Łatwe i wydajne podejście do produkcji odwracalnych miceli usieciowanych dwusiarczkowym

Podsumowanie

Aby dostarczyć leki przeciwnowotworowe do miejsc nowotworowych o wysokiej swoistości i zmniejszonych skutkach ubocznych, potrzebne są nowe metody oparte na nanocząsteczkach. Tutaj opisujemy usieciowane micele dwusiarczkowe, które można łatwo przygotować przez utlenianie za pośrednictwem nadtlenku wodoru i są w stanie skutecznie dysocjować w środowisku redukującym guza, aby uwolnić ładunki.

Streszczenie

Nanomedycyna to nowa forma terapii, która wykorzystuje unikalne właściwości cząsteczek o skali nanometrów do zastosowań biomedycznych. Poprawa dostarczania leków w celu maksymalizacji wyników terapeutycznych i zmniejszenia skutków ubocznych związanych z lekami to tylko niektóre z kamieni węgielnych współczesnej nanomedycyny. W szczególności nanocząstki znalazły szerokie zastosowanie w leczeniu raka. Przewiduje się, że nanocząstki, które oferują wysoki stopień elastyczności w projektowaniu, stosowaniu i produkcji w oparciu o mikrośrodowisko guza, będą bardziej skuteczne dzięki szybkiemu przełożeniu na praktykę kliniczną. Polimerowy nanonośnik micelarny jest popularnym wyborem do zastosowań związanych z dostarczaniem leków.

W tym artykule opisujemy prosty i skuteczny protokół syntezy naładowanych lekami, usieciowanych dwusiarczków w oparciu o samoorganizację dobrze zdefiniowanego amfifilowego kopolimeru liniowo-dendrytycznego (telodendrymer, TD). TD składa się z glikolu polietylenowego (PEG) jako segmentu hydrofilowego i tiolowanego klastra kwasu cholowego jako hydrofobowego ugrupowania tworzącego rdzeń, przyłączonego stopniowo do PEG zakończonego aminami przy użyciu chemii peptydów na bazie roztworu. Leki stosowane w chemioterapii, takie jak paklitaksel (PTX), mogą być ładowane przy użyciu standardowej metody odparowywania rozpuszczalnika. Utlenianie za pośrednictwem_O2 było wcześniej wykorzystywane do tworzenia wewnątrzmicelarnych wiązań krzyżowych dwusiarczku z wolnych grup tiolowych na TD. Reakcja była jednak powolna i niemożliwa do zrealizowania przy produkcji na dużą skalę. Niedawno zbadano metodę utleniania za pośrednictwem_H2O2jako bardziej wykonalne i wydajne podejście, która była 96 razy szybsza niż poprzednio opisana metoda. Dzięki temu podejściu udało się wyprodukować 50 g nanocząstek usieciowanych dwusiarczkiem obciążonych PTX o wąskim rozkładzie wielkości cząstek i wysokiej wydajności ładowania leku. Stabilność otrzymanego roztworu miceli jest analizowana przy użyciu warunków zakłócających, takich jak jednoczesna inkubacja z detergentem, dodecylosiarczanem sodu, z lub bez środka redukującego. Naładowane lekiem, usieciowane dwusiarczkowe micele wykazywały mniejszą aktywność hemolityczną w porównaniu z ich nieusieciowanymi odpowiednikami.

Wprowadzenie

Nanotechnologia to szybko rozwijająca się dziedzina, która przyniosła korzyści wielu dziedzinom biomedycznym¹. Nanocząstki dają możliwości projektowania i dostrajania właściwości, które nie są możliwe do uzyskania w przypadku innych rodzajów konwencjonalnych terapii. Nanonośniki zwiększają stabilność leków przed biodegradacją, wydłużają czas obiegu leków, rozwiązują problemy z rozpuszczalnością leków i mogą być precyzyjnie dostrojone do celowanego dostarczania leków i do współdostarczania środków obrazowania^1,2. Systemy dostarczania oparte na nanocząstkach są obiecujące w obrazowaniu i leczeniu nowotworów. Naczynia krwionośne guza są nieszczelne dla makrocząsteczek i mogą prowadzić do preferencyjnej akumulacji krążących nanocząstek w miejscach guza poprzez efekt zwiększonej przepuszczalności i retencji (EPR)³. Spośród kilku nanonośników (np. liposomów, hydrożeli i miceli polimerowych), które są aktywnie poszukiwane jako nośniki leków przeciwnowotworowych, micele polimerowe zyskały dużą popularność w ciągu ostatniej dekady^4,5.

Micele polimerowe to system termodynamiczny, który po podaniu dożylnym może potencjalnie zostać rozcieńczony poniżej krytycznego stężenia miceli (CMC), co prowadzi do ich dysocjacji na unimery. Zastosowano strategie sieciowania w celu zminimalizowania dysocjacji micelarnej na unimery. Jednak nadmiernie ustabilizowane micele mogą zapobiegać uwalnianiu leku w miejscach docelowych, zmniejszając w ten sposób ogólną skuteczność terapeutyczną. Zbadano kilka podejść chemicznych w celu urozdzielenia sieciowania w odpowiedzi na redoks lub bodźce zewnętrzne, takie jak redukowalne wiązania dwusiarczkowe^6,7 i rozszczepialne pH⁸ lub hydrolizowalne wiązania estrowe^9,10.

Wcześniej informowaliśmy o projektowaniu i syntezie nanocząsteczek micelarnych składających się z bloków dendrytycznego kwasu cholowego (CA) i liniowych kopolimerów glikolu polietylenowego (PEG), określanych jako telodendrimery (TD)^11-15. Te TD są reprezentowane jako PEG^nK-CAy (gdzie n = masa cząsteczkowa w kilodaltonach (K), y = liczba jednostek kwasu cholowego (CA)). Charakteryzują się niewielkimi rozmiarami, długim okresem trwałości i wysoką skutecznością w kapsułkowaniu leków takich jak paklitaksel (PTX) i doksorubicyna (DOX) w rdzeniu hydrofobowym. Elementy budulcowe TD, takie jak PEG, lizyna i CA, są biokompatybilne, a obecność korony PEG może nadać charakter nanocząstek "stealth", zapobiegając niespecyficznemu wychwytowi nanocząstek micelarnych przez układy siateczkowo-śródbłonkowe.

Tiolowane liniowo-dendrytyczne polimery mogą być łatwo generowane przez wprowadzenie cystein do dendrytycznego szkieletu oligolizynowego naszych standardowych TD. W artykule przedstawiono prosty protokół wytwarzania odwracalnie usieciowanego systemu dostarczania leków micelarnych poprzez wprowadzenie usieciowania dwusiarczkowego do hydrofobowego rdzenia TD (ryc. 1).

Protokół

Oświadczenie etyczne: Samice nagich myszy atymicznych (szczep Nu/Nu), w wieku 6-8 tygodni, zostały zakupione, a następnie trzymane w warunkach wolnych od patogenów zgodnie z wytycznymi AAALAC i pozwolono im na aklimatyzację przez co najmniej 4 dni przed jakimikolwiek eksperymentami. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zgodnie z protokołem nr 07-13119 i nr 09-15584, zatwierdzonym przez Administracyjny Komitet Doradczy ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis.

1. Synteza TD PEG^5K-Cys 4-Ebes _{8-CA 8}

1. W kolbie okrągłodennej rozpuścić MeO-PEG^5K-NH ₂ (2 g, 0,4 mmol) w 10-20 ml bezwodnego dimetyloformamidu (DMF) i schłodzić na lodzie.
2. W szklanej zlewce rozpuścić 3 równoważniki 1-hydroksy-6-chloro-benzotriazolu (HOBt), 3 równoważniki N,N'-diizopropylokarbodimidu (DIC) i 3 równoważniki (Fmoc)₂Lys-OH w bezwodnym DMF (10-15 ml). Mieszaj przez 15-20 minut na magnetycznej płytce mieszającej.
3. Dodać mieszaninę do kolby reakcyjnej zawierającej MeO-PEG^5K-NH _2. Usunąć łaźnię lodową i mieszać mieszaninę reakcyjną przez noc w temperaturze pokojowej.
4. Potwierdzić zakończenie reakcji za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)¹⁶ i testu Kaisera¹⁷ (żółty kolor oznacza brak wolnego_NH2). Wytrącić produkt polimerowy 1 (MeO-PEG^5K-Lys(NH-Fmoc)₂) przez dodanie około 200 ml lodowatego eteru do kolby reakcyjnej. Oddzielić wytrącony polimer przez odwirowanie (6 min w temperaturze 6 000 x g i temperaturze 4 °C).
   1. Aby wykonać TLC, należy umieścić próbki na płytkach TLC pokrytych żelem krzemionkowym. Jako fazę ruchomą należy użyć dichlorometanu/metanolu (9:1). Obserwuj plamy pod lampą UV po wywołaniu płytek TLC. Można również użyć odczynnika barwiącego ninhydrynę, aby uwidocznić plamy aminowe na gorącej płycie.
   2. W teście Kaisera umieść niewielką część próbki w szklanej probówce zawierającej odczynnik Kaisera. Podgrzewać w temperaturze 100 °C przez 5 minut i szukać zmiany koloru (jeśli kolor roztworu pozostaje żółty, oznacza to, że reakcja jest zakończona).
5. Ponownie rozpuścić produkt w bezwodnym DMF (10-20 ml) i powtórzyć wytrącanie i odwirowywanie (patrz krok 1.4).
6. Powtórz krok 1,5, a następnie przemyj osad polimerowy trzykrotnie lodowatym eterem.
7. Przenieść osad polimerowy 1 do czystej kolby reakcyjnej i podłączyć kolbę do źródła wysokiej próżni w celu usunięcia pozostałości eteru.
8. Przygotować i dodać około 20-30 ml 20% (v/v) 4-metylopiperirydyny w DMF do polimeru pośredniego 1. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia. Uruchom reakcję na 3 godziny.
9. Wykonaj TLC¹⁶ i test Kaisera (kolor niebieski potwierdza obecność wolnego NH₂)¹⁷ (patrz krok 1.4), aby potwierdzić zakończenie reakcji. Jeśli reakcja jest zakończona, należy przejść do wytrącania eteru, jak wspomniano dla produktu 1 (kroki 1.4-1.6).
10. Wysuszyć produkt polimerowy 2 (MeO-PEG^5K-Lys(NH₂)₂) w próżni.
11. Przeprowadzić jeszcze jedną rundę sprzężenia (Fmoc)₂Lys-OH na pośrodku 2 (kroki 1.1-1.7), aby wytworzyć produkt 3 (MeO-PEG^5K-Lys(Lys(NH-Fmoc)₂)₂). Odchroń (kroki 1.8-1.10) grupy Fmoc (4, MeO-PEG^5K-Lys(Lys(NH₂)₂)₂) i sprzęgnij (kroki 1.1-1.7) (Fmoc)Lys(Boc)-OH w celu wygenerowania dendrytycznej polilizyny trzeciej generacji (5, MeO-PEG 5k-Lys-Lys₂-((Fmoc)Lys(Boc))₄) zakończonej czterema grupami Boc i Fmoc na jednym końcu łańcucha PEG.
12. Przenieść otrzymany polimer pośredni 5 do kolby reakcyjnej. W oddzielnej kolbie reakcyjnej przygotować kwas trifluorooctowy (TFA) w stosunku 1:1 (v/v) w dichlorometanie (DCM). Dodać 15-20 ml mieszaniny 1:1 TFA/DCM (v/v) do polimeru pośredniego 5. Mieszaj mieszaninę, aż polimer całkowicie się rozpuści. Mieszaj przez dodatkowe 3 godziny.
13. Wykonaj TLC¹⁶ i test Kaisera (kolor niebieski potwierdza obecność wolnego NH₂)¹⁷ (patrz krok 1.4), aby potwierdzić zakończenie reakcji. Jeśli reakcja jest zakończona, odparować mieszaninę polimeru w TFA/DCM z powietrzem aż do uzyskania lepkiego roztworu. Przejdź do wytrącania eteru, jak wspomniano dla produktu 1 (kroki 1.4-1.6). Wysuszyć produkt polimerowy 6 (MeO-PEG 5k-Lys-Lys₂-((Fmoc)Lys(NH₂))4) w próżni
.
14. Przenieść pośredni polimer 6 do kolby reakcyjnej. Użyć około 40 ml bezwodnego DMF zawierającego 8 równoważników N,N-diizopropyloetyloaminy (DIEA) do rozpuszczenia polimeru pośredniego 6. W szklanej zlewce rozpuścić 12 ekwiwalentów HOBt, 12 ekwiwalentów DIC i 12 ekwiwalentów (Fmoc)Cys(Trt)-OH w 20-25 ml bezwodnego DMF. Wstrząsać przez 10-15 minut, a następnie dodać mieszaninę reakcyjną do kolby reakcyjnej zawierającej 6 składników. Uruchom reakcję przez noc.
15. Potwierdzić zakończenie reakcji za pomocą TLC¹⁶ i testu Kaisera (patrz krok 1.4; żółty kolor oznacza brak wolnego NH₂)¹⁷. Jeśli reakcja jest zakończona, przystąpić do wytrącania eteru, jak wspomniano dla produktu 1 (etap 1.4-1.6), w celu wyizolowania produktu 7 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys₂-((Fmoc)Lys-((Fmoc)Cys(Trt)))₄.
16. Wykonaj de-protection Fmoc na 7, jak opisano w kroku 1.8, aby uzyskać produkt 8 (PEG 5K-Lys-Lys₂-(Lys(NH₂)-(Cys(NH₂)(Trt))₎₄). Para (Fmoc)-PEG 2-Suc-OH (łącznik "Ebes", odpowiednik 24) na półprodukcie polimerowym przy użyciu procedury opisanej powyżej dla sprzężenia za pośrednictwem HOBt/DIC w celu otrzymania produktu pośredniego 9 (MeO-PEG^5K-Lys-Lys _{2-Lys 4}-(Cys(Trt))₄(Ebes(NH-Fmoc))₈).
17. Wykonaj jeszcze jedną rundę de-protection Fmoc (kroki 1.6-1.8), aby uzyskać pośrednie 10 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys_2-Lys 4-(Cys(Trt))₄(Ebes(NH₂))₈).
18. Przenieść półprodukt polimerowy 10 do kolby reakcyjnej i dodać bezwodny DMF (około 30-40 ml) w celu jego rozpuszczenia. W innej kolbie reakcyjnej rozpuścić 24 równoważniki CAOSu (przygotowanego zgodnie z poprzednio opublikowaną procedurą) w bezwodnym DMF (20-30 ml)¹⁸. Dodać 48 ekwiwalentów N,N-diizopropyloetyloaminy i mieszać przez 10-15 minut. Przenieść zawartość do kolby reakcyjnej zawierającej 10 roztworów i pozostawić reakcję na noc.
19. Potwierdzić zakończenie reakcji za pomocą TLC¹⁶ i testu Kaisera (patrz krok 1.4; żółty kolor oznacza brak wolnego NH₂)¹⁷. Jeśli reakcja jest zakończona, należy przystąpić do wytrącania eteru, jak wspomniano dla produktu 1 (kroki 1.4-1.6) w celu wyizolowania produktu 11 (MeO-PEG 5K-Lys-Lys_{2-Lys 4}-(Cys(Trt))_{4-Ebes 8-CA 8}). Dializuj go w wodzie dejonizowanej i liofilizuj próbkę, aby uzyskać biały proszek.
20. Umieścić półprodukt polimeru 11 w kolbie reakcyjnej. Przygotować i dodać 20 ml mieszaniny TFA/1,2-etaneditiol (EDT)/trietylosilan (TIS)/H₂O (94/2,5/1/2,5, v/v) do roztworu polimeru. Mieszaj mieszaninę aż do całkowitego rozpuszczenia. Uruchom reakcję na 4 godziny. Potwierdzić zakończenie reakcji za pomocą TLC¹⁶.
21. Pod wyciągiem wdmuchiwać powietrze do mieszaniny polimerów TFA/EDT/TIS/H₂O, aż roztwór stanie się lepki. Przystąpić do wytrącania eteru, jak wspomniano dla produktu 1 (kroki 1.4-1.6), w celu wyizolowania produktu końcowego 12 (PEG^5K-Cys 4-Ebes _{8-CA 8}). Rozpuść go w acetonitrylu i liofilizuj, aby uzyskać biały proszek.

2. Przygotowanie miceli z PTX

1. Przygotuj micelę PEG^5K-Cys 4-Ebes _{8-CA 8} obciążoną PTX, stosując standardową metodę odparowywania.
   1. Rozpuścić 20 mg TD z inną ilością PTX (1-9 mg) w 1 ml chloroformu (_{CHCl 3}). Usunąć rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej, aby uzyskać jednorodny, suchy film polimerowy. Ponownie rozpuścić film w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) za pomocą wiru, a następnie sonikować przez 30 minut przy 40 kHz, jeśli to konieczne, aby umożliwić utworzenie miceli obciążonych lekiem.
   2. Dodać 6 μl 3% (w/w)_H2O2 (1 ekwiwalent w celu uwolnienia grup tiolowych) w celu utlenienia grup tiolowych na TD. Roztwór miceli należy wykorzystać do dalszej charakterystyki, gdy poziom wolnych grup tiolowych utrzymuje się na stałych, niskich wartościach, jak wskazano w teście Ellmana¹⁹.
   3. Przefiltruj roztwór za pomocą filtra 0,22 μm, aby wysterylizować próbkę. Przeanalizuj ilość leku załadowanego do miceli w systemie HPLC²⁰ po uwolnieniu leków z miceli poprzez dodanie 9 razy acetonitrylu i wykonanie 10 minut sonikacji. Użyć kolumny C18 do HPLC z acetonitrylem/wodą jako fazą ruchomą.
   4. Obliczyć obciążenie lekiem zgodnie z krzywą kalibracyjną między wartościami powierzchni HPLC a stężeniami wzorca leku¹¹.
      UWAGA: Wydajność ładowania definiuje się jako stosunek leku załadowanego do miceli do początkowej zawartości leku.

3. Charakterystyka miceli

1. Zmierz rozmiar i rozkład wielkości miceli za pomocą przyrządu do dynamicznego rozpraszania światła (DLS)²⁹. Pomiary należy wykonywać w temperaturze pokojowej i utrzymywać stężenie miceli na poziomie 1 mg/ml.
   UWAGA: Aby przeprowadzić analizę wielkości cząstek, użyj PBS jako ślepej próby, a następnie zapisz wielkość cząstek dla rzeczywistych próbek. Wykonaj odczyty w trzech egzemplarzach dla próbek, a następnie uśrednij odczyty.
2. Użyj widm fluorescencyjnych do pomiaru krytycznego stężenia micelarnego (CMC) PEG^5K-Cys _{4-Ebes 8-CA 8} przed i po sieciowaniu z pirenem jako hydrofobową sondą fluorescencyjną, jak opisano wcześniej^13,21.
   UWAGA: Zazwyczaj stężenie miceli waha się od 5×^10-7 do 5×^10-4 M.

4. Stabilność miceli w SDS z lub bez środków redukujących

1. Przygotować roztwory podstawowe roztworu dodecylosiarczanu sodu (SDS) (7,5 mg/ml) i miceli usieciowanych dwusiarczków (1,5 mg/ml) w PBS. Następnie, używając roztworów podstawowych, przygotować mieszaninę roztworów, w której końcowe stężenie SDS wynosi 2,5 mg/ml, a stężenie miceli wynosi 1,0 mg/ml.
2. Zmierzyć wielkość i rozkład wielkości (jak wspomniano w kroku 3.1) roztworów miceli w określonych odstępach czasu, z obecnością 10 mM glutationu (GSH) lub bez niej.

5. Test hemolizy

1. Oceń potencjał hemolityczny nieusieciowanych miceli (PTX-NCM) obciążonych PTX przygotowanych zgodnie z wcześniej opublikowaną procedurą¹¹ i miceli usieciowanych ładowanych PTX (PTX-DCM) przy użyciu świeżej krwi cytrynianowej od nagich myszy pobranych z zasłony ogonowej.
   1. Zebrać czerwone krwinki przez odwirowanie próbki krwi (1,0 ml) o sile 1,000 x g przez 10 minut, przemyć je trzykrotnie PBS, a następnie ponownie zawiesić granulki komórek za pomocą PBS do końcowego stężenia 2%.
2. Zmieszać 200 μl zawiesiny erytrocytów o różnych stężeniach (0,2 i 1,0 mg/ml) odpowiednio PTX-NCM i PTX-DCM i inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C w wytrząsarce inkubatora.
3. Odwirować mieszaniny micela i erytrocyty przy 3 000 x g przez 5 minut. Przenieść 100 μl supernatantu ze wszystkich próbek na płytkę 96-dołkową. Zmierzyć absorbancję wolnej hemoglobiny w supernatancie przy długości fali 540 nm za pomocą czytnika mikropłytek.
   UWAGA: Erytrocyty inkubowane z Tritonem-100 (2%) i PBS należy stosować odpowiednio jako kontrole dodatnie i ujemne. Procentową hemolizę krwinek czerwonych oblicza się według następującego wzoru: hemoliza krwinek czerwonych = (_próbka OD -_{kontrola ujemna} OD)/(_{kontrola pozytywna} OD -_{kontrola ujemna} OD) × 100%.

Wyniki

Przygotowanie i charakterystyka miceli z obciążeniem lekiem, sieciowanych mostkami dwusiarczkowymi

Amfifilowy polimer PEG^5K-Cys₄-Ebes₈-CA₈ jest polimerem dendrytycznym zdolnym do tworzenia sieciowanego mostkami disiarczkowymi układu micelarnego do dostarczania leków przeciwnowotworowych. Pod względem strukturalnym jest on zdefiniowany jako oligomer dendrytyczny kwasów cholicznych (domena hydrofobowa) ...

Dyskusja

Zbadano kilka nanocząstek pod kątem ich potencjalnego zastosowania w dostarczaniu leków. Liposomalne nanoagregaty albuminy surowicy ludzkiej obciążone doksorubicyną i paklitakselem (PTX) należą do nanoterapeutyków zatwierdzonych przez FDA do leczenia raka. Jednak, chociaż klinicznie skuteczne, obie te nanoterapie mają stosunkowo "duże" rozmiary i mają tendencję do gromadzenia się w wątrobie i płucach. Polimerowe micele o stosunkowo mniejszych rozmiarach cząstek i większej zdolności ładowania leków stają się nowymi nośnik...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MeO-PEG5K-NH2	Rapp Polymere	125000-2
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH	Aaptec	AFK107
Fmoc-Lys(Boc)-OH	Anaspec	AS-20132
Fmoc-Cys(Trt)-OH	Aapptec	AAC105
Dimetyloformamid	Fisher Scientific	BP1160-4
Eter etylowy	Fisher Scientific	E134-20
N,N-Diisopropyloetyloamina	Sigma Aldrich	D125806
Kwas trifluorooctowy	Sigma Aldrich	T6508	, obchodź się z
4-metylopierydyną	Alfa-Aesar	L-02709
Łącznik Ebes	Anaspec	AS-61924
Kwas cholowy	Sigma Aldrich	C1129
1,2-Ethanedithiol	Sigma Aldrich	02390	Uchwyt wewnątrz dygestorio. Rękawice wybielające po użyciu.
Triizopropylosilan	Sigma Aldrich	233781
Chloroform (bezwodny)	Sigma Aldrich	288306
Roztwór nadtlenku wodoru 30%	Aaron Industries	NA
HoBt-Cl	Aaptec	CXZ096
DIC	Sigma Aldrich	D125407
Samice atymicznych nagich myszy (szczep Nu/Nu), 6– 8 tygodni	Harlan (Livermore, Kalifornia)