Method Article

Szybkie i wydajne wytwarzanie rekombinowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymianę kasetową za pośrednictwem rekombinazy w locus AAVS1

DOI:

10.3791/54718

⸱

November 20th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stem Cell Institute, Katholieke Universiteit Leuven

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj przedstawiamy szybką i efektywną metodę edycji genów opartą na RMCE w locus AAVS1 ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), która ulepsza poprzednio opisane systemy. Korzystając z tej techniki, linie izogeniczne mogą być szybko i niezawodnie generowane dla prawidłowych badań porównawczych, ułatwiając badania za pośrednictwem transgenezy za pomocą hPSCs.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nawet pomimo rewolucji technologii celowania w geny prowadzonej przez CRISPR-Cas9, genetyczna modyfikacja ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs) jest nadal czasochłonna. Badania porównawcze, w których wykorzystuje się linie rekombinowane z transgenami zintegrowanymi z loci "bezpiecznej przystani", mogą odnieść korzyści z podejść wykorzystujących ukierunkowane rekombinatyzy specyficzne dla danego miejsca, takie jak Cre lub FLPe, które są szybsze i mniej podatne na efekty niezgodne z celem. Takie metody zostały już opisane, chociaż w większości aspektów nie przewyższają znacząco celowania genowego. Używając nukleaz palców cynkowych, wcześniej utworzyliśmy główną linię komórkową w locus AAVS1 o hPSCs, która zawiera kasetę eksprymującą GFP-Hygromycin-tk, otoczoną heterotypowymi sekwencjami FRT. Tutaj opisujemy procedury przeprowadzania wymiany kasetowej za pośrednictwem rekombinazy FLPe (RMCE) przy użyciu tej linii. Główna linia komórkowa jest transfekowana wektorem donorowym RMCE, który zawiera oporność na puromycynę bez promotora, oraz rekombinazą FLPe. Zastosowanie zarówno programu selekcji pozytywnej (Puromycyna), jak i negatywnej (FIAU) prowadzi do wyboru RMCE bez przypadkowych całkowania. RMCE generuje w pełni scharakteryzowane pluripotencjalne poliklonalne linie transgeniczne w 15 d ze 100% wydajnością. Pomimo niedawno opisanych ograniczeń locus AAVS1, łatwość systemu toruje drogę do transgenezy hPSC w warunkach izogenicznych, jest niezbędna do badań porównawczych i umożliwia półwysokoprzepustowe genetyczne badania przesiewowe w celu analizy zysków/strat funkcji, które w przeciwnym razie byłyby bardzo czasochłonne.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ukierunkowana rekombinacja genomu umożliwiła szybki postęp w wielu dziedzinach badań. U myszy synergia między edycją genomu a badaniami nad komórkami macierzystymi pozwoliła na lepsze zrozumienie złożonego mechanizmu funkcji genów i regulacji genów. Oczekuje się, że taki postęp nastąpi również w przypadku ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), chociaż przez wiele lat od pierwszej izolacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC), a następnie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC), edycja genów stanowiła przeszkodę techniczną. Ostatnie postępy w inżynierii genomu przy użyciu ukierunkowanych nukleaz - nukleaz palca cynkowego (ZFN), nukleaz efektorowych podobnych do aktywatorów transkrypcji (TALEN) lub zgrupowanych regularnie rozmieszczonych krótkich powtórzeń palindromicznych / białka 9 związanego z CRISPR (CRISPR / Cas9) pozwoliły nam przezwyciężyć te trudności, sprawiając, że ukierunkowana rekombinacja jest wydajnym procesem 1-3.

Specyficzne loci w genomie myszy, które umożliwiają stabilną, niezawodną i wszechobecną ekspresję transgenu przy braku negatywnych efektów, takich jak Rosa26, Hprt1 czy Col1A1, stały się niezbędnymi narzędziami w przeprowadzaniu badań genetycznych. Loci "bezpiecznej przystani" umożliwiają porównywalną analizę między różnymi liniami myszy w kontekstach izogenicznych. Nie można tego osiągnąć przy użyciu standardowych metod integracji losowej, które są związane z dobrze znanymi ograniczeniami, takimi jak mutageneza insercja, efekty zależne od dawki lub różnorodna ekspresja transgenu. Łatwość i elastyczność edycji genów w loci "bezpiecznej przystani" jest zwiększona dzięki zastosowaniu specyficznych dla miejsca docelowych rekombinacji, takich jak Cre lub Flippase (FLPe), które specyficznie rozpoznają sekwencje docelowe (odpowiednio loxP lub FRT) i katalizują wydajną rekombinację między identycznymi celami. Ze względu na te cechy, edycja genów za pośrednictwem rekombinazy przy użyciu sekwencji loxP lub FRT we wstępnie zintegrowanych loci bezpiecznej przystani jest powszechnym narzędziem stosowanym w transgenezie myszy. Oprócz wprowadzania lub wycinania kasety za pośrednictwem identycznych sekwencji docelowych, zastosowanie niekompatybilnych miejsc loxP lub FRT pozwala na wymianę kasety za pośrednictwem rekombinazy (RMCE)4.

U ludzi przeprowadzono próby zidentyfikowania miejsc bezpiecznej przystani. Mysi ortologiczny HPRT, pomimo jego związku z utratą funkcji, zespołem Lescha-Nyhana, i ROSA26 były celem w hPSC. Doniesiono, że HPRT szybko wycisza ekspresję transgenu w ESC i, podobnie jak ROSA26, jego zdolność do podtrzymywania ekspresji transgenu w terminalnie zróżnicowanych komórkach nie została zbadana 5-7. Ponieważ homozygotyczna mutacja zerowa genu CCR5 wydaje się być dobrze tolerowana przez ludzi, oceniono jej wartość jako bezpiecznej przystani. CCR5 był ukierunkowany i stwierdzono, że utrzymuje stabilną ekspresję transgenu w różnych ludzkich liniach komórkowych, w tym w ESC8,9. Jednak to ostatnie nie zostało udowodnione na poziomie klonalnym podczas długotrwałej hodowli, a wszechobecna ekspresja transgenu nie została wykazana w zróżnicowanym potomstwie trzech listków zarodkowych. AAVS1, naturalne miejsce integracji wirusa związanego z adeno typu 2 (AAV), został również przetestowany w hESC, ze względu na zgłoszoną oporność na wyciszenie transgenu10. Później wiele grup wykorzystało locus AAVS1 i opisało stabilną ekspresję transgenu w niezróżnicowanych hPSC, a także w ich zróżnicowanym potomstwie wszystkich trzech listków rozrodczych, zarówno in vitro, jak i in vivo2,8,11,12. Ostatnie wyniki potwierdzają jednak te ustalenia, ponieważ stwierdzono, że locus AAVS1 wywiera zmienne hamowanie transgenu in vitro w niezróżnicowanych hESC i w potomstwie hepatocytów13.

Dodatkowe badania przesiewowe wykorzystujące metody integracji losowej do określenia integracji pojedynczej kopii miały na celu znalezienie miejsc integracji genomu odpornych na wyciszanie transgenów podczas ekspansji i różnicowania hPSC14,15. Ogólnie rzecz biorąc, do chwili obecnej żadne miejsce genomowe nie zostało w pełni zatwierdzone jako "bezpieczna przystań" u hPSC i ich potomstwa; Identyfikacja odpowiedniego miejsca dla wszechobecnej stabilnej ekspresji transgenu, nie tylko w hPSC, ale także w ich zróżnicowanym potomstwie in vitro i in vivo, pozostaje do rozstrzygnięcia. Spośród wszystkich badanych loci i pomimo swoich ograniczeń, AAVS1 pozostaje najlepiej scharakteryzowanym i najczęściej stosowanym w badaniach nad komórkami macierzystymi.

RMCE zostało pomyślnie przeprowadzone w hPSC w niektórych z tych loci6,7,14,16, głównie przy użyciu rekombinazy Cre, nawet jeśli istnieją przesłanki, że FLPe jest bardziej wydajny niż Cre17. We wszystkich tych przypadkach do selekcji rekombinowanych kolonii użyto jednej kasety z dodatnią lekoopornością. Chociaż procedury te są skuteczne, nie stanowią one postępu technicznego w stosunku do standardowych procedur edycji genów przy użyciu ZFN, TALEN-ów lub CRISPR/Cas9, ponieważ pojedyncza procedura selekcji antybiotyków nie wyklucza losowych integracji i wymaga badań przesiewowych kolonii w celu zidentyfikowania prawidłowo wybranych klonów.

W tej procedurze opisujemy metody wykonywania RMCE w hPSC w locus AAVS1 przy użyciu kombinacji selekcji pozytywnych (w kasecie przychodzącej) i ujemnych (w kasecie preintegrowanej), które pozwalają na wygenerowanie poliklonalnych linii transgenicznych w ciągu ±15 dni ze 100% wydajnością i bez przypadkowych zdarzeń integracyjnych. W związku z tym metoda ta stanowi postęp wykraczający poza obecnie opisane technologie RMCE w hPSC.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie głównej linii komórkowej hPSC zawierającej FRT do transfekcji

  1. Hodowla głównych linii komórkowych hESC/iPSC zgodnie ze standardowymi procedurami na inaktywowanych mysich fibroblastach embrionalnych (iMEF) lub poza nimi przy użyciu odpowiednio hESC lub pożywki iPSC bez podawania (Tabela 1). Przygotuj 2 (na karmnikach) lub 1 (bez karmnika) studzienki hPSC na płytce 6-dołkowej dla każdego warunku doświadczalnego.
  2. Obserwuj kultury, a gdy komórki osiągną 60 - 70% konfluencji, płytka lekooporna iMEF (iDR4). Krótko pokryć niezbędne studzienki 12-dołkowej płytki 0,5 ml 0,1% roztworu żelatyny i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Płytka 125 000 iDR4 na studzienkę i inkubować O/N z pożywką iMEF (Tabela 1).

2. Transfekcja hPSC przez Nucleofekcję

  1. Następnego dnia należy przeprowadzić wstępną inkubację kultur hESC/iPSC ze świeżymi pożywkami, w tym inhibitorem 10 μM kinazy białkowej związanej z Rho (ROCK) (Y-27632), przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Następnie wyjmij roztwór transfekcji hESC z lodówki, aby wstępnie ogrzać go do temperatury pokojowej.
  2. Przygotować 1 ml pożywki do powlekania nukleofekcji (Tabela 1) na każdy warunek nukleofekcji. Zdjąć pożywkę iMEF ze studzienek, przemyć 1 ml PBS o temperaturze pokojowej i dodać 500 μl pożywki do posiewu nukleofekcyjnego. Pozostałe 500 μl przenieść do sterylnych probówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 37 °C do czasu powlekania. UWAGA: Typowy eksperyment RMCE zawiera trzy różne warunki ze stosunkami molekularnymi wektorów RMCE donor:pFLPe wynoszącymi 2:0, 2:1 i 0:1.
  3. Odłączyć hESC/iPSC od zawiesiny pojedynczej komórki.
    1. Zdejmij pożywkę, przemyj ją 2 ml RT PBS i dodaj 1 ml trypsyny 0,05% lub akutazy odpowiednio na hodowlach hPSC podawanych lub niekarmionych. Inkubować przez 7 (trypsyna) lub i 2-5 (akutaza) min w temperaturze 37 °C. W przypadku leczenia preparatem Accutase — komórki muszą pozostać luźne, ale przyczepione.
    2. Ostrożnie wyjąć płytkę z inkubatora i nie dopuszczając do odłączenia komórek, usunąć czynnik dysocjacyjny przez aspirację. Dodać 1 ml pożywki z hESC i oddzielić luźne komórki, delikatnie spłukując podłoże na powierzchni płytki, unikając pienienia. Upewnij się, że komórki znajdują się w zawiesinie pojedynczej komórki.
    3. Zbierz komórki do czystej i sterylnej probówki o pojemności 15 lub 50 ml. Przemyć studzienki 1 ml pożywki hESC i zebrać komórki w tej samej probówce o pojemności 15 lub 50 ml. Pobrać porcję o pojemności 50 μl do zliczenia (w następnym kroku) za pomocą urządzenia do liczenia komórek. Zanotuj objętość kolekcji i oblicz całkowitą liczbę komórek. Wiruj komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Zawiesić osad komórkowy do zawiesiny 10-6 komórek/ml z PBS za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml i delikatnego pipetowania. Unikaj pienienia. Przenieś 2 ml na warunki eksperymentalne (około 2 x 106 komórek) do czystych, sterylnych probówek o pojemności 15 ml.
  5. Podczas wirowania należy przygotować mieszaniny plazmidów RMCE donor-pFLPe w maksymalnej objętości 10 μl.
    1. Przenieś 2,5 μg pFLPe (6,5 Kb) do czystej, sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml. Dodaj stosunek molekularny wektora dawcy RMCE13 2:1 do wektora pFLPe. Na przykład około 10 μg wektora dawcy RMCE o wartości 12 Kb.
  6. Kontynuuj nukleofekcję, unikając pienienia się na wszystkich etapach.
    UWAGA: Niektóre protokoły transfekcji hPSC stosują dodatkowy etap wyczerpywania się iMEF przed krokiem 2.4. Jednak w praktyce iMEF jest niewielką frakcją komórkową w pojedynczej zawiesinie, która nie zmienia znacząco wydajności transfekcji ani nie tworzy zanieczyszczających komórek rekombinowanych, ponieważ nie są one proliferacyjne. Ponadto ważne jest, aby postępować szybko podczas procesu transfekcji, aby zwiększyć żywotność. Z tych powodów nie stosuje się zubożenia iMEF.
    1. Wyjąć z inkubatora płytkę iDR4 i probówki o pojemności 1,5 ml z podłożem galwanicznym. Ostrożnie odpipetować jedną rurkę na raz, nie naruszając osadu komórkowego. Usuń jak najwięcej. Zawiesić osad ze 100 μl roztworu do transfekcji, delikatnie pipetując. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej mieszaniny plazmidów i delikatnie wymieszać.
    2. Przenieś mieszaninę komórka-DNA do kuwety transfektora, uważając, aby nie wprowadzać pęcherzyków. Wprowadzić kuwetę do urządzenia nukleofektorowego i zastosować program A13 (komórki hodowane na karmnikach) lub F16 (bez podajnika).
      UWAGA: Inne metody transfekcji lub urządzenia nukleofektorowe mogą wymagać optymalizacji tych programów lub warunków transfekcji.
    3. Ponownie pobrać kuwetę i za pomocą jednorazowych pipet transferowych dostępnych w zestawie do nukleofekcji zebrać jej zawartość, nakładając 0,5 ml podłoża galwanicznego i odsysając całą objętość. Wykonaj ten krok szybko, ale delikatnie i jednym ruchem.
    4. Płytkę do kropli w płytce 12-dołkowej zawierającej iDR4 i 500 μl podłoża galwanowego. Powtórzyć kroki 2.6.1 - 2.6.4 dla następnego warunku doświadczalnego.
  7. Umieść naczynie hodowlane na półce w inkubatorze i przesuwaj je powoli do przodu i do tyłu oraz na boki, aby równomiernie rozprowadzić zawiesinę komórkową. Inkubować go przez 24 godziny przed następną zmianą pożywki, aby umożliwić komórkom regenerację w obecności inhibitora 10 μM ROCK (Y-27632).

3. Pozytywny i negatywny wybór komórek poddawanych RMCE

  1. Zmieniaj pożywkę hodowlaną codziennie (1 ml / dołek) i 2 - 3 dni po transfekcji, rozpocznij selekcję od 100 ng / ml puromycyny.
    UWAGA: Optymalne stężenia odczynników selekcji dodatniej i ujemnej należy określić doświadczalnie dla każdej nowo wygenerowanej głównej linii komórkowej hPSC. Wykonać krzywą zabijania13, używając głównej linii komórkowej w celu określenia niskiej dawki (stężenie, przy którym minimalna toksyczność wzrokowa jest widoczna po 7 dniach selekcji, ale hodowla nie jest przerośnięta), dawki optymalnej (najniższe stężenie, przy którym wszystkie komórki są martwe po 7 dniach selekcji) i wysokiej dawki (stężenie, które spowodowało wyraźną toksyczność, zabijanie wszystkich komórek po 2 - 3 dniach) zarówno dla puromycyny, jak i fialurydyny (FIAU).
    1. Odessać pożywkę z jądrowym zawartością macierzy macierzystych macierzystych macierzystych komórek macierzystych. Przemyć 1 ml PBS. Dodać pożywkę z hESC ze 100 ng/ml puromycyny.
  2. Obserwuj wzrost komórek, aby śmierć i wzrost były zrównoważone. Zmieniaj pożywkę z puromycyną codziennie, postępując zgodnie z krokiem 3.1.1. Gdy tempo wzrostu przewyższa śmierć komórki, zwiększ stężenie puromycyny w blokach 25 - 50 ng/ml do maksimum 250 ng/ml. Kontynuuj selekcję puromycyny przez 5 - 7 dni.
  3. 3 - 4 dni po rozpoczęciu selekcji puromycyny, około 6 dnia po transfekcji, rozpocznij selekcję od 0,5 μM FIAU. Zmieniaj nośnik codziennie i utrzymuj FIAU nie dłużej niż 7 nieprzerwanych dni.

4. Rozbudowa i charakterystyka linii RMCE

  1. Po zakończeniu selekcji, około D14 - 15, obecne są odporne kolonie RMCE, które tworzą nową linię RMCE. Podzielić luzem w stosunku 1:2 zgodnie ze standardowymi procedurami (przejście 1, P1).
  2. Płytka 2 dołki na płytce 12-dołkowej (podawanie lub wyłączanie, w zależności od normalnych warunków hodowli oryginalnej linii komórek macierzystych). Jednego dołka należy używać do dalszej rozbudowy, przechowywania lub konfiguracji eksperymentalnej (w tym protokole nie ma dodatkowego opisu tych procedur), a drugiego do charakterystyki.
  3. Gdy komórki z P1 są gotowe do podziału, należy rozdzielić studzienkę w celu scharakteryzowania na zawiesinę pojedynczej komórki, jak opisano w ppkt 2.4 i zebrać komórki w probówce o pojemności 15 ml. UWAGA: Do charakterystyki należy użyć komórek z hPSC WT (brak modyfikacji genetycznej) i głównej linii komórkowej jako kontroli negatywnej i pozytywnej, odpowiednio.
  4. Wirować w dół przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić w 1 ml PBS i podzielić próbkę na dwie części w celu cytometrii przepływowej i analizy DNA13.
  5. Analiza metodą cytometrii przepływowej13 (300 μL):
    1. Dodać płodową surowicę cielęcą do komórek w PBS do końcowego stężenia 5%. Przenieś komórki do czystej probówki FACS z sitkiem do komórek i trzymaj je na lodzie.
      UWAGA: Żywotność komórek jest wysoka w tych warunkach, więc możliwe, ale nie jest to konieczne, użycie barwnika fluorescencyjnego dla komórek niezdolnych do życia (np. 7-AAD lub PI).
    2. Przejdź natychmiast do analizy w analizatorze komórek cytometru przepływowego i zarejestruj 20 000 - 30 000 zdarzeń. Do analizy należy ustawić bramki powyżej kwitnienia tła GFP lub tdT przy użyciu próbki kontroli ujemnej WT.
  6. Analiza DNA13 (700 μL):
    1. Przenieś komórki do czystej probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i zassać supernatant. Przystąp do ekstrakcji DNA za pomocą komercyjnego zestawu i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowywać suchy granulat w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy.
  7. Zmierz stężenie DNA.
    1. Przygotować standardowe reakcje PCR zgodnie z warunkami przedstawionymi na rysunku 3 i w tabeli 213. Próbki PCR należy przeprowadzić na 2% żelu agarozowym zawierającym 1x barwnik żelowy DNA pod napięciem 150 V przez 15 - 25 minut. Przeanalizuj przebieg w analizatorze żelu.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z ZNFów specyficznych dla AAVS1, wygenerowano i opisano w pełni scharakteryzowane linie komórek macierzystych hESC/iPSC zawierające heterotypowe sekwencje docelowe FRT13. Linie komórek macierzystych zawierające FRT zachowały pluripotencję i integralność genomu po leczeniu ZFN oraz stabilnie eksprymowały GFP in vitro i in vivo. RMCE przeprowadza się przez kotransfekcję głównych linii komórkowych z rekombinazą FLPe i wektorami donorowymi RMCE (Figura 1A). Wektory RMCE zawierają identyczne sekwencje FRT do tych w głównej linii komórkowej AAVS1 flankującej transgen. Rysunek 1B monitoruje RMCE przy użyciu konstytutywnie wyrażającego tdT pZ:F3-P CAGGS tdTPH-F. Po transfekcji hPSC tworzy małe grupy komórek równomiernie rozmieszczonych w warstwie iDR4 MEF, a transfekowane hPSC wyrażają zarówno GFP, jak i przejściowe tdT (Figura 1B, D 2). Komórki mogą się zregenerować przez 2 - 3 dni po transfekcji przed rozpoczęciem selekcji. Selekcja pozytywna rozpoczyna się najpierw przy użyciu niskiej dawki puromycyny w celu faworyzowania insercji dawcy RMCE. Puromycyna jest stosowana delikatnie na początku, ponieważ początkowa masywna śmierć komórki może prowadzić do rekombinacji pojedynczych komórek, co uniemożliwi im przetrwanie tego procesu. W ciągu następnych dni stężenie puromycyny należy stopniowo zwiększać do optymalnej dawki, aby umożliwić rekombinowanym komórkom wzrost w małe kolonie, podczas gdy komórki nierekombinowane stopniowo umierają.

3 - 4 d po zainicjowaniu selekcji pozytywnej (około D 6 po transfekcji), rozpoczyna się selekcja negatywna w celu selekcji tylko dla zdarzeń rekombinacji, w których pośredniczy FRT. RMCE powoduje utratę samobójczego genu kinazy tymidynowej (Tk), a tym samym wrażliwość na Fialurydynę (FIAU). Selekcja negatywna zastosowana w tym momencie, w której małe skupiska 2 - 4 komórek GFP-/tdT+ (RMCE) są w stanie wytrzymać optymalne stężenia FIAU (Figura 1B, D 6), zapobiega przypadkowej integracji, ponieważ w takich przypadkach gen Tk w locus AAVS1 pozostaje nienaruszony. Wystąpienie jednoczesnej integracji za pośrednictwem FRT i integracji losowej jest wysoce mało prawdopodobne, o czym świadczy brak przypadkowych zdarzeń integracji w późniejszym okresie charakterystyki (Rysunek 2B).

Mieszane kolonie RMCE GFP-/tdT+ nadal rosną, stając się coraz bardziej jednorodne, tak że po D 9 - 10 można znaleźć nie w pełni wybrane mieszane kolonie RMCE (Rysunek 1B). Kolonie GFP-/tdT+ RMCE są obecne tylko wtedy, gdy używany jest zarówno dawca RMCE, jak i FLPe (2:1), podczas gdy RMCE nie występuje przy braku FLPe (2:0). Pełna selekcja z FIAU do 13 - 15 dnia po transfekcji prowadzi do uzyskania jednorodnej kultury GFP-/tdT+. RMCE daje średnio 12,8 ± 6,8 (n = 6) kolonii PuroR/FIAUR w ciągu 15 dni13. Charakterystyka cytometrii przepływowej nowo wygenerowanej linii RMCE (kolonie PuroR / FIAUR RMCE połączone w populację komórek nieklonalnych) potwierdza, że 100% komórek wykazuje fenotyp RMCE GFP-/tdT+ (figura 2A). W przypadku użycia dawców RMCE bez konstytutywnej ekspresji reportera fluorescencyjnego, otrzymana linia hPSC PuroR/FIAUR RMCE jest jednorodnie GFP-.

Charakterystyka PCR nieklonalnej linii RMCE pokazuje pełną wymianę kasety (nie można wykryć żadnych śladów kasety głównej linii komórkowej) oraz że użyty program selekcyjny generuje losowe linie wolne od całkowania (zarówno dawcy RMCE, jak i wektora wyrażającego FLPe) (Rysunek 2B). Wyniki te zostały dodatkowo udowodnione przez southern blot, a ponadto wykazaliśmy, że linie RMCE pozostają pluripotencjalne13. To sprawia, że nie jest już konieczne przeprowadzanie ani oceny losowej integracji całego genomu, ani testu pluripotencji podczas rutynowych eksperymentów RMCE. Podsumowując, przy użyciu tego protokołu, transgeniczne linie komórkowe hPSC w locus AAVS1 wolne od losowej integracji mogą być łatwo generowane w 15 d ze 100% wydajnością i bez potrzeby obszernej charakterystyki.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczny przegląd RMCE. (A) Kalendarium programu wyboru RMCE. Po lewej: główna linia komórkowa (MCL), zawierająca kasetę flankowaną FRT (trójkąty), które wyrażają GFP i Hygromycynę-tk (połączone samorozszczepiającymi peptydami 2A), jest transfekowana przez nukleofekcję (NF) z wektorem eksprymującym FLPe i wektorem donorowym RMCE, który zawiera gen oporności na puromycynę bez promotora (akceptor splicingu - SA- PuroR) i zmienną kasetę eksperymentalną (X). Po prawej: nowa linia RMCE (RMCEL) uzyskana po zakończeniu selekcji z Puromycyną (czerwony trójkąt) i FIAU (niebieska linia). (B) RMCE przy użyciu konstytutywnego dawcy wykazującego ekspresję tdT i różnych proporcji DNA dawcy i DNA FLPe (0:1, 2:1, 2:0) monitorowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (GFP - zielona fluorescencja, tdT - czerwona fluorescencja) w różnych punktach czasowych. D 2 i 6: podziałki liniowe reprezentują 100 μm. D 10: podziałki reprezentują 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Charakterystyka linii RMCE. (A) Oznaczanie RMCE za pomocą cytometrii przepływowej. Ekspresję GFP i tdT pokazano dla linii WT, głównej linii komórkowej (MCL) i nowo wygenerowanej linii RMCE w D 15 po nukleofekcji przy użyciu konstytutywnego wektora ekspresji tdT (CAGGS tdT) lub dawców z GFP napędzanym przez promotor GOOSECOID (GSCp GFP, ostateczny marker endodermy) lub promotor AAT (APOeAATp GFP, marker hepatocytów). (B) Potwierdzenie RMCE (5'/3' JA RMCEL), brak kasety głównej linii komórkowej (MCL) (5'/3' JA MCL) i brak losowej integracji (5'/3'/FLPe RI) przez PCR przy użyciu przedstawionych par starterów. Użyto DNA z linii WT, MCL, RMCE (1 - 5), wektora RMCE dawcy (+RI), wektora eksprymującego FLPe i bez kontroli matrycy (NTC). Rysunek zmodyfikowany z (Ordovas i in., 2015)13. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Generowanie głównej linii komórkowej odpowiedniej dla RMCE i porównanie celowania genów z RMCE w AAVS1. Po lewej: Celowanie genowe wykorzystuje niezmodyfikowane komórki WT, które są kotransfekowane z dawcą (kaseta opisana na rysunku 1A do generowania głównej linii komórkowej, MCL) i specyficznymi zoptymalizowanymi ZFN. Proces do wykonania pełnej charakterystyki trwa do 3 miesięcy. Po prawej: RMCE wykonuje się przez kotransfekcję donora z wektorami FLPe, a w pełni scharakteryzowana linia jest generowana w ciągu 15 d. Skuteczność celowania genów w AAVS1 pochodzi z poprzednich badań1,2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

mediaSkładnikiKońcowe stężenie
średni hESCDMEM-F12, HEPES80%
Pożywka zastępcza dla surowicy20%
L-glutamina146 mg/ml
Roztwór aminokwasów endogennych MEM (100x)1x
2-merkaptoetanol0,1 mM
Penicylina/Streptomycyna0,1 %
Podstawowe FGF u ludzi4 ng/ml
pożywka hodowlana iMEFDMEM Wysoki poziom glukozy
Płodowa surowica bydlęca (FBS)15%
Penicylina-Streptomycyna0,1 %
L-Glutamina 200 mM4 mM
Roztwór aminokwasów endogennych MEM (100x)2x
2-merkaptoetanol0,1 mM
Medium do powlekaniaPożywka dla hESCW 100%
Inhibitor ROCK (Y-27632)10 μM

Tabela 1. Kompozycja medialna.

TestNaprzódOdwróconyWzmacniacz Cykl PCR
5'JA MCLCACTTTGAGCTCTACTGGCTTCCGTTACTATGGGAACATACGTCA1,1 KB95 ºC, 5' – [95 ºC, 30'' – 68 ºC (-0,5 ºC/cykl), 1' 30'']X15 – [95 ºC, 30'' – 58 ºC, 30'' – 72 ºC, 1' 30'']X25 – 72 ºC, 5'
3'JA MCLTAACTGAAACACGGAAGGAGAAGGCAGCCTGGTAGACA1,4 KB95 ºC, 5' – [95 ºC, 30'' – 68 ºC (-0,5 ºC/cykl), 1' 30'']X15 – [95 ºC, 30'' – 58 ºC, 30'' – 72 ºC, 1' 30'']X25 – 72 ºC, 5'
5'JA RMCELCACTTTGAGCTCTACTGGCTTCCATGTTAGAAGACTTCCTCTGC1,1 KB95 ºC, 5' – [95 ºC, 30'' – 68 ºC (-0,5 ºC/cykl), 1' 30'']X15 – [95 ºC, 30'' – 58 ºC, 30'' – 72 ºC, 1' 30'']X25 – 72 ºC, 5'
3'JA RMCELTTCACTGCATTCTAGTTGTGGAAGGCAGCCTGGTAGACA1,5 KB95 ºC, 5' – [95 ºC, 30'' – 68 ºC (-0,5 ºC/cykl), 1' 30'']X15 – [95 ºC, 30'' – 58 ºC, 30'' – 72 ºC, 1' 30'']X25 – 72 ºC, 5'
5'RI DAWCAGTACTTTGGGGGGGTCCAGTTGTAAAACGACGGCCAG0.5 Kb95 ºC, 5' – [95 ºC, 30'' - 60 ºC, 30'' - 72 ºC, 30'']X25 – 72 ºC, 5'
DAWCA 3'RICCTGAGTTCTAACTTTGGCTCACACAGGAAACAGCTATGAC0.5 Kb95 ºC, 5' – [95 ºC, 30'' - 60 ºC, 30'' - 72 ºC, 30'']X25 – 72 ºC, 5'
RI FLPeCCTAGCTACTTTCATCAATTGTGGTATGCTTCCTTCAGCACTAC0.65 KB95 ºC, 5' – [95 ºC, 30'' - 60 ºC, 30'' - 72 ºC, 30'']X25 – 72 ºC, 5'

Tabela 2. Zestawy starterów używane do genotypowania PCR. Zmodyfikowano na podstawie Ordovas et al., 201513.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metody edycji genów w loci "bezpiecznej przystani" pozostają podstawowym narzędziem rozwoju transgenezy w komórkach komórek macierzystych. Chociaż charakter AAVS1 jako bezpiecznej przystani został ostatnio zakwestionowany w odniesieniu do niektórych zastosowań13,18, locus ten pozostaje obecnie najlepiej scharakteryzowany w liniach komórkowych pochodzących od człowieka. Świadomość jego ograniczeń w hPSC może pomóc w uzyskaniu wiarygodnych danych. W związku z tym oczekuje się, że AAVS1 będzie nadal użytecznym miejscem, na przykład do badań nad zyskiem i utratą funkcji lub indukowalną/konstytutywną ekspresją czynników, które wymagają kontekstu izogenicznego w obrębie określonych środowisk genetycznych i pomiędzy nimi.

Locus AAVS1 był celem wielu grup korzystających z ZFNs, TALEN lub CRISPR/Cas91,2,19. Nukleazy te znacznie zwiększają efektywność rekombinacji homologicznej w określonym locus. Jednak proces badania przesiewowego i pełnego scharakteryzowania prawidłowo wybranych klonów, wolnych od losowej integracji oraz utrzymania pluripotencji i integralności genomu, może trwać do 3 miesięcy (przy użyciu zoptymalizowanych narzędzi do edycji genów) (Figura 3). Ostatnie dwa mogą być spowodowane możliwymi mutacjami generowanymi przez aktywność nukleazy poza celem. Zastosowany tutaj system RMCE oferuje jednak szybką, wydajną i elegancką metodę osiągnięcia tego celu w ciągu zaledwie dwóch tygodni, po wstępnej integracji sekwencji docelowych specyficznych dla rekombinazy z locus AAVS1 . Zastosowanie selekcji pozytywnej/negatywnej oraz odpowiedniego programu selekcji to główne czynniki przyczyniające się do uproszczenia edycji genów w locus AAVS1 przez RMCE.

Charakterystyka genotypowa nowych linii transgenicznych jest znacznie zmniejszona (nie jest konieczne badanie klonalne), a charakterystyka związana z aktywnością nukleazy poza celem staje się zbędna ze względu na specyficzność FLPe dla FRT. Charakterystyka może być również zmniejszona w rutynowych eksperymentach RMCE, wykazując całkowitą utratę ekspresji GFP z głównej linii komórkowej (Figura 2A), ponieważ pełna wymiana kasety i brak losowej integracji zostały już wystarczająco wykazane przez PCR (Figura 2B) i Southern blot13. Główną różnicę w stosunku do poprzednich sprawozdań stanowi również zastosowanie selekcji pozytywnej/negatywnej. Kilka grup, które wcześniej opisywały RMCE w hPSC, zarówno w AAVS1 , jak i w innych loci, stosowało tylko jeden etap selekcji pozytywnej7,14,16. Nie stanowi to głównej przewagi technicznej nad edycją genów wykonywaną za pomocą nukleaz, ponieważ badania przesiewowe kolonii muszą być przeprowadzane w równym stopniu, aby wykazać prawidłową integrację i brak przypadkowej integracji na poziomie klonalnym.

Zastosowanie tego systemu RMCE w wielu liniach hESC/iPSC wymaga wstępnej integracji opisanej kasety zawierającej FRT w locus AAVS1 każdej niezależnej linii. Jednak po wygenerowaniu, jego szybkość i prostota umożliwia opracowanie półwysokoprzepustowych genetycznych badań przesiewowych w określonych warunkach izogenicznych dla wyżej wymienionych zastosowań, które w przeciwnym razie byłyby technicznie bardzo czasochłonne. Ponadto wszystkie wektory RMCE są zbudowane w wektorze ukierunkowanym na gen pZ AAVS1 używanym do celowania w locus za pomocą ZFN, ale zgłoszono również TALEN-y lub CRISPR/Cas9. Dwoistość wektora RMCE jest bardzo przydatna do generowania wielu linii dla określonego transgenu w hPSC z FRT lub bez niego. Na przykład, jedno trafienie, które okazało się skuteczne w określonym genetycznym badaniu przesiewowym przeprowadzonym przez RMCE, w idealnym przypadku musiałoby zostać przetestowane na wielu liniach hPSC w celu potwierdzenia wyników. W przypadku braku wielu linii komórek macierzystych odpowiednich dla RMCE, można przeprowadzić bezpośrednie celowanie w gen trafienia za pomocą nukleaz. Użyteczność dwoistego charakteru wektorów RMCE została udowodniona przez naszą grupę20. W tym badaniu korekcję genów przeprowadzono w iPSC otępienia czołowo-skroniowego (FTD) pochodzących od pacjentów, które są nosicielami mutacji powodującej niedobór ekspresji progranuliny (PGRN). Komplementacja genów przez insercję za pośrednictwem ZFN w locus AAVS1 kasety, która przywróciła poziomy PGRN , skorygowała wadliwy fenotyp w kortykogenezie związany z obecnością mutacji. Dodatkowo, porównywalna linia została wygenerowana przez RMCE w hESC WT do wykorzystania jako kontrola egzogennej ekspresji PGRN .

W przypadku braku rekombinowanych kolonii należy sprawdzić skuteczność transfekcji wektora dawcy RMCE. Wydajność transfekcji wyższa niż 30% daje wyniki wskazane powyżej. Niższa wydajność transfekcji zmniejsza wydajność rekombinacji. Wreszcie, system RMCE został wygenerowany w locus AAVS1 , ale ma zastosowanie do każdego innego locus.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L.O. został ufundowany przez IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04 i Rząd Aragonii FMI048/08; RB przez stypendium IWT SB-121396; M.P. przez FWO 1288714N; i R.S. przez Holenderską Fundację Diabetologiczną. N.H., J.V., K.C. i Q.C. byli wspierani przez stypendia IWT odpowiednio SB-121396, SB-101230, SB-91228 i SB-093228. Finansowanie dla C.M.V. pochodziło z FWO G.0667.07, G.0975.11 i KU Leuven (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO (266777).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DR4 Mysie fibroblasty embrionalne (MEF)AMS bioGSC-6204GHodowla hPSC na karmnikach
CF-1 MEF, mitomycyna C traktowana AMSBioGSC-6001M
EmbryoMax 0,1% roztwór żelatynyMiliporeES-006-BiMEF posiew,
DMEM/F-12, HEPESGibco31330-038
Wymiana surowicy nokautującej

Gibco10828-028
L-GlutaminaSigma AldrichG8540Dla podłoża hESC
L-glutamina, 200 mMGibco25030-081Dla pożywki iMEF
2-merkaptoetanol, 50  mMGibco31350-010
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)Gibco11140-035
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Gibco15140122
Zasada ludzka FGFPeprotech100-18C
Y-27632 w roztworzeVWR688001-500
DMEM o wysokiej zawartości glukozyGibco41965-039 
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Sigma AldrichF7524
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaGibco25300-054Hodowla hPSC na karmnikach
Matrigel, z kwalifikacją hESCVWR734-1440
mTeSR1 kompletny zestaw pożywkiTechnologie komórek macierzystych05850Do hodowli bez karmnika
Odczynnik do dysocjacji komórek StemPro AccutaseGibcoA1110501Do hodowli bez karmnika
Y-27632 w roztworzeVWR56726
Zestaw nukleofektorów ludzkich komórek macierzystych 2LonzaVVPH-5022
Dichlorowodorek puromycynyGibcoA11138-03
FIAU (Fialurydyna)ABX2910
Hygromycyna BSigma AldrichH3274
pFLPeZmodyfikowany do z pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) w celu usunięcia dawców puromycyny
RMCE-Zmodyfikowany z wektora < dawcy pZ em>AAVS1 < / em>puromycyny (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich) 13
5 mL Probówka z polistyrenu z okrągłym dnem, z sitkiem do komórekFalcon352235
Zestaw PureLink Genomic DNAInvitrogen
Polimeraza DNA GoTaq FlexiPromegaM8298
AgarozaSigmaA9539
SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNAInvitrogenS33102
Urządzenie Nucleofector 2bLonza (Amaxa)AAB-1001
NucleoCounter NC-100ChemometecNC-100
BD FACS CantoBD Nauki biologiczne337175
Kaseta nukleotynowaChemometec941-0002
K182001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat. Biotechnol. 29 (8), 731-734 (2011).
  2. Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 27 (9), 851-857 (2009).
  3. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  4. Baer, A., Bode, J. Coping with kinetic and thermodynamic barriers: RMCE, an efficient strategy for the targeted integration of transgenes. Curr. Opin. Biotechnol. 12 (5), 473-480 (2001).
  5. Sakurai, K., et al. Efficient integration of transgenes into a defined locus in human embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 38 (7), e96(2010).
  6. Irion, S., et al. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  7. Di Domenico, A. I., Christodoulou, I., Pells, S. C., McWhir, J., Thomson, A. J. Sequential genetic modification of the hprt locus in human ESCs combining gene targeting and recombinase-mediated cassette exchange. Cloning Stem Cells. 10 (2), 217-230 (2008).
  8. Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat. Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
  9. Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nat. Biotechnol. 25 (11), 1298-1306 (2007).
  10. Simth, J. R., et al. Robust , Persistent Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Is Achieved with AAVS1-Targeted Integration. Stem Cells. 26, 496-504 (2008).
  11. DeKelver, R. C., et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome. Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).
  12. Qian, K., et al. A simple and efficient system for regulating gene expression in human pluripotent stem cells and derivatives. Stem Cells. 32 (5), 1230-1238 (2014).
  13. Ordovás, L., et al. Efficient Recombinase-Mediated Cassette Exchange in hPSCs to Study the Hepatocyte Lineage Reveals AAVS1 Locus-Mediated Transgene Inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
  14. Du, Z. -W., Hu, B. -Y., Ayala, M., Sauer, B., Zhang, S. -C. Cre recombination-mediated cassette exchange for building versatile transgenic human Embryonic Stem Cells lines. Stem Cells. 27, 1032-1041 (2009).
  15. Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high β-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29 (1), 73-78 (2011).
  16. Ramachandra, C. J., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange at the AAVS1 locus in human embryonic stem cells using baculoviral vectors. Nucleic Acids Res. 39 (16), e107(2011).
  17. Takata, Y., Kondo, S., Goda, N., Kanegae, Y., Saito, I. Comparison of efficiency between FLPe and Cre for recombinase-mediated cassette exchange in vitro and in adenovirus vector production. Genes to Cells. 16 (7), 765-777 (2011).
  18. Mizutani, T., Li, R., Haga, H., Kawabata, K. Transgene integration into the human AAVS1 locus enhances myosin II-dependent contractile force by reducing expression of myosin binding subunit 85. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465 (2), 270-274 (2015).
  19. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  20. Raitano, S., et al. Restoration of progranulin expression rescues cortical neuron generation in an induced pluripotent stem cell model of frontotemporal dementia. Stem Cell Reports. 4 (1), 16-24 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Recombinase mediated Cassette ExchangeAAVS1 LocusHuman Pluripotent Stem CellsFLPe RecombinasePuromycin SelectionFIAU SelectionNucleofection TechniqueFlow Cytometry AnalysisPCR CharacterizationIsogenic Settings

Related Articles