Artykuł metodologiczny

Prosta i wydajna produkcja i oczyszczanie glikoproteiny oligodendrocytów mieliny myszy do eksperymentalnych badań nad autoimmunologicznym zapaleniem mózgu i rdzenia kręgowego

DOI:

10.3791/54727

⸱

27 października 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Western University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy prosty protokół wykorzystujący tylko podstawowy sprzęt laboratoryjny do generowania i oczyszczania dużych ilości białka fuzyjnego, które zawiera glikoproteinę oligodendrocytów mieliny myszy. Białko to może być wykorzystane do wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia wywołanego zarówno przez limfocyty T, jak i B.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stwardnienie rozsiane (MS) jest przewlekłą chorobą zapalną ośrodkowego układu nerwowego (OUN), która prawdopodobnie występuje w wyniku reakcji autoimmunologicznych skierowanych przeciwko mielinie. Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (EAE) jest najczęstszym zwierzęcym modelem choroby autoimmunologicznej OUN i jest zwykle indukowane poprzez immunizację krótkimi peptydami reprezentującymi immunodominujące epitopy limfocytów T CD4 + białek mielinowych. Jednak limfocyty B rozpoznają nieprzetworzone białko bezpośrednio, a immunizacja krótkim peptydem nie aktywuje limfocytów B, które rozpoznają białko natywne. Ponieważ ostatnie badania kliniczne nad terapiami zubożającymi limfocyty B w stwardnieniu rozsianym sugerują rolę komórek B w wywoływaniu chorób u ludzi, istnieje pilne zapotrzebowanie na modele zwierzęce, które uwzględniają rozpoznawanie autoantygenu przez limfocyty B. W tym celu wygenerowaliśmy nowe białko fuzyjne zawierające domenę zewnątrzkomórkową mysiej wersji glikoproteiny oligodendrocytów mielinowych (MOG), a także N-końcowe fuzje znacznika His w celu oczyszczania oraz białka tioredoksyny w celu poprawy rozpuszczalności (znacznik MOG). Miejsce rozszczepienia proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEV) zostało włączone, aby umożliwić usunięcie wszystkich sekwencji znaczników, pozostawiając tylko czystą domenę zewnątrzkomórkową MOG1-125. W tym miejscu opisujemy prosty protokół wykorzystujący wyłącznie standardowy sprzęt laboratoryjny do produkcji dużych ilości czystego znacznikaMOG lub MOG 1-125. Protokół ten konsekwentnie generuje ponad 200 mg białkaznacznika MOG. Immunizacjaznacznikiem MOG lub MOG1-125 generuje odpowiedź autoimmunologiczną, która obejmuje patogenne limfocyty B, które rozpoznają natywny mysi MOG.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stwardnienie rozsiane jest chorobą ludzką charakteryzującą się przewlekłym stanem zapalnym i neurodegeneracją OUN, która jest uważana za spowodowaną reakcją autoimmunologiczną skierowaną na mielinę. Utrata mieliny i aksonów z czasem powoduje stopniowy spadek funkcji poznawczych i motorycznych1. "Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego" to termin zbiorczy dla zwierzęcych modeli choroby autoimmunologicznej skierowanej na mielinę OUN. Podobnie jak stwardnienie rozsiane u ludzi, EAE zwykle charakteryzuje się infiltracją komórek odpornościowych OUN i, w niektórych przypadkach, demielinizacją2. Jednak stopień, w jakim dany model EAE przypomina ludzkie stwardnienie rozsiane, zależy częściowo od użytego gatunku lub szczepu oraz od złożoności leżącej u podstaw odpowiedzi autoimmunologicznej antymieliny.

Autoimmunizacja przeciw mielinie może być eksperymentalnie wywołana na kilka sposobów, ale najpowszechniejszą metodą stosowaną obecnie jest immunizacja myszy krótkim peptydem aminokwasów naśladującym immunodominujący epitop limfocytów T CD4+ białka mielinowego. Stanowi to minimalny wymóg do wywołania odpowiedzi patogennej. Być może najczęstszym z nich jest peptyd składający się z 21 aminokwasów pochodzący z glikoproteiny mielinowej oligodendrocytów (MOG35-55), który jest używany do indukcji EAE u myszy C57Bl / 63. Jednak do niektórych celów eksperymentalnych pożądane lub nawet konieczne jest uodparnianie większymi antygenami białkowymi i rzeczywiście ma to kilka zalet w porównaniu z immunizacją krótkim peptydem. Po pierwsze, ze względu na ograniczenie MHC, krótkie peptydy są zwykle skuteczne tylko w bardzo ograniczonym zakresie szczepów, podczas gdy większe antygeny białkowe reprezentujące całe białko lub określoną domenę mogą być normalnie przetwarzane w celu prezentacji w wielu wsobnych szczepach myszy lub nawet u różnych gatunków4. Po drugie, większy antygen białkowy jest w stanie wywołać bardziej złożoną odpowiedź immunologiczną obejmującą więcej typów limfocytów w rozpoznawaniu antygenu, zamiast ograniczać rozpoznawanie antygenu do limfocytów T CD4 +. Na przykład limfocyty B poprzez swój receptor limfocytów B (BCR) oddziałują bezpośrednio z całym, a nie przetworzonym białkiem. My i inni wykazaliśmy, że limfocyty B aktywowane przez immunizację MOG35-55 nie rozpoznają białka MOG5. Ponieważ niedawno wykazano, że limfocyty B odgrywają patogenną rolę w ludzkim stwardnieniu rozsianym6, modele EAE, które włączają komórki B do patologii autoimmunologicznej, stają się coraz ważniejsze.

Pomimo zalet stosowania większych antygenów białkowych do indukcji EAE, pozostało niewiele dostępnych na rynku źródeł takich białek. Rzeczywiście, podczas gdy krótkie peptydy, takie jak MOG35-55, mogą być syntetyzowane bardzo szybko i przy stosunkowo niskich kosztach, opcje komercyjne dla białka MOG są ograniczone i kosztują znacznie więcej. Niemniej jednak istnieje kilka wektorów ekspresji dostępnych dla grup badawczych do samodzielnego generowania domeny zewnątrzkomórkowej MOG (MOG1-125). Jednak wszystkie systemy ekspresji, które zidentyfikowaliśmy w literaturze, są oparte na starszych technologiach, które od tego czasu zostały zastąpione bardziej wydajnymi systemami ekspresji7. Co więcej, większość z nich jest oparta na szczurzym lub ludzkim MOG8. W przypadku niektórych badań autoimmunizacji u myszy preferowany jest antygen oparty na mysim autoantygenie MOG. Wreszcie, wszystkie zidentyfikowane przez nas białka oparte na MOG, zarówno komercyjne, jak i jako wektory ekspresyjne, są białkami fuzyjnymi zawierającymi dodatkowe aminokwasy do zasady MOG1-125. Należą do nich znacznik do oczyszczania i zwykle również inne sekwencje, z których wiele ma funkcję, której nie byliśmy w stanie zidentyfikować.

Aby rozwiązać te problemy, stworzyliśmy nowe białko fuzyjne oparte na domenie zewnątrzkomórkowej myszy MOG połączonej ze znacznikiem zawierającym tioredoksynę, aby zwalczyć znaną nierozpuszczalność białka MOG5. Sekwencja znaczników zawiera również sekwencję 6xHis do oczyszczania i miejsce cięcia proteazy TEV, które pozwala na całkowite usunięcie wszystkich sekwencji znaczników, jeśli jest to pożądane. Jest to jedyna znana nam metoda generowania czystego białka MOG1-125. Aby ułatwić produkcję dużych ilości białka, sekwencję MOG1-125 zoptymalizowano pod kątem ekspresji kodonów bakteryjnych, a białko fuzyjneznacznika MOG wprowadzono do systemu ekspresji pET-32. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół produkcji i oczyszczania białkaznacznika MOG oraz czystego MOG1-125, przy użyciu niespecjalistycznego sprzętu dostępnego w większości laboratoriów immunologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Indukcja białek

UWAGA: W następujących krokach, bakterie BL21 Escherichia coli przekształcone za pomocą wektora pET-32 zawierającego sekwencję białka fuzyjnegoznacznika MOG (patrz odniesienie5 i rysunek 1) są hodowane do wysokich gęstości, a następnie indukowane do ekspresji białkaznacznika MOG. Zobacz rysunek 2, aby zapoznać się z ogólną osią czasu - należy pamiętać, że dni są przybliżone, a alternatywne punkty zatrzymania są odnotowane w protokole. Jeśli zaczynasz od oczyszczonego DNAwektora znacznika pET-32 MOG, konieczne będzie chemiczne przekształcenie go w kompetentne bakterie BL21 E. coli przy użyciu selekcji ampicyliny, jak to zostało dobrze opisane9. Pomyślną transformację można potwierdzić poprzez oczyszczenie DNA z wybranych bakterii przy użyciu standardowego zestawu komercyjnego, a następnie trawienie za pomocą enzymów restrykcyjnych Age1 i Sac1 w celu wytworzenia pasma 424 pz na żelu agarozowym10.

  1. Zaszczepić 5 ml sterylnego bulionu lizogenicznego (LB) (0,1 mg ampicyliny/ml) bulionem glicerolowym BL21-MOG i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 200 obr./min.
  2. Umieścić dwie 1 l kolby Erlenmeyera zawierające 500 ml sterylnego bulionu LB w inkubatorze o temperaturze 37 °C w celu przygotowania do następnego dnia.
  3. Dodać 500 μl ampicyliny o stężeniu 100 mg/ml do każdej z kolb zawierających 500 ml LB z etapu 1.2 (stężenie końcowe 0,1 mg/ml ampicyliny). Przenieść 1 ml kultury przez noc z etapu 1.1 do każdej z dwóch kolb bulionu LB. Inkubować w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 200 obr./min przez 5 godzin lub do uzyskania gęstości optycznej 0,6.
  4. Pobrać jedną podwielokrotność o pojemności 1 ml z jednej z kolb i przenieść ją do oddzielnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Osadzać komórki w masie 16 000 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant. Oznacz probówkę jako T0 (wstępna indukcja), a następnie umieść osad bakteryjny w zamrażarce o temperaturze -20 °C do przyszłej analizy elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) (patrz rozdział 8 i rysunek 3).
  5. Dodać 0,5 ml 1 M izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu, β-D-tiogalaktozydu izopropylu (IPTG) do każdej kolby hodowlanej. Inkubować kolby w temperaturze 37 °C, 200 obr./min przez 4 godziny, a następnie w temperaturze pokojowej przy 75 obr./min przez noc.

2. Zbiórznacznika MOG Białko

UWAGA: Na tym etapie bakterie będą już wyprodukować duże ilości białkaznacznika MOG. Aby zebraćznacznik MOG, bakterie są najpierw poddawane lizie w buforze Triton X-100, a następnie poddawane sonikacji. Znacznik MOG jest następnie uwalniany z ciał inkluzyjnych i denaturowany imidazolem i guanidyną, w wyniku czego powstaje surowy roztwór białkowy zawierający białkoznacznika MOG.

  1. Pobrać jedną podwielokrotność o pojemności 1 ml z jednej z nocnych kultur z kroku 1.5 i przenieść ją do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Osadzać komórki w masie 16 000 x g przez 1 minutę i usunąć supernatant. Oznacz probówkę TO/N (po indukcji), a następnie umieść osad bakteryjny w zamrażarce o temperaturze -20 °C w celu przyszłej analizy strony SDS (Rysunek 3).
  2. Rozprowadzić kultury równomiernie w butelkach o pojemności 250 ml zgodnych z wirowaniem z dużą prędkością i od tego momentu przechowywać je na lodzie. Osadzać komórki bakteryjne w temperaturze 22 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Odrzucić supernatant. Przechowywać granulki bakteryjne w temperaturze -20 °C lub przejść do kroku 2.4.
  4. Przygotować bufor do lizy (0,1 mg/ml lizozymu jaj kurzych, 0,1% Triton-X (v/v) w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (PBS)) przez dodanie 60 μl Triton X-100 i 120 μl 50 mg/ml roztworu podstawowego lizozymu jaj kurzych do 60 ml PBS.
  5. Ponownie zawiesić i połączyć wszystkie osady bakteryjne z kroku 2.3 w sumie 30 ml buforu do lizy. Przenieść tę objętość do probówki o okrągłym dnie o pojemności 50 ml, która umożliwia szybkie wirowanie. Umieść tę rurkę w łaźni wodnej o temperaturze 30 °C na 30 minut. W czasie inkubacji należy dwukrotnie wstrząsnąć probówką, aby ponownie zawiesić komórki.
  6. Po inkubacji przenieś probówkę na lód i poddaj sonikacji roztworu przy 20 kHz, amplitudzie 70%, impuls na 3 sekundy, impuls wyłączony na 3 sekundy i pięć impulsów na rundę. Poddaj roztwór sonifikacji przez łącznie sześć rund i pozwól roztworowi ostygnąć na lodzie pomiędzy rundami.
  7. Odwirować roztwór o stężeniu 24 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i powtórzyć czynności 2,5-2,7 raz. Przechowywać granulki w temperaturze -20 °C lub przejść do kroku 2.8.
  8. Przygotować bufor A (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazolu, pH 7,9) dodając 0,8766 g NaCl, 0,09456 g Tris-HCl i 0,01021 g imidazolu do zlewki o pojemności 100 ml. DodawaćH2O, aż objętość osiągnie 28 ml, a następnie dostosować pH roztworu do 7,9. Następnie przenieść roztwór do cylindra miarowego o pojemności 100 ml i dodawaćH2O, aż objętość osiągnie 30 ml.
  9. Zawiesić osad z etapu 2.7 w 30 ml buforu A i inkubować ten roztwór w temperaturze 4 °C przez 3 godziny. W tym czasie odważyć 17,2 g chlorowodorku guanidyny.
  10. Sonikować roztwór na lodzie, używając tych samych ustawień, co w kroku 2.6. Następnie dodaj 17,2 g chlorowodorku guanidyny do roztworu. Inkubuj to na lodzie przez 1 godzinę, aby rozpuścić białkoznacznika MOG.
  11. Odwirować roztwór o stężeniu 24 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i przechowywać go w temperaturze 4 °C do czasu oczyszczenia białka.

3. Oczyszczanie białka

UWAGA: W następujących krokach białkoznacznika MOG zostanie oczyszczone przez 4 rundy absorpcji na naładowanej żywicy niklowej (za pomocą znacznika His) i elucji.

  1. Utwórz następujące:
    1. Przygotować bufor B (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazol, 6 M guanidyno-HCl, pH 7,9). Do zlewki o pojemności 500 ml dodać 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 0,0681 g imidazolu i 114,64 g chlorowodorku guanidyny. Następnie dodaćH2O, aż osiągnie 190 ml i dostosować pH do 7,9. Przenieść roztwór do cylindra miarowego o pojemności 250 ml i dodawaćH2O, aż objętość osiągnie 200 ml.
    2. Przygotować bufor elucyjny (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 0,5 M imidazol, 6 M guanidyno-HCl, pH 7,9). Do zlewki o pojemności 500 ml dodać 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 6,808 g imidazolu i 114,64 g chlorowodorku guanidyny. DodawaćH2O, aż osiągnie 190 ml i dostosować pH do 7,9. Przenieść roztwór do cylindra miarowego o pojemności 250 ml i dodawaćH2O, aż objętość osiągnie 200 ml.
    3. Przygotować bufor paskowy (500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, pH 7,9). Dodać 5,844 g NaCl, 0,6304 g Tris-HCl, 40 ml 500 mM EDTA do zlewki o pojemności 500 ml. DodaćH2O, aż osiągnie 190 ml i dostosować pH do 7,9. Przenieść roztwór do cylindra miarowego o pojemności 250 ml i dodawaćH2O, aż objętość osiągnie 200 ml.
    4. Przygotować bufor wsadowy (0,1 M siarczan niklu). Dodać 5,257 g siarczanu niklu do zlewki o pojemności 500 ml i dodawaćH2O, aż osiągnie 190 ml (UWAGA, nie dotykać siarczanu niklu poza wyciągiem, dopóki siarczan niklu nie zostanie rozpuszczony wH2O). Po rozpuszczeniu siarczanu niklu przenieść roztwór do cylindra miarowego o pojemności 250 ml i dodawaćH2O, aż objętość osiągnie 200 ml.
  2. Rozdzielić 10 ml żywicy niklowej między dwie stożkowe probówki wirówkowe o pojemności 50 ml, które są w stanie wytrzymać siły odśrodkowe powyżej 4 500 x g (po 5 ml w każdej probówce).
  3. Naładować i zrównoważyć żywicę niklową:
    1. Przemyć żywicę, dodając 40 mlH2Odo każdej probówki zawierającej żywicę. Ułożyć rurki poziomo na kołysce i pozostawić do mieszania przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu odwirować probówki o stężeniu 4 500 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Usunąć supernatant przez pipetowanie, aby uniknąć uszkodzenia osadu. Dodać 40 ml buforu ładującego do każdej probówki. Przenieść rurki na kołyskę i pozostawić je na mieszanie przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu odwirować probówki o stężeniu 4 500 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Odrzucić sklarowany osad, a następnie dodać 40 ml buforu B do probówek. Przenieść rurki na kołyskę i pozostawić je na mieszanie przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu odwirować probówki o masie 4 500 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C, a następnie wyrzucić sklarowane nad osadem.
  4. Opcjonalnie: Pobrać 150 μl rozpuszczonego białka zebranego w kroku 2.11 i przenieść je do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Oznacz probówkę jako preinkubacyjną i zamroź ją w temperaturze -20 °C do przyszłej analizy strony SDS (Rysunek 3,Znacznik surowego MOG).
  5. Oczyść białkoznacznika MOG:
    1. Przenieść całą objętość rozpuszczonego białka z kroku 2.11 (~40 ml, minus mała próbka usunięta w kroku 3.4) do pierwszej probówki (Rysunek 2, probówka 1) zawierającej żywicę niklową z kroku 3.3, wymieszać i umieścić poziomo na kołysce w temperaturze 4 °C na 1 godzinę.
    2. Odwirować probówkę o ciśnieniu 4 500 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Po zakończeniu przenieść supernatant do drugiej probówki (Rysunek 2, probówka 2) z żywicy niklowej i inkubować zgodnie z opisem w poprzednim kroku. W międzyczasie kontynuuj kroki od 3 do 6 poniżej z rurką 1.
    3. Zawiesić żywicę niklową w probówce 1 na 40 ml buforu elucyjnego i umieścić probówkę poziomo na kołysce w temperaturze 4 °C na 5 minut. Następnie odwirować probówkę o stężeniu 4 500 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Przenieść sklarowany nad osadem zawierający eluowane białkoznacznika MOG do butelki o pojemności 250 ml z napisem "oczyszczone białkoznacznika MOG" i przechowywać tę butelkę w temperaturze 4 °C. Na każdym etapie elucji należy zebrać powstały supernatant w tej butelce.
    5. Dodać 40 ml buforu paskowego do żywicy niklowej i umieścić poziomo na kołysce na 5 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Odwirować probówkę o stężeniu 4 500 x g przez 8 minut w temperaturze 4 °C. Wyrzucić supernatant, a następnie ponownie napełnić żywicę niklową, jak podano w kroku 3.3.
    7. Po zakończeniu przejdź do przodu z drugą rurką, jak wymieniono w kroku 3.5. W sumie 4 rundy absorpcji rozpuszczonego białka z kroku 2.11 na naładowaną żywicę niklową i elucja pozwolą odzyskać większość białka, chociaż w razie potrzeby dodatkowe białko można odzyskać w dodatkowych rundach wchłaniania i elucji.
  6. Po zakończeniu czterech (lub więcej) rund absorpcji i elucji, należy przechowywać zebrane oczyszczone białko w temperaturze 4 °C przez noc. Żywica niklowa może być przechowywana w 40 ml 20% roztworu etanolu w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie ponownie potrzebna.

4. Pomiar stężenia białka

UWAGA: Zanim przejdziemy dalej, konieczne jest ilościowe określenie ilości oczyszczonego białkaznacznika MOG wygenerowanego w sekcji 3. Wartość ta zostanie wykorzystana do określenia końcowej objętości do zagęszczenia białka na końcu protokołu. Poniżej opisujemy standardowy test Bradforda. Stężenie oczyszczonego białka MOGtag określa się przez porównanie absorbancji widmowej seryjnie rozcieńczanego białkaMOG tag z krzywą wzorcową albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o znanym stężeniu.

  1. Sporządzić 10-krotny bufor octanowy, dodając 23 ml lodowatego kwasu octowego do 8,2 g octanu sodu w zlewce o pojemności 3 l, a następnie dodać 1,9 lH2Ow celu rozpuszczenia octanu sodu. Przenieść ten roztwór do cylindra miarowego o pojemności 2 l i dodawaćH2O, aż objętość osiągnie 2 l. Następnie przechowuj go w butelce o pojemności 2 litrów w temperaturze pokojowej. Przygotować 1 ml 1x buforu octanowego, dodając 100 μl 10x buforu octanowego do 900 μlH2O.
  2. Ustawić 96-dołkową płytkę do rozcieńczeń, dodając 30 μl 1x buforu octanowego do studzienek G2-8 i 60 μl do G9. Dodać 48 μl 1x buforu octanowego do H2 i H3.
  3. Ustawić początkowe seryjne rozcieńczenie wzorca BSA w wierszu G w następujący sposób: Dodać 216 μl 1x buforu octanowego i 54 μl dostępnego w handlu wzorca BSA 2 mg/ml do studzienki G1 i dokładnie wymieszać. Dodać 210 μl z dołka G1 do dołka G2, dokładnie wymieszać, a następnie dodać 180 μl basenika G2 do dołka G3. Dodać 150 μl basenika G3 do dołka G4, dokładnie wymieszać i kontynuować ten trend dodawania 30 μl mniej do każdego kolejnego dołka, aż do dołka G8. (Patrz tabela 1 w celu zapoznania się z wykazem równoważnych współczynników rozcieńczenia).
  4. Ustawić trzy próbki każdego rozcieńczenia, przenosząc 10 μl dołka G1 do studzienek A1, B1 i C1 oraz 10 μl dołka G2 do studzienek A2, B2 i C2 i tak dalej. Użyj pipety wielokanałowej.
  5. Aby ustawić rozcieńczeniaznacznika MOG, dodaj 60 μl oczyszczonego białkaznacznika MOG z kroku 3.6 do dołka H1. Dodać 12 μl z dołka H1 do dołka H2, dokładnie wymieszać, następnie dodać 12 μl dołka H2 do dołka H3, dokładnie wymieszać (w ten sposób uzyskuje się 1-krotne rozcieńczenie w H1, rozcieńczenie 1/5 w H2 i 1/25 rozcieńczenie w H3).
  6. Ustawić potrójne próbki do rozcieńczeńznacznika MOG, przenosząc 10 μl studzienek H1-H3 do rzędów D, E i F, jak opisano w kroku 4.4.
  7. Zmieszać 2 ml koncentratu odczynnika do oznaczania białka z 8 mlH2O. Dodać 200 μl tej mieszaniny do wszystkich wstępnie załadowanych studzienek w rzędach A, B, C, D, E i F, używając pipety wielokanałowej, jeśli jest dostępna. Umieść wszelkie bąbelki w studzienkach za pomocą igły przed odczytaniem stężenia białka.
  8. W ciągu 10 minut od dodania odczynnika barwiącego zmierzyć absorbancję 595 nm wszystkich studzienek w rzędach A, B, C, D, E i F.
  9. Użyj wierszy A, B i C, aby ustawić krzywą standardową, w której pozycje 1-9 odpowiadają 0,4, 0,35, 0,3, 0,25, 0,2, 0,15, 0,1, 0,05 i 0 mg/ml BSA. Na podstawie tej krzywej oblicz stężenie białkaznacznika MOG, stosując rozcieńczenieznacznika MOG, które najlepiej pasuje do krzywej standardowej. Zazwyczaj z 1 l kultury bakteryjnej będzie pochodzić od 200 do 250 mg białkaMOG tag według protokołu opisanego tutaj.
    UWAGA: Aby wykonać MOG1-125, należy przejść do opcjonalnej sekcji 7 wymienionej na końcu protokołu. W przeciwnym razie przejdź do sekcji 5.

5. Dializy

UWAGA: Dializa jest przeprowadzana w celu stopniowego usuwania guanidyny z roztworu zawierającego oczyszczony, zdenaturowanyznacznik MOG, aby umożliwić ponowne fałdowanie białka. Na tym etapie należy zachować ostrożność, ponieważ sam MOG jest bardzo nierozpuszczalny i chociaż poprawia się to dzięki obecności znacznika tioredoksyny, nadal jest podatny na wydostawanie się z roztworu. Dlatego ponowne składanie powinno odbywać się stopniowo i przy stosunkowo niskim stężeniuznaczników MOG.

  1. Przed rozpoczęciem dializy należy rozcieńczyć oczyszczone białkoznacznika MOG buforem B (bufor B można przygotować zgodnie z opisem w kroku 3.1) do momentu, gdy stężenie wyniesie 0,5 mg/ml lub mniej, w oparciu o ilośćznacznika MOG obliczoną w sekcji 4.
  2. Przeciąć około 30 cm rurki dializacyjnej ze skóry węża i zabezpieczyć jeden koniec hemostatem blokującym, składając koniec skóry węża ponad trzy razy i zaciskając złożony koniec hemostatem. Napełnij skórę węża rozcieńczonym białkiem MOGtag (od 60 do 90 ml białka MOGtag na probówkę), a następnie usuń pęcherzyki powietrza ze skóry węża, wypychając je z otwartego końca. Na koniec uszczelnij drugi koniec rurki za pomocą drugiego hemostatu blokującego.
  3. Powtórz krok 5.2, aby napełnić dodatkowe odcinki rurki dializacyjnej, aż całe białkoznacznika MOG zostanie przeniesione do rurki dializacyjnej ze skóry węża. Upewnij się, że nie ma wycieków.
  4. Przygotować 1x octan z 4 M guanidyną, odważając 382,12 g chlorowodorku guanidyny i dodając 100 ml 10x buforu octanowego przygotowanego w kroku 4.1 do zlewki o pojemności 2 l. Dodać 0,5 lH2Odo zlewki i pozostawić chlorowodorek guanidyny do rozpuszczenia. Po rozpuszczeniu przenieść roztwór do cylindra z podziałką o pojemności 1 l i dodawaćH2O, aż objętość osiągnie 1 l. Powtórz ten przepis dla każdych 2 wymaganych skór węży.
  5. Dializę należy przeprowadzić w następujący sposób: napełnić duże wiadro (minimum 10 l) 1 litrem buforu octanowego z 4 M guanidyną z kroku 5.4. Umieść do 2 odcinków rurki dializacyjnej zawierającejznacznik MOG w wiadrze, pozostawiając miejsce na mieszadło magnetyczne, które może się bez przeszkód obracać na dnie. Umieść wiadro w pomieszczeniu o temperaturze 4 °C na magnetycznej płycie mieszającej i włącz je do niskiej prędkości obrotowej (tj. nie wysokiej, tylko na tyle, aby przesunąć płyn):
    UWAGA: Wykonaj następujące kroki, aby stopniowo zmniejszać ilość guanidyny w buforze. Czasy mieszania są podane jako minimum, ale można je pozostawić na noc. Dializa trwa co najmniej 3 dni, ale w razie potrzeby można ją przedłużyć. Regularnie sprawdzaj, czy rurka jest nienaruszona, a jej końce są dobrze zamknięte.
    1. Odstaw wiadro i mieszaj przez 4-5 godzin.
    2. Dodać 1 l 1x buforu octanowego (100 ml 10x buforu octanowego i 900 mlH2O) do każdego wiadra.
    3. Powtórzyć kroki 5.5.1 i 5.5.2 w sumie 3 razy, aby uzyskać łącznie 4 l buforu w wiadrze.
    4. Wyrzuć połowę buforu do wiadra i ponownie napełnij 1 litrem 1x buforu octanowego (100 ml 10x buforu octanowego i 900 mlH2O, bez guanidyny) i ustaw rurkę i mieszadło.
    5. Kroki 5.5.1 i 5.5.2 powtórzyć jeden raz (tj. do momentu, gdy w wiadrze znajdzie się łącznie 4 l buforu).
    6. Na koniec wymień całą objętość 4 l w wiadrze na 4 l świeżego buforu 1x octanowego i mieszaj przez 4-5 godzin. Aby uzyskać najlepsze wyniki, wykonaj ten krok w dniu koncentracji białka.
    7. Ostrożnie wyjmij rurkę dializacyjną z ponownie złożonymMOG tag i wyrzuć bufor wiadra.

6. Koncentratorbiałka

znacznika MOG

UWAGA: W końcowym kroku, ponownie złożone białkoznacznika MOG jest zagęszczane do roboczego rozcieńczenia w celu przechowywania. Ze względu na to, żeMOG tag jest bardzo nierozpuszczalny, nie powinien przekraczać 5 mg/ml. Stężenie to jest w przybliżeniu równomolowe z peptydem 0,4 mg/ml MOG35-55, który jest powszechnie stosowany do indukcji EAE u myszy (zmieszany 1:1 z pełnym adiuwantem Freunda (CFA)). Podczas procesu zagęszczania nierzadko zdarza się, że z roztworu wydostaje się niewielka ilość białka w postaci białego osadu. Problemem są jednak nadmierne opady.

  1. Obliczyć ostateczną pożądaną objętość, aby osiągnąć stężenieznacznika MOG wynoszące 5 mg/ml, na podstawie wartości obliczonej w sekcji 4.
  2. Wyłóż patelnię folią aluminiową i przykryj folię aluminiową glikolem polietylenowym (PEG) 3350 i PEG 8,000 w stosunku 1:1. PEG 3350 jest włączony do tej mieszaniny, ponieważ może pomóc w zapobieganiu agregacji białek podczas koncentracji i jest skutecznym cyrokonserwantem11.
  3. Umieść rurkę z wężowej skóry (z białkiemMOG tag w środku) na folii aluminiowej i przykryj PEG 8000. Pozostaw to w temperaturze pokojowej i regularnie sprawdzaj objętość, aż objętość będzie równa lub mniejsza od szacowanej objętości końcowej (obliczonej w kroku 6.1), rzeczywista objętość zostanie zmierzona w następnym kroku. Jeśli podczas procesu zagęszczania patelnia zostanie przesycona wodą, ustaw świeżą patelnię z folią aluminiową i PEG 3350 i PEG 8000.
  4. Skórę węża należy przemyć z zewnątrzH2O, a białkoznacznika MOG przenieść do osobnej szklanej butelki za pomocą pipety serologicznej. Śledź objętość podczas przenoszenia białka, aby upewnić się, że objętość jest prawidłowa.
    1. Jeśli objętość została zmniejszona poniżej szacowanej objętości końcowej, dodaj 1x bufor octanowy, aż do osiągnięcia żądanej objętości. Jeśli objętość jest większa niż szacowana objętość końcowa, przenieść białkoznacznika MOG z powrotem do rurki dializacyjnej i kontynuować zatężanie (kroki 6.2-6.3).
    2. Rozprowadzić białkoznacznika MOG w probówkach o pojemności 1,5 ml (0,5 ml na probówkę), przechowywać probówki w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będą potrzebne. Aby wywołać EAE, wymieszaj ten tom 1:1 z CFA.
  5. Uruchom żel SDS PAGE, aby potwierdzić ekspresję białkaznacznika MOG przy użyciu próbek pobranych w krokach 1.4, 2.1, 3.4 i oczyszczonego białka MOG z kroku 6.4.

7. Generowanie MOG1-125 ztagu MOG za pomocą proteazy TEV (opcjonalnie)

UWAGA: Ten opcjonalny krok jest kontynuowany od końca kroku 4. Jeśli wymagany jest MOG1-125 bez żadnych dodatkowych sekwencji znaczników, sekwencje znaczników można usunąć za pomocą proteazy TEV (ryc. 4). O ile nam wiadomo, nie ma innego systemu ekspresji zdolnego do wygenerowania czystego MOG1-125. Należy jednak zauważyć, że bez znacznika tioredoksyny MOG1-125 jest wysoce nierozpuszczalny, co może powodować problemy podczas oczyszczania i obchodzenia się z nim, i z tego powodu usunąć znacznik, jeśli jest to absolutnie konieczne ze względów eksperymentalnych. Do wygenerowania czystego MOG1-125 wymagane jest kilka kroków. Znacznik MOG jest najpierw dializowany do bufora rozszczepienia proteazy TEV. Po trawieniu proteazą TEV objętość jest zmniejszana, aby pomóc w późniejszych etapach oczyszczania, a następnie dializowana do buforu B, a następnie sekwencja znacznika His-zawierająca znacznik jest usuwana za pomocą żywicy niklowej. Na koniec białko jest oznaczane ilościowo, a czysty MOG1-125 jest zagęszczany do końcowego stężenia.

  1. Przygotować 1 l 10 x bufor rozszczepienia TEV (500 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA), dodając 1,861 g EDTA, 44,4 g Tris-HCl i 26,5 g Tris do zlewki o pojemności 2 l. DodawaćH2O, aż objętość osiągnie 990 ml, a następnie dostosować pH do 8, aby rozpuścić EDTA. Przenieść roztwór do cylindra z podziałką o pojemności 1 l i zwiększyć objętość do 1 litra za pomocąH2O.
  2. Rozcieńczyć białkoznacznika MOG od kroku 3,6 do 0,5 mg/ml przy użyciu buforu B (tego samego buforu opisanego w kroku 3.1), w oparciu o ilość białka obliczoną w punkcie 4. Przenieść 120 ml rozcieńczonego białkaznacznika MOG do rurki dializacyjnej ze skóry węża zgodnie z opisem w krokach 5.2 do 5.3. Objętość można zwiększyć, jednak ilość proteazy TEV wymagana do rozszczepienia całego białkaznacznika MOG będzie znaczna.
  3. Postępuj zgodnie z protokołem dializy wymienionym w kroku 5.5, z wyjątkiem zastąpienia 10-krotnego buforu octanowego buforem 10-krotnego rozszczepienia TEV wykonanym w kroku 7.1.
  4. Przenieśznacznik MOG, teraz w buforze rozszczepienia TEV, do nowej szklanej butelki o pojemności 250 ml i monitoruj zwiększoną objętość po dializie. Dodać 1 μl β-merkaptoetanolu na każde 2,85 ml białkaMOG tag dodanego do butelki. Dodać co najmniej 1 mg proteazy TEV (podstawowy roztwór TEV o stężeniu 5 mg/ml) na każde 50 mg białkaznacznika MOG (proteazę TEV można dodać w stosunku białka 1:10 TEV:MOG) i inkubować w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem przez co najmniej 72 godz.
    UWAGA: Pod koniec inkubacji proteazy TEV na dnie szklanej butelki powinny być widoczne białe osady.
  5. Przed przeniesieniem białka do rurki dializacyjnej należy dodać chlorowodorek guanidyny do roztworu, aż białka się rozpuszczą, aby zapobiec przywieraniu osadów białkowych do szklanej butelki. Przenieść 150 μl tego roztworu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i oznaczyć probówkę jako "MOG z TEV". Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C do przyszłej analizy SDS-PAGE.
  6. Przenieść cały płyn z kroku 7.5 do rurki dializacyjnej zgodnie z opisem w krokach od 5.2 do 5.3. Napełnij duże wiadro 2 litramiH2Oi umieść w nim rurkę do dializy. Inkubować w temperaturze 4 °C, lekko mieszając przez noc. Ten krok jest ważny, aby rozcieńczyć guanidynę, aby umożliwić szybkie zagęszczenie białka i rozpocząć usuwanie EDTA z roztworu, który będzie zakłócał oczyszczanie białka.
  7. Zagęścić białko w wężyku do dializy zgodnie z opisem w krokach od 6.2 do 6.3 (z wyjątkiem stosowania wyłącznie PEG 8000) w taki sposób, aby końcowa objętość roztworu wynosiła ~40 ml. Umyć rurkę do dializyH2Oi usunąć wszelkie pozostałości PEG 8000 nadal przymocowane do przewodu. To zmniejszenie objętości umożliwia zmieszczenie całego strawionego białka w probówce o pojemności 50 ml zawierającej żywicę niklową, jak opisano w kroku 3.5.
  8. Dializować strawione białko do buforu B:
    1. Napełnij duże wiadro 1 litrem buforu B (29,22 g NaCl, 3,152 g Tris-HCl, 0,3405 g Imidazolu, 573,18 g guanidyno-HCl, pH 7,9).
    2. Umieść skóry węży zawierające strawione białko z kroku 7.7 w wiadrze wraz z magnesem mieszającym (zgodnie z bardziej szczegółowym opisem w kroku 5.5). Umieść wiadro w chłodnym pomieszczeniu o temperaturze 4 °C na talerzu mieszającym ustawionym na powolne mieszanie i pozwól skórom węży dializować się przez 5 lub więcej godzin.
    3. Opróżnij wiadro i napełnij je kolejnym 1 litrem buforu B i pozostaw go w chłodni o temperaturze 4 °C na płytce mieszającej ustawionej na powolne mieszanie i pozwól skórom wężowym dializować przez 5 lub więcej godzin.
  9. Przeprowadzić oczyszczanie białka MOG1-125 zgodnie z opisem w sekcji 3, z istotną różnicą, że rozszczepione sekwencje znaczników zostaną związane przez żywicę niklową, pozostawiając MOG1-125 w roztworze. Ponownie, 4 rundy oczyszczania zostaną przeprowadzone na tej samej objętości, ale w tym przypadku celem jest poprawa czystości, a nie odzyskanie jak największej ilości białka. Zobacz rysunek 4.
    1. Przygotuj do oczyszczania białek wymienione w kroku 3.1
    2. Naładować obie rurki żywicy niklowej zgodnie z opisem w kroku 3.3.
    3. Oczyszczać MOG1-125 zgodnie z protokołem opisanym w kroku 3.5, z zasadniczym wyjątkiem, że eluat z etykiety zawierającej żywicę niklową jest odrzucany (150 μl eluatu należy przechowywać w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml do przyszłej analizy SDS-PAGE), podczas gdy roztwór zawierający MOG1-125 zachowuje się jako produkt końcowy.
  10. Zmierzyć stężenie białka MOG1-125 zgodnie z opisem w punkcie 4:
    1. Ustawić rozcieńczenia krzywej wzorcowej BSA zgodnie z opisem w krokach 4.2 i 4.4.
    2. Ustaw rozcieńczenia MOG1-125 zgodnie z opisem w krokach 4.5 i 4.6. Alternatywnie cenne może być wygenerowanie większego zakresu rozcieńczeń (na przykład 1x, 1/2, 1/4 i 1/8). Dostosuj odpowiednio objętości 1x buforu octanowego i MOG1-125.
    3. Wykonaj test Bradforda zgodnie z opisem w krokach od 4.7 do 4.9 i oblicz ilość wygenerowanego MOG1-125. Oczekiwany plon to około 4 mg lub więcej białka.
  11. Ponownie złożyć MOG1-125 poprzez stopniowe usuwanie guanidyny za pomocą dializy, jak opisano w punkcie 5.
  12. Koncentrat białka MOG1-125 zgodnie z opisem w punkcie 6. Końcowe stężenie powinno wynosić 2,24 mg/ml, co jest równomolowe z 5 mg/mlMOG tag.

8. SDS-PAGE Żel do potwierdzania produkcji i czystościznacznika MOG

UWAGA: Próbki pobrane z kroków 1.4, 2.1, 3.4 i 6.4 są analizowane przez standardową SDS-PAGE w celu potwierdzenia produkcji i czystościznaczników MOG. Ten krok należy wykonać po ostatecznym oczyszczeniu zMOG tag lub MOG1-125.

  1. Wykonaj bufor ładujący 2x SDS-PAGE, dodając 1,576 g Tris-HCl do 2 mlH2Oi ustaw pH na 6,8. Dodać 0,4 g SDS do roztworu Tris-HCl, a następnie dodawaćH2O, aż objętość osiągnie 7 ml.
  2. Dodać 0,2 g błękitu bromofenolowego do 10 mlH2O, a następnie dodać 1 ml tego roztworu do roztworu przygotowanego w kroku 8.1. Na koniec dodaj 2 ml glicerolu, aby zakończyć bufor ładujący 2x SDS-PAGE. Podczas przechowywania tego roztworu należy przechowywać w temperaturze 4 °C i chronić go przed światłem przez okres do 3 miesięcy.
  3. Rozmrozić zamrożone porcje bakterii z kroków 1.4 i 2.1, a także rozpuszczone białkoznacznika MOG z kroków 3.4 i 6.4 w temperaturze pokojowej.
  4. Usunąć sole z roztworów zebranych w krokach 3.4 i 6.4, dodając po 60 μl każdego z nich do kolumn do odsalania białek. Oczyść białka zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Dodać 20 μl β-merkaptoetanolu do 1 ml roztworu przygotowanego w kroku 8.2. Dodać 40 μl tego do dwóch osadów bakteryjnych z etapu 8.3 i 60 μl do odsolonych białek z kroku 8.4 i inkubować je w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
  6. Zrób 1x bufor do pracy strony SDS, ważąc 5 g Tris, 28,8 g glicyny i 1 g SDS. Dodaj je do 1 litrowej zlewki i dodaj 500 ml H2O, aby wszystko rozpuścić. Po rozpuszczeniu przenieść roztwór do cylindra z podziałką o pojemności 1 l i napełnić goH2O, aż objętość osiągnie 1 l.
  7. Umieść 12% żel poliakryloamidowy w aparacie żelowym, a następnie dodaj bufor do biegania 1x SDS-PAGE do aparatu żelowego tak, aby bufor do biegania znajdował się tuż nad górną częścią studzienek w żelu. Przemyć studzienki żelu, odpipetowując 50 μl buforu do studzienek po pięć razy każdy.
  8. Załadować 10 μl drabinki białkowej do pierwszego dołka i dodać 10 μl przegotowanych roztworów z kroku 8.5 do oddzielnych studzienek. Uruchom żel pod napięciem 115 V przez 60 minut.
  9. Wyjmij żel z aparatu i przenieś go do małego pojemnika. Napełnić pojemnik 100 ml czystegoH2Oi przenieść pojemnik na wolno obracającą się platformę na 8 minut. Po upływie 8 minut wylej wodę i przemyj żel jeszcze dwukrotnie za pomocąH2O.
  10. WylaćH2Oz pojemnika i dodać do pojemnika 100 ml odczynnika do szybkiego barwienia. Pozostaw na noc na wolno obracającej się platformie, przykryj folią aluminiową.
  11. Zrzuć odczynnik do szybkiego barwienia i dodaj około 100 mlH2Odo pojemnika. Pozostaw go na obrotowej platformie na 8 minut. WyrzućH2Oi powtórz mycieH2Odwukrotnie.
  12. Zobrazuj żel za pomocą imagera dla niebieskich plam coomassie. Poszukaj pasma około 31,86 kDa (białkoznacznika MOG) i słabszego pasma przy 63,72 kDa (dimeryznacznika MOG).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po zakończeniu oczyszczania, próbki zebrane w krokach 1.4, 2.1, 3.4 oraz produkt końcowy z kroku 6.4 powinny zostać poddane działaniu żelu białkowego (Rysunek 3A). Oznacznik MOG powinien najpierw pojawić się jako pasmo 31,86 kDa w próbce TO/N, ale nie T0 i powinno być jedynym pasmem w czystym produkcie końcowym. Aby sprawdzić, czy białkoznacznika MOG prawidłowo się pofałdowało, białkoznacznika MOG można użyć do znakow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisaliśmy protokół produkcji białkaMOG tag oraz sposób generowania czystego MOG1-125 z białkaMOG tag . Protokół ten opiera się zarówno na standardowych metodach oczyszczania białek opartych na znaczniku Hisa, jak i na wcześniej opisanym protokole wytwarzania starszego białka opartego na MOG15. Chociaż nie jest to tutaj opisane, głównym zastosowaniem białkaznacznika MOG jest indukowanie EAE poprzez immunizację antygenem białkowym. Protokół opisujący, w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant z Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ jest laureatem nagrody Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Studentship Award.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BL21 E. coli- pet32-MOGtagKerfoot labBakterie te są niezbędne do wytworzenia białka MOGtag. Zapasy glicerolu tych bakterii są dostępne na życzenie.
LB młynek bulionowyBioshopLBL407.1
Ampicylinabio basicAB0028Rozpuścić proszek na 50% etanolu / 50% H2O w temperaturze 100 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 stopni C.
IPTGBioshopIPT002.5Ponownie rozpuść proszek w H2O w temperaturze 1M i przechowuj w temperaturze -20 stopni C.
Lizozym jaj kurzychBioshopLYS702.10Rozpuścić w H2O w dawce 50 mg/ml i przechowywać w temperaturze -80 stopni C.
Triton-X100SigmaT-8532
Technologie życiasoli buforowanej fosforanami20012-027Komercyjna sól fizjologiczna buforowana fosforanami nie jest wymagana, wystarczy każda standardowa sól fizjologiczna buforowana fosforanem wyprodukowana w laboratorium.
Chlorek soduBioshopSOD004.1
Tris-HClBioshopTRS002.1
ImidazoleBioshopIMD508.100
Guanidyna-HClSigmaG3272Jakość musi być większa niż 98% czystości.
0,5 M EDTAbioshopEDT111.500
Siarczan niklu (II)BioshopNIC700.500
Żywica wiążąca goEMD Millipore69670-3Przechowywać w 20% etanolu 80% H2O w temperaturze 4 ° C
Alkohole handloweetanolu bezwodnegoP016EAANW razie potrzeby rozcieńczyć wodą.
Lodowaty kwas octowyBioshopACE222.1
Octan sodu trójwodnyBioshopSAA305.500
albumina surowicy bydlęcej standardbio-rad500-0206
Test białkowy Bio-rad koncentrat odczynnikabio-rad500-0006
Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa dwuwodianFisher scientificBP120-500
Tris-baseBioshopTRS001.1
7000 MW Wężowa rurka dializowaThermoscientific68700
2-merkaptoetanolSigmaM3148-25mlTen odczynnik nie powinien być używany poza wyciągiem.
Technologie życiaproteazy AcTEV12575-015Wytwarzanie własnej proteazy TEV można wykonać za pomocą (https://www.addgene.org/8827/) i oczyścić jak w odnośniku 17
Glikol polietylenowy 3350BioshopPEG335.1
glikol polietylenowy 8000BioshopPEG800.1
Nunc MaxiSorp płaska płytka 96-dołkowaebioscience44-2404-21
SonicatorFisher scientificFB-120-110
Spektrometr mikropłytkowy EonBiotek11-120-611To urządzenie wykorzystuje oprogramowanie do analizy danych Gen5.
Oprogramowanie do analizy danych Gen5BioTek
dodecylosiarczan soduBioshopSDS001
błękit bromofenolowyBioshopBRO777
GlicerolBioshopGLY001
Kolumny do odsalania białekThermoscientific89849
GlicynaBioshopGLN001
prefabrykowany 12% żel poliakrylamidowybio-rad456-1045
Szybki odczynnik do barwieniaEMD Millipore553215
Stacja dokująca do żelu EZ imagerbio-rad1708270
Taca na próbki białego światłabio-rad1708272 Używany wraz z żelową stacją dokującą EZ imager do niebieskich plam coomassie
Drabinka białkowabio-rad1610375
na barwnikowego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).
  3. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  4. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22(2014).
  5. Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
  6. Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).
  7. Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).
  8. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).
  9. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).
  10. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).
  11. Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).
  12. Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470(2015).
  13. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
  14. Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
  15. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).
  16. Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6 (1), e16136(2011).
  17. Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).
  18. Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).
  19. Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).
  20. Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).
  21. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
  22. Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie bia ekchromatografia na ywicy niklowejzag szczanie za pomoc rurek do dializyanaliza cytometrycznaaktywacja limfocyt w Bmodel indukcji EAEbia ko z tagiem MOGstandardowy sprz t laboratoryjny

Powiązane artykuły