Method Article

Zautomatyzowana kwantyfikacja i analiza procedur zliczania komórek za pomocą wtyczek ImageJ

DOI:

10.3791/54719

⸱

November 17th, 2016

 ,  , 
1Department of Biology, York University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje kwantyfikację hemocytometru i mikrofotografii migracji/inwazji za pomocą dwóch nowych wtyczek ImageJ o otwartym kodzie źródłowym: Kalkulatora Stężenia Komórek i Licznika Testu Migracji. Ponadto opisano w nim protokoły akwizycji i kalibracji obrazu, a także szczegółowo omówiono wymagania wejściowe wtyczek.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ImageJ Narodowego Instytutu Zdrowia to potężny, swobodnie dostępny pakiet oprogramowania do przetwarzania obrazów. ImageJ posiada kompleksowe algorytmy analizy cząstek, które mogą być skutecznie wykorzystywane do liczenia różnych cząstek biologicznych. Podczas liczenia dużej liczby próbek komórek hemocytometr stanowi wąskie gardło w odniesieniu do czasu. Podobnie, liczenie błon z testów migracji/inwazji za pomocą wtyczki ImageJ Cell Counter, choć dokładne, jest wyjątkowo pracochłonne, subiektywne i niesławne z powodu powodowania bólu nadgarstka. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowaliśmy dwie wtyczki w ramach ImageJ do wyłącznego zadania automatycznego hemocytometru (lub znanej objętości) i zliczania komórek migracji/inwazji. Obie wtyczki opierają się na możliwości pozyskiwania wysokiej jakości mikrofotografii przy minimalnym tle. Są łatwe w użyciu i zoptymalizowane pod kątem szybkiego liczenia i analizy dużych rozmiarów próbek z wbudowanymi narzędziami analitycznymi, które pomagają w kalibracji zliczeń. Łącząc podstawowe zasady licznika komórek z automatycznym algorytmem zliczania i analizą po zliczeniu, znacznie zwiększa to łatwość, z jaką można przetwarzać testy migracji bez utraty dokładności.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Liczenie komórek in vitro jest ważną podstawową techniką w szerokim zakresie eksperymentów z hodowlami tkankowymi. Dokładne określenie liczby komórek w hodowli ma zasadnicze znaczenie dla odtwarzalności doświadczalnej i standaryzacji1,2. Liczenie komórek można przeprowadzić ręcznie za pomocą hemocytometru, a także przy użyciu różnych metod automatycznych, z których każda ma swoje zalety i wady3,4,5. Większość zautomatyzowanych metod liczenia komórek należy do jednej z dwóch klas, tych, które wykorzystują zasadę Coultera lub cytometrię przepływową. Liczniki redlic wykorzystują opór elektryczny komórek do określania liczby i wielkości komó....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja mikroskopu złożonego i kamery (kalkulator stężenia komórek)

  1. Zwiększ jasność żarówki do pełnej za pomocą pokrętła regulacji światła, przełącz na soczewkę obiektywu 4X i upewnij się, że wybrano filtry kontrastu fazowego.
    UWAGA: Każdy mikroskop z kontrastem z odwróconą fazą do hodowli tkanek z ciemnym tłem, np. Kontrast fazowy PhP, może być używany zgodnie ze standardowymi procedurami mikroskopowymi i kamerowymi.
  2. W oprogramowaniu mikroskopu ustaw ustawienia przechwytywania obrazu na wartości domyślne.
    UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją obsługi mikroskopu, aby znaleźć lokalizację tych ustawień.
    1. Ustaw "....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalkulator stężenia komórek

Rysunek 1 przedstawia ogólny proces kalibracji CCC i policzalnej akwizycji obrazu. Rysunki 1A i 1B przedstawiają obraz kalibracji P-kwadrat i obliczanie długości P-kwadratu w pikselach. CCC określa stężenie komórek w danej objętości za pomocą wzoru:

figure-results-1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kroki krytyczne, rozwiązywanie problemów i ograniczenia

Sama natura zautomatyzowanych metod obliczeniowych, w szczególności tych związanych z analizą cząstek, wymaga matematycznej zdolności do definiowania tych cząstek. W związku z tym dokładność zarówno kalkulatora stężenia komórek, jak i licznika testu migracji zależy w dużej mierze od wierności obrazu, to znaczy od tego, jak bardzo przechwycony obraz przypomina próbkę komórki lub błonę testu migracji. Dlatego niezwykle ważne jest, aby jak najl.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem do CP (OR 142730 i OR 89931). Chcielibyśmy podziękować Jelenie Brkic za jej początkowy pomysł na analizę cząstek binarnych w ImageJ.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HyClone Klasyczne płynne podłoże: RPMI 1640 - z L-glutaminąFisher ScientificSH3002702Pożywki do hodowli komórkowych 
Surowica płodowa (FBS)GIBCO BRLP00015Dostawa pożywki
Linia komórkowa trofoblastów HTR8 / SVneoKomórki uzyskano od dr Charlesa Grahama (Królowa' s University, Kingston, Kanada)Oprogramowanie jest przeznaczone do pracy z dowolną linią komórkową.
TrypsynaGIBCO BRL27250-018Przygotowany jako 0,20% (w/v) w 10 &mikro; M EDTA 1x PBS
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
10 cm płytki do hodowli komórkowychSARSTEDT833902Odpowiednie będą wszelkie płytki poddane działaniu kultur tkankowych
Wkładki z membrany poliestrowej Transwell - 8.0  &mikro; m Wielkość porówCostar 3422 zamówiona w Fisher Scientific 7200150Do płytek 24-dołkowych; Wielkość porów: 8,0 i mikro; m; średnica 6,5 mm; 0,33 cm2 obszar wzrostu
HARLECO Hematologia Barwniki i odczynniki, EMD Millipore - Roztwory 1, 2 i 3EMD Millipore i zamówione w VWR65044A, B i CZestaw barwników Hemacolor składa się z trzech butelek foliowych o pojemności 500 ml (16,9 uncji) i zawiera utrwalacz metanolu (roztwór 1), barwnik eozynowy lub kwasowy (roztwór 2) oraz błękit metylenowy lub barwnik zasadowy (roztwór 3)
Aplikator z bawełnianą końcówkąPuritan Medical806-WC
Przemysłowe żyletki jednokrawędzioweVWR55411 - 055Grubość: 0,30 mm (0,012")
Szkiełka mikroskopowe - wstępnie oczyszczone/gładkieFisher Scientific12550A3Wymiary: 25 mm x 75 mm x 1,0 mm
Okulary przeciwsłoneczne Fisherbrand - prostokąty nr 1Fisher Scientific12-545EGrubość: 0,13 do 0,17 mm; Rozmiar: 50 mm x 22 mm
Fisher Chemical Permount Mounting MediumFisher ScientificSP15-500
Leica Stereo mikroskop preparacyjnyLeica MicrosystemsMikroskop jest wyposażony w kamerę mikroskopową Leica Model MC170 HD, a oprogramowanie kamery to Leica App. Suite (LAS E2) wersja 3.1.1 [Build: 490]. Części mikroskopu:  LED3000 Oświetlenie punktowe Model: MEB126, Leica M80 Optic Carrier Model M80, Obiektyw achromatyczny 1.0X, WD=90  mm Model: MOB306 & Obiektyw achromatyczny 0,32X, WD=303  mm Model: MOB315, Obiektyw wideo 0,5X Model: MTU-293
hemacytometruNiemcy Głębokość 0,100 mm - 0,0025 mm2
Mikroskop światła odwróconegoOlympus CorporationCKX41SFMikroskop jest wyposażony w kolorową kamerę Lumenera Infinity 1-2
2.0 Megapiksel CMOS i oprogramowanie kamery to analiza Infinity Wersja 6.5.2
Komora laminarna Seria 1300 A2Thermo Scientific Model: 1375Każda komora z przepływem laminarnym do prac związanych z hodowlą komórkową będzie odpowiednia 
Inkubator do hodowli komórkowychThermo Scientific Model: 370Każdy inkubator do hodowli komórkowych będzie odpowiedni - Komórki hodowano w wilgotnym środowisku, 5% CO2, 37 & C 
ImageJNIH Wersja 1.50eWymagana minimalna wersja
Java Runtime EnvironmentOracleVersion 1.8.0_66Wymagana minimalna wersja
Asystent

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J. Vis. Exp. (16), e752(2008).
  2. JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016).
  3. Graham, M. D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

ImageJ PluginsCell CountingHemocytometer AnalysisMigration AssayParticle AnalysisAutomated CountingImage CalibrationColor ThresholdingCell Concentration CalculatorTC Plugin

Related Articles