Analiza importu białek do chloroplastów wyizolowanych z roślin zestresowanych

Podsumowanie

Tutaj opisujemy nową metodę badania importu białek do izolowanych chloroplastów pod wpływem stresu. Metoda jest szybka i prosta i może być stosowana do badania konsekwencji różnych warunków stresowych dla importu białka chloroplastowego i odpowiednich mechanizmów regulacyjnych.

Streszczenie

Chloroplasty to organelle pełniące wiele ważnych ról w roślinach, które obejmują nie tylko fotosyntezę, ale także wiele innych funkcji metabolicznych i sygnalizacyjnych. Ponadto chloroplasty mają kluczowe znaczenie dla reakcji roślin na różne stresy abiotyczne, takie jak zasolenie i stresy osmotyczne. Chloroplast może zawierać do ~ 3,000 różnych białek, z których niektóre są kodowane przez jego własny genom. Jednak większość białek chloroplastowych jest kodowana w jądrze i syntetyzowana w cytozolu, a białka te muszą być importowane do chloroplastu przez translokony na błonach otoczki chloroplastowej. Ostatnie badania wykazały, że import białka chloroplastowego może być aktywnie regulowany przez stres. Aby biochemicznie zbadać taką regulację importu białka w warunkach stresowych, opracowaliśmy opisaną tutaj metodę jako szybką i prostą procedurę, którą można łatwo osiągnąć w każdym laboratorium. W tej metodzie rośliny są uprawiane w normalnych warunkach, a następnie poddawane warunkom stresowym w płynnej kulturze. Zbierany jest materiał roślinny, a następnie uwalniane są chloroplasty w wyniku homogenizacji. Surowy homogenat jest oddzielany przez wirowanie w gradiencie gęstości, co umożliwia izolację nienaruszonych chloroplastów. Wydajność chloroplastów ocenia się przez liczenie, a nienaruszalność chloroplastów sprawdza się pod mikroskopem. W przypadku testów importu białek, oczyszczone chloroplasty inkubuje się z ³⁵S znakowanymi radioizotopowo białkami prekursorowymi in vitro i przeprowadza się eksperymenty w czasie, aby umożliwić porównanie wskaźników importu między genotypami w warunkach stresu. Przedstawiamy dane wygenerowane tą metodą, które pokazują, że szybkość importu białka do chloroplastów z mutanta regulatorowego jest specyficznie zmieniona w warunkach stresu osmotycznego.

Wprowadzenie

Chloroplasty to bardzo obfite organelle, które istnieją w zielonych tkankach roślin. Są dobrze znane ze swojej kluczowej roli w fotosyntezie, procesie, który wykorzystuje energię świetlną do przekształcania dwutlenku węgla w cukier, a tym samym podtrzymuje prawie całe życie na Ziemi ¹. Ponadto chloroplasty (i szersza rodzina pokrewnych organelli zwanych plastydami) odgrywają wiele innych istotnych ról w roślinach, w tym biosyntezę aminokwasów, lipidów, pigmentów i wykrywanie sygnałów środowiskowych, takich jak grawitacja i prowokacja patogenów. Fotosynteza generuje reaktywne formy tlenu (ROS) jako produkty uboczne, które w pewnych okolicznościach pełnią użyteczną rolę, ale w przypadku nadprodukcji mogą powodować szkodliwe lub nawet śmiertelne skutki. Nadprodukcji ROS sprzyjają szczególnie niekorzystne warunki środowiskowe, a zatem chloroplasty są ściśle związane z reakcjami na stresy abiotyczne, takie jak zasolenie i stresy osmotyczne ².

Chloroplasty mają złożoną strukturę. Każdy chloroplast jest otoczony zewnętrzną warstwą z podwójną błoną zwaną otoczką, która składa się z błony zewnętrznej i wewnętrznej. Wewnątrz znajduje się inny system błonowy zwany tylakoidami, w którym zachodzą reakcje świetlne fotosyntezy. Pomiędzy tymi dwoma systemami membranowymi znajduje się przedział wodny zwany zrębem, który bierze udział w wiązaniu węgla. Chloroplast może zawierać do ~ 3,000 różnych białek, a zdecydowana większość tych białek jest syntetyzowana w cytozolu w postaci prekursora i musi być importowana do organelli przez dedykowane translokony białkowe w błonach otoczki ¹. Co ciekawe, ostatnie prace wykazały, że import białek chloroplastowych jest aktywnie regulowany, a zatem jest w stanie wywierać istotny poziom kontroli nad proteomem chloroplastowym. Na przykład w 2015 r. doniesiono, że import białek może reagować na stres abiotyczny poprzez bezpośrednią regulację obfitości translokonu na zewnętrznej błonie otoczki chloroplastów (TOC) przez układ ubikwityna-proteasom ³.

Używając oczyszczonych chloroplastów i syntetyzowanych in vitro białek prekursorowych, import białek może być odtworzony in vitro ^4,5. W związku z tym metody in vitro mogą być stosowane do oceny wskaźników importu w różnych zmutowanych roślinach ⁶, co było kluczowym podejściem do analizy przypuszczalnych składników maszynerii importu białek oraz do odkrywania mechanizmów leżących u podstaw importu białka i jego regulacji. Ponadto chloroplasty mogą być przetwarzane z dalszym frakcjonowaniem lub trawieniem proteazy, po imporcie in vitro, co może ułatwić badania nad lokalizacją i topologią suborganellarów ^{białek chloroplastowych 7,8}.

Aby zbadać regulację importu białek przez stres, zmodyfikowaliśmy naszą rutynową metodę izolacji chloroplastów, jak to opiszemy tutaj. Co ważne, chloroplasty wyizolowano z roślin, które były uprawiane na standardowym podłożu agarowym Murashige and Skoog (MS) przez 8 dni, a następnie przeniesiono do płynnej pożywki MS uzupełnionej stresorem, zapewniając stosunkowo krótkie, kontrolowane leczenie stresu. Wydajność i kompetencje chloroplastów wyizolowanych z takich roślin poddanych działaniu stresu są zgodne z późniejszym testem importu białka in vitro ³. Oprócz protokołu izolacji chloroplastów przedstawiamy naszą rutynową metodę importu białka in vitro, która okazała się solidna i jest szeroko stosowana ^3,9-12.

Protokół

1. Wzrost rzodkiewnika i leczenie stresu

1. Przygotować 1 l pożywki Murashige i Skoog (MS), dodając 4,3 g mieszaniny soli bazowej MS, 10 g sacharozy, 0,5 g kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) do wody dejonizowanej do 1 l i dostosować pH do 5,7 wodorotlenkiem potasu (KOH). Dodać 6 g fitoagaru i sterylizować w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 120 °C.
   1. Przed zestaleniem należy wlać pożywkę do okrągłych płytek Petriego (średnica 9 cm, wysokość 1,5 cm, z 20 - 25 ml pożywki MS na płytkę). Pozostaw płytki do wyschnięcia przez ~1 godzinę w okapie z przepływem laminarnym przed zamknięciem pokrywek.
2. Umieść nasiona Arabidopsis thaliana w probówce o pojemności 1,5 ml w celu sterylizacji powierzchniowej, dodając 1 ml 70% (v/v) etanolu zawierającego 0,02% (v/v) Triton X-100 i ciągle wstrząsając przez 5-10 minut. Dla każdego genotypu/warunku przygotuj 10 szalek Petriego, z których każda zawiera ~100 - 150 sadzonek.
3. Odczekać około 10 sekund, aż nasiona osiądną na dnie probówki, a następnie wyrzucić supernatant przez pipetowanie. Dodaj 1 ml 100% etanolu i ponownie potrząsaj probówką przez 10 minut.
4. Przygotuj okap z przepływem laminarnym podczas sterylizacji nasion. Weź jeden kawałek bibuły filtracyjnej na próbkę, złóż go na pół, aby ułatwić siew, i namocz go w 100% etanolu w kapturze. Poczekaj, aż całkowicie wyschnie. Należy pamiętać, że stosuje się 100% etanol, ponieważ odparowuje on szybciej niż 70% etanolu.
5. Przenieść nasiona na bibułę filtracyjną, pipetując za pomocą końcówki do pipet o pojemności 1 ml wyciętej ~5 mm od drobnego końca. Pozostaw je do wyschnięcia, co powinno zająć około 10 - 15 minut.
6. Zasiej ~ 100 - 150 wysterylizowanych nasion równomiernie na każdej pożywce Petriego MS i uszczelnij każdą płytkę taśmą chirurgiczną.
7. Przechowuj płytki do góry nogami w temperaturze 4 °C przez 2 - 4 dni, aby pobudzić i zsynchronizować kiełkowanie. Stare nasiona mogą wymagać dłuższego przechowywania (do tygodnia) w temperaturze 4 °C.
8. Przenieś płytki do komory do hodowli tkanek roślinnych i pozostaw je do góry nogami. Rośliny uprawiać przez 8 dni w cyklu długiego dnia (16 h 100 μmol·m⁻²·s⁻¹ jasny, 8 h ciemny) w temperaturze 20 °C.
9. W celu leczenia stresu, gdy rośliny mają 8 dni, w okapie przepływowym przenieś je z podłoża agarowego, delikatnie zeskrobując je ręcznie w rękawicach wysterylizowanych etanolem, do wysterylizowanej kolby z płynnym podłożem MS zawierającym stresor (np. 200 mM mannitol). Unikaj przenoszenia pożywki agarowej. Przykryj otwór kolby wysterylizowaną folią i pozwól roślinom rosnąć w tych samych warunkach, co w kroku 1.8 przez dodatkowe 2 dni na wytrząsarce orbitalnej z delikatnym potrząsaniem (~100 obr./min).

2. Wytwarzanie białka prekursorowego przez transkrypcję/translację in vitro

Uwaga: Protokół ten zakłada użycie prekursora fotosystemu Arabidopsis I podjednostki D (pPsaD) jako matrycy/preproteiny, ale metoda jest kompatybilna z innymi.

1. Sklonuj sekwencję kodującą (CDS) pPsaD do miejsca wielokrotnego klonowania (MCS) wektora SK pBlueScript II (lub innego podobnego wektora z promotorem T7) ¹³. Oczyść plazmid (pBSK-pPsaD) za pomocą zestawu do izolacji DNA i zweryfikuj sekwencję za pomocą sekwencjonowania DNA.
   UWAGA: Wszystkie te kroki wykorzystują standardowe techniki klonowania molekularnego.
2. Oznaczyć stężenie plazmidowego DNA pBSK-pPsaD za pomocą spektrofotometru ustawionego do pomiaru absorbancji przy 260 nm. Rozcieńczyć plazmid do końcowego stężenia 10 ng/μl.
3. Przeprowadzić PCR 20 μl (przez 35 cykli), używając rozcieńczonego plazmidu jako matrycy. Przygotować reakcję w następujący sposób: 2 μL 10× buforu polimerazy, 2 μL 2 mM dNTPs, 1 μL 5 mM M13 startera do przodu (5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3'), 1 μL 5 mM startera wstecznego M13 (5'-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3'), 1 μL rozcieńczony plazmid pBSK-pPsaD, 1 U polimerazy Taq i wody destylowanej, aby uzyskać całkowitą objętość reakcji do 20 μl. Użyć standardowego programu PCR, jak następuje: 95 °C, 5 min; 35 cykli [95 °C, 30 s; 56 °C, 30 s; 72 °C, 30 s); i 72 °C, 5 min.
4. Przeprowadzić 5 μl produktu PCR na 1% (w/v) żelu agarozowym w buforze TAE (Tris-HCl, pH 7,6, 20 mM kwas octowy, 1 mM EDTA) w celu sprawdzenia poprawności amplifikacji cDNA i określić ilościowo odpowiednie pasmo w stosunku do wzorców w celu potwierdzenia stężenia. Pozostałą część produktu należy przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszych zastosowań.
5. Przygotować reakcję o objętości 50 μl przy użyciu bezkomórkowego systemu transkrypcji/translacji na bazie lizatu retikulocytów królika, zgodnego z DNA PCR, w następujący sposób: 40 μl lizatu retikulocytów z systemu transkrypcji/translacji, 2,5 μl znakowanej radioaktywnie [³⁵S] metioniny, 11 μCi/ml (aktywność specyficzna: >1,000 Ci/mmol), 2,5 μl sterylnej wody destylowanej i 5 μl produktu pPsaD PCR (100 - 800 ng).
   Ostrzeżenie: Podczas pracy z materiałem radioaktywnym należy nosić rękawice, odzież laboratoryjną i okulary ochronne. Monitoruj i odkażaj powierzchnię roboczą i sprzęt. Wszystkie odpady radioaktywne należy utylizować w zatwierdzonym pojemniku na odpady.
6. Inkubować reakcję przez 90 minut w łaźni wodnej o temperaturze 30 °C. Zatrzymaj reakcję, umieszczając próbkę na lodzie.
7. Pobrać 1 μl reakcji jako próbkę badaną (ta sama objętość może również służyć jako kontrola wejściowa dla kroku 5.7) w celu weryfikacji za pomocą standardowej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), a następnie autoradiografii, fluorografii lub obrazowania luminoforowego. Na dobry wynik wskazuje obserwacja wyraźnego i silnego prążka odpowiadającego masie cząsteczkowej pPsaD (~23 kD). Pozostałą część reakcji należy przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszych zastosowań.

3. Izolacja chloroplastów

1. Przygotuj następujące roztwory podstawowe:
   1. Przygotować bufor izolacyjny chloroplastów (CIB, 2x): 0,6 M sorbitolu, 10 mM chlorku magnezu (MgCl₂), 10 mM kwasu tetraoctowego glikolu etylenowego (EGTA), 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 20 mM wodorowęglanu sodu (NaHCO₃), 40 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego (HEPES); dostosować do pH 8,0 za pomocą KOH. Przygotować 2 litry 2x CIB, przygotować porcje i przechowywać je w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania lub w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego przechowywania. Aby zrobić 1x CIB, rozcieńczyć 2x CIB 1:1 wodą destylowaną; Można to przygotować świeżo w dniu eksperymentu z izolacją chloroplastów.
   2. Przygotować HEPES-MgSO, 4-bufor sorbitolowy (HMS, 1x): 50 mM HEPES, 3 mM siarczan magnezu (_MgSO4), 0,3 M sorbitol; dostosować do pH 8,0 wodorotlenkiem sodu (NaOH). Przygotować 400 ml buforu, przygotować porcje i przechowywać je w temperaturze -20 °C w przypadku długotrwałego przechowywania lub w temperaturze 4 °C w przypadku krótkotrwałego przechowywania.
2. Wszystkie poniższe procedury należy przeprowadzić w chłodni lub na lodzie. Przed rozpoczęciem należy schłodzić wszystkie roztwory, urządzenia, sprzęt i wirniki.
3. Przygotować ciągły gradient gęstości, mieszając 13 ml Percollu, 13 ml buforu 2x CIB i 5 mg glutationu w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i odwirowując mieszaninę w temperaturze 43 000 × g przez 30 minut (hamowanie wyłączone) w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu należy obchodzić się z probówką ostrożnie, aby nie zakłócić gradientu i trzymać ją na lodzie do późniejszego użycia.
4. Przenieść 100 ml 1x CIB na genotyp/warunek do zlewki o pojemności 1 l.
   1. Usunąć sadzonki z płynnego podłoża, przerzucając je na sito, i przenieść je do innej zlewki zawierającej CIB; następnie przepłukać tkankę CIB, aby usunąć wszelkie pozostałości płynnego podłoża przed zastąpieniem jej 100 ml świeżego CIB.
5. Do homogenizacji należy użyć łącznie 100 ml 1x CIB na próbkę w pięciu kolejnych rundach homogenizacji, przy czym w każdej rundzie używa się 20 ml świeżego CIB przechowywanego w zlewce o pojemności 50 ml.
   1. W pierwszej rundzie homogenizacji przenieś ręcznie tkankę roślinną do zlewki o pojemności 50 ml, pozwalając poprzedniemu buforowi do przechowywania spłynąć przez palce. Spróbuj użyć większości tkanki w pierwszej rundzie, ale upewnij się, że jest ona zanurzona w buforze; Jeśli nie jest to możliwe, wprowadź pozostałą niewykorzystaną tkankę w drugiej rundzie.
6. Umieścić sondę homogenizatora tkankowego w tkance i homogenizować dwoma impulsami po 1 - 2 s każdy. Przefiltrować homogenat przez dwie warstwy tkaniny filtracyjnej do probówki wirówkowej o pojemności 250 ml, delikatnie ściskając. Zachować filtrat i przenieść tkankę z powrotem do zlewki o pojemności 50 ml.
7. Umieścić drugą porcję CIB o pojemności 20 ml w zlewce o pojemności 50 ml, dodając pozostałą tkankę niewykorzystaną w pierwszej rundzie homogenizacji i powtórzyć etapy homogenizacji i filtracji. W ten sposób powtarzać kroki 3.5 i 3.6, aż do zużycia wszystkich 100 ml CIB (tj. 5 podwielokrotności po 20 ml) i połączyć otrzymane filtraty.
8. Odwirować zebrany homogenat o stężeniu 1 000 × g przez 5 minut (hamulec włączony) w temperaturze 4 °C i wylać sklaczek natychmiast po zakończeniu wirowania, uważając, aby nie naruszyć osadu. Zawiesić osad w pozostałym supernatantze pozostawionym w probówce, delikatnie mieszając probówkę z lodem. Nie mieszać energicznie przez pipetowanie lub wirowanie.
9. Delikatnie przenieść homogenat na wierzch wstępnie przygotowanego ciągłego gradientu gęstości, używając pipety Pasteura, aby nałożyć go przez ściankę rurki odbiorczej. Unikaj zakłócania gradientu. Wirować w wirniku z wahliwym kubełkiem o natężeniu 7 800 × g przez 10 minut (hamulec wyłączony) w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Po odwirowaniu w gradiencie widoczne są dwa zielone paski: dolny pas zawiera nienaruszone chloroplasty, a górny pas zawiera połamane chloroplasty.
10. Odrzucić górne pasmo przez pipetowanie, a następnie przenieść dolne pasmo za pomocą pipety Pasteura do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, zachowując objętość do 8 ml na gradient.
11. Dodaj ~ 25 ml buforu 1x HMS do probówki i dwukrotnie odwróć probówkę, aby zmyć Percoll z chloroplastów. Umieścić probówkę ponownie w wirniku kubełkowym i odwirować przy 1.000 × g przez 5 minut (hamulec włączony) w temperaturze 4 °C.
12. Odlej supernatant i ostrożnie ponownie zawieś osad chloroplastowy w resztkach HMS pozostawionych w probówce, delikatnie mieszając probówkę na lodzie. W razie potrzeby dodać dodatkowe 100 - 300 μl HMS (w zależności od wielkości osadu i liczenia w sekcji 4), ale staraj się nie rozcieńczać próbki zbyt mocno.
    1. Utrzymuj chloroplasty na lodzie. Za każdym razem, zanim chloroplasty zostaną użyte do dalszych zastosowań, należy wstrząsnąć rurką, aby je ponownie zawiesić. Zawsze używaj odciętej końcówki pipety (z rozszerzonymi porami) do przenoszenia chloroplastów.

4. Analiza wydajności i nienaruszoności chloroplastów

1. Dodaj 5 μl wyizolowanych chloroplastów do 495 μl 1x buforu HMS w probówce o pojemności 1,5 ml, a następnie delikatnie wymieszaj, odwracając probówkę, aby uzyskać rozcieńczenie 1:100.
2. Umieść szklankę nakrywkową na górze komory zliczającej hemocytometru. Powoli odpipetować ~40 - 60 μL rozcieńczonej zawiesiny chloroplastowej do szczeliny między szkłem nakrywkowym a komorą liczącą. Używając mikroskopu z kontrastem fazowym z obiektywem 10X lub 20X, nienaruszone chloroplasty wyglądają na okrągłe i jasne i są otoczone aureolą światła.
   UWAGA: Pod mikroskopem znajduje się obszar zliczania o wielkości 1 mm² z 25 dużymi kwadratami, z których każdy zawiera 16 małych kwadratów pośrodku komory liczącej.
3. Policz liczbę chloroplastów w 10 dużych kwadratach. Liczba chloroplastów na duży kwadrat powinna wynosić średnio od 10 do 30. Jeśli obecnych jest zbyt mało lub zbyt wiele chloroplastów, należy odpowiednio dostosować współczynnik rozcieńczenia (krok 4.1 powyżej) i powtórzyć procedurę.
4. Obliczyć liczbę chloroplastów na ml (stężenie) w następujący sposób: n (średnia liczba chloroplastów na duży kwadrat obliczona w kroku 4.3) × 25 (całkowita liczba dużych kwadratów) × 100 (współczynnik rozcieńczenia) ×^{10 4} (współczynnik skalowania do wyrażenia danych na 1 ml, ponieważ objętość powyżej 25 kwadratów wynosi 0,1 mm³).
5. Obliczyć rzeczywistą wydajność chloroplastów, mnożąc stężenie przez objętość zawiesiny chloroplastów otrzymaną w kroku 3.12. Zwykle można uzyskać ponad 50 × 10⁶ chloroplastów.

5. Import białka chloroplastowego

1. Przygotuj następujące roztwory podstawowe:
   1. Przygotuj 10x bufor HMS: 500 mM HEPES, 30 mM_MgSO4 i 3,0 M sorbitolu; dostosuj do pH 8,0 za pomocą NaOH. Przygotować 50 ml tego buforu, podwielokrotność, i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania i w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego przechowywania.
   2. Przygotuj bufor zatrzymujący import: 50 mM EDTA rozpuszczony w 1x buforze HMS. Przygotować 50 ml tego buforu, podwielokrotność, i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   3. Przygotuj 2x Bufor ładujący białko: 60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (v/v) glicerol, 2% (w/v) SDS, 0,005% (w/v) błękit bromofenolowy. Przygotować 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C. Tuż przed użyciem dodać 100 μl 1 M 1,4-ditiotreitolu (DTT) do 900 μl buforu.
2. Aby przeprowadzić kurs czasowy z 3 punktami czasowymi, przygotuj 3 probówki, z których każda zawiera 130 μl podwielokrotności buforu zatrzymującego przywóz i pozostaw je na lodzie. Przygotować 450 μl reakcji importu w probówce o pojemności 2 ml (według genotypu/warunku). Rozmrozić wszystkie składniki tuż przed użyciem.
   1. Dla jednej reakcji importu zwykle stosuje się 10 × 10⁶ chloroplastów w objętości A μl; na przykład, jeśli stężenie chloroplastów wynosi 2,5 × 10⁸ / ml, należy użyć 40 μl zawiesiny chloroplastów. Trzy punkty czasowe będą wymagały 3 × μL (tj. 120 μL w naszym przykładzie).
   2. Wymieszać składniki reakcji na lodzie w następującej kolejności: woda destylowana (aby uzyskać całkowitą objętość 600 μL), B μL 10x bufor HMS (gdzie B = [600-3×A]/10; tj. 48 w naszym przykładzie), 12 μL 1 M kwasu glukonowego (sól potasowa), 6 μL 1 M NaHCO₃, 6 μL 20% (w/v) BSA, 30 μL 100 mM adenozyno-5′-trifosforanu soli magnezowej (MgATP), 24 μL 250 mM metioniny (nieznakowanej radioaktywnie) i 30 μL białka prekursorowego. Bezpośrednio przed rozpoczęciem reakcji importowej dodać 3 × μl chloroplastów i wymieszać, delikatnie stukając w probówkę.
3. Inkubować probówkę reakcyjną w temperaturze 25 °C w łaźni wodnej pod światłem 100 μmol·m⁻²·s⁻¹. Od czasu do czasu przesuwaj rurki, aby ponownie zawiesić chloroplasty.
4. Aby przeprowadzić przebieg w czasie, należy pobrać 130 μL podwielokrotności z reakcji w wymaganych punktach czasowych w liniowym zakresie importu, który dla pPsaD wynosi do ~12 min (w tym przypadku odpowiednie są 4-, 8- i 12-minutowe punkty czasowe). Okres zakresu liniowego może być różny dla różnych białek ¹⁴. Dlatego sugeruje się wcześniejsze przetestowanie każdego pojedynczego prebiałka w celu optymalizacji punktów czasowych.
5. Natychmiast po pobraniu przenieść każdą 130 μl podwielokrotności do probówki z lodowatym buforem zatrzymującym import, wymieszać, delikatnie stukając w probówkę i pozostawić wszystkie probówki na lodzie aż do zakończenia upływu czasu.
6. Odwirować wszystkie próbki przez 30 s przy 12 000 × g w mikrofuge, wyrzucić supernatanty przez pipetowanie i ponownie zawiesić granulki w 15 μl buforu ładującego 2x białko przez wirowanie.
7. Przeanalizować wszystkie próbki oraz kontrolną metodę wejściową pPsaD (zawierającą pPsaD odpowiadającą 10% ilości dodanej do każdej reakcji importu, począwszy od kroku 2.7) za pomocą standardowej SDS-PAGE i autoradiografii, fluorografii lub obrazowania luminoforowego ¹⁵. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby określić ilościowo i przeanalizować wyniki. Aby zapewnić wskazanie efektywności przywozu, ilość importowanego białka w różnych genotypach/warunkach można ocenić, mierząc radioaktywność związaną z każdym dojrzałym prążkiem.

Wyniki

Przykładowy eksperyment importu białka chloroplastowego z 3 punktami czasowymi jest pokazany na rysunku 1. PsaD jest składnikiem ~18 kD fotosystemu I wystawionym na działanie zrębu, z formą prekursorową ~23 kD¹⁶. PsaD został tutaj wybrany do testu importu białka in vitro, ponieważ jego poziomy w stanie stacjonarnym są podwyższone w mutancie sp1 w stosunku do WT w warunkach stresu, co sugeruje zmianę jego efektywności importu w mutancie ³. Mutant sp1 niesie ze sobą defekt w ważnym regulatorze maszynerii importu białek chloroplastowych - białku SP1 ³. W przypadku chloroplastów wyizolowanych z roślin uprawianych w normalnych warunkach nie stwierdzono oczywistej różnicy w imporcie PsaD między sp1 i WT (dane nie pokazane)³. Jednak przy użyciu opisanych tutaj metod do oceny importu PsaD do chloroplastów wyizolowanych z roślin zestresowanych osmotycznie wykryto wyraźną różnicę. Podczas gdy zaobserwowaliśmy akumulację dojrzałej formy białka w sposób zależny od czasu z obydwoma genotypami, szybkość importu była znacznie niższa dla chloroplastów WT niż dla chloroplastów sp1 (Figura 1), co jest zgodne z naszymi poprzednimi wynikami ³ i ujawnia ważną rolę białka SP1 w regulacji importu chloroplastów PsaD w warunkach stresowych.

Rysunek 1. Test importu białka przeprowadzony przy użyciu chloroplastów wyizolowanych z roślin uprawianych w warunkach stresu osmotycznego. Chloroplasty wyizolowano z 10-dniowego WT (Col-0) i zmutowanych roślin rzodkiewnika sp1 uprawianych w warunkach stresowych (200 mM mannitolu) przez 2 dni. (A) Import białka przeprowadzono przy użyciu [³⁵S]-metioniny znakowanej pPsaD i pozostawiono na 4, 8 i 12 minut przed analizą za pomocą SDS-PAGE i obrazowania luminoforem. Równolegle analizowano 10% kontrolę wejściową pPsaD zawierającą białko translowane in vitro (IVT). Wskazane są prekursorowe (pre) i dojrzałe (matowe) formy pPsaD, podczas gdy pomiędzy nimi znajdują się dwa pasma, które prawdopodobnie odpowiadają skróconym lub proteolizowanym produktom translacji, ponieważ ich intensywność nie zmieniła się w ciągu czasu (*). (B) W celu porównania wskaźników importu do chloroplastów z roślin WT i sp1 uprawianych w warunkach stresu, określono ilościowo intensywność każdego pasma odpowiadającego importowanemu dojrzałemu białku w A. Wszystkie dane są wyrażone w procentach ilości importowanego białka w chloroplastach z roślin WT po 12 minutach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Niedawno wykazaliśmy, że import białka chloroplastowego może być aktywnie regulowany przez stres, który ma kluczowe znaczenie dla funkcji chloroplastów i przetrwania roślin ³. W tym badaniu, aby monitorować takie regulacje, zmodyfikowaliśmy nasze procedury izolacji chloroplastów i testów importowych in vitro , aby umożliwić ocenę zdolności importowej roślin uprawianych w warunkach stresowych. Wyniki wskazują na ważną rolę SP1 w regulacji importu białek chloroplastowych.

W konwencjonalnych testach importowych in vitro wykorzystuje się rośliny uprawiane na standardowym podłożu agarowym MS^6,17,18. W przypadku opisywanego tutaj mutanta sp1 takie konwencjonalne testy nie wykazały żadnych różnic w imporcie białka w stosunku do WT³. Jednak rola SP1 w regulacji importu białka jest wyraźnie widoczna, gdy import białka jest oceniany w warunkach stresu przy użyciu metod opisanych w niniejszym dokumencie (ryc. 1). Chociaż bezpośrednie porównanie danych przywozowych z testu warunków stresowych z danymi uzyskanymi z testów konwencjonalnych może nie być możliwe (ponieważ metody te wykorzystują rośliny uprawiane odpowiednio w kulturze płynnej i na podłożu agarowym), porównanie między warunkami stresowymi i niestresowymi jest wykonalne, pod warunkiem że wszystkie rośliny są uprawiane na tym samym płynnym podłożu hodowlanym, ze stresorami lub bez.

W porównaniu z leczeniem stresu na podłożu agarowym, kultura płynna jest wygodniejsza do leczenia dużej liczby roślin potrzebnych do testów importu in vitro . Ponadto ułatwia równomierne zastosowanie stresora we wszystkich roślinach, co jest szczególnie ważne w przypadku krótkotrwałych zabiegów stresowych. Przedstawiona tutaj metoda została zastosowana do badania stresu osmotycznego za pomocą leczenia mannitolem, ale może być łatwo dostosowana do szerokiego zakresu innych naprężeń; na przykład krótkotrwały stres solny i stres oksydacyjny, dla których odpowiednie czynniki stresogenne mogą być podobnie zastosowane za pomocą ciekłego podłoża MS. W przypadku innych rodzajów naprężeń sugerujemy, aby najpierw zoptymalizować stopień naprężenia; Zbyt surowe zabiegi mogą mieć niekorzystny wpływ na wydajność i/lub kompetencje importowe wyizolowanych organelli.

W protokole jest kilka ważnych kroków, na które należy zwrócić szczególną uwagę, jak opisano poniżej.

Optymalne stężenie agaru dla podłoża MS może się różnić (0,6 - 0,9%, w/v) w zależności od producenta. Dlatego zaleca się empiryczną optymalizację stężenia agaru przed rozpoczęciem eksperymentów. Pożywka nie powinna być tak miękka, aby przyklejała się do tkanki na etapie zbioru (krok 1.9), ani nie powinna być tak twarda, aby hamować rozwój korzeni roślin. Stężenie sacharozy można również dostosować w zależności od wykorzystywanych roślin. Podczas pracy ze szczególnie chorymi mutantami, pożywka MS uzupełniona o 2 - 3% (w/v) sacharozy może pomóc roślinom w lepszym wzroście. Podczas stosowania leczenia stresu nie jest dobrze przenosić bardzo stare rośliny na płynne podłoże (np. >14 dni). Dzieje się tak, ponieważ bardziej rozwinięte korzenie starszych roślin łatwiej ulegają uszkodzeniu podczas przenoszenia.

Jeśli chodzi o system transkrypcji/translacji, istnieją 2 główne systemy: te oparte na kiełkach pszenicy i te oparte na retikulocytach królika. Zestawy te mogą wykorzystywać różne szablony, takie jak zlinearyzowane plazmidy, nielinearyzowane plazmidy lub produkty PCR. Zestawy są również specyficzne dla promotorów T3, T7 i SP6. Należy pamiętać, że polecany przez nas zestaw nadaje się wyłącznie do stosowania z produktami PCR i promotorem T7. Jednak z nieznanych przyczyn niektóre znakowane radioaktywnie preproteiny wytworzone za pomocą tego systemu mogą nie działać skutecznie w teście importowym; W takich przypadkach można rozważyć wypróbowanie systemu ekstraktu z kiełków pszenicy lub systemu lizatu retikulocytów przeznaczonego do matryc plazmidowych. Można również poprawić wynik reakcji transkrypcji/translacji, modyfikując warunki reakcji zgodnie z instrukcją producenta.

Ważne jest, aby rozpocząć izolację chloroplastów wcześnie rano (lub wcześnie w cyklu świetlnym komory wzrostu), aby uniknąć gromadzenia się skrobi wewnątrz chloroplastów w wyniku fotosyntezy, co może utrudniać izolację nienaruszonych organelli. Procedura izolacji chloroplastów musi być wykonana szybko, bez zbędnych opóźnień, a wyizolowane chloroplasty muszą być zawsze przechowywane w niskiej temperaturze. Ma to na celu złagodzenie obserwacji, że izolowane chloroplasty będą stopniowo tracić swoją żywotność, co nie jest dobre. W przypadku korzystania z nowo rozmrożonego buforu CIB lub HMS, należy dobrze wymieszać bufor przed użyciem, aby uzyskać jednorodny roztwór. Optymalne warunki homogenizacji materiału roślinnego zostały ustalone empirycznie i mogą się zmieniać, jeśli stosuje się inny homogenizator tkankowy.

Jeśli różne genotypy roślin zawierają podobne poziomy chlorofilu, oznaczanie ilościowe chlorofilu może być stosowane jako alternatywny sposób normalizacji próbek przed przeprowadzeniem testów importowych. Chlorofil można oznaczyć spektrofotometrycznie po ekstrakcji próbki wyizolowanych chloroplastów w 80% (v/v) wodnym roztworze acetonu ^19,20. Jednakże, jeżeli mają być porównane wielkości przywozu roślin wykazujących różną zawartość chlorofilu (np. mutanty o fenotypach chlorotycznych), należy zastosować liczenie liczby chloroplastów w celu normalizacji próbek chloroplastów w testach przywozu. Szczególnie ważne jest dokładne ponowne zawieszenie chloroplastów w kroku 3.11. Niewystarczająca ilość ponownego zawieszenia może pozostawić agregaty chloroplastów, co utrudni dokładne zliczenie liczb, a tym samym utrudni prawidłowe ładowanie w reakcjach przywozu. Jeżeli pod mikroskopem zaobserwuje się silną agregację (np. agregaty z >10 chloroplastami połączonymi ze sobą), należy kontynuować wytrząsanie próbki chloroplastu na lodzie, aż agregaty zostaną usunięte. Łatwiej jest ponownie zawiesić chloroplasty w mniejszej objętości buforu.

Ważne jest, aby mieć świadomość, że reakcje przywozu białek (sekcja 5) muszą być przeprowadzane z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności ze względu na ich radioaktywny charakter. Niezbędne środki ostrożności obejmują: noszenie rękawiczek jednorazowych, odzieży laboratoryjnej i okularów ochronnych, monitorowanie i odkażanie powierzchni roboczej i sprzętu oraz usuwanie wszystkich odpadów promieniotwórczych w zatwierdzonym pojemniku na odpady. Należy również pamiętać, że prawidłowe ciśnienie osmotyczne ma kluczowe znaczenie dla utrzymania nienaruszonego stanu chloroplastów podczas reakcji importu, a jest to głównie utrzymywane przez bufor HMS. Ponieważ 10x HMS jest lepki, należy go najpierw podgrzać do temperatury pokojowej, a następnie dokładnie wymieszać i nałożyć za pomocą wyciętej końcówki pipety, aby zapewnić dokładny pomiar objętości. W reakcji importu zimna metionina jest dodawana w celu zahamowania włączania wolnej metioniny znakowanej radioaktywnie do niepowiązanych białek chloroplastowych poprzez translację organellarów na etapie inkubacji, podczas gdy BSA jest stosowana w celu zminimalizowania proteolizy, działając jako substrat dla proteaz.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sól bazalna Murashige i Skoog	Melford	M0221
fitoagar	Melford	P1003
Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES)	Melford	B2002
triton X-100	Fisher	BPE151-500
taśma chirurgiczna (e.g., Micropore, 3M)	3M	1530-1
bibuła filtracyjna	Fisher	FB59023
Percoll	Fisher	10607095
Kwas tetraoctowy glikolu etylenowego (EGTA)	Sigma	E4378
kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Fisher	D/0700/53
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy (HEPES)	Tkanina	B2001
(Miracloth)	Calbiochem	475855
Probówka wirówkowa 50 ml	Fisher	CFT-595-040M
Butelka wirówkowa 250 ml	Fisher	CFT-891-V
Polytron (e.g., Kinematica PT10-35)	Sonda Fisher	11010070
Polytron (np. , Kinematica PTA20S)	Fisher	11030083
wirówka (np. , Beckman Coulter Avanti JXN-26, do probówek 50 i 250 ml)	Beckman Coulter	B34182
do 250  Butelki ml (np. , JLA-16.250)	Rotor stałokątowy Beckman Coulter	363930
do 50  Probówki mL (np. , JA-25.50)	Beckman Coulter	363058
do probówek 50 mL (np. , JS-13.1)	Beckman Coulter	346963
znakowany radioizotopowo [35S] metionina	Perkin Elmer	NEG072002MC
bezkomórkowy system translacji oparty na lizacie retikulocytów królika (TNT T7 Szybki zestaw do PCR DNA)	Mikroskop z	L5540
(np. , Nikon Eclipse 80i)	Nikon	niedostępny
hemocytometr (ulepszona komora Neubauer BS748)	Hawksley Technology	AC1000	0,1 mm głębokość, 1/400 mm2
okulary nakrywkowe	VWR	16004-094	22 mm i razy; 22 mm, grubość 0,13-0,17 mm
1,5 ml rurki do mikrofuge	Sarstedt	72.690.001
2 mL probówki do mikrofuge	Starlab	S1620-2700
microfuge (np. , Eppendorf 5415D)	Eppendorf	niedostępny
Spektrofotometr Nanodrop 2000 lub podobny	Thermo Fisher	SPR-700-310L
kwas glukonowy (sól potasowa)	Fisher	22932-2500
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma	A7906
MgATP	Sigma	A9187
metionina	Sigma	M6039
błękit bromofenolowy	Fisher	B/P620/44
glicerol	Fisher	G/0650/17
SDS	Fisher	S/5200/53
Tris Base	Melford	B2005
ditiotreitol (DTT)	Oprogramowanie do analizy obrazu Melford	MB1015
(np. , Aida Image Analyzer)	Raytest	niedostępny