
    5. Pod koniec inkubacji komórek/kulek umyć komórki, dodając 10 ml buforu kolumny do separacji komórek i odwirowując przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforu kolumny do separacji komórek na 10-8 komórek, ale nadal używać 500 μl, jeśli komórek jest mniej.
    6. Nanieść 500 μl zawiesiny komórek/kulek na kolumnę i zebrać przepływ. Przepuść to przez kolumnę jeszcze 1 raz i ponownie zbierz przepływ. Przepłukać kolumnę 3 razy 500 μl buforu do separacji komórek, dodając każdy przepływ z tych płukań do pobranych komórek. Są to komórki CD25-. Policz komórki, aby określić wydajność.
    7. Jeśli pożądane są limfocyty Treg (komórki CD25+), wyizoluj je w następujący sposób.
      1. Wyjmij kolumnę z separatora i przytrzymaj ją nad otwartą uniwersalną probówką, uważając, aby zachować sterylność. Szybko odpipetować 500 μl buforu do separacji komórek na kolumnę i dokładnie wypłukać frakcję dodatnią za pomocą tłoka dostarczonego z kolumną.
      2. Powtórz procedurę spłukiwania jeszcze 2 razy. Przepuścić frakcję dodatnią przez świeżą kolumnę do separacji komórek MS i odrzucić ten przepływ. Mocno wypłukać dodatnie komórki trzy razy, jak poprzednio, i odwirować komórki w temperaturze 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki R10 i policzyć w celu określenia wydajności.
    8. Aby otrzymać limfocyty T owysokiej zawartości CD25-CD62L, należy odwirować limfocyty T CD25-T wyizolowane powyżej w kroku 2.3.6 w temperaturze 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4° i ponownie zawiesić w 150-200 μl pożywki R10 na 107 komórek. Dodać 5 μl podstawowego biotynylowanego przeciwciała monoklonalnego CD62L (klon MEL-14) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 4°C, delikatnie mieszając na wałku jak poprzednio.
    9. Przeprowadzić płukanie, wiązanie kulek streptawidyny i przygotowanie kolumny separacji komórek zgodnie z opisem w protokole izolacji Treg (2.3.7). Tym razem użyj kolumny separacji dużych komórek (LS), która ma pojemność 108 komórek.
      1. Ponieważ limfocyty To wysokiej zawartości CD62L zwykle stanowią około 60-70% komórek CD25, należy użyć 1 kolumny separacji komórek LS na 108 komórek. Dodaj mieszaninę komórek/kulek do kolumny separacji komórek LS, jak opisano w kroku 2.3.6 – tym razem odrzucając końcowy przepływ i przepłukując kolumnę. Zbierz limfocyty To wysokiej zawartości CD62L zgodnie z opisem w kroku 2.3.7 dla kolekcji komórek CD25+.
      2. Odwirować komórki w temperaturze 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml R10 i policzyć w celu określenia wydajności. Rozcieńczyć do 0,75-1 X106 komórek na ml w pożywce R10.
  4. Analizuj czystość komórek przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS).
    1. Strategia barwienia FACS
      1. W przypadku komórek przed i po wszystkich etapach izolacji, barwienie za pomocą CD4-FITC, CD8a-PerCP-Cy5.5 (pomocnicze i cytotoksyczne limfocyty T) i MHCII-PE (komórki eksprymujące MHC klasy II).
      2. W przypadku komórek przed i po izolacji CD25 wybarwić CD4-FITC i CD25-PE (Tregi w porównaniu z innymi pomocniczymi limfocytami T).
      3. W przypadku komórek przed i po izolacji CD62L barwienie CD4-FITC, CD62L-PE i CD44-APC (limfocyty T naiwne w porównaniu z limfocytami T pomocniczymi pamięci i efektorów).
    2. Do każdej analizy umieść10-5 komórek w studzience z 96-dołkową płytką dolną w kształcie litery U. Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odlewać pożywkę i raz przemyć komórki 200 μl DPBS. Odwirować jak wyżej i odlać DPBS.
    3. Dodać 50 μl DPBS na basenik i 0,5 μl każdego przeciwciała (jak wskazano w 2.4.1) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności, aby uniknąć bielenia znacznika fluorescencyjnego.
    4. Przemyć komórki 2x za pomocą DPBS, jak w 2.4.2 i natychmiast przeanalizować na cytometrze przepływowym, korzystając z protokołów i wytycznych specyficznych dla danego urządzenia.
      UWAGA: Po ostatnim etapie izolacji dobrego preparatu, 90-95% komórek będzie limfocytami To wysokiej zawartości CD4 + CD25-CD62L.

3. Transdukcja retrowirusowa aktywowanych limfocytów T CD4+ i ich różnicowanie w specyficzne podzbiory T Helper

  1. Transdukcja retrowirusowa
    UWAGA: Integracja retrowirusowa i ekspresja genów wymaga podziału komórek. Dlatego limfocyty T muszą być aktywowane O/N.
    1. Podczas izolowania naiwnych limfocytów T pokryj 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej przeciwciałami anty-CD3 i anty-CD28 rozcieńczonymi w DPBS. Dodać 250 μl na studzienkę. Użyj anty-CD3 w stężeniu 1μg/ml. Użyj anty-CD28 w stężeniu 2 μg/ml, jeśli komórki ostatecznie zostaną zróżnicowane w warunkach Th0, Th1, Th2 i iTregs. Użyj anty-CD28 w stężeniu 10 μg/ml w warunkach Th9 i Th17. Inkubować ~ 2 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych.
    2. Tuż przed hodowlą komórek należy usunąć roztwór przeciwciała i przemyć płytkę ~250 μl DPBS na studzienkę, aby usunąć niezwiązane przeciwciało. Uważaj, aby płyta nie wyschła, więc przetwarzaj maksymalnie 6 dołków na raz. Usuń płucz DPBS i dodaj 1 ml naiwnych limfocytów T CD4 + w pożywce R10 w ilości 0,75-1 x 106 komórek na ml. Aktywuj komórki O/N (14-16 godzin).
    3. Następnego dnia odwirować komórki na płytce o stężeniu 900 x g przez 5 minut w temperaturze 30 °C, aby przymocować komórki do dna studzienek.
    4. Zebrać i zachować pożywkę, uważając, aby nie przemieścić komórek, i zastąpić ją 1 ml supernatantu do hodowli wirusa przygotowanego na podstawie protokołu produkcji wirusa. Nie pozwól, aby komórki wyschły, więc przetwarzaj maksymalnie 4 dołki na raz.
      1. Do każdej studzienki dodać 1 μl 8 mg/ml polibrenu i 10 μl 1M HEPES pH 7,5, aby wspomóc wchłanianie wirusa i zapobiec znacznej alkalizacji w otaczającym CO2 podczas następnego wirowania. Odwirować komórki na płytce o masie 900 x g przez 90 minut w temperaturze 30°C.
  2. Różnicowanie komórek w określone podzbiory
    1. Ostrożnie usunąć supernatant hodowli wirusa i zastąpić go 1 ml pożywki zebranej powyżej w kroku 3.1.4, ponieważ zawiera ona IL-2 i inne czynniki wzrostu limfocytów T. Dodaj odczynniki wskazane w Tabeli 2 i hoduj komórki przez 3-4 dni, aby zróżnicować komórki w określone podzbiory.
  3. Analiza komórek
    1. W celu wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin należy potraktować komórki po 1 μg/ml 12-mirystynianu 13-octanu forbolu (PMA) i jonomycyny przez 4 godziny. W ciągu ostatnich 2 godzin stymulacji dodać 1 μg/ml brefeldyny A.
    2. Ponownie zawiesić komórki od dna każdej studzienki, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Przenieść około 10-5 komórek na 96-dołkową płytkę dolną U (zwykle 100 μl z 1 ml kultury komórek Th) w celu utrwalenia i barwienia.
    3. W przypadku barwienia GFP należy przymocować komórki za pomocą 100 μl 2% paraformaldehydu w temperaturze pokojowej dokładnie przez 5 minut, ponieważ dłuższy czas inkubacji wybieli GFP i zakłóci barwienie Foxp3. Przemyć komórki, dodając 100 μl DPBS do każdej studzienki i odwirować w temperaturze 600 x g w temperaturze 22 °C przez 5 minut. Odlać skonstytucyjny.
      Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny. Trzymaj się go w dygestorium z ochroną skóry i oczu.
    4. Ponownie utrwalić komórki za pomocą 100 μl 1x bufor utrwalający wykonany z zestawu do barwienia Foxp3 (1 objętość buforu utrwalającego na 3 objętości rozcieńczalnika). Inkubować komórki przez 45 minut w temperaturze pokojowej lub alternatywnie inkubować w temperaturze 4 °C przez 16 godzin.
    5. Po utrwaleniu przepuszczalność komórek poprzez dodanie 100 μl buforu permeabilizacji z tego samego zestawu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30-45 minut, a następnie odwirowywać przy 600 x g w temperaturze 22 °C przez 5 minut.
    6. W przypadku barwienia przeciwciał usunąć bufor utrwalający/permeabilizacyjny i dodać 50 μl świeżego buforu do permeabilizacji. Dodać wymagane przeciwciało rozcieńczone w buforze permeabilizacyjnym w ilości 0,5 μl na 50 μl buforu na próbkę. Inkubować przez 30-45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, aby uniknąć bielenia etykiety fluorescencyjnej.
    7. Dodać 150 μl buforu permeabilacyjnego i odwirować w temperaturze 600 x g w temperaturze 22 °C przez 5 minut. Odrzucić bufor permeabilizacyjny i dodać 200 μl DPBS. Analizuj za pomocą cytometru przepływowego, korzystając z protokołów i wytycznych specyficznych dla danego instrumentu.
      UWAGA: Pamiętaj, aby uwzględnić odpowiednie kontrole barwienia cytokin, takie jak barwienie przeciwciałami kontrolnymi izotypu, analiza komórek nieaktywowanych lub aktywowanych Th0 itp.

Wyniki

Sukces tego systemu eksperymentalnego wymaga wysokiej czystości populacji limfocytów T oraz preparatów retrowirusów o wysokim mianie. Reprezentatywne wyniki przedstawiono tutaj jako przykłady udanych eksperymentów. Rysunek 1 przedstawia typową czystość populacji przed i po selekcji na każdym etapie protokołu izolacji naiwnych limfocytów T pomocniczych. Rysunek 2 i 3 ilustrują analizę produkcji retrowirusów poprzez ekspresję GFP w transfektowanych komórkach HEK 293T (Rysunek 2) oraz transdukowanych limfocytach T (Rysunek 3). Wydajność transfekcji komórek HEK 293T może znacznie różnić się w zależności od konstrukcji retrowirusowych, ale często nie koreluje to z poziomem produkcji retrowirusów obserwowanym na podstawie liczby limfocytów T GFP+. Ponadto liczba limfocytów T GFP+ może się różnić w zależności od warunków polaryzacji. Co więcej, średni poziom ekspresji GFP i wstawionego genu może się różnić w zależności od liczby zintegrowanych kopii wirusa, wpływu miejsca integracji na transkrypcję oraz potranskrypcyjnych mechanizmów regulacyjnych wpływających na transkrypt wirusowy.

Wreszcie, Rycina 4 przedstawia typowe wyniki zaobserwowane podczas różnicowania limfocytów T pomocniczych przy nadekspresji miRNA miR-15b/16. Wyniki te ukazują zmienność, która może wystąpić w ramach pojedynczego eksperymentu, dlatego rzeczywiste efekty muszą zostać potwierdzone analizą statystyczną wielu powtórzeń eksperymentalnych z wykorzystaniem różnych preparatów limfocytów T pomocniczych. W tych eksperymentach odpowiedzi Th2 mogą być trudne do zaobserwowania w linii C57BL/6 użytej w badaniu, ponieważ wykazuje ona skłonność do odpowiedzi Th1. Podobnie, barwienie na IL-9 może być trudne do wykrycia powyżej poziomu tła. Dlatego niezbędne jest wykonanie kontroli izotypowych oraz odpowiednia kompensacja, aby zapewnić prawidłowe bramkowanie ekspresji cytokin. W naszych wynikach stwierdzono, że miR-15b/16 nasila indukcję iTreg poprzez hamowanie szlaku sygnałowego mTOR poprzez supresję ekspresji komponentów Rictor i mTOR 15. miR-15b/16 może czasami wpływać na różnicowanie Th0, Th1 i Th17 w pojedynczych eksperymentach, jednak nie stwierdzono istotnego efektu po analizie wielu powtórzeń eksperymentalnych. W przeciwieństwie do tego, nadekspresja miR-15b/16 istotnie hamuje różnicowanie Th9 (patrz referencja 18).

Schematy cytometrii przepływowej selekcji CD4, CD25, CD62L w analizie komórek odpornościowych; wizualizacja danych.
Rycina 1. Typowa czystość limfocytów T pomocniczych na poszczególnych etapach izolacji. Przedstawiono reprezentatywne wyniki cytometrii przepływowej dla wskazanych antygenów z bramki żywych komórek wyznaczonej na wykresach rozproszenia przedniego (FSC) i bocznego (SSC). (A) Przed i po negatywnej selekcji CD4. Pokazano profile ekspresji CD4, CD8a i MHCII. Ilustrują one wzbogacenie populacji limfocytów T pomocniczych oraz utratę limfocytów T cytotoksycznych i komórek wykazujących ekspresję MHC klasy II. Prawidłowe oczyszczanie powinno skutkować uzyskaniem ~90% limfocytów T CD4+ na tym etapie. (B) Selekcja CD25. Po lewej stronie znajdują się profile ekspresji CD4, CD8a i MHCII, a po prawej profile ekspresji CD4 i CD25 przed i po selekcji. Na tym etapie >95% komórek poddanych negatywnej selekcji CD25 powinno być CD4+ CD25-. (C) Selekcja CD62L. Profile ekspresji CD4, CD8a i MHCII przedstawiono po lewej stronie. Po prawej stronie pokazano profile ekspresji CD62L i CD44 dla komórek przed i po selekcji CD62L, wraz z profilem ekspresji CD4 i CD62L komórek po selekcji. Po selekcji CD62L niemal wszystkie komórki pamięci (CD44+) zostają usunięte, pozostawiając silnie wzbogaconą populację naiwnych limfocytów T pomocniczych, która zawiera 10-15% komórek efektorowych (CD62Llow). Dla wszystkich profili FACS przez cały czas utrzymywano jednakowe ustawienia i skale dla konkretnych parametrów. Liczby reprezentują procent komórek w obrębie bramkowanej populacji. Nieznaczny spadek wielkości komórek po wstępnej selekcji wynika prawdopodobnie ze stresu mechanicznego podczas protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza cytometrii przepływowej; wykresy rozrzutu; ekspresja GFP w komórkach 293T; wydajność transfekcji.
Rycina 2. Analiza komórek HEK 293T po transfekcji retrowirusowej. Przedstawiono ekspresję GFP w komórkach HEK 293T, które nie były transfekowane lub zostały poddane transfekcji i przeanalizowane po zebraniu nadekspresji z kultur wirusowych. Analiza GFP została przeprowadzona na żywych komórkach z bramki na wykresie FSC i SSC w pierwszym panelu. Liczby reprezentują procent komórek GFP+ w obrębie bramkowanego obszaru. Typowa wydajność transfekcji mieści się w zakresie 30-90%. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wyniki cytometrii przepływowej, ekspresja GFP, pMIG-miR-15b/16, różnicowanie limfocytów T, wykresy rozrzutu.
Rysunek 3. Analiza pomocniczych limfocytów T transdukowanych retrowirusem. Ekspresja GFP jest przedstawiona w transdukowanych retrowirusem pomocniczych limfocytach T po różnicowaniu w warunkach polaryzacji Th0, Th1, Th2, Th9, Th17 i Treg przez trzy dni. Analizę ograniczono do żywych i aktywowanych komórek wskazanych na panelu FSC/SSC. Efektywność transdukcji może wynosić od 10-75% w zależności od konstruktu i warunków polaryzacji. Podobnie może różnić się średnia intensywność fluorescencji ekspresji GFP. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki cytometrii przepływowej różnicowania komórek odpornościowych; markery IL-4, IFNγ, Foxp3; sześć wykresów.
Rycina 4. Wpływ nadekspresji miR-15b/16 na różnicowanie pomocniczych limfocytów T w różnych warunkach polaryzacji. Przedstawiono reprezentatywne profile cytokin dla populacji komórek GFP+ z Ryciny 3. Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Protokół przygotowania buforów, zawiera przepisy na NaCl, KCl, Na2HPO4, CaCl2, NH4Cl do eksperymentów laboratoryjnych.
Tabela 1: Bufory użyte w tych protokołach. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę jako arkusz Excel.

Warunki polaryzacji limfocytów T pomocniczych
Th0anti-IL-4 5 µg/ml
anti-IFN-γ 5 µg/ml
Th1recombinant-IL-12 20 ng/ml
anti-IL-4 5 µg/ml
Th2recombinant IL-4 40 ng/ml
anti-IFN-γ 5 µg/ml
Th9recombinant TGF-β 2.5 ng/ml
recombinant IL-440 ng/ml
anti-IFN-γ 10 µg/ml
Th17recombinant TGF-β2.5 ng/ml
recombinant IL-650 ng/ml
anti-IFN-γ5 µg/ml
anti-IL-4 5 µg/ml
anti-IL-2 5 µg/ml
Tregsrecombinant TGF-β2.5 ng/ml
recombinant IL-25 ng/ml

Tabela 2: Warunki polaryzacji podzbiorów pomocniczych limfocytów T.

Dyskusja

Nadekspresja genów za pośrednictwem retrowirusa jest potężnym sposobem analizy funkcji pomocniczych limfocytów T, ponieważ ich rozwój i funkcja są często determinowane przez poziom ekspresji kluczowych regulatorów. Wymagana jest jednak ostrożna interpretacja wyników, ponieważ poziomy ekspresji znacznie przekraczające poziomy genu endogennego mogą wprowadzać wiele artefaktów. Dlatego tę technikę należy połączyć z innymi w celu zweryfikowania istotności funkcji. Na przykład nadekspresja powinna być uzupełniona zmniejszoną ekspresją za pomocą siRNA lub nokautów genów, jeśli są dostępne. W przypadku miRNA uzupełniliśmy eksperymenty z nadekspresją eksperymentami blokowania, używając wirusów, które nadmiernie eksprymowały sztuczne miejsca docelowe miRNA, które działały jako konkurencyjne inhibitory miRNA 15. Transdukowane komórki retrowirusowe mogą być również wykorzystywane w testach biochemicznych obejmujących analizę RNA i białek. Jednak głównym ograniczeniem tych eksperymentów jest wydajność transdukcji, w wyniku której powstaje mieszana populacja komórek transdukowanych i nietransdukowanych. W związku z tym testy te najprawdopodobniej będą wymagały sortowania populacji GFP+ . Wreszcie, testy różnicowania in vitro powinny być połączone z eksperymentami in vivo , a jednym ze sposobów osiągnięcia tego jest adoptywne przeniesienie transdukowanych limfocytów T do myszy i śledzenie ich różnicowania i wpływu na odpowiedź immunologiczną.

Jednym z kluczowych ograniczeń tego systemu jest rozmiar genomu RNA, który można umieścić w retrowirusowym kapsydzie. Z naszego doświadczenia wynika, że maksymalny rozmiar wkładki do systemu retrowirusowego MIG, który zapewnia dobrą produkcję wirusa, wynosi 3-3,5 kb. Dlatego większe geny nie mogą być analizowane za pomocą tego systemu, ponieważ dają one słabe miana wirusa. Jednak większość genów jest mniejsza niż ten rozmiar, więc ten system jest przydatny w szerokiej gamie badań genów.

W przypadku transdukcji retrowirusowej zastosowano kilka alternatyw w ramach tych protokołów. Wielu badaczy wykorzystało linie komórkowe do pakowania, które stabilnie wyrażają geny retrowirusowe (na przykład odniesienie 16). Najwyższe miana uzyskaliśmy jednak przy użyciu standardowych komórek HEK 293T z kotransfekcją wektora wirusa pomocniczego pCL-Eco. Izolację naiwnych limfocytów T pomocniczych można również osiągnąć poprzez sortowanie komórek, a nie protokół kolumny do separacji kulek magnetycznych i komórek, ale wymaga to dostępu do sortownika komórek, a koszty czasu sortowania są zwykle wyższe niż w przypadku odczynników kulkowych. Wreszcie, istnieją wariacje na temat warunków aktywacji stosowanych do różnicowania limfocytów T pomocniczych w różne podzbiory. Na przykład stymulacja komórek TCR zbyt długo przed ekspozycją na warunki indukujące Treg może hamować ich indukcję 16. Może to stanowić problem, ponieważ ekspresja retrowirusowa wymaga podziału komórek wywołanego przez stymulację komórek. Niemniej jednak znaleźliśmy skuteczną indukcję Treg przy użyciu tego protokołu z aktywacją O/N przed transdukcją retrowirusową.

W ramach tych protokołów pomyślne zastosowanie wymaga kilku czynników. Preparaty retrowirusów o wysokim mianie wymagają skutecznej transfekcji komórek HEK 293T, dlatego ważna jest wysoka jakość DNA i precyzyjnie przygotowane 2x HBS. Ponadto gęstość komórek HEK 293T musi wynosić około 50% w momencie transfekcji, ponieważ dobra ekspresja transfekowanego DNA wymaga, aby komórki aktywnie rosły, a to zostanie zahamowane, jeśli komórki są zbyt rzadkie lub gęste. Komórki o optymalnej gęstości podczas transfekcji powinny osiągnąć konfluencję w pewnym momencie na etapach zbierania wirusa, ale będą nadal wytwarzać zapasy wirusa o wysokim mianie aż do ostatniego pobrania. Skuteczne różnicowanie pomocniczych limfocytów T wymaga dobrej jakości komórek, dlatego należy upewnić się, że izolowane komórki mają czystość zilustrowaną na rysunku 1. Podobnie jakość komórek zależy od myszy, od których zostały odizolowane. Do tych badań wykorzystaliśmy 6-8 tygodniowe myszy C57BL/6. Starsze myszy mogą mieć mniej naiwne komórki, a inne szczepy mogą różnić się różnicowaniem. Na przykład myszy BALB / c są bardziej podatne na odpowiedzi Th2 niż myszy C57BL / 6 17 , więc jak wspomniano powyżej, limfocyty T C57BL / 6 mogą być trudne do wywołania odpowiedzi Th2. Ponadto każdy z warunków różnicowania może się nieznacznie różnić w zależności od laboratorium, a efekt nadekspresji genów może stać się widoczny tylko w warunkach nieoptymalnych, więc może być konieczne miareczkowanie stężeń cytokin w różnych warunkach polaryzacji. Wreszcie, wpływ nadekspresji genu lub warunków polaryzacji na proliferację komórek może wpływać na wydajność transdukcji, więc pomiar efektów genu będącego przedmiotem zainteresowania może wymagać optymalizacji czasu i stężenia odczynników polaryzujących. Optymalizacja wszystkich tych czynników powinna prowadzić do pouczających wyników dzięki temu systemowi.

Oświadczenia

Autorzy nie mają sprzecznych interesów w publikacji tej pracy.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant Rady ds. Badań Biotechnologii i Nauk Biologicznych (BBSRC) (BB/H018573/1) oraz grant BD Biosciences.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMISigmaR8758
DMEMSigmaD5671
Penicylina Streptomycyna roztwórSigmaP4333
L-GlutaminaSigmaG7513
β-merkaptoetanolSigmaM3148
DPBSSigmaD8537
WektorMIGAddgenePlasmid 9094
pCL-Eco wektorAddgenePlasmid 12371
Sitko do komórekBD Falcon352350
Koraliki magnetyczne mysz CD4 zestaw komórek Invitrogen (Dynabeads)11415D
Koraliki Streptawidyny Miltenyi Biotech130-048-102
Kolumny do separacji komórek MSMiltenyi Biotech130-042-201
Kolumny do separacji komórek LSMiltenyi Biotech130-042-401
CD25 Biotenylowane MAb BD Biosciences85059klon 7D4
CD62L Biotenylowany MAb BD Biosciences553149klon MEL-14
Polybrene (bromek heksadimetryny)Sigma107689
Anty-CD3eBiosciences16-0031-85klon 145-2C11 
Anty-CD28eBiosciences16-0281-85klon 37.51 
Klon anty-IL-4559062 BD Biosciences11B11
Anty-IFN-gammaKlon 559065 BD BiosciencesXMG1.2
Klon 554425 anty-IL-2BD BiosciencesJES6-5H4
Rekombinowany IL-12 p70eBiosciences14-8121
Rekombinowany IL-4BD Biosciences550067
Rekombinowany TGF-betaeBiosciences14-8342-62
Rekombinowana IL-6eBiosciences14-8061
Rekombinowana IL-2eBiosciences14-8021
PMA SigmaP8139
JonomycynaSigmaI0634
Brefeldin AeBiosciences00-4506
ParaformaldehydSigma16005Paraformaldehyd jest toksyczny, dlatego należy zachować odpowiednią ostrożność podczas obchodzenia się 
Zestaw barwiących Foxp3eBiosciences00-5523
Anti-CD4  FITCeBiosciences11-0041klon GK1.5 
Anty-CD8a perCP-cy5.5eBiosciences45-0081-80klon 53-6.7 
Anty-MHCII PEeBiosciences12-0920  klon HIS19
Anti-CD25 PEeBiosciences12-0251-82  klon PC61.5 
Anty-CD62L PEeBiosciences12-0621-82klon MEL-14 
Anty-CD44 APCeBiosciences17-0441klon IM7 
Anty-IFN-gamma FITC eBiosciences11-7311-81klon XMG1.2
Anti-IL-4 PEBD Biosciences554435klon 11B11
Anti-IL-9 PE lub APCeBiosciences/Biolegend50-8091-82/514104klon RM9A4
Anti-IL-17a PEBD Biosciences559502klon TC11-18H10
Anti-Foxp3  APC lub PEeBiosciences17-5773-82/12-5773-80 klon FJK-16s
NaClSigmaS7653
KClSigmaP9333
Na2HPO4-2H2OSigma71643
Dekstroza/GlukozaSigmaG7021
HEPES, wolny kwasSigmaH3375
NH4ClSigmaA9434
Dysodowy EDTASigmaD2900000
KHCO3Sigma237205
  CaCl2 SigmaC5670

Bibliografia

  1. Baumjohann, D., Ansel, K. M. MicroRNA-mediated regulation of T helper cell differentiation and plasticity. Nat Rev Immunol. 13 (9), 666-678 (2013).
  2. Wilson, C. B., Rowell, E., Sekimata, M. Epigenetic control of T-helper-cell differentiation. Nat Rev Immunol. 9 (2), 91-105 (2009).
  3. Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342 (6155), 1242454(2013).
  4. Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., Van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral Expression in Embryonic Stem Cells and Hematopoietic Stem Cells. Mol and Cell Biol. 20 (20), 7419-7426 (2000).
  5. Miller, A. D., Rosman, G. J. Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. BioTechniques. 7 (9), 980-990 (1989).
  6. Grez, M., Akgün, E., Hilberg, F., Ostertag, W. Embryonic stem cell virus, a recombinant murine retrovirus with expression in embryonic stem cells. Proc Nat Acad Sci USA. 87 (23), 9202-9206 (1990).
  7. Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
  8. Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight? Nat Rev Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).
  9. He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nat Rev Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
  10. Bernstein, E., Kim, S. Y., et al. Dicer is essential for mouse development. Nat Genetics. 35 (3), 215-217 (2003).
  11. Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. J Exp Med. 203 (11), 2519-2527 (2006).
  12. Chong, M. M. W., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y., Rundensky, A. Y., Littman, D. R. The RNAseIII enzyme Drosha is critical in T cells for preventing lethal inflammatory disease. J Exp Med. 205 (9), 2005-2017 (2008).
  13. Liston, A., Lu, L. F., O'Carroll, D., Tarakhovsky, A., Rudensky, A. Y. Dicer-dependent microRNA pathway safeguards regulatory T cell function. J Exp Med. 205 (9), 1993-2004 (2008).
  14. Zhou, X., Jeker, L. T., et al. Selective miRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity. J Exp Med. 205 (9), 1983-1991 (2008).
  15. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. MicroRNA-15b/16 Enhances the Induction of Regulatory T Cells by Regulating the Expression of Rictor and mTOR. J Immunol. 195 (12), 5667-5677 (2015).
  16. Sauer, S., Bruno, L., et al. T cell receptor signaling controls Foxp3 expression via PI3K, Akt, and mTOR. Proc Nat Acad Sci USA. 105 (22), 7797-7802 (2008).
  17. Yagi, J., Arimura, Y., Takatori, H., Nakajima, H., Iwamoto, I., Uchiyama, T. Genetic background influences Th cell differentiation by controlling the capacity for IL-2-induced IL-4 production by naive CD4+ T cells. Int Immunol. 18 (12), 1681-1690 (2006).
  18. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. MicroRNAs regulate T-cell production of interleukin-9 and identify hypoxia-inducible factor-2a as an important regulator of T helper 9 and regulatory T-cell differentiation. Immunology. 149, 74-86 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pierwotne limfocyty T myszyizolacja limfocytów Tprodukcja wirusaróżnicowanie komórekcytometria przepływowakulki magnetyczneseparacja komórekekspresja genów
Transdukcja retrowirusowa limfocytów T pomocniczych jako genetyczne podejście do badania mechanizmów kontrolujących ich różnicowanie i funkcję
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.