Badania przesiewowe pod kątem aktywności hormonalnej w wodzie przy użyciu dostępnych na rynku testów biologicznych transaktywacji in vitro

Podsumowanie

Protokół badania przesiewowego pod kątem aktywności endokrynologicznej w organicznych ekstraktach próbek wody, w tym ścieków oczyszczonych i wód powierzchniowych (odbierających), został dostosowany przy użyciu dostępnych na rynku testów biologicznych in vitro transaktywacji z zatrzymaniem ("zamrożenie i rozmrożenie").

Streszczenie

Testy biologiczne transaktywacji in vitro okazały się obiecujące jako narzędzia do monitorowania jakości wody, jednak ich przyjęcie i powszechne zastosowanie było utrudnione częściowo z powodu braku ustandaryzowanych metod i dostępności solidnej, przyjaznej dla użytkownika technologii. W tym badaniu, dostępnym na rynku, linie komórkowe z zatrzymanym podziałem wykorzystano do ilościowego badania przesiewowego pod kątem aktywności hormonalnej substancji chemicznych obecnych w próbkach wody, które są przedmiotem zainteresowania specjalistów ds. jakości środowiska. Opracowano pojedynczy, ustandaryzowany protokół, który obejmował kompleksowe kontrole zapewnienia jakości/kontroli jakości (QA/QC) dla aktywności receptorów estrogenowych i glikokortykosteroidowych (odpowiednio ER i GR) przy użyciu komórkowego testu transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET). Próbki oczyszczonych ścieków komunalnych i wód powierzchniowych z systemów słodkowodnych w Kalifornii (USA) zostały wyekstrahowane za pomocą ekstrakcji do fazy stałej i przeanalizowane pod kątem aktywności hormonalnej przy użyciu znormalizowanego protokołu. Kontekst i dawka-odpowiedź dla referencyjnych substancji chemicznych specyficznych dla punktu końcowego spełniły wytyczne QA/QC uznane za niezbędne do wiarygodnego pomiaru. Odpowiedź przesiewowa testu biologicznego dla próbek wód powierzchniowych była w dużej mierze niewykrywalna. Natomiast próbki ścieków z oczyszczalni wtórnych miały najwyższą mierzalną aktywność, z szacowanymi równoważnymi stężeniami testu biologicznego (BEQ) do 392 ng deksametazonu/L dla GR i 17 ng 17β-estradiolu/L dla ER. Odpowiedź testu biologicznego dla próbki ścieków trzeciorzędowych była niższa niż zmierzona dla ścieków wtórnych, co wskazuje na niższą pozostałość substancji chemicznych aktywnych endokrynologicznie po zaawansowanym leczeniu. Protokół ten wykazał, że testy biologiczne transaktywacji in vitro, które wykorzystują dostępne na rynku, "zestawy" komórek zatrzymanych przez podział, można dostosować do badań przesiewowych pod kątem aktywności endokrynologicznej w wodzie.

Wprowadzenie

Obecne monitorowanie jakości wody opiera się na możliwości dokładnego i precyzyjnego pomiaru występowania zanieczyszczeń chemicznych jako wskaźnika narażenia na kontakt z dziką przyrodą i ludźmi. Jednak ten paradygmat monitorowania i oceny chemicznej po substancji nie jest w stanie nadążyć za ciągle zmieniającym się wszechświatem chemicznym, z którym mamy do czynienia. W miarę jak dowiadujemy się więcej o losie i skutkach syntetycznych i naturalnych chemikaliów, kontynuujemy poszukiwanie narzędzi pomiarowych, które uwzględniają oczekiwane skutki biologiczne, a jednocześnie są odporne na zmiany w produkcji chemicznej, zastosowaniu i wpływie środowiska. Takie narzędzia są szczególnie istotne dla zrozumienia, czy nieznane lub nowe substancje chemiczne i produkty przemian zasługują na naszą uwagę. Co więcej, złożone mieszaniny substancji chemicznych obecnych w wodzie są słabo eliminowane przez indywidualne monitorowanie chemiczne. W związku z tym stoimy przed wyzwaniem modernizacji istniejącego zestawu narzędzi do monitorowania, aby lepiej rozwiązać te problemy w wodach powierzchniowych, które są odprowadzane z oczyszczonych ścieków i spływów wód miejskich/burzowych.

W ostatnich latach techniki bioanalityczne okazały się obiecujące jako narzędzia przesiewowe do oceny jakości wody. W szczególności testy biologiczne in vitro, które reagują na substancje chemiczne działające za pośrednictwem znanych, specyficznych sposobów działania^1,2, cieszą się dużym zainteresowaniem społeczności zajmującej się monitorowaniem środowiska³. W licznych badaniach wykorzystano testy biologiczne in vitro w celu ilościowego określenia aktywności hormonalnej wód pitnych, powierzchniowych i ścieków^{4 -6}. Co więcej, szereg testów biologicznych jest ukierunkowanych na molekularne zdarzenia inicjujące (np. aktywację receptora), które można potencjalnie powiązać ze szkodliwymi skutkami poprzez analizy szlaków niekorzystnych^{skutków 7,8}.

Ewolucja badań biologicznych do oceny jakości wody była stosunkowo szybka, z setkami różnych punktów końcowych testów biologicznych in vitro, które zostały ocenione pod kątem ich użyteczności^9,10. Obecnie wykazano, że tylko kilka testów biologicznych osiąga dobrą precyzję pomiaru (w laboratoriach), wykazując jednocześnie zdolność do różnicowania jakości wody^5,6. W szczególności w przypadku ścieków oczyszczonych występowanie estrogenów i steroidów glikokortykosteroidowych udało się wyjaśnić za pomocą testów transaktywacji in vitro ^11,12. Jednak w większości dotychczasowych badań stosowano testy biologiczne, których linie komórkowe są zastrzeżone (a zatem nie są powszechnie dostępne), wymagają ciągłej opieki i manipulacji lub obu. W rezultacie, zdolność do standaryzacji protokołów, wykonywania ćwiczeń kalibracji międzylaboratoryjnej, a ostatecznie do przeniesienia tej technologii badań przesiewowych do społeczności zajmującej się zasobami wodnymi, pozostaje utrudniona.

Co najmniej jeden dostawca testów biologicznych in vitro sprawdzonych przez amerykański program ToxCast jest dostępny na rynku¹³ w łatwych w użyciu formatach "zamrażania i rozmrażania". Wykazano, że te "zestawy" komórek zatrzymanych przez podział są solidne w pomiarze aktywności substancji chemicznych ekstrahowanych z wody, reprezentujących różne poziomy uzdatniania¹⁴. Chociaż dostępne są protokoły dostawców do badania bioaktywności poszczególnych substancji chemicznych lub mieszanin, niektóre z nich wymagają modyfikacji, zanim będzie można je zastosować do próbek wody. Oczyszczone ścieki¹⁵, odpływ wód opadowych¹⁶, wody odbiorcze^17,18, a ostatnio woda z recyklingu^19,20 to doskonałe przykłady środowisk wodnych, które są przedmiotem zainteresowania społeczności zajmującej się jakością wody.

To badanie przedstawia pojedynczy, ustandaryzowany protokół do pomiaru aktywności endokrynologicznej w próbkach wody za pomocą dostępnych na rynku, zatrzymanych podziałowo testów biologicznych transaktywacji in vitro. Wykazaliśmy solidność protokołu poprzez kompleksową ocenę tła, reakcji na dawkę i powtarzalności odpowiedzi dla dwóch punktów końcowych o szczególnym znaczeniu: transaktywacji receptora estrogenowego i glikokortykosteroidowego (odpowiednio ER i GR). Protokół został zastosowany do badania próbek oczyszczonych ścieków, ścieków i wód powierzchniowych z systemów słodkowodnych w Kalifornii.

Protokół

1. Pobieranie i przetwarzanie próbki wody (zmodyfikowane przez Escher et al.⁹)

1. Napełnij czystą butelkę ze szkła oranżowego o pojemności 1 litra zawierającą 1 g azydku sodu i 50 mg kwasu askorbinowego do góry próbką wody, która Cię interesuje. Przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C i przetwarzać w ciągu 72 godzin.
   UWAGA: Azydek sodu jest wysoce toksyczny i należy obchodzić się z nim ostrożnie. Używać sprzętu ochronnego (oczy/twarz, rękawice, odzież) i zważyć prawidłowo działający wyciąg. Do ważenia nie używaj metalowej szpatułki.
2. Przepuść próbkę przez filtr z włókna szklanego 1,6 μM, a następnie przez wstępnie przygotowany wkład do ekstrakcji do fazy stałej (SPE) z natężeniem przepływu 5-10 ml/min. Dostosuj ciśnienie pompy próżniowej, aby kontrolować natężenie przepływu.
3. Suszyć próżniowo wkład przez 15 minut.
4. Do wkładu należy dodać 10 ml metanolu, a następnie 10 ml acetonu:heksanu (1:1, v/v).
5. Stężyć eluat do ~1 ml pod delikatnym strumieniem azotu o wysokiej czystości. Wymiana rozpuszczalnika poprzez dodanie 500 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) i odparowanie ekstraktu do 500 μl.
6. Przenieść ekstrakt do fiolki z automatycznym podajnikiem próbek ze szkła oranżowego. Przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Przygotuj rozcieńczenia specyficznego referencyjnego ekstraktu chemicznego i wodnego do testu

1. Przygotować 9 rozcieńczeń do krzywej kalibracyjnej.
   1. Sporządzić roztwór podstawowy substancji chemicznej odniesienia specyficznej dla testu w 100% DMSO. Końcowe stężenie musi wynosić 2 μM 17β-estradiolu w teście ER i 100 μM deksametazonu w teście GR. Roztwory podstawowe przechowywać w temperaturze -20 °C.
   2. Dodać 15 μl odpowiedniej referencyjnej substancji chemicznej do 285 μl podłoża do oznaczania w sterylnej probówce (probówka #1). Wymieszać próbkę, pipetując w górę i w dół.
   3. Dodać 200 μl roztworu 5% DMSO w pożywce testowej w 8 dodatkowych probówkach (probówki #2-9).
   4. Przenieść 100 μl podwielokrotności z probówki #1 do probówki #2 przez probówkę #9 w celu przeprowadzenia serii 3-krotnego rozcieńczenia. Każdą rozcieńczoną próbkę należy dokładnie wymieszać pipetą przed pobraniem podwielokrotności i dodaniem jej do następnej probówki.
2. Przygotować próbkę kontrolną rozpuszczalnika, mieszając 10 μl DMSO w 190 μl pożywki do oznaczania.
3. Przygotować cztery rozcieńczenia dla każdego ekstraktu wodnego.
   1. Do pierwszej probówki dodać 5 μl ekstraktu wodnego w 95 μl pożywki do oznaczania i dokładnie wymieszać. Dodać 50 μl 5% DMSO w pożywce testowej w trzech innych probówkach.
   2. Wykonać 2-krotne rozcieńczenie, przenosząc 50 μl roztworu z jednej probówki do drugiej.

3. Przygotuj zawiesinę komórek do przeprowadzenia testu biologicznego FRET

1. Przygotować pożywkę specyficzną dla testu zgodnie z instrukcjami producenta. Pożywka do oznaczania musi być przechowywana w temperaturze 4 °C i ogrzana do 37 °C w łaźni wodnej przed użyciem.
2. Wyjąć z zamrażarki kriogenicznej fiolkę z komórkami zatrzymanymi przez podział ER lub GR i szybko rozmrozić komórki, umieszczając fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 2 minuty, delikatnie mieszając. Odkazić fiolkę 70% etanolem i umieścić ją w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
3. Otworzyć fiolkę z zachowaniem zasad aseptyki i przenieść komórki do 10 ml pożywki do oznaczania.
4. Wirować przy 200 x g przez 5 min.
5. Odessać supernatant za pomocą sterylnej szklanej pipety i ponownie zawiesić osad komórkowy w 6 ml pożywki do oznaczania.
6. Zmieszać 5 μl zawiesiny komórkowej z 5 μl roztworu barwnego do przyżyciowej i dodać porcję do komory liczącej.
7. Policz liczbę żywych komórek za pomocą mikroskopu świetlnego lub automatycznego licznika komórek i oszacuj gęstość żywych komórek w zawiesinie komórek. W razie potrzeby rozcieńczyć, aby uzyskać końcową gęstość 550 000 żywych komórek na ml podłoża do oznaczania.

4. Umieść komórki w 96-dołkowej płycie z czarnym dnem i dodaj rozcieńczony ekstrakt wodny

1. Utwórz układ płytki, który zawiera 9-punktową krzywą kalibracyjną specyficzną dla testu, próbki QA/QC i wiele rozcieńczeń dla każdego ekstraktu wodnego. Przykład układu płytek 96-dołkowych pokazano na rysunku 1.
2. Dodać 90 μl pożywki do prób do powtórzonych studzienek kontrolnych bezkomórkowych.
3. Wlać zawiesinę komórek do sterylnego zbiornika do pipetowania i dodać 90 μl zawiesiny komórek do pozostałych studzienek za pomocą pipety wielokanałowej.
4. Dodać 10 μl rozcieńczonych próbek przygotowanych podczas etapu 2 do odpowiednich studzienek. Końcowe stężenie DMSO na studzienkę musi wynosić maksymalnie 0,5%.
5. Przykryj płytkę pokrywką i umieść ją w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ w temperaturze 37 °C na 16 godzin.

Rysunek 1: Przykład układu płytek 96-dołkowych. Płytka wielodołkowa została zaprojektowana tak, aby zawierała krzywą kalibracyjną specyficzną dla testu, 3 rodzaje kontroli QA/QC (tylko pożywka, komórki w czystym pożywce i komórki w pożywce wzbogaconej DMSO) oraz 4 rozcieńczenia na ekstrakt wodny. Każda kontrola i rozcieńczenie ekstraktu wodnego jest analizowane w trzech studzienkach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Przygotuj roztwór ładujący i dodaj do każdej studzienki

1. Po inkubacji odczekać, aż płytka zrównoważy się do RT. W przypadku tego testu biologicznego FRET kroki od 5.2 do 5.6 należy przeprowadzić przy braku bezpośredniego światła.
2. Przygotuj 6-krotny roztwór ładujący zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Dodaj 20 μl 6-krotnego roztworu ładującego do każdej studzienki.
4. Dodać 10 μl odczynnika żywotności komórek do każdej studzienki, aby ocenić cytotoksyczność rozcieńczonego ekstraktu wodnego.
5. Uszczelnij płytkę aluminiową folią samoprzylepną.
6. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.

6. Pomiar cytotoksyczności i reakcji na aktywność endokrynologiczną

1. Zainstaluj czytnik mikropłytek z funkcją odczytu od dołu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
2. W przypadku testu biologicznego transaktywacji FRET należy zmierzyć fluorescencję w kanale niebieskim (409/460 nm, długość fali wzbudzenia (Ex)/emisji (Em)) i zielonym (409 Ex/530 Em nm).
3. W przypadku testu cytotoksyczności zmierzyć fluorescencję przy 560 Ex/590 Em nm.

7. Ocena kontroli jakości/kontroli jakości w celu określenia jakości danych

1. Porównaj średnią surową fluorescencję kontroli bezkomórkowych (tylko pożywka) i tylko komórek (komórki w czystej pożywce testowej). Fluorescencja tła tylko z pożywką powinna być co najmniej o 25% niższa niż odpowiedź kontroli tylko z komórkami.
2. Przetwarzaj nieprzetworzone dane FRET. Zarówno w przypadku "niebieskich", jak i "zielonych" zbiorów danych należy odjąć średnią fluorescencję studzienek kontrolnych bez komórek od wszystkich komórek zawierających studzienkę. Oblicz stosunek koloru niebieskiego do zielonego dla każdego dołka doświadczalnego.
3. Porównaj stosunek niebieskiego do zielonego samych komórek i komórek z kontrolkami DMSO. Wartości fluorescencji tych kontroli powinny mieścić się w granicach 15% względnego odchylenia standardowego (RSD).
4. Wykreślić krzywą wzorcową specyficzną dla testu jako stosunek koloru niebieskiego/zielonego w stosunku do stężenia próbki wyrażonego jako logarytm masy cząsteczkowej (log M). Obliczyć nachylenie, R² i log EC₅₀ (50% stężenie powodujące działanie). Parametry kalibracji powinny mieścić się w oczekiwanym zakresie podanym w tabeli 1.
5. Oblicz RSD dla wszystkich studzienek potrójnych. Zmienność między kontrpróbami powinna być mniejsza niż 20%.
6. W przypadku danych dotyczących cytotoksyczności (560 Ex/590 Em nm) należy odjąć średnią kontrolną dla osób bezkomórkowych (tj. tła pożywki) od wszystkich studzienek zawierających komórki.
7. Obliczyć średnią fluorescencję odjętą od tła dla każdej próbki. Wykreślić wynikowe dane fluorescencji jako procent kontroli DMSO. Rozcieńczenia próbek nie powinny wykazywać więcej niż 20% śmiertelności komórek w porównaniu z samymi komórkami i kontrolami DMSO.

8. Analizy danych

1. Obliczyć granicę wykrywalności (LOD) w teście jako minimalną odpowiedź kalibracyjną powiększoną o dwa odchylenia standardowe średniej tej reakcji.
2. W przypadku próbek wykazujących reakcję na dawkę, należy wyprowadzić EC₅₀ ekstraktu wodnego, stosując nachylenie regresji liniowej krzywej kalibracyjnej między 10 a 50 % stężeniami powodującymi wpływ substancji chemicznej odniesienia.
3. Obliczyć równoważne stężenie bioanalityczne (BEQ) przy użyciu wzoru: BEQ = EC₅₀ dla substancji chemicznej odniesienia/EC₅₀ dla próbki wody.

Wyniki

W obecnym badaniu, do zilustrowania tego protokołu wybrano 4x 24-godzinne próbki kompozytowe oczyszczonych ścieków komunalnych, 6 próbek wody powierzchniowej z systemów słodkowodnych w południowej Kalifornii oraz ślepą próbę pola składającą się z wody ultraczystej. 3 z 4 próbek ścieków pochodziły z konwencjonalnych oczyszczalni ścieków z osadem czynnym ("ścieki wtórne"), a czwarty z zaawansowanej oczyszczalni ścieków z filtracją piaskowo-węglową dodaną po oczyszczaniu biologicznym ("ście...

Dyskusja

Dobrze udokumentowana siła działania estrogenów środowiskowych, takich jak 17β-estradiol (E2), uzasadnia badania przesiewowe pod kątem tych substancji chemicznych w stężeniach ng / L^23,24. W tym badaniu reakcja ER dla ścieków (zakres BEQ: 2,3 do 17 ng E2/L) była nieco wyższa niż w przypadku ścieków wtórnych z australijskich oczyszczalni ścieków²⁰, podczas gdy BEQ dla wód powierzchniowych (<0,5 do 4 ng E2/L) mieściły się w zakresie zgłaszanym dla wód powierzchniowych i burzowych w innych miejscach (<...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw testowy GeneBLAzer ER alpha DA	Zestaw ThermoFisher	K1393	zawiera komórki zatrzymane przez podział ER (DA) i zestaw do ładowania LiveBLAzer FRET.
Zestaw testowy GeneBLAzer GR DA	Zestaw ThermoFisher	K1391	zawiera komórki z zatrzymaniem podziału GR (DA) i zestaw do ładowania LiveBLAzer FRET.
Odczynnik do żywotności komórek PrestoBlue	ThermoFisher	A-13261
Błękit trypanowy, 0,4% w PBS	Sigma-Aldrich	T8154	Dostępne również w ThermoFisher
Corning 96-dołkowa ściana, przezroczysta płyta dolna	Corning	3603	Indywidualnie pakowane, sterylne z pokrywką
Filtry z włókna szklanego Whatman, GF/A, 1,6 i mikro; M	Sigma-Aldrich
Aluminiowa folia uszczelniająca z mikropłytką	E & K Scientific	T592100
Oasis HLB 6 cc kartusz, 200 mg sorbentu	Wody	WAT106202
17β Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	CAS #50-28-2
Kwas askorbinowy	Fisher Scientific	A61-100	Dostępny również w Sigma-Aldrich
Deksametazon	Sigma-Aldrich	D4902	CAS #50-02-2
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Rozpuszczalniki klasy molekularnej
(aceton, heksan, metanol)	Fisher Scientific		HPLC klasy
azydek sodu	Sigma-Aldrich	S2002	jest wysoce toksyczna i należy się z nią obchodzić ostrożnie. Używać odzieży ochronnej i ważyć pod wyciągiem. Dostępne również w EMD Millipore.
Automatyczny licznik komórek lub hemocytometr	Różni*		Dostawcy to Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich i ThermoFisher.
Komora bezpieczeństwa biologicznego klasy II	Różne*
Inkubator CO2	Różne*
Zamrażarka kriogeniczna	Różne*		Zalecane jest przechowywanie ciekłego azotu dewara.
Czytnik mikropłytek fluorescencyjnych	Różne*		Czytnik musi mieć możliwość odczytu od dołu.
* Brak zalecanego źródła, wybór tego sprzętu zależy od budżetu, częstotliwości użytkowania i przestrzeni laboratoryjnej.