Wykrywanie zmiany glikoproteiny powierzchniowej wariantu Trypanosoma brucei za pomocą magnetycznego sortowania komórek i cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Afrykańskie trypanosomy hodowane in vitro ulegają zmienności antygenowej w niskim tempie, tak że populacje składają się z pasożytów wyrażających dominujący wariant typu glikoproteiny powierzchniowej (VSG) i małej populacji "przełączonych" wariantów. Protokół ten opisuje szybką metodę wykrywania i ilościowego określania tych populacji.

Streszczenie

Trypanosoma brucei, pasożyt pierwotniak, który powoduje zarówno ludzką, jak i zwierzęcą trypanosomatozę afrykańską (znaną odpowiednio jako śpiączka i nagana) między wektorem tse-tse a ssaczym gospodarzem. Unika układu odpornościowego gospodarza ssaków poprzez okresową zmianę gęstej, wariantowej glikoproteiny powierzchniowej (VSG), która pokrywa jego powierzchnię. Wykrycie zmienności antygenowej u Trypanosoma brucei może być zarówno kłopotliwe, jak i pracochłonne. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania liczby pasożytów, które "przełączyły się" na ekspresję nowego VSG w danej populacji. Pasożyty są najpierw barwione przeciwciałem przeciwko wyjściowemu VSG, a następnie barwione wtórnym przeciwciałem przyczepionym do kulki magnetycznej. Pasożyty wyrażające początkowy VSG są następnie oddzielane od reszty populacji poprzez przesuwanie pasożytów po kolumnie przymocowanej do magnesu. Pasożyty wyrażające dominujący, początkowy VSG są zatrzymywane w kolumnie, podczas gdy przepływ zawiera pasożyty, które wyrażają nowy VSG, a także niektóre zanieczyszczenia wyrażające początkowy VSG. Ta przepływowa populacja jest ponownie barwiona fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem przeciwko wyjściowemu VSG w celu znakowania zanieczyszczeń i jodkiem propidyny (PI), który znakuje martwe komórki. Do populacji przepływowej dodaje się znaną liczbę bezwzględnych kulek zliczających, które są widoczne za pomocą cytometrii przepływowej. Stosunek kulek do liczby zebranych komórek można następnie wykorzystać do ekstrapolacji liczby komórek w całej próbce. Cytometria przepływowa służy do ilościowego określenia populacji przełączników poprzez zliczenie liczby komórek PI ujemnych, które nie barwią się dodatnio dla początkowego, dominującego VSG. Odsetek osób zmieniających populację można następnie obliczyć na podstawie danych z cytometrii przepływowej.

Wprowadzenie

Pasożyt pierwotniaka, Trypanosoma brucei, jest czynnikiem wywołującym choroby, które dotykają ludzi (poprzez Trypanosoma brucei gambiense i Trypanosoma brucei rhodesiense) i zwierzęta (poprzez Trypanosoma brucei brucei) w całej Afryce Subsaharyjskiej. Jest przenoszony na żywiciela ssaków przez ślinę wektora muchy tse-tse. Zarówno ludzka, jak i zwierzęca trypanosomatoza afrykańska powoduje poważne obciążenie ekonomiczne w regionach endemicznych, a niewiele leków jest dostępnych lub opracowywanych w celu leczenia którejkolwiek z tych chorób. Zrozumienie mechanizmów unikania odpowiedzi immunologicznej ma kluczowe znaczenie dla opracowania leków na trypanosomatozę. Antygenowa odmiana gęstej, wariantowej powłoki glikoproteiny powierzchniowej (VSG), która pokrywa pasożyta, jest jednym z podstawowych sposobów, za pomocą których T. brucei unika odpowiedzi przeciwciał ssaków. W genomie trypanosomu istnieje około 2000 wariantów genu VSG, ale tylko jeden jest transkrybowany w danym momencie z jednego z ~15 miejsc ekspresji. "Zamiana" ekspresji VSG może nastąpić albo przez skopiowanie genu VSG do aktywnego miejsca ekspresji, albo przez transkrypcyjną aktywację wcześniej cichego miejsca ekspresji (omówione w¹).

Chociaż wiele pracy poświęcono na zrozumienie zmienności antygenowej u T. brucei, czynniki wpływające na częstotliwość przełączania są nadal słabo poznane. Dotychczasowe badania były utrudnione przez fakt, że podczas gdy przełączanie zachodzi stochastycznie in vitro, częstotliwości przełączania są bardzo niskie, rzędu 1 na około 10⁶ komórek². Utrudnia to zmierzenie, czy dany czynnik zwiększa czy zmniejsza częstotliwość przełączania, ponieważ przełączanie jest trudne do wykrycia w pierwszej kolejności. Przed 2009 r. metody izolowania osób zmieniających populację były długotrwałe i pracochłonne. Obejmowały one przechodzenie trypanosomów przez myszy uodpornione przeciwko dominującemu VSG, a następnie pobieranie komórek dzień później³ lub liczenie setek komórek za pomocą immunofluorescencji^4,5. Inna strategia opiera się na selekcji pod kątem lekooporności w celu wyizolowania^osób zmieniających 6. Ponieważ afrykańskie trypanosomy hodowane in vitro zazwyczaj składają się z dużej populacji wyrażającej jeden główny wariant i znacznie mniejszej populacji przełączników wyrażających alternatywne warianty, w tym artykule odnosimy się do głównego wariantu jako dominującego, rozpoczynającego VSG. Robiąc to, w żaden sposób nie chcemy sugerować, że ten główny wariant ma większą przydatność niż inne warianty w populacji.

Tutaj opisujemy metodę, która może wiarygodnie zmierzyć liczbę trypanosomów wyrażających niedominujący VSG w danej populacji w ciągu 3 - 4 godzin. Metoda ta jest szczególnie przydatna, gdy chce się ustalić, czy dana manipulacja genetyczna lub leczenie farmakologiczne zwiększa liczbę przełączanych komórek w populacji. Zamiast pozbywać się populacji komórek wykazujących ekspresję dominującą, rozpoczynając VSG za pomocą leków lub środków immunologicznych, komórki te są eliminowane poprzez najpierw pokrycie ich kulkami magnetycznymi sprzężonymi z przeciwciałem przeciwko dominującemu VSG, a następnie wyizolowanie ich na kolumnie magnetycznej. Przełączona populacja jest następnie zbierana w przepływie i ponownie barwiona przeciwciałem anty-VSG znakowanym fluoroforem w celu identyfikacji zanieczyszczeń. Oznaczanie ilościowe uzyskuje się poprzez dodanie określonej liczby bezwzględnych kulek zliczających do każdej próbki, tak aby można było określić stosunek kulek do komórek i wykorzystać je do ilościowego określenia liczby przełączników w populacji⁷.

Protokół

UWAGA: Przez cały czas trwania procedury konieczne jest utrzymywanie komórek na lodzie. Przez cały czas należy również używać zimnych mediów.

1. Pobieranie próbek

1. Grow Lister 427 przecedził trypanosomy krwionośne do gęstości 0,5 - 1 miliona/ml. Najlepiej jest rozpoczynać uprawy z niewielką liczbą pasożytów. Wirować 50 x 10⁶ komórek/próbkę przez 10 minut przy 1,500 x g. Pamiętaj, aby pozostawić 1 x 10⁶ komórek w hodowli do późniejszego wykorzystania jako kontrole przeciwciał dodatnich i ujemnych.
   UWAGA: Protokół ten może być również stosowany w przypadku trypanosomów wyizolowanych z krwi zwierzęcej (szczegóły w dyskusji).
2. Odpipetować lub odlać większość supernatantu (pozostawić około 750 μl). Przenieść komórki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
3. Wirować komórki w temperaturze 4 °C przez 4 minuty przy 5 200 x g w mikrowirówce i usunąć supernatant.

2. Etykietowanie magnetyczne

1. Zawiesić komórki w pożywce hodowlanej o objętości 150 μl (na przykład HMI-9 z surowicą) + pierwszorzędowe przeciwciało anty-VSG w odpowiednim rozcieńczeniu.
   UWAGA: Przeciwciało anty-VSG jest wytwarzane we własnym zakresie i stosowane w rozcieńczeniu 1:50. Ważne jest, aby użyć pierwszorzędowego przeciwciała anty-VSG, które nie jest znakowane fluoroforem.
2. Komórki wirowe za pomocą adaptera wirowego-60 z prędkością 6 - 8 w chłodni w temperaturze 4 °C przez 10 min. Przemyć 800 - 1.000 μl zimnego HMI-9 z serum.
3. Wirować w temperaturze 4 °C przez 4 minuty przy 5 200 x g i zassać supernatant. Przemyć 1 ml HMI-9 z serum i odwirować jak wyżej. Odessać supernatant. Zawiesić osad w 100 μl HMI-9 z surowicą.
4. Dodać 110 μl mikrokulek do sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MSC). Użyj kulek anty-myszy, anty-królika lub anty-biotyny, odpowiednio do pierwszorzędowego przeciwciała anty-VSG. Dobrze wymieszaj. Wirować komórki w chłodni w temperaturze 4 °C przez 10 min.
5. Podczas wirowania komórek ustaw jedną kolumnę/próbkę separacyjną aktywowaną magnetycznie na magnesie separacyjnym. Upewnij się, że pod kolumną znajduje się pojemnik (używamy probówki wirówkowej o pojemności 15 ml) do zbierania przepływu. Ustaw urządzenie w chłodni.
6. Dodać 2 ml HMI-9 z surowicą do kolumny wstępnej. Po zalaniu umieścić probówkę wirówkową o pojemności 15 ml pod kolumną, aby zebrać przepływ z każdej próbki.
7. Po 10-minutowej inkubacji w kroku 2.4 dodać 800-1 000 μl zimnego HMI-9 z surowicą. Wirować w temperaturze 4 °C przez 4 minuty przy 5 200 x g i usunąć supernatant w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała. Przemyć 1 ml HMI-9 surowicą i powtórzyć czynność, pozostawiając 100 μl supernatantu.
8. Energicznie potrząśnij probówką wirówkową i sprawdź wzrokowo probówkę, aby upewnić się, że osad jest całkowicie zawieszony. Dodaj 1 ml HMI-9 z surowicą i pipetą w górę iw dół, aby upewnić się, że komórki są dobrze zawieszone.

3. Separacja magnetyczna

1. Upewnij się, że kolumny są zagruntowane zgodnie z powyższym opisem. Zastosuj komórki do kolumny. Zbierz przepływ z komórkami wyrażającymi niedominujący VSG. 1 ml pożywki + trypanosomów zwykle potrzebuje 6 - 7 minut, aby przepłynąć przez kolumnę.
2. Przemyć 2x 1 ml HMI-9 surowicą i zebrać przepływ do tej samej probówki, co w kroku 3.1.
3. Podzielić przepływowy (3 ml) na dwie probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA: Można je połączyć później lub połowę można użyć do wyizolowania RNA itp.
4. Zdejmij kolumnę z magnesu. Dodać 3 ml HMI-9 z surowicą do kolumny i zanurzyć kolumnę w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, aby uzyskać komórki wykazujące ekspresję wyjściowego, dominującego VSG. Usunąć 300 μl eluowanego materiału do późniejszej analizy. Utrzymuj te komórki na lodzie.
5. W celu użycia jako kontrola dodatnia i ujemna należy pobrać około 1 miliona komórek z początkowej hodowli komórek kontrolnych rosnących w temperaturze 37 °C (tych, w których nie przewiduje się częstej zmiany) i pipetować je do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
   UWAGA: Komórki kontroli dodatniej zostaną wybarwione przeciwciałem znakowanym fluoroforem w kroku 4.1. Ujemne komórki kontrolne pozostają niezabarwione przez pozostałą część protokołu.
6. Wirować próbki przepływowe i dodatnią próbkę kontrolną przeciwciał w temperaturze 4 °C przez 4 minuty przy 5 200 x g i usunąć supernatant.
   UWAGA: Kolejne 300 μl podwielokrotności eluowanych komórek można zastosować jako kontrolę pozytywną do barwienia anty-VSG.

4. Barwienie w celu identyfikacji zanieczyszczeń i przełączników

1. Zawiesić przepływające próbki i dodatnie komórki kontrolne w 100 μl HMI-9 z surowicą + pierwszorzędowym, znakowanym fluoroforem przeciwciałem anty-VSG w odpowiednim rozcieńczeniu.
   UWAGA: Znakowane przeciwciało anty-VSG jest wytwarzane we własnym zakresie i używane w rozcieńczeniu 1:1,000. Znakowany fluoroforem anty-VSG może pochodzić z tego samego źródła, co nieznakowane przeciwciało na etapie separacji MACS. Po wykonaniu kroku 3.5 w dwóch probówkach do mikrowirówek należy umieścić 3 ml próbki przepływowej.
2. Aby przeanalizować cały przepływ za pomocą cytometrii przepływowej, połącz granulki w dwóch probówkach mikrowirówek, jednocześnie ponownie zawieszając próbki w 100 μl HMI-9 z surowicą + przeciwciałem anty-VSG. Dobrze wymieszaj.
3. Wirować komórki w chłodnym pomieszczeniu w temperaturze 4 °C przez 10 min. Dodać 800 - 1 000 μl zimnego HMI-9 z surowicą. Wirować próbki w temperaturze 4 °C przez 4 minuty przy 5 200 x g i usunąć supernatant w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała.
4. Przemyć komórki 1 ml HMI-9 z surowicą. Wirować próbki w temperaturze 4 °C przez 4 minuty przy 5 200 x g i usunąć supernatant. Podczas tego ostatniego wirowania odwirować wymyte próbki z kroku 3.4 i próbkę kontroli ujemnej.
5. Zawiesić wszystkie przepływowe i eluowane próbki w: 148,5 μl HMI-9 z surowicą, 25 μl absolutnych kulek zliczających i 1,5 μl roztworu barwiącego jodku propidyny (łącznie 175 μl). Zawiesić dodatnie i ujemne próbki kontrolne przeciwciał w 175 μl HMI-9 z surowicą. Należy pamiętać o zapisaniu liczby bezwzględnych kulek do liczenia/25 μl dla konkretnej użytej partii.
6. Przepuść wszystkie próbki przez cytometr przepływowy i zbierz dane. Martwe komórki barwią się jako PI⁺. Zanieczyszczenia barwią się ^jako PI-VSG⁺. Przełączniki barwią się jako PI-VSG-8.
7. Obliczanie częstotliwości przełączania na podstawie danych cytometrii przepływowej.
   UWAGA: Instrukcje dotyczące obliczania częstotliwości przełączania można znaleźć w pliku uzupełniającym Cytometria przepływowa Calculations.docx i Tabela 1.

Wyniki

Opisana tutaj metoda została użyta do wykazania, że dwuniciowe przerwy w miejscu ekspresji VSG zwiększają liczbę przełączników w populacji⁸. Tutaj pokazujemy reprezentatywne wyniki z populacji trypanosomów, które zostały podobnie indukowane do generowania pęknięcia podwójnej nici w miejscu ekspresji. Porównujemy te trypanosomy z tymi, które nie zostały wywołane do wytworzenia pęknięcia dwuniciowego. Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne wykresy cytometrii przep...

Dyskusja

Jeśli chodzi o technikę eksperymentalną, najbardziej krytycznym elementem protokołu jest utrzymywanie wszystkich próbek w niskiej temperaturze. Trypanosomy bardzo szybko internalizują przeciwciało związane ze swoją powierzchnią⁹, ale proces ten jest zależny od ruchliwości i nie wpływa na test, o ile komórki są utrzymywane w temperaturze 4 °C. Wszystkie próbki należy zawsze przechowywać na lodzie, a pipetowanie powinno odbywać się szybko, aby zminimalizować narażenie na środowisko laboratoryjne o temperaturze 2...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
nieznakowane przeciwciało anty-VSG	n/a	n/a	Przeciwciało VSG jest wytwarzane w domu
przeciwciało anty-VSG znakowane fluoroforem	nie	Przeciwciało	VSG jest wytwarzane w domowym
pożywce HMI-9	nie		HMI-9 jest wytwarzane w domu Jodek
propidium	BD Pharmingen	556463
CountBright absolutne kulki do liczenia	Thermofisher Naukowe	kolumny C36950
LD	Miltenyi Biotech	130-042-901
Magnes MACS	Miltenyi Biotech	130-042-303
Separator magnetyczny MACS	Miltenyi Biotech	130-042-302
adapter wirowy-60	ThermoFisher naukowy	cytometr
	Coulter	n/a
oprogramowanie do analizy cytometrem przepływowym	FloJo	n/a