Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowana kwantyfikacja i analiza procedur zliczania komórek za pomocą wtyczek ImageJ

DOI:

10.3791/54719

⸱

17 listopada 2016

 ,  , 
1Department of Biology, York University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje kwantyfikację hemocytometru i mikrofotografii migracji/inwazji za pomocą dwóch nowych wtyczek ImageJ o otwartym kodzie źródłowym: Kalkulatora Stężenia Komórek i Licznika Testu Migracji. Ponadto opisano w nim protokoły akwizycji i kalibracji obrazu, a także szczegółowo omówiono wymagania wejściowe wtyczek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ImageJ Narodowego Instytutu Zdrowia to potężny, swobodnie dostępny pakiet oprogramowania do przetwarzania obrazów. ImageJ posiada kompleksowe algorytmy analizy cząstek, które mogą być skutecznie wykorzystywane do liczenia różnych cząstek biologicznych. Podczas liczenia dużej liczby próbek komórek hemocytometr stanowi wąskie gardło w odniesieniu do czasu. Podobnie, liczenie błon z testów migracji/inwazji za pomocą wtyczki ImageJ Cell Counter, choć dokładne, jest wyjątkowo pracochłonne, subiektywne i niesławne z powodu powodowania bólu nadgarstka. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowaliśmy dwie wtyczki w ramach ImageJ do wyłącznego zadania automatycznego hemocytometru (lub znanej objętości) i zliczania komórek migracji/inwazji. Obie wtyczki opierają się na możliwości pozyskiwania wysokiej jakości mikrofotografii przy minimalnym tle. Są łatwe w użyciu i zoptymalizowane pod kątem szybkiego liczenia i analizy dużych rozmiarów próbek z wbudowanymi narzędziami analitycznymi, które pomagają w kalibracji zliczeń. Łącząc podstawowe zasady licznika komórek z automatycznym algorytmem zliczania i analizą po zliczeniu, znacznie zwiększa to łatwość, z jaką można przetwarzać testy migracji bez utraty dokładności.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liczenie komórek in vitro jest ważną podstawową techniką w szerokim zakresie eksperymentów z hodowlami tkankowymi. Dokładne określenie liczby komórek w hodowli ma zasadnicze znaczenie dla odtwarzalności doświadczalnej i standaryzacji1,2. Liczenie komórek można przeprowadzić ręcznie za pomocą hemocytometru, a także przy użyciu różnych metod automatycznych, z których każda ma swoje zalety i wady3,4,5. Większość zautomatyzowanych metod liczenia komórek należy do jednej z dwóch klas, tych, które wykorzystują zasadę Coultera lub cytometrię przepływową. Liczniki redlic wykorzystują opór elektryczny komórek do określania liczby i wielkości komórek. Są szybkie, dokładne i tańsze niż cytometry przepływowe. Jednak są one rzadko używane tylko do zliczania komórek ze względu na ich znaczny koszt w porównaniu z liczeniem ręcznym3. Z drugiej strony cytometry przepływowe są drogie, ale mają wiele zastosowań, takich jak zliczanie komórek, analiza kształtu, struktury komórek i pomiar wewnętrznych markerów komórkowych4,5. Maszyny, które wykorzystują jedną z tych dwóch zasad, są dostępne u wielu producentów. Liczenie ręczne jest niedrogie, ale czasochłonne i podatne na błędy, podczas gdy metody automatyczne zajmują ułamek czasu potrzebnego na liczenie ręczne, ale przy użyciu drogich maszyn6.

Inne popularne procedury hodowli komórek to testy ruchliwości komórek in vitro, a mianowicie migracja komórek i inwazja7. Testy migracji i inwazji są powszechnie stosowane do badania ruchliwości i inwazyjności komórek w odpowiedzi na odpowiedź chemotaktyczną. Ponadto są szeroko stosowane do badania rozwoju embrionalnego, różnicowania, odpowiedzi zapalnej i przerzutów wielu typów komórek7-11. Komórki, które migrowały lub zostały zaatakowane przez porowatą błonę testu migracji, można określić ilościowo na dwa różne sposoby. Po pierwsze, poprzez barwienie komórek barwnikiem fluorescencyjnym, dysocjację od błony i kwantyfikację za pomocą czytnika fluorescencyjnego12. Ograniczeniem tej metody oznaczania ilościowego jest to, że nie można zachować żadnych zapisów dotyczących błon i nie ma możliwości dalszej analizy13. Druga metoda oznaczania ilościowego polega na utrwaleniu migrowanych/zaatakowanych komórek i wybarwieniu ich barwnikiem fluorescencyjnym lub, częściej, barwnikami cytologicznymi, takimi jak fiolet krystaliczny, barwnik błękitu toluidynowego lub hematoksylina; Następnie komórki są oznaczane ilościowo ręcznie za pomocą odwróconych obrazów mikroskopowych tych błon, co jest bardzo czasochłonnym zadaniem12,13.

Aby przezwyciężyć wady ręcznego liczenia komórek, opracowano dwa niezawodne i dokładne automatyczne liczniki komórek do koncentracji komórek i do testu migracji. Te zautomatyzowane algorytmy licznika komórek zostały opracowane dla ImageJ jako wtyczka wykorzystująca język komputerowy Java firmy Oracle. ImageJ jest publicznym i szeroko stosowanym narzędziem do przetwarzania obrazów opracowanym przez National Institute of Health (NIH)14,15; w ten sposób napisanie tych wtyczek dla ImageJ ułatwia łatwą integrację ze społecznością biologiczną.

Automatyzacja liczenia komórek zapewnia wysoką przepustowość i powtarzalność w porównaniu do liczenia ręcznego. Chociaż inne dostępne programy i wtyczki mogą być używane do obliczania stężenia komórek poprzez analizę obrazu5,16,17, wtyczka Kalkulator stężenia komórek jest szybka i może również obsługiwać rozcieńczenia komórek i zabiegi. Co więcej, wszystkie wyniki i obliczenia z tych dwóch liczników można zapisać i wyeksportować. Dwie wtyczki opisane w tym artykule są zoptymalizowane pod kątem użycia mikroskopu z kontrastem fazowym do obrazowania żywych komórek i obrazowania o dużym polu widzenia (przechwytywanie całej błony) do oznaczania migracji membran za pomocą lunety preparacyjnej. Wtyczki są dostępne do pobrania bezpłatnie z instrukcją instalacji pod adresem: http://peng.lab.yorku.ca/imagej-plugins.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja mikroskopu złożonego i kamery (kalkulator stężenia komórek)

  1. Zwiększ jasność żarówki do pełnej za pomocą pokrętła regulacji światła, przełącz na soczewkę obiektywu 4X i upewnij się, że wybrano filtry kontrastu fazowego.
    UWAGA: Każdy mikroskop z kontrastem z odwróconą fazą do hodowli tkanek z ciemnym tłem, np. Kontrast fazowy PhP, może być używany zgodnie ze standardowymi procedurami mikroskopowymi i kamerowymi.
  2. W oprogramowaniu mikroskopu ustaw ustawienia przechwytywania obrazu na wartości domyślne.
    UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją obsługi mikroskopu, aby znaleźć lokalizację tych ustawień.
    1. Ustaw "jasność", "kontrast" i "nasycenie" na 100%, a "gamma" i "wzmocnienie" na 1.0.
      UWAGA: W zależności od oprogramowania, "jasność" i "kontrast" mogą domyślnie mieć wartość 0% zamiast 100%.
    2. Ustaw obrazy tak, aby były rejestrowane w czerni i bieli przy użyciu najwyższej dostępnej rozdzielczości (1 600 x 1 200 pikseli (px) lub większej).
      UWAGA: "Nasycenie" 0% jest wystarczające, jeśli ustawienie czerni i bieli jest niedostępne.
  3. Umieścić standardowy hemocytometr na stoliku mikroskopu i uchwycić obraz, jak pokazano na rysunku (Rysunek 1A); jest to "Obraz kalibracji objętości". Dostosuj czas ekspozycji zgodnie z wymaganiami.

2. Kalibracja głośności obrazu

  1. Otwórz ImageJ i z menu Wtyczki uruchom wtyczkę Cell Concentration Calculator (CCC), np. Plugins > Analyzer > 'Cell Concentration Calculator'.
    1. Jeśli panel "Kalibracja głośności obrazu" po prawej stronie nie jest widoczny, kliknij "Kalibruj", aby go wyświetlić.
  2. W ImageJ otwórz 'Obraz kalibracji objętości' z kroku 1.3 ("Plik" > 'Otwórz') i w CCC kliknij przycisk 'Pobierz wymiar obrazu'.
    UWAGA: Spowoduje to automatyczne wypełnienie pól tekstowych Szerokość i Wysokość obrazu rozdzielczością obrazu w pikselach.
  3. W ImageJ wybierz "Narzędzie linii prostej" obok narzędzi do zaznaczania i narysuj linię prostą na całej długości głównego kwadratu hemocytometru (P) pokazanego na (Rysunku 1B), klikając i przeciągając kursor.
    1. Naciśnij "M", aby wyświetlić okno Wyniki zawierające pomiary w linii prostej. Wpisz wartość z kolumny Długość w polu tekstowym "Długość P-kwadrat" w CCC (Rysunek 1B).
    2. Kliknij przycisk "Oblicz głośność obrazu", aby wyświetlić wolumin obrazu w polu tekstowym Objętość obrazu. Alternatywnie, jeśli objętość obrazu jest już znana, wpisz wolumin w nL w polu tekstowym Wolumin obrazu.
  4. Kliknij przycisk 'Zapisz'.
    UWAGA: Wtyczka jest teraz skalibrowana.

3. Kalibracja ekspozycji kamery

  1. Po pobraniu komórek do zliczenia za pomocą hemocytometru, załaduj 10 μl komórek do komory hemocytometru i umieść je na stoliku mikroskopu.
  2. Korzystając z tych samych ustawień, co w kroku 1.2, dostosuj czas ekspozycji tak, aby linie tła hemocytometru zniknęły.
    1. Dostosuj ostrość tak, aby wnętrze komórek było ciemniejsze niż błona komórkowa, wskazując ostrość w centralnym przekroju komórki, a nie na biegunach.
    2. Dalej dostosuj ekspozycję, aby komórki nie były prześwietlone i przypominały te przedstawione na (Rysunek 1C).
      UWAGA: Dopuszczalne są słabo widoczne linie hemocytometru. Zaleca się zapisanie lub zapisanie tych ustawień w celu zachowania dokładności i odtwarzalności.

4. Akwizycja obrazu

  1. Dla każdej próbki komórki załaduj 10 μl do obu komór hemocytometru, aby zwiększyć moc wnioskowania statystycznego2. Umieść hemocytometr na stoliku mikroskopu w celu obrazowania.
    UWAGA: Rozdzielczość i powiększenie każdego obrazu muszą być takie same jak w przypadku "obrazu kalibracji głośności". Wtyczka zlicza wszystkie obrazy z dowolnego wybranego folderu; Zachowaj obrazy, które mają być liczone razem w tym samym folderze.
    1. Jeśli dostępna jest funkcja automatycznego zwiększania nazwy pliku, włącz ją i upewnij się, że każdy obraz nie jest wyświetlany po przechwyceniu, aby zwiększyć przepustowość.
      UWAGA: Ręczne zapisywanie i zamykanie każdego obrazu drastycznie spowolni ten proces. Zapoznaj się z instrukcją obsługi mikroskopu, aby uzyskać informacje na temat dostępności funkcji automatycznego przyrostu.
    2. Uchwyć co najmniej trzy nienakładające się na siebie obrazy centralnego obszaru hemocytometru, chociaż zaleca się więcej (5-10) w celu zwiększenia dokładności.
      UWAGA: Unikaj zarówno górnej, jak i dolnej części komór, ponieważ komórki mają tendencję do zwiększania gęstości w obu miejscach. Wykonaj taką samą liczbę zdjęć dla każdej komory. Jest to wymagane do poprawnego działania wtyczki podczas liczenia.

5. Zliczanie i rozcieńczanie obrazów

  1. W CCC kliknij "Policz komórki" i obserwuj okno dialogowe Wybierz katalog. Wybierz folder, który ma zostać zliczony.
  2. Zwróć uwagę na pole wprowadzania numeru próbki po wybraniu folderu. Wprowadź liczbę zdjęć wykonanych w każdej komorze, tj. 4.1.2, i kliknij "OK". Wtyczka będzie teraz zliczać wszystkie obrazy jpg, tiff i png w wybranym folderze w kolejności alfabetycznej.
    UWAGA: Kliknięcie przycisku 'Sample Viewer' spowoduje wyświetlenie okna Sample Viewer wyświetlającego informacje o zliczonych próbkach. Stężenie próbki to średnie stężenie wszystkich obrazów wykonanych w komorze. Do tej listy można dodać próbki o stężeniach bezjednostkowych, takie jak dodanie leku lub leczenie małymi cząsteczkami.
    1. Ponownie przeliczyć próbki komórek, jeżeli ich stężenia różnią się znacznie w obrębie liczb tych samych próbek (sekcja 4).
      UWAGA: Aby obliczyć rozcieńczenia dla wszystkich zliczonych próbek, CCC automatycznie stosuje wzór C1V1 = C2V2.
  3. Skorzystaj ze scenariusza wysiewu 15 000 komórek na 200 μL do 30 dołków na płytce 96-dołkowej + 1 dodatkowo:
    1. Ustaw pole tekstowe po prawej stronie etykiety C2 na 15 000, a pole tekstowe objętość stężenia na 200, zmieniając sąsiednią jednostkę pola kombi na "μL".
      UWAGA: Wtyczka ostatecznie obliczy stężenie w komórkach/ml.
    2. Upewnij się, że w polu kombi woluminów wybrano V2 (objętość końcowa), a w polu tekstowym po prawej stronie wprowadź 6200 (200 μL x (30 + 1)), wybierając "μL" w polu kombi jednostek objętości
      3. .
  4. Kliknij "Oblicz rozcieńczenie", aby dodać aktualnie wprowadzone rozcieńczenie do lewego dolnego pola listy.
    UWAGA: Dla każdego dodanego rozcieńczenia zostanie rozpuszczony dla każdej próbki i wyświetlony na schemacie drzewa po prawej stronie. Kliknij dwukrotnie każdy wpis, aby rozwinąć.
  5. Klikając przycisk "Zapisz" poniżej przycisku "Przeglądarka próbek", aby zapisać do pliku wszystkie przykładowe dane i rozcieńczenia.
  6. UWAGA: Dane te można odzyskać w dowolnym momencie, klikając "Załaduj" i wybierając zapisany plik.

6. Migracja i inwazja (Licznik)

  1. Wykonaj testy migracji i inwazji przy użyciu standardowej metody komory Boydena7-9.
  2. Po migracji/inwazji komórek ostrożnie wyjmij nośnik z wkładki, odwracając i delikatnie stukając. Usuń nadmiar mediów przyklejonych do dolnej części membrany, dotykając krawędzi ręcznika papierowego.
    UWAGA: Nie dotykaj samej membrany ręcznikiem, może to spowodować usunięcie przylegających komórek.
  3. Utrwalić i wybarwić komórki zgodnie z opisem7-9 na 24-dołkowej płytce ustawionej z każdym rzędem zawierającym ~ 500 μl innego roztworu, np. Utrwalacza, Barwnik 1, Barwnik 2 i Woda podwójnie destylowana (ddH2O). Napełnij drugą płytkę 1x PBS, aby umieścić w niej wkładki przed cięciem.
  4. Umyj wkładki, umieszczając je w studzienkach wypełnionych ddH2O i napełnij wkład ddH2O. Spuść wodę przed pobraniem wymazu z komórek przez odwrócenie.
  5. Użyj czystego bawełnianego aplikatora, aby usunąć niemigrowane/niezaatakowane komórki z górnej części membrany, uważając, aby nie uszkodzić membrany. Bądź dokładny wokół krawędzi membrany.
  6. Przetnij membranę za pomocą brzytwy lub skalpela i ostrożnie przenieś membranę (od dołu do góry) na czyste szkiełko
    7. podstawowe.
  7. Dodaj niewielką kroplę roztworu montażowego pod i na górze membrany i przykryj cienką szkiełkiem nakrywkowym.
    UWAGA: Unikaj zatrzymywania pęcherzyków w roztworze montażowym, aby zachować dokładność zliczania.

7. Konfiguracja lunety i kamery

  1. Włącz źródło światła mikroskopu i kamerę.
    UWAGA: Szczegółowe instrukcje można znaleźć w instrukcji obsługi mikroskopu.
  2. W oprogramowaniu mikroskopu ustaw ustawienia przechwytywania obrazu na wartości domyślne.
    UWAGA: Jeśli istnieje funkcja uśredniania, zalecana jest wartość czterech. Jest to dobry kompromis pomiędzy stopniem uśredniania a czasem akwizycji obrazu. Podobnie, niewielki stopień wyostrzenia może zwiększyć wierność obrazu.
    1. Ustaw "jasność", "kontrast" i "nasycenie" na 100%, a "gamma" i "wzmocnienie" na 1.0.
      UWAGA: W zależności od oprogramowania, "jasność" i "kontrast" mogą domyślnie mieć wartość 0% zamiast 100%.
    2. Ustaw maksymalną rozdzielczość wyświetlania (w czasie rzeczywistym) i przechwytywania (odpowiednio 1 600 x 1 200 px i 2 592 x 1 944 px).
      UWAGA: Rozdzielczość wyświetlacza można dostosować zgodnie z wymaganiami, jeśli częstotliwość odświeżania jest zbyt niska. Niższe rozdzielczości utrudnią dokładne ustawienie ostrości, ale zwiększą częstotliwość odświeżania.
  3. Na etapie lunety sekcyjnej użyj jednolitego białego tła; czarne lub szklane tło jest niewystarczające.
  4. Użyj nadstage źródło światła, najlepiej z dwóch elastycznych diod LED po prawej i lewej stronie stage.
    UWAGA: Źródło światła znajdujące się pod stolikiem oświetli pory w membranie testowej migracji, co może negatywnie wpłynąć na dokładność kolejnych zliczeń.
  5. Umieść na stoliku wypełniony szkiełko membranowe do oznaczania migracji. Patrząc na obraz w czasie rzeczywistym wyświetlany przez oprogramowanie, wyreguluj powiększenie za pomocą pokrętła regulacji zoomu tak, aby krawędzie pojedynczej membrany znajdowały się dokładnie w polu widzenia kamery.
    UWAGA: Umieszczenie slajdu na szklanej płycie nad białym tłem stage ułatwia manewrowanie slajdem w celu obrazowania.
  6. Dostosuj położenie źródła światła (7.6.1) i czasy naświetlania, aby jak najdokładniej odtworzyć idealny obraz przedstawiony na rysunku 2A. W zależności od jasności czasy naświetlania 5-60 ms powinny być wystarczające.
    UWAGA: Celem jest uzyskanie obrazu z jak najmniejszą ilością koloru tła i równomiernie oświetloną membraną bez zmniejszania wierności obrazu, tj. prześwietlenia prowadzącego do utraty widocznych komórek.
    1. Ustaw lewe i prawe źródło światła pod niskim kątem w stosunku do suwaka. Pomoże to usunąć plamy tła i aberracje chromatyczne. Staraj się, aby każde źródło światła było dokładnie naprzeciwko drugiego.
      UWAGA: Podczas manewrowania każdym źródłem światła na miejsce, wyłącz drugie. Pomaga to w łatwiejszym i dokładniejszym wyśrodkowaniu obszaru oświetlenia na samej membranie.
  7. Usuń szkiełko i zrównoważ biel obrazu za pomocą jednego kliknięcia przycisku w oprogramowaniu mikroskopu.
    UWAGA: Mikroskop jest teraz skalibrowany. Zapisz jak najwięcej ustawień do wykorzystania w przyszłości i zwróć uwagę na pozycje i intensywność źródła światła.

8. Akwizycja obrazu i Flatfield

  1. W oprogramowaniu ustaw lokalizację folderu przechwytywania i przechwyć jeden obraz na membranę. Nazwij obrazy zgodnie z ogólnym szablonem: Nazwa - ###, np. Kontrola - 001.tif, Kontrola - 002.tif, Test leku - 001.tif i tak dalej.
    UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki obrazu, zapisz typ pliku obrazu jako tiff w porównaniu z innymi formatami stratnymi, takimi jak jpeg.
    UWAGA: Obrazy, które nie są zgodne z ogólnym szablonem, będą nadal zliczane, ale nie będą podlegać automatycznemu grupowaniu i płaskiemu polowaniu.
    1. Jeśli wymagana jest korekta płaskiego pola, dla każdego slajdu znajdź pusty obszar i utwórz pusty obraz zgodnie z konwencją nazewnictwa: Nazwa - Blank.
      UWAGA: Puste miejsce to obszar na slajdzie, który nie zawiera membrany i reprezentuje oświetlenie tła.
    2. Bezpośrednio przed obrazowaniem spłaszcz każdą membranę, wywierając nacisk na szkiełko nakrywkowe i usuń jak najwięcej uwięzionych pęcherzyków.
  2. W ImageJ przejdź do Wtyczki i otwórz wtyczkę TC; Na przykład, Wtyczki > analizują > "licznika Transwell".
  3. W TC kliknij przycisk "Flatfield" i obserwuj okno dialogowe Wybierz katalog. Wybierz folder, w którym zostały zapisane obrazy membrany.
    UWAGA: Tylko obrazy zapisane z powyższym ogólnym szablonem zostaną automatycznie poprawione i zapisane w nowym folderze o nazwie Flatfield w wybranym folderze. Na rysunku 2B przedstawiono przykład obrazu z korekcją płaskiego pola.

9. Ustawienia konfiguracyjne

  1. Otwórz obraz membrany testu migracji w ImageJ ("Plik" > "Otwórz") i wybierz Obraz > Dostosuj > "Próg koloru...". Obserwuj okno Color Threshold (Próg koloru), aby dostosować kolory, które będą odfiltrowywane z obrazu.
    1. U dołu okna ustaw Metodę progowania na "Shanbhag", Kolor progu na "Biały", a Przestrzeń kolorów na "RGB" (czerwony, zielony, niebieski); odznacz Ciemne tło, jeśli jest wybrane.
    2. Dostosuj górne suwaki, klikając i przeciągając znaczniki do 0, a dolne suwaki do 255 (pozostaw dolne suwaki na 255). Upewnij się, że obraz jest całkowicie biały.
  2. Dostosuj zielone i czerwone górne suwaki, aż widoczne będą tylko jądra.
    UWAGA: Wybrane ustawienia będą się całkowicie różnić w zależności od użytego barwnika komórkowego. Zobacz rysunek 2C.
  3. We wtyczce TC wprowadź wartości górnych suwaków RGB do powiązanych pól tekstowych "Próg RGB" ustawień konfiguracyjnych. Kliknij przycisk "Dodaj/Modyfikuj" i zastąp konfigurację.
    1. Pozostaw dolne i górne wartości zakresu rozmiarów na 1 - Nieskończoność.
  4. W panelu Ustawienia konfiguracji kliknij "Zapisz", aby zapisać ustawienia na dysku twardym.

10. Zliczanie obrazów i kalibracja

  1. Otwórz wtyczkę TC (8.2) i kliknij "Count Folder" i obserwuj okno dialogowe Wybierz katalog. Wybierz folder, który ma zostać zliczony i poczekaj na jego zakończenie.
  2. Każda zliczona próbka jest automatycznie dodawana do tabeli głównej. Kluczowe kolumny to "Liczba", "Jakość" i "Kalibracja?".
    UWAGA: Nieskalibrowana liczba to liczba cząstek na membranę w obszarze wyświetlanym w kolumnie "Zakres obszaru".
    UWAGA: Jakość waha się od około -0,8 do 1,7; Q ≥ 0,5 jest dopuszczalne.
    1. Zwróć uwagę na znacznik wyboru w kolumnie "Kalibrować?", jeśli obraz jest oznaczony do kalibracji na podstawie jego podobieństwa do idealnych wskaźników.
      UWAGA: Zarówno jakość, jak i kalibracja mogą sugerować, że bieżące ustawienia są prawdopodobnie niewystarczające. Jeśli po wybraniu odpowiednich opcji "Próg kolorów" i "Zakresy rozmiarów" nadal sugerowana jest kalibracja, oględziny oryginalnych i zliczonych obrazów powinny być ostatecznym wyznacznikiem prawidłowego zliczenia.
  3. Wybierz wszystkie próbki w tabeli oznaczone do kalibracji.
    1. Kliknij prawym przyciskiem myszy w tabeli i wybierz Przelicz > "Sugerowany rozmiar". Spowoduje to ponowne przeliczenie obrazów z sugerowaną minimalną powierzchnią cząstek.
    2. Kliknij ponownie prawym przyciskiem myszy i wybierz "Pokaż działkę". Obserwuj wykres punktowy częstotliwości obszarów cząstek. Idealny obraz będzie zawierał wykres przypominający długi prawostronny rozkład normalny, tj. krzywą dzwonową. Zobacz rysunek 3B.
    3. W razie potrzeby dostosuj dolny zakres rozmiarów, wybierając próbkę, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając Przelicz > "Ustawienia ręczne". Zwróć uwagę na okno dialogowe ustawień ręcznych. Wprowadź żądane ustawienia i kliknij przycisk Liczba, aby ponownie przeliczyć obraz z nowymi ustawieniami.
  4. Aby ręcznie dostosować zliczenia, wybierz próbki, klikając tabelę prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję "Otwórz obraz z liczeniami". Obserwuj oryginalny obraz z czerwonymi znacznikami reprezentującymi każdą cząstkę zliczoną przez wtyczkę.
    UWAGA: Przelicz > "Pokaż zliczony obraz binarny" może być przydatne, aby sprawdzić, jak dobrze poszczególne komórki są rozpoznawane przez próg kolorów.
    1. Aby dodać liczbę, przytrzymaj "Ctrl" i kliknij lewym przyciskiem myszy. Obserwuj znacznik w miejscu kursora, który zostanie dodany do całkowitej liczby próbek. Aby usunąć znacznik, kliknij go prawym przyciskiem myszy. Wtyczka usunie znacznik znajdujący się najbliżej kursora.
    2. Aby usunąć grupę znaczników, użyj narzędzia do zaznaczania w ImageJ, aby wybrać obszar zainteresowania (ROI). Przytrzymując "Ctrl", kliknij obraz prawym przyciskiem myszy, a wszystkie znaczniki wewnątrz ROI zostaną usunięte. Zwróć uwagę na numer komórki w kolumnie "Liczba".

11. Zapisywanie/otwieranie wyników i eksport do pliku CSV

  1. W TC przejdź do paska menu i kliknij "Plik" > "Zapisz wyniki". Zwróć uwagę na okno dialogowe Zapisywanie wyników. Wybierz nazwę i miejsce docelowe, a następnie kliknij "Zapisz".
    1. Użyj opcji 'Plik' > 'Otwórz wyniki', aby załadować plik zawierający wszystkie dane wyświetlane w tabeli głównej, w tym wykres.
      UWAGA: Plik wyników zapisuje katalogi, w których zostały zapisane obrazy. Jeśli oryginalne obrazy zostaną przeniesione po zapisaniu, funkcje "Otwórz oryginalny obraz" i "Otwórz obraz z licznikami" zakończą się niepowodzeniem.
    2. Aby zresetować katalog obrazów, wybierz próbki, kliknij prawym przyciskiem myszy tabelę i wybierz opcję "Resetuj katalog obrazów". Zwróć uwagę na okno dialogowe Wybierz katalog. Wybierz nowy folder, a jeśli obrazy istnieją, katalogi zostaną zresetowane. Ponownie zapisz plik wyników.
  2. Aby zapisać plik z wartościami oddzielonymi przecinkami (CSV), na pasku menu przejdź do "Plik" > "Eksportuj do .csv". W ten sposób powstaje plik z próbkami zorganizowanymi w grupy statystyczne z liczbą średnich i błędem standardowym średniej; Jego układ jest przeznaczony do szybkiego tworzenia wykresów w popularnych programach do tworzenia wykresów.
    UWAGA: Grupy statystyczne są oparte na grupach utworzonych w ramach TC.
    1. Jeśli przykłady są zgodne z ogólnym szablonem nazewnictwa, wybierz próbki do zgrupowania, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję "Automatyczne grupowanie". Spowoduje to dodanie próbek o tej samej nazwie "Nazwa" do tej samej grupy. Korzystając z przykładu Kontrola - 1, Kontrola - 2, Leczenie - 1, Leczenie - 2: obie kontrole zostaną dodane do grupy "Kontrola", a zabiegi do "Leczenie".
    2. Dodaj próbki ręcznie do grup, klikając dwukrotnie komórkę "Grupa" próbki i wpisując nazwę grupy. Wybierz próbki, które mają zostać dodane do tej grupy, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Dodaj do grupy".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalkulator stężenia komórek

Rysunek 1 przedstawia ogólny proces kalibracji CCC oraz obrazowania w celu zliczenia komórek. Rysunek 1A i 1B przedstawiają obraz kalibracyjny kwadratu P oraz obliczanie długości kwadratu P w pikselach. CCC określa stężenie komórek w danej objętości korzystając ze wzoru:

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kroki krytyczne, rozwiązywanie problemów i ograniczenia

Sama natura zautomatyzowanych metod obliczeniowych, w szczególności tych związanych z analizą cząstek, wymaga matematycznej zdolności do definiowania tych cząstek. W związku z tym dokładność zarówno kalkulatora stężenia komórek, jak i licznika testu migracji zależy w dużej mierze od wierności obrazu, to znaczy od tego, jak bardzo przechwycony obraz przypomina próbkę komórki lub błonę testu migracji. Dlatego niezwykle ważne jest, aby jak najl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem do CP (OR 142730 i OR 89931). Chcielibyśmy podziękować Jelenie Brkic za jej początkowy pomysł na analizę cząstek binarnych w ImageJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
HyClone Klasyczne płynne podłoże: RPMI 1640 - z L-glutaminąFisher ScientificSH3002702Pożywki do hodowli komórkowych 
Surowica płodowa (FBS)GIBCO BRLP00015Dostawa pożywki
Linia komórkowa trofoblastów HTR8 / SVneoKomórki uzyskano od dr Charlesa Grahama (Królowa' s University, Kingston, Kanada)Oprogramowanie jest przeznaczone do pracy z dowolną linią komórkową.
TrypsynaGIBCO BRL27250-018Przygotowany jako 0,20% (w/v) w 10 &mikro; M EDTA 1x PBS
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
10 cm płytki do hodowli komórkowychSARSTEDT833902Odpowiednie będą wszelkie płytki poddane działaniu kultur tkankowych
Wkładki z membrany poliestrowej Transwell - 8.0  &mikro; m Wielkość porówCostar 3422 zamówiona w Fisher Scientific 7200150Do płytek 24-dołkowych; Wielkość porów: 8,0 i mikro; m; średnica 6,5 mm; 0,33 cm2 obszar wzrostu
HARLECO Hematologia Barwniki i odczynniki, EMD Millipore - Roztwory 1, 2 i 3EMD Millipore i zamówione w VWR65044A, B i CZestaw barwników Hemacolor składa się z trzech butelek foliowych o pojemności 500 ml (16,9 uncji) i zawiera utrwalacz metanolu (roztwór 1), barwnik eozynowy lub kwasowy (roztwór 2) oraz błękit metylenowy lub barwnik zasadowy (roztwór 3)
Aplikator z bawełnianą końcówkąPuritan Medical806-WC
Przemysłowe żyletki jednokrawędzioweVWR55411 - 055Grubość: 0,30 mm (0,012")
Szkiełka mikroskopowe - wstępnie oczyszczone/gładkieFisher Scientific12550A3Wymiary: 25 mm x 75 mm x 1,0 mm
Okulary przeciwsłoneczne Fisherbrand - prostokąty nr 1Fisher Scientific12-545EGrubość: 0,13 do 0,17 mm; Rozmiar: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting MediumFisher ScientificSP15-500
Leica Stereo mikroskop preparacyjnyLeica MicrosystemsMikroskop jest wyposażony w kamerę mikroskopową Leica Model MC170 HD, a oprogramowanie kamery to Leica App. Suite (LAS E2) wersja 3.1.1 [Build: 490]. Części mikroskopu:  LED3000 Oświetlenie punktowe Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Obiektyw achromatyczny 1.0X, WD=90  mm Model: MOB306 & Obiektyw achromatyczny 0,32X, WD=303  mm Model: MOB315, Obiektyw wideo 0,5X Model: MTU-293
hemacytometruNiemcy Głębokość 0,100 mm - 0,0025 mm2
Mikroskop światła odwróconegoOlympus CorporationCKX41SFMikroskop jest wyposażony w kolorową kamerę Lumenera Infinity 1-2
2.0 Megapiksel CMOS i oprogramowanie kamery to analiza Infinity Wersja 6.5.2
Komora laminarna Seria 1300 A2Thermo Scientific Model: 1375Każda komora z przepływem laminarnym do prac związanych z hodowlą komórkową będzie odpowiednia 
Inkubator do hodowli komórkowychThermo Scientific Model: 370Każdy inkubator do hodowli komórkowych będzie odpowiedni - Komórki hodowano w wilgotnym środowisku, 5% CO2, 37 & C 
ImageJNIH Wersja 1.50eWymagana minimalna wersja
Java Runtime EnvironmentOracleVersion 1.8.0_66Wymagana minimalna wersja
Asystent

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J. Vis. Exp. (16), e752(2008).
  2. JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016).
  3. Graham, M. D. The coulter principle: foundation of an industry. J. Lab. Autom. 8 (6), 72-81 (2003).
  4. Ormerod, M. G., Imrie, P. R. Flow cytometry. Animal Cell Culture. Walker, J. M., Pollard, J. W. , Humana Press. 543-558 (1990).
  5. Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nat. Methods. 9 (7), 697-710 (2013).
  6. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using Trypan blue: manual and automated methods. Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. Stoddart, J. M. , Humana Press. 7-12 (2011).
  7. Scott, W. N. Invasion and motility assays. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. Langdon, S. P. , Humana Press. 225-229 (2004).
  8. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro Cell Migration and Invasion Assays. J. Vis. Exp. (88), e51046(2014).
  9. Luo, L., et al. MicroRNA-378a-5p promotes trophoblast cell survival, migration and invasion by targeting Nodal. J. Cell Sci. 125, 3124-3132 (2012).
  10. Adorno, M., et al. A Mutant-p53/Smad Complex Opposes p63 to Empower TGFbeta-Induced Metastasis. Cell. 137, 87-98 (2009).
  11. Chung, T. K. H., et al. Dysregulation of microRNA-204 mediates migration and invasion of endometrial cancer by regulating FOXC1. Int. J. Cancer. 130, 1036-1045 (2012).
  12. Kramer, N., et al. et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat. Res./Rev. Mutat. 752, 10-24 (2013).
  13. Al-Khazraji, B. K., Medeiros, P. J., Novielli, N. M., Jackson, D. N. An automated cell-counting algorithm for fluorescently-stained cells in migration assays. Biol. Proced. Online. 13, 1-6 (2011).
  14. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://rsb.info.nih.gov/ij/ (2007).
  15. Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Intern. 11, 36-42 (2004).
  16. Grishagin, I. V. Automatic cell counting with ImageJ. Anal. Biochem. 473, 63-65 (2015).
  17. Thomas, C. R., Paul, G. C. Applications of image analysis in cell technology. Curr. Opin. Biotech. 7 (1), 35-45 (1996).
  18. Appreciating data: warts, wrinkles and all. Nat. Cell Biol. 8, 203(2006).
  19. Rossner, M., Yamada, K. M. What's in a picture? The temptation of image manipulation. J. Cell Biol. 166, 11-15 (2004).
  20. Count objects in an image in Adobe Photoshop. Helpx.adobe.com. , Available from: https://helpx.adobe.com/photoshop/using/counting-objects-image.html (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza przy u yciu komory countingowejtest migracjianaliza cz stekzautomatyzowane liczeniekalibracja obrazuprogowanie kolorystycznekalkulator st enia kom rekwtyczka TC

Powiązane artykuły