Łatwe i wydajne podejście do produkcji odwracalnych miceli usieciowanych dwusiarczkowym

Podsumowanie

Aby dostarczyć leki przeciwnowotworowe do miejsc nowotworowych o wysokiej swoistości i zmniejszonych skutkach ubocznych, potrzebne są nowe metody oparte na nanocząsteczkach. Tutaj opisujemy usieciowane micele dwusiarczkowe, które można łatwo przygotować przez utlenianie za pośrednictwem nadtlenku wodoru i są w stanie skutecznie dysocjować w środowisku redukującym guza, aby uwolnić ładunki.

Streszczenie

Nanomedycyna to nowa forma terapii, która wykorzystuje unikalne właściwości cząsteczek o skali nanometrów do zastosowań biomedycznych. Poprawa dostarczania leków w celu maksymalizacji wyników terapeutycznych i zmniejszenia skutków ubocznych związanych z lekami to tylko niektóre z kamieni węgielnych współczesnej nanomedycyny. W szczególności nanocząstki znalazły szerokie zastosowanie w leczeniu raka. Przewiduje się, że nanocząstki, które oferują wysoki stopień elastyczności w projektowaniu, stosowaniu i produkcji w oparciu o mikrośrodowisko guza, będą bardziej skuteczne dzięki szybkiemu przełożeniu na praktykę kliniczną. Polimerowy nanonośnik micelarny jest popularnym wyborem do zastosowań związanych z dostarczaniem leków.

W tym artykule opisujemy prosty i skuteczny protokół syntezy naładowanych lekami, usieciowanych dwusiarczków w oparciu o samoorganizację dobrze zdefiniowanego amfifilowego kopolimeru liniowo-dendrytycznego (telodendrymer, TD). TD składa się z glikolu polietylenowego (PEG) jako segmentu hydrofilowego i tiolowanego klastra kwasu cholowego jako hydrofobowego ugrupowania tworzącego rdzeń, przyłączonego stopniowo do PEG zakończonego aminami przy użyciu chemii peptydów na bazie roztworu. Leki stosowane w chemioterapii, takie jak paklitaksel (PTX), mogą być ładowane przy użyciu standardowej metody odparowywania rozpuszczalnika. Utlenianie za pośrednictwem_O2 było wcześniej wykorzystywane do tworzenia wewnątrzmicelarnych wiązań krzyżowych dwusiarczku z wolnych grup tiolowych na TD. Reakcja była jednak powolna i niemożliwa do zrealizowania przy produkcji na dużą skalę. Niedawno zbadano metodę utleniania za pośrednictwem_H2O2jako bardziej wykonalne i wydajne podejście, która była 96 razy szybsza niż poprzednio opisana metoda. Dzięki temu podejściu udało się wyprodukować 50 g nanocząstek usieciowanych dwusiarczkiem obciążonych PTX o wąskim rozkładzie wielkości cząstek i wysokiej wydajności ładowania leku. Stabilność otrzymanego roztworu miceli jest analizowana przy użyciu warunków zakłócających, takich jak jednoczesna inkubacja z detergentem, dodecylosiarczanem sodu, z lub bez środka redukującego. Naładowane lekiem, usieciowane dwusiarczkowe micele wykazywały mniejszą aktywność hemolityczną w porównaniu z ich nieusieciowanymi odpowiednikami.

Wprowadzenie

Nanotechnologia to szybko rozwijająca się dziedzina, która przyniosła korzyści wielu dziedzinom biomedycznym¹. Nanocząstki dają możliwości projektowania i dostrajania właściwości, które nie są możliwe do uzyskania w przypadku innych rodzajów konwencjonalnych terapii. Nanonośniki zwiększają stabilność leków przed biodegradacją, wydłużają czas obiegu leków, rozwiązują problemy z rozpuszczalnością leków i mogą być precyzyjnie dostrojone do celowanego dostarczania leków i do współdostarczania środków obrazowania^1,2. Systemy dostarczania oparte na nanocząstkach są obiecujące w obrazowaniu i leczeniu nowotworów. Naczynia krwionośne guza są nieszczelne dla makrocząsteczek i mogą prowadzić do preferencyjnej akumulacji krążących nanocząstek w miejscach guza poprzez efekt zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR)³. Spośród kilku nanonośników (np. liposomów, hydrożeli i miceli polimerowych), które są aktywnie poszukiwane jako nośniki leków przeciwnowotworowych, micele polimerowe zyskały dużą popularność w ciągu ostatniej dekady^4,5.

Micele polimerowe to system termodynamiczny, który po podaniu dożylnym może potencjalnie zostać rozcieńczony poniżej krytycznego stężenia miceli (CMC), co prowadzi do ich dysocjacji na unimery. Zastosowano strategie sieciowania w celu zminimalizowania dysocjacji micelarnej na unimery. Jednak nadmiernie ustabilizowane micele mogą zapobiegać uwalnianiu leku w miejscach docelowych, zmniejszając w ten sposób ogólną skuteczność terapeutyczną. Zbadano kilka podejść chemicznych w celu urozdzielenia sieciowania w odpowiedzi na redoks lub bodźce zewnętrzne, takie jak redukowalne wiązania dwusiarczkowe^6,7 i rozszczepialne pH⁸ lub hydrolizowalne wiązania estrowe^9,10.

Wcześniej informowaliśmy o projektowaniu i syntezie nanocząsteczek micelarnych składających się z bloków dendrytycznego kwasu cholowego (CA) i liniowych kopolimerów glikolu polietylenowego (PEG), określanych jako telodendrimery (TD)^11-15. Te TD są reprezentowane jako PEG^nK-CAy (gdzie n = masa cząsteczkowa w kilodaltonach (K), y = liczba jednostek kwasu cholowego (CA)). Charakteryzują się niewielkimi rozmiarami, długim okresem trwałości i wysoką skutecznością w kapsułkowaniu leków takich jak paklitaksel (PTX) i doksorubicyna (DOX) w rdzeniu hydrofobowym. Elementy budulcowe TD, takie jak PEG, lizyna i CA, są biokompatybilne, a obecność korony PEG może nadać charakter nanocząstek "stealth", zapobiegając niespecyficznemu wychwytowi nanocząstek micelarnych przez układy siateczkowo-śródbłonkowe.

Tiolowane liniowo-dendrytyczne polimery mogą być łatwo generowane przez wprowadzenie cystein do dendrytycznego szkieletu oligolizynowego naszych standardowych TD. W artykule przedstawiono prosty protokół wytwarzania odwracalnie usieciowanego systemu dostarczania leków micelarnych poprzez wprowadzenie usieciowania dwusiarczkowego do hydrofobowego rdzenia TD (ryc. 1).

Protokół

Oświadczenie etyczne: Samice nagich myszy atymicznych (szczep Nu/Nu), w wieku 6-8 tygodni, zostały zakupione, a następnie trzymane w warunkach wolnych od patogenów zgodnie z wytycznymi AAALAC i pozwolono im na aklimatyzację przez co najmniej 4 dni przed jakimikolwiek eksperymentami. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zgodnie z protokołem nr 07-13119 i nr 09-15584, zatwierdzonym przez Administracyjny Komitet Doradczy ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis.

1. Synteza TD PEG^5K-Cys 4-Ebes _{8-CA 8}

1. W kolbie okrągłodennej rozpuścić MeO-PEG^5K-NH ₂ (2 g, 0,4 mmol) w 10-20 ml bezwodnego dimetyloformamidu (DMF) i schłodzić na lodzie.
2. W szklanej zlewce rozpuścić 3 równoważniki 1-hydroksy-6-chloro-benzotriazolu (HOBt), 3 równoważniki N,N'-diizopropylokarbodimidu (DIC) i 3 równoważniki (Fmoc)₂Lys-OH w bezwodnym DMF (10-15 ml). Mieszaj przez 15-20 minut na magnetycznej płytce mieszającej.
3. Dodać mieszaninę do kolby reakcyjnej zawierającej MeO-PEG^5K-NH _2. Usunąć łaźnię lodową i mieszać mieszaninę reakcyjną przez noc w temperaturze pokojowej.
4. Potwierdzić zakończenie reakcji za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)¹⁶ i testu Kaisera¹⁷ (żółty kolor oznacza brak wolnego_NH2). Wytrącić produkt polimerowy 1 (MeO-PEG^5K-Lys(NH-Fmoc)₂) przez dodanie około 200 ml lodowatego eteru do kolby reakcyjnej. Oddzielić wytrącony polimer przez odwirowanie (6 min w temperaturze 6 000 x g i temperaturze 4 °C).
   1. Aby wykonać TLC, należy umieścić próbki na płytkach TLC pokrytych żelem krzemionkowym. Jako fazę ruchomą należy użyć dichlorometanu/metanolu (9:1). Obserwuj plamy pod lampą UV po wywołaniu płytek TLC. Można również użyć odczynnika barwiącego ninhydrynę, aby uwidocznić plamy aminowe na gorącej płycie.
   2. W teście Kaisera umieść niewielką część próbki w szklanej probówce zawierającej odczynnik Kaisera. Podgrzewać w temperaturze 100 °C przez 5 minut i szukać zmiany koloru (jeśli kolor roztworu pozostaje żółty, oznacza to, że reakcja jest zakończona).
5. Ponownie rozpuścić produkt w bezwodnym DMF (10-20 ml) i powtórzyć wytrącanie i odwirowywanie (patrz krok 1.4).
6. Powtórz krok 1,5, a następnie przemyj osad polimerowy trzykrotnie lodowatym eterem.
7. Przenieść osad polimerowy 1 do czystej kolby reakcyjnej i podłączyć kolbę do źródła wysokiej próżni w celu usunięcia pozostałości eteru.
8. Przygotować i dodać około 20-30 ml 20% (v/v) 4-metylopiperirydyny w DMF do polimeru pośredniego 1. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia. Uruchom reakcję na 3 godziny.
9. Wykonaj TLC¹⁶ i test Kaisera (kolor niebieski potwierdza obecność wolnego NH₂)¹⁷ (patrz krok 1.4), aby potwierdzić zakończenie reakcji. Jeśli reakcja jest zakończona, należy przejść do wytrącania eteru, jak wspomniano dla produktu 1 (kroki 1.4-1.6).
10. Wysuszyć produkt polimerowy 2 (MeO-PEG^5K-Lys(NH₂)₂) w próżni.
11. Przeprowadzić jeszcze jedną rundę sprzężenia (Fmoc)₂Lys-OH na pośrodku 2 (kroki 1.1-1.7), aby wytworzyć produkt 3 (MeO-PEG^5K-Lys(Lys(NH-Fmoc)₂)₂). Odchroń (kroki 1.8-1.10) grupy Fmoc (4, MeO-PEG^5K-Lys(Lys(NH₂)₂)₂) i sprzęgnij (kroki 1.1-1.7) (Fmoc)Lys(Boc)-OH w celu wygenerowania dendrytycznej polilizyny trzeciej generacji (5, MeO-PEG 5k-Lys-Lys₂-((Fmoc)Lys(Boc))₄) zakończonej czterema grupami Boc i Fmoc na jednym końcu łańcucha PEG.
12. Przenieść otrzymany polimer pośredni 5 do kolby reakcyjnej. W oddzielnej kolbie reakcyjnej przygotować kwas trifluorooctowy (TFA) w stosunku 1:1 (v/v) w dichlorometanie (DCM). Dodać 15-20 ml mieszaniny 1:1 TFA/DCM (v/v) do polimeru pośredniego 5. Mieszaj mieszaninę, aż polimer całkowicie się rozpuści. Mieszaj przez dodatkowe 3 godziny.
13. Wykonaj TLC¹⁶ i test Kaisera (kolor niebieski potwierdza obecność wolnego NH₂)¹⁷ (patrz krok 1.4), aby potwierdzić zakończenie reakcji. Jeśli reakcja jest zakończona, odparować mieszaninę polimeru w TFA/DCM z powietrzem aż do uzyskania lepkiego roztworu. Przejdź do wytrącania eteru, jak wspomniano dla produktu 1 (kroki 1.4-1.6). Wysuszyć produkt polimerowy 6 (MeO-PEG 5k-Lys-Lys₂-((Fmoc)Lys(NH₂))4) w próżni
.
14. Przenieść pośredni polimer 6 do kolby reakcyjnej. Użyć około 40 ml bezwodnego DMF zawierającego 8 równoważników N,N-diizopropyloetyloaminy (DIEA) do rozpuszczenia polimeru pośredniego 6. W szklanej zlewce rozpuścić 12 ekwiwalentów HOBt, 12 ekwiwalentów DIC i 12 ekwiwalentów (Fmoc)Cys(Trt)-OH w 20-25 ml bezwodnego DMF. Wstrząsać przez 10-15 minut, a następnie dodać mieszaninę reakcyjną do kolby reakcyjnej zawierającej 6 składników. Uruchom reakcję przez noc.
15. Potwierdzić zakończenie reakcji za pomocą TLC¹⁶ i testu Kaisera (patrz krok 1.4; żółty kolor oznacza brak wolnego NH₂)¹⁷. Jeśli reakcja jest zakończona, przystąpić do wytrącania eteru, jak wspomniano dla produktu 1 (etap 1.4-1.6), w celu wyizolowania produktu 7 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys₂-((Fmoc)Lys-((Fmoc)Cys(Trt)))₄.
16. Wykonaj de-protection Fmoc na 7, jak opisano w kroku 1.8, aby uzyskać produkt 8 (PEG 5K-Lys-Lys₂-(Lys(NH₂)-(Cys(NH₂)(Trt))₎₄). Para (Fmoc)-PEG 2-Suc-OH (łącznik "Ebes", odpowiednik 24) na półprodukcie polimerowym przy użyciu procedury opisanej powyżej dla sprzężenia za pośrednictwem HOBt/DIC w celu otrzymania produktu pośredniego 9 (MeO-PEG^5K-Lys-Lys _{2-Lys 4}-(Cys(Trt))₄(Ebes(NH-Fmoc))₈).
17. Wykonaj jeszcze jedną rundę de-protection Fmoc (kroki 1.6-1.8), aby uzyskać pośrednie 10 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys_2-Lys 4-(Cys(Trt))₄(Ebes(NH₂))₈).
18. Przenieść półprodukt polimerowy 10 do kolby reakcyjnej i dodać bezwodny DMF (około 30-40 ml) w celu jego rozpuszczenia. W innej kolbie reakcyjnej rozpuścić 24 równoważniki CAOSu (przygotowanego zgodnie z poprzednio opublikowaną procedurą) w bezwodnym DMF (20-30 ml)¹⁸. Dodać 48 ekwiwalentów N,N-diizopropyloetyloaminy i mieszać przez 10-15 minut. Przenieść zawartość do kolby reakcyjnej zawierającej 10 roztworów i pozostawić reakcję na noc.
19. Potwierdzić zakończenie reakcji za pomocą TLC¹⁶ i testu Kaisera (patrz krok 1.4; żółty kolor oznacza brak wolnego NH₂)¹⁷. Jeśli reakcja jest zakończona, należy przystąpić do wytrącania eteru, jak wspomniano dla produktu 1 (kroki 1.4-1.6) w celu wyizolowania produktu 11 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys_{2-Lys 4}-(Cys(Trt))_{4-Ebes 8-CA 8}). Dializuj go w wodzie dejonizowanej i liofilizuj próbkę, aby uzyskać biały proszek.
20. Umieścić półprodukt polimeru 11 w kolbie reakcyjnej. Przygotować i dodać 20 ml mieszaniny TFA/1,2-etaneditiol (EDT)/trietylosilan (TIS)/H₂O (94/2,5/1/2,5, v/v) do roztworu polimeru. Mieszaj mieszaninę aż do całkowitego rozpuszczenia. Uruchom reakcję na 4 godziny. Potwierdzić zakończenie reakcji za pomocą TLC¹⁶.
21. Pod wyciągiem wdmuchiwać powietrze do mieszaniny polimerów TFA/EDT/TIS/H₂O, aż roztwór stanie się lepki. Przystąpić do wytrącania eteru, jak wspomniano dla produktu 1 (kroki 1.4-1.6), w celu wyizolowania produktu końcowego 12 (PEG^5K-Cys 4-Ebes _{8-CA 8}). Rozpuść go w acetonitrylu i liofilizuj, aby uzyskać biały proszek.

2. Przygotowanie miceli z PTX

1. Przygotuj micelę PEG^5K-Cys 4-Ebes _{8-CA 8} obciążoną PTX, stosując standardową metodę odparowywania.
   1. Rozpuścić 20 mg TD z inną ilością PTX (1-9 mg) w 1 ml chloroformu (_{CHCl 3}). Usunąć rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej, aby uzyskać jednorodny, suchy film polimerowy. Ponownie rozpuścić film w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą wiru, a następnie sonikować przez 30 minut przy 40 kHz, jeśli to konieczne, aby umożliwić utworzenie miceli obciążonych lekiem.
   2. Dodać 6 μl 3% (w/w)_H2O2 (1 ekwiwalent w celu uwolnienia grup tiolowych) w celu utlenienia grup tiolowych na TD. Roztwór miceli należy wykorzystać do dalszej charakterystyki, gdy poziom wolnych grup tiolowych utrzymuje się na stałych, niskich wartościach, jak wskazano w teście Ellmana¹⁹.
   3. Przefiltruj roztwór za pomocą filtra 0,22 μm, aby wysterylizować próbkę. Przeanalizuj ilość leku załadowanego do miceli w systemie HPLC²⁰ po uwolnieniu leków z miceli poprzez dodanie 9 razy acetonitrylu i wykonanie 10 minut sonikacji. Użyć kolumny C18 do HPLC z acetonitrylem/wodą jako fazą ruchomą.
   4. Obliczyć obciążenie lekiem zgodnie z krzywą kalibracyjną między wartościami powierzchni HPLC a stężeniami wzorca leku¹¹.
      UWAGA: Wydajność ładowania definiuje się jako stosunek leku załadowanego do miceli do początkowej zawartości leku.

3. Charakterystyka miceli

1. Zmierz rozmiar i rozkład wielkości miceli za pomocą przyrządu do dynamicznego rozpraszania światła (DLS)²⁹. Pomiary należy wykonywać w temperaturze pokojowej i utrzymywać stężenie miceli na poziomie 1 mg/ml.
   UWAGA: Aby przeprowadzić analizę wielkości cząstek, użyj PBS jako ślepej próby, a następnie zapisz wielkość cząstek dla rzeczywistych próbek. Wykonaj odczyty w trzech egzemplarzach dla próbek, a następnie uśrednij odczyty.
2. Użyj widm fluorescencyjnych do pomiaru krytycznego stężenia micelarnego (CMC) PEG^5K-Cys _{4-Ebes 8-CA 8} przed i po sieciowaniu z pirenem jako hydrofobową sondą fluorescencyjną, jak opisano wcześniej^13,21.
   UWAGA: Zazwyczaj stężenie miceli waha się od 5×^10-7 do 5×^10-4 M.

4. Stabilność miceli w SDS z lub bez środków redukujących

1. Przygotować roztwory podstawowe roztworu dodecylosiarczanu sodu (SDS) (7,5 mg/ml) i miceli usieciowanych dwusiarczków (1,5 mg/ml) w PBS. Następnie, używając roztworów podstawowych, przygotować mieszaninę roztworów, w której końcowe stężenie SDS wynosi 2,5 mg/ml, a stężenie miceli wynosi 1,0 mg/ml.
2. Zmierzyć wielkość i rozkład wielkości (jak wspomniano w kroku 3.1) roztworów miceli w określonych odstępach czasu, z obecnością 10 mM glutationu (GSH) lub bez niej.

5. Test hemolizy

1. Oceń potencjał hemolityczny nieusieciowanych miceli (PTX-NCM) obciążonych PTX przygotowanych zgodnie z wcześniej opublikowaną procedurą¹¹ i miceli usieciowanych ładowanych PTX (PTX-DCM) przy użyciu świeżej krwi cytrynianowej od nagich myszy pobranych z zasłony ogonowej.
   1. Zebrać czerwone krwinki przez odwirowanie próbki krwi (1,0 ml) o sile 1,000 x g przez 10 minut, przemyć je trzykrotnie PBS, a następnie ponownie zawiesić granulki komórek za pomocą PBS do końcowego stężenia 2%.
2. Zmieszać 200 μl zawiesiny erytrocytów o różnych stężeniach (0,2 i 1,0 mg/ml) odpowiednio PTX-NCM i PTX-DCM i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w wytrząsarce inkubatora.
3. Odwirować mieszaniny micela i erytrocyty przy 3 000 x g przez 5 minut. Przenieść 100 μl supernatantu ze wszystkich próbek na płytkę 96-dołkową. Zmierzyć absorbancję wolnej hemoglobiny w supernatancie przy długości fali 540 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
   UWAGA: Erytrocyty inkubowane z Tritonem-100 (2%) i PBS należy stosować odpowiednio jako kontrole dodatnie i ujemne. Procentową hemolizę krwinek czerwonych oblicza się według następującego wzoru: hemoliza krwinek czerwonych = (_próbka OD -_{kontrola ujemna} OD)/(_{kontrola pozytywna} OD -_{kontrola ujemna} OD) × 100%.

Wyniki

Przygotowanie i charakterystyka miceli usieciowanych dwusiarczkowymi naładowanymi lekami

Amfifilowy polimer PEG^5K-Cys _{4-Ebes 8-CA 8} to dendrytyczny polimer zdolny do tworzenia dwusiarczkowego usieciowanego układu micelarnego do dostarczania leków przeciwnowotworowych. Strukturalnie definiuje się go jako dendrytyczny oligomer kwasów cholowych (domena hydrofobowa) połączony z jednym końcem liniowej cząs...

Dyskusja

Zbadano kilka nanocząstek pod kątem ich potencjalnego zastosowania w dostarczaniu leków. Liposomalne nanoagregaty albuminy surowicy ludzkiej obciążone doksorubicyną i paklitakselem (PTX) należą do nanoterapeutyków zatwierdzonych przez FDA do leczenia raka. Jednak, chociaż klinicznie skuteczne, obie te nanoterapie mają stosunkowo "duże" rozmiary i mają tendencję do gromadzenia się w wątrobie i płucach. Polimerowe micele o stosunkowo mniejszych rozmiarach cząstek i większej zdolności ładowania leków stają się nowymi nośnik...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MeO-PEG5K-NH2	Rapp Polymere	125000-2
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH	Aaptec	AFK107
Fmoc-Lys(Boc)-OH	Anaspec	AS-20132
Fmoc-Cys(Trt)-OH	Aapptec	AAC105
Dimetyloformamid	Fisher Scientific	BP1160-4
Eter etylowy	Fisher Scientific	E134-20
N,N-Diisopropyloetyloamina	Sigma Aldrich	D125806
Kwas trifluorooctowy	Sigma Aldrich	T6508	, obchodź się z
4-metylopierydyną	Alfa-Aesar	L-02709
Łącznik Ebes	Anaspec	AS-61924
Kwas cholowy	Sigma Aldrich	C1129
1,2-Ethanedithiol	Sigma Aldrich	02390	Uchwyt wewnątrz dygestorio. Rękawice wybielające po użyciu.
Triizopropylosilan	Sigma Aldrich	233781
Chloroform (bezwodny)	Sigma Aldrich	288306
Roztwór nadtlenku wodoru 30%	Aaron Industries	NA
HoBt-Cl	Aaptec	CXZ096
DIC	Sigma Aldrich	D125407
Samice atymicznych nagich myszy (szczep Nu/Nu), 6– 8 tygodni	Harlan (Livermore, Kalifornia)