Artykuł metodologiczny

Prosty test fluorescencyjny do ilościowego oznaczania uwalniania zewnątrzkomórkowej pułapki neutrofili u psów

DOI:

10.3791/54726

⸱

21 listopada 2016

 ,  , 
1Department of Veterinary Microbiology and Preventative Medicine, College of Veterinary Medicine, Iowa State University, 2MRC Centre for Inflammation Research, University of Edinburgh, 3Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Iowa State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) to sieci DNA, histonów i białek neutrofilowych. Chociaż jest to składnik wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, NET są zaangażowane w autoimmunizację i zakrzepicę. Protokół ten opisuje prostą metodę izolacji neutrofili u psów i ilościowego oznaczania NET za pomocą testu fluorescencji mikropłytek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofili to sieci DNA, histonów i białek neutrofilowych uwalnianych w odpowiedzi na bodźce zakaźne i zapalne. Chociaż są składnikiem wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, NET są zaangażowane w szereg procesów chorobowych, w tym autoimmunizację i zakrzepicę. Protokół ten opisuje prostą metodę izolacji neutrofili u psów i ilościowego oznaczania NET za pomocą testu fluorescencji mikropłytek. Krew pobierana jest przy użyciu konwencjonalnych technik nakłuwania żył. Neutrofile izoluje się za pomocą sedymentacji dekstranu i gradientu gęstości w warunkach zoptymalizowanych dla krwi psa. Po pozostawieniu czasu na przyłączenie się do studzienek 96-dołkowej płytki, neutrofile są traktowane agonistami indukującymi NET, takimi jak octan forbolu-12-mirystynianu 13 lub czynnik aktywujący płytki krwi. Uwalnianie DNA mierzy się fluorescencją nieprzepuszczalnego dla komórek barwnika kwasu nukleinowego. Ten test jest prostą i niedrogą metodą ilościowego określania uwalniania NET, ale powstawanie NET, a nie inne przyczyny śmierci komórki, musi zostać potwierdzone za pomocą alternatywnych metod.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W samych Stanach Zjednoczonych jest ponad 70 milionów psów domowych,1. Jako cenieni członkowie rodziny, zwierzęta te często otrzymują najnowocześniejszą opiekę medyczną. Również dlatego, że psy dzielą nasze środowisko, mogą dostarczać informacji na temat patogenezy i leczenia chorób u ludzi1. Jednak niezależnie od tego, czy przekłada się odkrycia w medycynie ludzkiej na leczenie weterynaryjne, czy odwrotnie, ważne jest, aby dokładnie scharakteryzować różnice gatunkowe nawet w wysoce konserwatywnych systemach, takich jak wrodzona odpowiedź immunologiczna. Przykłady różnic między wrodzonym układem odpornościowym psa i człowieka obejmują wysoką ekspresję CD4 na neutrofilach2 psów; brak funkcjonalnego homologu cytoplazmatycznego czujnika flageliny IPAF u psów3 i ekspresji hybrydy kaspazy 1/4 u mięsożerców4.

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET) są stosunkowo niedawno odkrytym składnikiem odporności wrodzonej5. NET to sieci DNA, białek jądrowych i ziarnistych uwalnianych w odpowiedzi na szeroki zakres bodźców zapalnych lub zakaźnych6. Struktury podobne do NET wykazano u wielu gatunków, w tym u kurcząt7, ryb8,9 i acoelomates10, ale istnieją różnice gatunkowe. Na przykład neutrofile mysie wolniej reagują na bodźce NETozy niż neutrofile ludzkie i tworzą mniej rozproszone NET11. Istnieje wiele dowodów pochodzących od wielu gatunków, że NET więzią drobnoustroje i, co bardziej kontrowersyjne, mogą być bezpośrednio zaangażowane w zabijanie patogenów12,13. Jednak składniki NET zwiększają również uszkodzenia tkanek, sprzyjają zakrzepicy i działają jako autoantygeny14,15. Równowaga między korzystnymi i szkodliwymi skutkami NET może być różna w zależności od różnych chorób i gatunków, co sugeruje, że ważne jest zbadanie NET zarówno pod względem gatunku, jak i stanu będącego przedmiotem zainteresowania.

Tutaj opisujemy prosty protokół indukowania i mierzenia uwalniania NET przez neutrofile u psów. Metoda ta jest podobna do metod stosowanych do izolowania neutrofili16 i indukowania NETozy u innych gatunków, ale warunki takie jak stężenie agonistów i czas inkubacji zostały zoptymalizowane dla neutrofili u psów. Podobny test ilościowy uwalniania DNA NET został również opisany u innych gatunków, ale przedstawiona tutaj metoda jest również zoptymalizowana dla psów8,17,18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone za etycznym pozwoleniem Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Iowa.

1. Pobieranie krwi

  1. Pobrać 9 ml krwi z żyły odpiszczelowej, głowowej lub szyjnej bezpośrednio do leków przeciwzakrzepowych (np. kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 1,8 mgK2EDTA/ml krwi) lub do strzykawki z natychmiastowym przeniesieniem do probówek zawierających EDTA. Delikatnie zwiń lub odwróć probówki krwi, aby zapewnić odpowiednie wymieszanie krwi i antykoagulantu.

2. Izolacja neutrofili

  1. W stożkowej probówce o pojemności 50 ml wymieszaj krew z równą objętością sterylnego 3% dekstranu-500 o temperaturze pokojowej (złożonego z 0,9% sterylnego roztworu soli fizjologicznej) przez delikatne odwrócenie. Pozostaw w pozycji pionowej na 18-20 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś górną warstwę w kolorze słomy do świeżej tuby, aż nie będzie można jej już zebrać bez zanieczyszczenia dolną czerwoną warstwą. Erytrocyty w oryginalnej probówce można wyrzucić.
  2. Odwirować supernatant przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odsączyć i wyrzucić supernatant. Ręcznie ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że wirowanie nie powinno być stosowane do ponownego zawieszania neutrofili na żadnym etapie tego protokołu. Ręczne ściąganie, a nie wylewanie supernatantów, jest również zalecane w całym protokole, aby zmaksymalizować wydajność komórek.
  3. Dodać 10 ml roztworu do separacji komórek polisacharozy i diatrizoinu sodu o temperaturze pokojowej (np. Histopaque 1077) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Ostrożnie nałożyć roztwór zawierający komórki na roztwór do separacji komórek. Należy pamiętać, że użycie roztworu do separacji komórek, który nie osiągnął równowagi z temperaturą pokojową, może zmniejszyć wydajność komórek.
  4. Wirować przy 300 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy wyłączonym hamulcu.
  5. Ponieważ neutrofile znajdują się w najniższej warstwie gradientu, należy odciągnąć i odrzucić 3 górne warstwy, składające się z górnej warstwy osocza i płytek krwi, wąskiego białego pasma komórek jednojądrzastych i przezroczystej warstwy ośrodka gradientu gęstości.
  6. Aby zlizować pozostałe erytrocyty, ponownie zawiesić osad neutrofili w 10 ml wody o temperaturze pokojowej.
  7. Po 30 sekundach przywrócić toniczność, dodając 10 ml sterylnego 1,8% chlorku sodu o temperaturze pokojowej i wymieszać przez delikatne odwrócenie.
  8. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odciągnąć sklarowany osad i odrzucić.
  9. Jeśli osad jest nadal czerwony, powtórz etap lizy. Jeśli osad jest biały (lub jeśli liza została już przeprowadzona dwukrotnie), delikatnie ponownie zawiesić komórki w 10 ml sterylnego PBS.
  10. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika lub hemocytometru. Typowa wydajność to co najmniej 106 komórek na ml krwi.
  11. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odciągnąć sklarowany osad i odrzucić.
  12. Ponownie zawiesić komórki do pożądanego stężenia w sterylnym PBS o temperaturze pokojowej. W przypadku testu uwalniania DNA opisanego w punkcie 2 zawiesić ponownie w stężeniu 5 x 106 komórek na ml.
  13. W razie potrzeby przenieś niewielką objętość komórek bezpośrednio lub za pomocą cytowirówki na szklane szkiełko. Pozostaw komórki do wyschnięcia i zabarwienia za pomocą zestawu do szybkiego utrwalania i barwienia zgodnie z instrukcjami producenta. Jeśli izolacja neutrofili zakończyła się sukcesem, podczas badania pod mikroskopem co najmniej 95% komórek jądrzastych powinno być granulocytami (neutrofile, bazofile, eozynofile) o minimalnym zanieczyszczeniu erytrocytów.

3. Test uwalniania DNA

  1. Ustaw test uwalniania DNA natychmiast po izolacji neutrofili
    2. .
  2. Jeśli podczas badania roztworu podstawowego za pomocą mikroskopii świetlnej występuje zlepianie się komórek, należy przepuścić zawiesinę komórek przez sterylny filtr o sterylnej mocy 70 μm bezpośrednio przed rozpoczęciem testu.
  3. Do każdej studzienki testowej sterylnej 96-dołkowej płytki dodać 5 x 104 komórek/basenik; agonistę i pożywkę Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI) bez czerwieni fenolowej i uzupełnioną 0,5% inaktywowaną termicznie surowicą cielęcą płodu do końcowej objętości 100-200 μl. Włączyć co najmniej dwie ślepe studzienki na agonistę, w których podstawowy roztwór neutrofili jest zastąpiony równą objętością PBS. Należy pamiętać, że ustawienie ślepych studzienek dla każdego agonisty jest ważne w celu wykluczenia zanieczyszczenia DNA agonisty lub interferencji agonisty z testem fluorescencji.
  4. Inkubować w temperaturze 39 °C przez 30 minut w inkubatorze z użyciem dwutlenku węgla (4%).
  5. Dodaj agonistów w pożądanych stężeniach i nieprzepuszczalny dla komórek barwnik kwasu nukleinowego. Należy pamiętać, że optymalne stężenie barwnika nieprzepuszczalnego dla komórek będzie się różnić w zależności od różnych barwników kwasów nukleinowych. Niestymulowane kontrole, w których agoniści są zastępowani przez równą objętość pożywki, powinny być włączone do każdego doświadczenia.
    UWAGA: Pożądane jest rozcieńczenie agonistów w podobnych objętościach pożywki hodowlanej w celu utrzymania stałych warunków między studzienkami. Końcowe objętości studzienek wynoszące 200 μl zostały pomyślnie wykorzystane, a w przypadku ich zmiany objętości studzienek powinny pozostać identyczne we wszystkich warunkach. Jako kontrole pozytywne można stosować octan forbolu-12-mirystynianu 13 (PMA) (stężenie końcowe ≥0,1 μM) lub czynnik aktywujący płytki krwi (PAF) (stężenie końcowe ≥31 μM). Agoniści powinni być mierzeni co najmniej dwukrotnie.
  6. Inkubować w temperaturze 39 °C. Zmierzyć fluorescencję za pomocą czytnika mikropłytek po 2 godzinach lub w żądanych odstępach czasu. Należy pamiętać, że optymalne przedziały czasowe będą się różnić w zależności od zastosowanych agonistów.
    UWAGA: Długość fali będzie zależeć od zastosowanego barwnika.
  7. Odejmij fluorescencję ślepej próby przed obliczeniem średniej fluorescencji.
  8. Aby umożliwić porównanie między osobnikami i między płytkami, oblicz krotną zmianę fluorescencji, dzieląc średnią fluorescencję studzienek stymulowanych przez średnią fluorescencję studzienek niestymulowanych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stosując niniejszy protokół, po stymulacji neutrofilów kontrolami pozytywnymi, PMA i PAF, powinien wystąpić silny krotny wzrost fluorescencji. Jak przedstawiono na Rysunku 1B, stymulacja neutrofili psich 31 µM PAF przez 1 h skutkuje średnio 4,0-krotnym wzrostem fluorescencji w porównaniu z komórkami niestymulowanymi (zakres 2,0-5,8, n = 5 psów)18. PMA w stężeniu 0,1 µM (Rysunek 1A) jest wolniej działającym agonistą, który nie powoduje wzrostu f...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony test uwalniania DNA jest łatwo mierzalnym testem dla zewnątrzkomórkowego DNA. Metoda została zaadaptowana z podobnych technik stosowanych do oceny tworzenia NET u innych gatunków, ale prędkości wirowania, stężenia agonistów i czasy inkubacji zostały zmienione w celu optymalizacji metody do stosowania z neutrofilami u psów8,17,18. Podobne dostosowania można by wprowadzić w celu dostosowania metody do innych gatunków. Test jest prosty i niedrogi w porównaniu z innymi metodami pomiaru NETozy, takimi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują doktorom Jamesowi Rothowi, Williamowi Nauseefowi i Kayoko Kimurze oraz panu Tomowi Skadowowi za pomoc w opracowaniu protokołów dotyczących neutrofili u psów. RDG jest wspierany przez Wellcome Trust Fellowship ref: WT093767MA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Plastikowa probówka z pełną krwią z powłoką natryskową K2EDTABD367835
Histopaque-1077Sigma-Aldrich10771
Dextran-500Dokładny korpus chemiczny i naukowy.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiThermoFisher scientific20012043
Surowica dla cieląt bydlęcych, inaktywowana termicznieThermoFisher scientific10100139
RPMI Media 1640, bez czerwieni fenolowej i L-glutaminyThermoFisher scientific32404-014Powinien być wolny od czerwieni fenolowej
96-dołkowa sterylna płytka polistyrenowa z płaskim dnemSokół
12-mirystynian 13-octanu PhorbolSigma-AldrichP1585
Czynnik aktywujący płytkikrwi Sigma-AldrichP4904
SYTOX Zielona plama kwasu nukleinowegoThermoFisher scientificS7020
Synergy 2 Multi-Mode ReaderBioTekNA
AN228410353072

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schiffman, J. D., Breen, M. Comparative oncology: what dogs and other species can teach us about humans with cancer. Philos Trans Rl Soc B Biol Sci. 370, 1673(2015).
  2. Williams, D. L. Studies of canine leucocyte antigens: a significant advance in canine immunology. Vet J. 153 (1), 31-39 (1997).
  3. Eckhart, L., et al. Duplication of the caspase-12 prodomain and inactivation of NLRC4/IPAF in the dog. Biochem Biophys Res Commun. 384 (2), 226-230 (2009).
  4. Eckhart, L., et al. Identification of novel mammalian caspases reveals an important role of gene loss in shaping the human caspase repertoire. Mol Biol Evol. 25 (5), 831-841 (2008).
  5. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  6. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: is immunity the second function of chromatin. J Cell Biol. 198 (5), 773-783 (2012).
  7. Chuammitri, P., et al. Chicken heterophil extracellular traps (HETs): novel defense mechanism of chicken heterophils. Vet Immunol Immunopathol. 129 (1-2), 126-131 (2009).
  8. Palić, D., Ostojić, J., Andreasen, C. B., Roth, J. A. Fish cast NETs: neutrophil extracellular traps are released from fish neutrophils. Dev Comp Immunol. 31 (8), 805-816 (2007).
  9. Poirier, A. C., Schmitt, P., Rosa, R. D., Vanhove, A. S., Kieffer-Jaquinod, S., Rubio, T. P., et al. Antimicrobial histones and DNA traps in invertebrate immunity: evidences in Crassostrea gigas. J Biol Chem. 289 (36), 24821-24831 (2014).
  10. Robb, C. T., Dyrynda, E. A., Gray, R. D., Rossi, A. G., Smith, V. J. Invertebrate extracellular phagocyte traps show that chromatin is an ancient defense weapon. Nat Commun. 5, 4627(2014).
  11. Kaplan, M. J., Radic, M. Neutrophil extracellular traps: double-edged swords of innate immunity. J Immunol. 189 (6), 2689-2695 (2012).
  12. Menegazzi, R., Decleva, E., Dri, P. Killing by neutrophil extracellular traps: fact or folklore? Blood. 119 (5), 1214-1216 (2012).
  13. Parker, H., Albrett, A. M., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Myeloperoxidase associated with neutrophil extracellular traps is active and mediates bacterial killing in the presence of hydrogen peroxide. J Leukoc Biol. 91 (3), 369-376 (2012).
  14. Martinod, K., Wagner, D. D. Thrombosis: tangled up in NETs. Blood. 123 (18), 2768-2776 (2014).
  15. Pratesi, F., et al. Antibodies from patients with rheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutrophils extracellular traps. Ann Rheum Dis. 73 (7), 1414-1422 (2014).
  16. Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods Mol Biol. 1124, 13-18 (2014).
  17. Gray, R. D., et al. Activation of conventional protein kinase C (PKC) is critical in the generation of human neutrophil extracellular traps. J Inflamm (Lond). 10 (1), 12(2013).
  18. Jeffery, U., et al. Dogs cast NETs too: Canine neutrophil extracellular traps in health and immune-mediated hemolytic anemia. Vet Immunol Immunopathol. 168 (3-4), 262-268 (2015).
  19. McCracken, J. M., Allen, L. A. Regulation of human neutrophil apoptosis and lifespan in health and disease. J Cell Death. 7, 15-23 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja neutrofili psichpozakom rkowe pu apki neutrofilowesedymentacja dekstranowawirowanie w gradiencie g sto ciczytnik mikrop ytekbarwnik nieprzenikaj cy do kom rekagoni ci NETozyoctan mirystianowy forboluczynnik aktywuj cy p ytki krwi

Powiązane artykuły