Badania przesiewowe pod kątem aktywności hormonalnej w wodzie przy użyciu dostępnych na rynku testów biologicznych transaktywacji in vitro

Podsumowanie

Protokół badania przesiewowego pod kątem aktywności endokrynologicznej w organicznych ekstraktach próbek wody, w tym ścieków oczyszczonych i wód powierzchniowych (odbierających), został dostosowany przy użyciu dostępnych na rynku testów biologicznych in vitro transaktywacji z zatrzymaniem ("zamrożenie i rozmrożenie").

Streszczenie

Testy biologiczne transaktywacji in vitro okazały się obiecujące jako narzędzia do monitorowania jakości wody, jednak ich przyjęcie i powszechne zastosowanie było utrudnione częściowo z powodu braku ustandaryzowanych metod i dostępności solidnej, przyjaznej dla użytkownika technologii. W tym badaniu, dostępnym na rynku, linie komórkowe z zatrzymanym podziałem wykorzystano do ilościowego badania przesiewowego pod kątem aktywności hormonalnej substancji chemicznych obecnych w próbkach wody, które są przedmiotem zainteresowania specjalistów ds. jakości środowiska. Opracowano pojedynczy, ustandaryzowany protokół, który obejmował kompleksowe kontrole zapewnienia jakości/kontroli jakości (QA/QC) dla aktywności receptorów estrogenowych i glikokortykosteroidowych (odpowiednio ER i GR) przy użyciu komórkowego testu transferu energii rezonansu fluorescencyjnego (FRET). Próbki oczyszczonych ścieków komunalnych i wód powierzchniowych z systemów słodkowodnych w Kalifornii (USA) zostały wyekstrahowane za pomocą ekstrakcji do fazy stałej i przeanalizowane pod kątem aktywności hormonalnej przy użyciu znormalizowanego protokołu. Kontekst i dawka-odpowiedź dla referencyjnych substancji chemicznych specyficznych dla punktu końcowego spełniły wytyczne QA/QC uznane za niezbędne do wiarygodnego pomiaru. Odpowiedź przesiewowa testu biologicznego dla próbek wód powierzchniowych była w dużej mierze niewykrywalna. Natomiast próbki ścieków z oczyszczalni wtórnych miały najwyższą mierzalną aktywność, z szacowanymi równoważnymi stężeniami testu biologicznego (BEQ) do 392 ng deksametazonu/L dla GR i 17 ng 17β-estradiolu/L dla ER. Odpowiedź testu biologicznego dla próbki ścieków trzeciorzędowych była niższa niż zmierzona dla ścieków wtórnych, co wskazuje na niższą pozostałość substancji chemicznych aktywnych endokrynologicznie po zaawansowanym leczeniu. Protokół ten wykazał, że testy biologiczne transaktywacji in vitro, które wykorzystują dostępne na rynku, "zestawy" komórek zatrzymanych przez podział, można dostosować do badań przesiewowych pod kątem aktywności endokrynologicznej w wodzie.

Wprowadzenie

Obecne monitorowanie jakości wody opiera się na możliwości dokładnego i precyzyjnego pomiaru występowania zanieczyszczeń chemicznych jako wskaźnika narażenia na kontakt z dziką przyrodą i ludźmi. Jednak ten paradygmat monitorowania i oceny chemicznej po substancji nie jest w stanie nadążyć za ciągle zmieniającym się wszechświatem chemicznym, z którym mamy do czynienia. W miarę jak dowiadujemy się więcej o losie i skutkach syntetycznych i naturalnych chemikaliów, kontynuujemy poszukiwanie narzędzi pomiarowych, które uwzględniają oczekiwane skutki biologiczne, a jednocześnie są odporne na zmiany w produkcji chemicznej, zastosowaniu i wpływie środowiska. Takie narzędzia są szczególnie istotne dla zrozumienia, czy nieznane lub nowe substancje chemiczne i produkty przemian zasługują na naszą uwagę. Co więcej, złożone mieszaniny substancji chemicznych obecnych w wodzie są słabo eliminowane przez indywidualne monitorowanie chemiczne. W związku z tym stoimy przed wyzwaniem modernizacji istniejącego zestawu narzędzi do monitorowania, aby lepiej rozwiązać te problemy w wodach powierzchniowych, które są odprowadzane z oczyszczonych ścieków i spływów wód miejskich/burzowych.

W ostatnich latach techniki bioanalityczne okazały się obiecujące jako narzędzia przesiewowe do oceny jakości wody. W szczególności testy biologiczne in vitro, które reagują na substancje chemiczne działające za pośrednictwem znanych, specyficznych sposobów działania^1,2, cieszą się dużym zainteresowaniem społeczności zajmującej się monitorowaniem środowiska³. W licznych badaniach wykorzystano testy biologiczne in vitro w celu ilościowego określenia aktywności hormonalnej wód pitnych, powierzchniowych i ścieków^{4 -6}. Co więcej, szereg testów biologicznych jest ukierunkowanych na molekularne zdarzenia inicjujące (np. aktywację receptora), które można potencjalnie powiązać ze szkodliwymi skutkami poprzez analizy szlaków niekorzystnych^{skutków 7,8}.

Ewolucja badań biologicznych do oceny jakości wody była stosunkowo szybka, z setkami różnych punktów końcowych testów biologicznych in vitro, które zostały ocenione pod kątem ich użyteczności^9,10. Obecnie wykazano, że tylko kilka testów biologicznych osiąga dobrą precyzję pomiaru (w laboratoriach), wykazując jednocześnie zdolność do różnicowania jakości wody^5,6. W szczególności w przypadku ścieków oczyszczonych występowanie estrogenów i steroidów glikokortykosteroidowych udało się wyjaśnić za pomocą testów transaktywacji in vitro ^11,12. Jednak w większości dotychczasowych badań stosowano testy biologiczne, których linie komórkowe są zastrzeżone (a zatem nie są powszechnie dostępne), wymagają ciągłej opieki i manipulacji lub obu. W rezultacie, zdolność do standaryzacji protokołów, wykonywania ćwiczeń kalibracji międzylaboratoryjnej, a ostatecznie do przeniesienia tej technologii badań przesiewowych do społeczności zajmującej się zasobami wodnymi, pozostaje utrudniona.

Co najmniej jeden dostawca testów biologicznych in vitro sprawdzonych przez amerykański program ToxCast jest dostępny na rynku¹³ w łatwych w użyciu formatach "zamrażania i rozmrażania". Wykazano, że te "zestawy" komórek zatrzymanych przez podział są solidne w pomiarze aktywności substancji chemicznych ekstrahowanych z wody, reprezentujących różne poziomy uzdatniania¹⁴. Chociaż dostępne są protokoły dostawców do badania bioaktywności poszczególnych substancji chemicznych lub mieszanin, niektóre z nich wymagają modyfikacji, zanim będzie można je zastosować do próbek wody. Oczyszczone ścieki¹⁵, odpływ wód opadowych¹⁶, wody odbiorcze^17,18, a ostatnio woda z recyklingu^19,20 to doskonałe przykłady środowisk wodnych, które są przedmiotem zainteresowania społeczności zajmującej się jakością wody.

To badanie przedstawia pojedynczy, ustandaryzowany protokół do pomiaru aktywności endokrynologicznej w próbkach wody za pomocą dostępnych na rynku, zatrzymanych podziałowo testów biologicznych transaktywacji in vitro. Wykazaliśmy solidność protokołu poprzez kompleksową ocenę tła, reakcji na dawkę i powtarzalności odpowiedzi dla dwóch punktów końcowych o szczególnym znaczeniu: transaktywacji receptora estrogenowego i glikokortykosteroidowego (odpowiednio ER i GR). Protokół został zastosowany do badania próbek oczyszczonych ścieków, ścieków i wód powierzchniowych z systemów słodkowodnych w Kalifornii.

Protokół

1. Pobranie i opracowanie próbki wody (zmodyfikowane na podstawie Escher et al.⁹)

1. Napełnić do pełna czystą, 1 L bursztynową szklaną butelkę zawierającą 1 g azotku sodu i 50 mg kwasu askorbinowego badaną próbką wody. Próbkę przechowywać w temperaturze 4 °C i przetworzyć w ciągu 72 hr.
   UWAGA: Azotek sodu jest silnie toksyczny i należy z nim obchodzić się ostrożnie. Należy stosować środki ochrony osobistej (ochrona oczu/twarzy, rękawice, odzież) i odważać go w sprawnie działającej dygestorii. Do odważania nie używać szpatułki metalowej.
2. Przepuścić próbkę przez filtr z włókna szklanego 1.6 µM, a następnie przez uprzednio przygotowany wkład do ekstrakcji do fazy stałej (SPE) z szybkością przepływu 5-10 ml/min. Ciśnienie pompy próżniowej należy dostosować w celu kontrolowania szybkości przepływu.
3. Osuszyć wkład pod próżnią przez 15 min.
4. Eluować wkład 10 ml metanolu, a następnie 10 mL mieszaniny aceton:heksan (1:1, v/v).
5. Skoncentrować eluat do objętości ~1 ml pod delikatnym strumieniem azotu o wysokiej czystości. Przeprowadzić wymianę rozpuszczalnika poprzez dodanie 500 µl dimetylosulfotlenku (DMSO) i odparowanie ekstraktu do objętości 500 µl.
6. Przenieść ekstrakt do bursztynowej szklanej fiolki do autosamplera. Przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Przygotowanie rozcieńczeń substancji odniesienia specyficznej dla testu oraz ekstraktu wodnego

1. Przygotuj 9 rozcieńczeń do krzywej kalibracyjnej.
   1. Przygotuj roztwór zapasowy substancji referencyjnej specyficznej dla danego testu w 100% DMSO. Stężenie końcowe musi wynosić 2 µM 17β-estradiol dla testu ER oraz 100 µM dexamethasone dla testu GR. Roztwory zapasowe przechowuj w temperaturze -20 °C.
   2. Do sterylnej probówki (probówka nr 1) dodaj 15 µl odpowiedniego roztworu zapasowego substancji referencyjnej do 285 µl medium testowego. Wymieszaj próbkę, pipetując ją w górę i w dół.
   3. Do 8 dodatkowych probówek (probówki nr 2-9) dodaj po 200 µl roztworu 5% DMSO w medium testowym.
   4. Przenieś alikwot 100 µl z probówki nr 1 do probówki nr 2, a następnie kolejno do probówki nr 9, aby wykonać 3-krotny szereg rozcieńczeń. Każda rozcieńczona próbka musi zostać dokładnie wymieszana pipetą przed pobraniem alikwotu i dodaniem go do następnej probówki.
2. Przygotuj próbkę kontrolną rozpuszczalnika, mieszając 10 µl DMSO w 190 µl medium testowego.
3. Przygotuj cztery rozcieńczenia dla każdego ekstraktu wodnego.
   1. Do pierwszej probówki dodaj 5 µL ekstraktu wodnego do 95 µL medium testowego i dokładnie wymieszaj. Do trzech pozostałych probówek dodaj po 50 µl 5% DMSO w medium testowym.
   2. Wykonaj 2-krotne rozcieńczenie, przenosząc 50 µl roztworu z jednej probówki do następnej.

3. Przygotowanie zawiesiny komórkowej do przeprowadzenia bioanalizy FRET

1. Przygotować pożywkę specyficzną dla testu zgodnie z instrukcjami producenta. Pożywkę należy przechowywać w temperaturze 4 °C i ogrzać do 37 °C w łaźni wodnej przed użyciem.
2. Wyjąć fiolkę z komórkami ER lub GR z zatrzymanym podziałem z zamrażarki kriogenicznej i szybko rozmrozić komórki, umieszczając fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 2 min przy delikatnym mieszaniu. Zdezynfekować fiolkę 70% etanolem i umieścić ją w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
3. Otworzyć fiolkę, stosując techniki aseptyczne, i przenieść komórki do 10 ml pożywki do testu.
4. Wirować przy 200 x g przez 5 min.
5. Odssać nadsącz za pomocą sterylnej pipety szklanej i zawiesić osad komórkowy w 6 ml pożywki do testu.
6. Zmieszać 5 µl zawiesiny komórkowej z 5 µl roztworu barwnika żywotności i nanieść alikwot do komory licznikowej.
7. Policzyć liczbę żywych komórek za pomocą mikroskopu świetlnego lub automatycznego licznika komórek i oszacować gęstość żywych komórek w zawiesinie. Jeśli to konieczne, rozcieńczyć, aby uzyskać końcową gęstość 550 000 żywych komórek na ml pożywki do testu.

4. Wysianie komórek na 96-dołkową płytkę z czarnymi ściankami i przezroczystym dnem oraz dodanie rozcieńczonego ekstraktu wodnego

1. Przygotuj układ płytki zawierający 9-punktową krzywą kalibracyjną specyficzną dla analizy, próbki QA/QC oraz wielokrotne rozcieńczenia dla każdego ekstraktu wodnego. Przykład układu płytki 96-dołkowej przedstawiono na Rysunku 1.
2. Dodaj 90 µl medium do analizy do powtórzeń kontroli bezkomórkowej.
3. Przelej zawiesinę komórkową do sterylnego zbiornika do pipetowania i dodaj 90 µl zawiesiny komórkowej do pozostałych dołków za pomocą pipety wielokanałowej.
4. Dodaj 10 µl rozcieńczonych próbek przygotowanych w kroku 2 do odpowiednich dołków. Końcowe stężenie DMSO w każdym dołku nie może przekraczać 0,5%.
5. Przykryj płytkę pokrywką i umieść ją w inkubatorze z 5% CO₂ w temperaturze 37 °C na 16 hr.

Rysunek 1: Przykład układu płytki 96-dołkowej. Płytka wielodołkowa została zaprojektowana tak, aby obejmowała specyficzną dla testu krzywą kalibracyjną, 3 rodzaje kontroli QA/QC (sama pożywka, komórki w czystej pożywce oraz komórki w pożywce z dodatkiem DMSO) i 4 rozcieńczenia na każdy ekstrakt wodny. Każda kontrola oraz każde rozcieńczenie ekstraktu wodnego są analizowane w trzech powtórzeniach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

5. Przygotowanie roztworu obciążającego i dodanie go do każdego dołka

1. Po inkubacji pozwolić płytce osiągnąć temperaturę pokojową (RT). W przypadku tego bioanalizy FRET kroki od 5.2 do 5.6 należy przeprowadzać bez dostępu bezpośredniego światła.
2. Przygotować 6-krotny roztwór obciążający zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Do każdego dołka dodać 20 µl 6-krotnego roztworu obciążającego.
4. Do każdego dołka dodać 10 µl odczynnika do oceny żywotności komórek w celu zbadania cytotoksyczności rozcieńczonego ekstraktu wodnego.
5. Uszczelnić płytkę aluminiową folią samoprzylepną.
6. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 hr.

6. Pomiar cytotoksyczności i odpowiedzi aktywności endokrynnej

1. Przygotować czytnik mikropłytek z funkcją odczytu od dołu zgodnie z instrukcjami producenta.
2. W przypadku bioanalizy transaktywacji FRET, zmierzyć fluorescencję w kanałach niebieskim (409/460 nm, długość fali wzbudzenia (Ex)/emisji (Em)) i zielonym (409 Ex/530 Em nm).
3. W przypadku testu cytotoksyczności, zmierzyć fluorescencję przy 560 Ex/590 Em nm.

7. Ocena kontroli QA/QC w celu określenia jakości danych

1. Porównaj średnią surową fluorescencję kontroli bezkomórkowej (samego medium) oraz kontroli zawierającej tylko komórki (komórki w czystym medium do testu). Fluorescencja tła dla samego medium powinna być co najmniej o 25% niższa niż odpowiedź kontroli zawierającej tylko komórki.
2. Przetwórz surowe dane FRET. Dla obu zbiorów danych, „niebieskiego” i „zielonego”, odejmij średnią fluorescencję studni kontroli bezkomórkowej od wszystkich studni zawierających komórki. Oblicz stosunek niebieski/zielony dla każdej studni eksperymentalnej.
3. Porównaj stosunek niebieski/zielony w kontrolach zawierających tylko komórki oraz komórki z DMSO. Wartości fluorescencji tych kontroli powinny mieścić się w granicach 15% względnego odchylenia standardowego (RSD).
4. Wykreśl specyficzną dla testu krzywą kalibracyjną, przedstawiając stosunek niebieski/zielony w funkcji stężenia próbki wyrażonego jako logarytm masy cząsteczkowej (log M). Oblicz nachylenie, R² oraz log EC₅₀ (stężenie wywołujące 50% efektu). Parametry kalibracyjne powinny mieścić się w oczekiwanym zakresie wymienionym w Tabeli 1.
5. Oblicz RSD dla wszystkich studni wykonanych w trzech powtórzeniach. Zmienność między powtórzeniami powinna być mniejsza niż 20%.
6. W przypadku danych dotyczących cytotoksyczności (560 Ex/590 Em nm), odejmij średnią wartość kontroli bezkomórkowej (tj. tło medium) od wszystkich studni zawierających komórki.
7. Oblicz średnią fluorescencję po odjęciu tła dla każdej próbki. Przedstaw otrzymane dane fluorescencyjne jako procent kontroli DMSO. Rozcieńczenia próbek nie powinny wykazywać śmiertelności komórek większej niż 20% w porównaniu do kontroli zawierającej tylko komórki oraz kontroli DMSO.

8. Analiza danych

1. Oblicz granicę wykrywalności (LOD) testu jako minimalną odpowiedź kalibracyjną plus dwa odchylenia standardowe średniej tej odpowiedzi.
2. W przypadku próbek wykazujących odpowiedź na dawkę, wyznacz EC₅₀ wyciągu wodnego, wykorzystując nachylenie regresji liniowej krzywej kalibracyjnej w zakresie stężeń efektowych od 10 do 50% substancji odniesienia.
3. Oblicz bioanalityczne stężenie ekwiwalentne (BEQ), korzystając ze wzoru: BEQ = EC₅₀ substancji odniesienia/EC₅₀ próbki wody.

Wyniki

W niniejszym badaniu, w celu zilustrowania niniejszego protokołu, wybrano cztery 24-godzinne próbki złożone oczyszczonych ścieków komunalnych, 6 próbek punktowych wody powierzchniowej z ekosystemów słodkowodnych w południowej Kalifornii oraz próbkę ślepą terenową składającą się z wody ultrapure. 3 z 4 próbek ścieków pochodziły z konwencjonalnych oczyszczalni ścieków z osadem czynnym („odciek wtórny”), a czwarta z zaawansowanej oczyszczalni ścieków z dodatkową filtracją piaskową/węglową po...

Dyskusja

Dobrze udokumentowana siła działania estrogenów środowiskowych, takich jak 17β-estradiol (E2), uzasadnia badania przesiewowe pod kątem tych substancji chemicznych w stężeniach ng / L^23,24. W tym badaniu reakcja ER dla ścieków (zakres BEQ: 2,3 do 17 ng E2/L) była nieco wyższa niż w przypadku ścieków wtórnych z australijskich oczyszczalni ścieków²⁰, podczas gdy BEQ dla wód powierzchniowych (<0,5 do 4 ng E2/L) mieściły się w zakresie zgłaszanym dla wód powierzchniowych i burzowych w innych miejscach (<...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw testowy GeneBLAzer ER alpha DA	Zestaw ThermoFisher	K1393	zawiera komórki zatrzymane przez podział ER (DA) i zestaw do ładowania LiveBLAzer FRET.
Zestaw testowy GeneBLAzer GR DA	Zestaw ThermoFisher	K1391	zawiera komórki z zatrzymaniem podziału GR (DA) i zestaw do ładowania LiveBLAzer FRET.
Odczynnik do żywotności komórek PrestoBlue	ThermoFisher	A-13261
Błękit trypanowy, 0,4% w PBS	Sigma-Aldrich	T8154	Dostępne również w ThermoFisher
Corning 96-dołkowa ściana, przezroczysta płyta dolna	Corning	3603	Indywidualnie pakowane, sterylne z pokrywką
Filtry z włókna szklanego Whatman, GF/A, 1,6 i mikro; M	Sigma-Aldrich
Aluminiowa folia uszczelniająca z mikropłytką	E & K Scientific	T592100
Oasis HLB 6 cc kartusz, 200 mg sorbentu	Wody	WAT106202
17β Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	CAS #50-28-2
Kwas askorbinowy	Fisher Scientific	A61-100	Dostępny również w Sigma-Aldrich
Deksametazon	Sigma-Aldrich	D4902	CAS #50-02-2
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	Rozpuszczalniki klasy molekularnej
(aceton, heksan, metanol)	Fisher Scientific		HPLC klasy
azydek sodu	Sigma-Aldrich	S2002	jest wysoce toksyczna i należy się z nią obchodzić ostrożnie. Używać odzieży ochronnej i ważyć pod wyciągiem. Dostępne również w EMD Millipore.
Automatyczny licznik komórek lub hemocytometr	Różni*		Dostawcy to Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich i ThermoFisher.
Komora bezpieczeństwa biologicznego klasy II	Różne*
Inkubator CO2	Różne*
Zamrażarka kriogeniczna	Różne*		Zalecane jest przechowywanie ciekłego azotu dewara.
Czytnik mikropłytek fluorescencyjnych	Różne*		Czytnik musi mieć możliwość odczytu od dołu.
* Brak zalecanego źródła, wybór tego sprzętu zależy od budżetu, częstotliwości użytkowania i przestrzeni laboratoryjnej.

WHA1820025Substancja chemiczna