Badanie systemu kontroli jakości białek D. discoideum przy użyciu obrazowania żywych komórek w kontrolowanej temperaturze

Podsumowanie

Społeczny ameba Dictyostelium discoideum został niedawno założony jako system do badania nieprawidłowego fałdowania białek i proteostazy. W tym miejscu opisujemy nową metodologię opartą na obrazowaniu do badania agregacji białek wywołanej temperaturą i odpowiedzi na stres komórkowy u D. discoideum.

Streszczenie

Złożony styl życia ameba społecznego Dictyostelium discoideum czyni go cennym modelem do badania różnych procesów biologicznych. Niedawno wykazaliśmy, że D. discoideum jest niezwykle odporny na agregację białek i może być wykorzystany do uzyskania wglądu w system kontroli jakości białek komórkowych. Jednak wykorzystanie D. discoideum jako systemu modelowego stwarza kilka wyzwań dla podejść eksperymentalnych opartych na mikroskopii, takich jak wysoka ruchliwość komórek i ich podatność na fototoksyczność. To ostatnie okazuje się szczególnie trudne podczas badania homeostazy białek, ponieważ efekty fototoksyczne mogą indukować komórkową reakcję na stres, a tym samym wpływać na zachowanie systemu kontroli jakości białek.

Wzrost temperatury jest powszechnie stosowanym sposobem wywoływania stresu komórkowego. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania z kontrolowaną temperaturą, który pozwala na obserwację zaburzeń wywołanych temperaturą w D. discoideum. Co więcej, po zastosowaniu w normalnej temperaturze wzrostu, ten protokół obrazowania może również zauważalnie zmniejszyć fototoksyczność, umożliwiając w ten sposób obrazowanie z większą intensywnością. Może to być szczególnie przydatne podczas obrazowania białek o bardzo niskim poziomie ekspresji. Co więcej, wysoka ruchliwość komórek często wymaga nabycia wielu pól widzenia, aby podążać za poszczególnymi komórkami, a liczba pól musi być zrównoważona z pożądanym przedziałem czasowym i czasem ekspozycji.

Wprowadzenie

Dictyostelium discoideum to samotne ameby żyjące w glebie, które żywią się bakteriami i innymi mikroorganizmami, które są pobierane przez fagocytozę. Ma unikalny i niezwykły cykl życia, który jest głównym obszarem badań od czasu jego odkrycia¹. Wczesne zainteresowanie rozwojem wielokomórkowym² i molekularnymi podstawami chemotaksji³ zostało wkrótce uzupełnione badaniami skupiającymi się na ruchliwości komórek, polarności komórek i odporności wrodzonej. Ponadto wprowadzono D. discoideum jako system modelowy dla badań biomedycznych^4,5.

Niedawno założyliśmy D. discoideum jako nowy system do badania systemu kontroli jakości białek (PQC)^6,7. Jego proteom jest wzbogacony w podatne na agregację białka podobne do prionów, co stanowi wyzwanie dla kontroli jakości białek⁸. Aby zbadać, czy D. discoideum rozwinęła specjalne mechanizmy molekularne do kontrolowania swojego wysoce podatnego na agregację proteomu, zbadaliśmy zachowanie podatnych na agregację białek markerowych zarówno w normalnych warunkach wzrostu, jak i podczas stresu. Warunki stresowe, takie jak stres cieplny, mogą być wykorzystane do zwiększenia tempa nieprawidłowego fałdowania białek⁹. W związku z tym poszukiwaliśmy systemu, w którym moglibyśmy indukować zmiany temperatury i jednocześnie śledzić zachowanie białek markerowych. W tym celu połączyliśmy obrazowanie żywych komórek z ogrzewaniem sterowanym przez Peltiera za pomocą wkładki termicznej (komory chłodzącej). Metoda ta pozwoliła nam utrzymać stałą i jednolitą temperaturę, a także wywołać szybką, ale precyzyjną zmianę temperatury.

Obrazowanie żywych komórek służy do badania różnych procesów biologicznych w D. discoideum. Podejście to napotyka jednak na dwa zasadnicze ograniczenia. Po pierwsze, komórki wykazują dużą ruchliwość i mają tendencję do migracji poza pole widzenia, dlatego śledzenie pojedynczych komórek często wymaga obrazowania dużego obszaru. Ruchomość komórek można zmniejszyć za pomocą nakładki agarowej¹⁰, jednak warunki te nie są odpowiednie do długotrwałego obrazowania ze względu na spadek żywotności. Po drugie, komórki D. discoideum wykazują szczególnie wysoką wrażliwość na fototoksyczność, co skutkuje zaokrągleniem komórek i zatrzymaniem mitozy¹¹. Poprzednie protokoły rozwiązywały ten problem poprzez dodanie askorbinianu jako wymiatacza rodników i skrócenie czasu ekspozycji¹². To ostatnie może być krytyczne, jeśli białko będące przedmiotem zainteresowania ulega ekspresji na niskich poziomach i wykazuje słaby sygnał fluorescencyjny. Autorzy sugerują również zapewnienie stałej temperatury 21 °C poprzez obrazowanie w klimatyzowanym pomieszczeniu lub za pomocą komór inkubacyjnych o kontrolowanej temperaturze, które obejmują obiektyw i mikroskop stage¹².

Tutaj opisujemy metodę z ulepszoną kontrolą temperatury za pomocą komory chłodzącej ustawionej na 23 °C. Podczas obrazowania nasz zestaw znacznie zwiększa odporność na fototoksyczność. Pozwala to na zastosowanie dłuższych czasów naświetlania i wyższych natężeń światła wzbudzenia. Ma to szczególne znaczenie w przypadku zdjęć poklatkowych, ponieważ odstępy czasowe muszą być starannie zbalansowane w stosunku do liczby obrazowanych pozycji i zastosowanego czasu naświetlania. Możliwość zwiększenia liczby obrazowanych pozycji pozwala również na pokrycie szerszego obszaru obrazowania i ułatwia śledzenie poszczególnych komórek w dłuższym okresie czasu.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

1. Rosnące komórki
   1. Hodować komórki D. discoideum w pożywce AX w temperaturze 23 °C pod światłem na płytkach do hodowli tkankowych. Unikaj utrzymywania komórek w dużej gęstości powyżej 75% konfluencji.
      UWAGA: Aby uzyskać optymalną reakcję na stres cieplny, komórki muszą znajdować się w fazie wzrostu wykładniczego i nie powinny osiągnąć fazy stacjonarnej.
   2. Dzień przed obrazowaniem podziel komórki na pożywkę o niskiej fluorescencji (LFM) na 1 x 10⁴ komórek/ml.
      UWAGA: Ten krok jest konieczny do zmniejszenia fluorescencji tła spowodowanej przez medium AX. Czas inkubacji można skrócić do minimum 2 godzin. Jednak pęcherzyki wchłonięte przez pożywkę AX mogą nadal generować pewien sygnał tła po 2 godzinach.
2. Przygotowanie komórek do mikroskopii
   1. Przed obrazowaniem należy pobrać komórki z płytki tkankowej w LFM i przenieść odpowiednią liczbę komórek do naczyń ze szklanym dnem.
      UWAGA: Zwykle wystarczy 1 x 10⁵ komórek/ml; jednakże, jeśli konfiguracja eksperymentalna wymaga długich okresów obrazowania (dłuższych niż 8 godzin), liczba komórek musi być starannie dostosowana, ponieważ komórki D. discoideum przejdą do cyklu rozwojowego i zaczną przepływać i agregować, jeśli liczba komórek jest wysoka, podczas gdy składniki odżywcze są niskie.
   2. Pozwól komórkom osiąść przez 20 minut. Usuń nieosadzone komórki, ostrożnie zastępując zużyte podłoże świeżym podłożem.

2. Obrazowanie

UWAGA: Protokół może być używany w systemach o szerokim polu widzenia, jak również w konfokalnych ustawieniach mikroskopii. Użycie komory inkubacyjnej z kontrolowaną temperaturą, obejmującej obiektywy i stolik mikroskopu, jest pomocne, ale nie jest niezbędne do kontroli temperatury. Temperaturę w komorze inkubacyjnej ustawia się na najwyższą temperaturę zastosowaną w doświadczeniu, np. na 40 °C, jeżeli występuje stres cieplny. W przeciwnym razie temperaturę ustawia się na 25 °C. Zmiany temperatury należy dokonywać z wyprzedzeniem, aby system mógł się dostosować, ponieważ zmiany temperatury podczas obrazowania mogą wpływać na ostrość.
UWAGA: Podczas obrazowania temperatura jest kontrolowana za pomocą komory chłodzącej. Domyślna temperatura do obrazowania komórek nieobciążonych wynosi 23 °C. W warunkach stresu cieplnego temperatura jest odpowiednio zwiększana do pożądanego poziomu. Element piezoelektryczny w komorze chłodzenia może bardzo szybko reagować na zmianę temperatury. Jednak ostrość obrazów zmieni się nieznacznie (może odchylić się do 20 μm w zależności od zmiany temperatury). W związku z tym konieczne jest ręczne ponowne ustawianie ostrości w ciągu pierwszych minut od uzyskania obrazu, chyba że używany mikroskop jest wyposażony w sprzętowy autofokus.

1. Akwizycja obrazu w warunkach bezstresowych
   1. Komórki obrazowe w warunkach bezstresowych w temperaturze 23 °C uzyskują co najmniej 6 pól widzenia (FOV).
      UWAGA: Stan bezstresowy można zwizualizować, nagrywając krótki film poklatkowy (5-30 min) lub rejestrując reprezentatywne zdjęcia. Dla każdego warunku lub linii komórkowej uzyskaj co najmniej 6 pól widzenia (FOV).
      UWAGA: W przypadku, gdy interesujące są pojedyncze komórki, umieść odpowiednie komórki w środku pola widzenia i nagraj serię kafelków 3 x 3 z polem widzenia zawierającym interesujące komórki pośrodku. Komórki D. discoideum są ruchliwe i mogą migrować poza pole widzenia. Jednak seria kafelków 3 x 3 zwiększa obszar potencjalnie eksplorowany przez komórkę zainteresowania i pozostaje on możliwy do prześledzenia przez okresy poklatkowe ~6 godzin.
   2. Uzyskaj stosy z o maksymalnej wielkości 7 μm w krokach co 1-0,25 μm, aby uchwycić całą objętość komórki.
   3. Uzyskaj referencyjny obraz w jasnym polu, aby ocenić całkowitą liczbę komórek.
2. Akwizycja obrazu pod kątem stresu cieplnego
   1. Ustaw temperaturę komory chłodzącej na 30 °C zgodnie z instrukcjami producenta.
   2. Gdy wyświetlacz temperatury osiągnie żądaną wartość, ponownie ustaw ostrość ręcznie w jasnym kanale pola i sprawdź wszystkie zarejestrowane pola widzenia przed rozpoczęciem filmu poklatkowego.
   3. Rozpocznij film poklatkowy przez 4 godziny stresu cieplnego w odstępie 5-10 minut między punktami czasowymi. Sprawdź, czy ustawienie ostrości jest prawidłowe podczas uzyskiwania pierwszych dwóch punktów czasowych.
3. Akwizycja obrazu podczas odzyskiwania
   1. Po stresie cieplnym zmniejsz temperaturę z powrotem do 23 °C, poczekaj, aż wyświetlacz temperatury dostosuje się i ręcznie ponownie ustaw ostrość.
   2. Nagrywaj filmy poklatkowe w fazie odzyskiwania przez 8-10 godzin w odstępach 10-20 minut. Sprawdź, czy ustawienie ostrości jest prawidłowe podczas uzyskiwania pierwszego punktu czasowego.

3. Analiza obrazu

UWAGA: Aby określić ilościowo liczbę komórek zawierających ogniska cytozolowe, oceń całkowitą liczbę komórek i liczbę komórek z ogniskami cytozolowymi w każdym przedziale czasowym. Ze względu na trudność w segmentacji komórek na podstawie obrazów w jasnym polu, kwantyfikacja musi być wykonana ręcznie. Poniżej opisano analizę danych dla bezpłatnego pakietu do przetwarzania obrazu ((http://fiji.sc/Fiji). Wymaga wtyczki "Cell Counter" (http://fiji.sc/Cell_Counter).

1. Ocena całkowitej liczby komórek
   1. Załaduj stos obrazów jasnego pola (XYT), klikając "Plik" i "Otwórz".
   2. Otwórz wtyczkę "Licznik komórek" ("Wtyczki" -"Licznik komórek"). Załaduj stos obrazów, klikając "Zainicjuj".
   3. Wybierz odpowiedni typ liczników, zaznaczając odpowiednie pole.
      UWAGA: użyj typu 1 jako licznika całkowitej liczby komórek i typu 2 jako licznika dla komórek z ogniskami cytozolowymi. Policz wszystkie komórki.
   4. Zapisz znaczniki, klikając "Zapisz znaczniki".
2. Ocena liczby komórek z ogniskami cytozolowymi
   1. Załaduj hiperstos obrazu fluorescencyjnego (XZYT) ("Plik" - "Otwórz") i wykonaj projekcję o maksymalnej intensywności za pomocą "Projektora Z" (Obraz/Stosy).
   2. Otwórz wtyczkę "Licznik komórek". Załaduj wynikowy stos obrazów (XYT), klikając "Zainicjuj".
   3. Załaduj znaczniki, klikając "Załaduj znaczniki".
      UWAGA: Nazwy plików obrazu referencyjnego i stosu fluorescencji muszą być identyczne. W razie potrzeby zmień odpowiednio nazwę przed zainicjowaniem stosu obrazów.
   4. Wybierz odpowiedni typ markera (patrz 3.1.3) i policz komórki z ogniskami cytozolowymi. Istniejące znaczniki mogą być wykorzystane jako wskazówki dotyczące położenia poszczególnych komórek.
   5. Pobierz liczbę zliczeń na wycinek, klikając "Wyniki" i zapisz liczby w innym miejscu do dalszych obliczeń.

Wyniki

Opisany protokół obrazowania może być wykorzystany do analizy zachowania podatnych na agregację białek prionowych w amebie D. discoideum podczas stresu cieplnego. Rysunek 1 przedstawia rozkład białka poliglutaminowego Q103 znakowanego GFP w komórkach w normalnych warunkach wzrostu (Rysunek 1A), po 2 godzinach stresu cieplnego w temperaturze 30 °C (Rysunek 1B) i po 6 godzinach regeneracji stresu i wzrostu w normalnych warunkach wzrostu (Rysunek 1C). Po wzroście temperatury z 23 °C do 30 °C marker Q103-GFP łączy się z rozkładem rozproszonym, tworząc struktury punktowe. Po uwolnieniu i wzroście stresu w normalnej temperaturze struktury te rozpuszczają się. Redystrybucję Q103-GFP i powstawanie ognisk cytozolowych wywołanych stresem cieplnym można określić ilościowo za pomocą analizy obrazu. Rysunek 2A przedstawia analizę poszczególnych FOV przy użyciu Fiji i wtyczki "Cell counter". Rysunek 2B przedstawia kwantyfikację reakcji na stres cieplny. Pokazuje to, że cytozolowe ogniska Q103-GFP zwiększają swoją liczbę przy utrzymującym się stresie cieplnym. Podczas stresu cieplnego system kontroli jakości białek (PQC) jest przeciążony, przez co białka podatne na agregację, takie jak białko podobne do prionów Q103, nie mogą być utrzymywane w stanie rozpuszczalnym i coraz częściej agregują się w ogniskach cytozolowych. Komórki wykazują również charakterystyczne zaokrąglenie, jak pokazano na rysunku 1B. Zmniejszenie ognisk cytozolowych po usunięciu stresu sugeruje, że zagregowane białka są rozpuszczone.

Jakość obrazowania zależy od początkowej gęstości komórek. Rysunek 3 przedstawia przykład komórek po powrocie do zdrowia po stresie, porównując odpowiednią początkową gęstość komórek (Figura 3A) i wysoką początkową gęstość komórek (Figura 3B). Jeśli początkowa gęstość komórek była zbyt wysoka, komórki zaczynały tworzyć strumienie, jak pokazano na rysunku 3b. To sprawia, że kolejne kwantyfikacje utrudniają późniejszą kwantyfikację, ponieważ komórki przesunęły się poza płaszczyznę ogniskową.

Opisana metoda może być używana do monitorowania zmian wywołanych temperaturą, jak opisano powyżej. Może być również stosowany w celu zmniejszenia fototoksyczności podczas obrazowania w fizjologicznej temperaturze wzrostu. Rysunek 4 przedstawia porównanie komórek zobrazowanych w temperaturze 23 °C w komorze chłodzącej (rysunek 4A) i komórek zobrazowanych bez kontroli temperatury w klimatyzowanym pomieszczeniu, ustawionym na 25 °C (Rysunek 4B). Przy stałej ekspozycji na światło wzbudzenia komórki zaokrąglają się w górę, gdy nie są obrazowane w warunkach kontrolowanej temperatury. Ta zmiana kształtu komórki wskazuje na stres.

Ryc. 1: Białka priopodobne podatne na agregację zmieniają swoją dystrybucję komórkową podczas stresu cieplnego. Znakowany GFP ekson 1 huntingtyny bogaty w poliglutaminę (Q103) ulega konstytutywnej ekspresji w komórkach AX2-214 D. discoideum (sygnał GFP przedstawiony w odwróconej tabeli wyszukiwania w skali szarości). (A) W normalnych warunkach wzrostu w temperaturze 23 °C, Q103-GFP jest dyfuzyjnie rozprowadzany w cytoplazmie. (B) Po 2 godzinach stresu cieplnego w temperaturze 30 °C, Q103-GFP łączy się w ogniska cytozolowe (czerwone strzałki). Komórki wykazują charakterystyczną zmianę kształtu i zaokrąglanie w górę. (C) Po uwolnieniu stresu i wzroście w temperaturze 23 °C ogniska cytozolowe rozpuszczają się. Po 6 godzinach nie można zaobserwować ognisk cytozolowych. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Kwantyfikacja powstawania ognisk cytozolowych pod wpływem ciepła. (A) Analiza komórek przy użyciu darmowego pakietu do przetwarzania obrazów Fiji i wtyczki "Cell Counter". Całkowita liczba komórek (typ 1, niebieskie znaczniki licznika) jest określana na obrazie w jasnym polu. Markery są ładowane do kanału GFP i określana jest liczba komórek z ogniskami cytozolowymi (typ 2, czerwone znaczniki licznika). (B) Kwantyfikacja ognisk po 3 godzinach stresu cieplnego w temperaturze 30 °C i 3 godzinach powrotu do naprężeń w temperaturze 23 °C (n = 4 pola widzenia, słupek błędu = SD). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3: Wpływ gęstości komórek na długoterminowe obrazowanie poklatkowe. (A) Komórki zobrazowane przy początkowej gęstości komórek <10⁵ komórek/ml. Po 3 godzinach stresu cieplnego w temperaturze 30 °C i 6 godzinach regeneracji po stresie w temperaturze 23 °C komórki nadal pozostają w cyklu wegetatywnym i dzielą się. Tylko nieliczne komórki opuszczają płaszczyznę ogniskowej. (B) Komórki zobrazowane przy początkowej gęstości komórek >10⁶ komórek/ml. Po 9 godzinach obrazowania (ustawienia jak w A) komórki weszły w cykl rozwojowy i zaczęły przesyłać strumieniowo i agregować. Komórki w agregatach nie mogą być wyraźnie rozróżnione. Duża część komórek opuszcza płaszczyznę ogniskową i nie może być analizowana. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wpływ kontroli temperatury na efekty fototoksyczne. (A) Komórki obrazowane przez 10 minut z kontrolą temperatury 23 °C: 6 pól widzenia, stos z (odstęp 0,5 μM, grubość próbki 8 μM), upływ czasu (całkowity czas 10 min, upływ 1 min), kanał GFP (czas ekspozycji 0,07 ms, natężenie lasera 10%), kanał RFP (czas ekspozycji 0,1 ms, intensywność lasera 10%). Komórki nie wykazują oznak charakterystycznych zmian morfologicznych związanych ze stresem fototoksycznym. (B) Komórki obrazowane przez 10 minut bez kontroli temperatury (te same warunki co w A). Komórki wykazują oznaki zaokrąglenia wywołanego fototoksycznością, co wskazuje na stres. Podziałka = 10 μm. Komórki zostały zobrazowane za pomocą systemu opartego na mikroskopie z obiektywem o aperturze numerycznej 100x/1,4 (NA). Obrazy zostały zebrane za pomocą kamery CCD jako pliki o wymiarach 1 024 x 1 024 pikseli przy użyciu binningu 1 x 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół może być wykorzystany do badania zachowania określonego białka będącego przedmiotem zainteresowania w odpowiedzi na stres wywołany ciepłem. Doniesiono, że wzrost temperatury do 30 °C wywołuje reakcję na stres cieplny i w tych warunkach żywotność D. discoideum jest znacznie zmniejszona.

Modyfikacje
Protokół można modyfikować w celu porównania zachowania różnych białek w tych samych warunkach stresu. W tym celu komórki wyrażające różne białka o tym samym znaczniku fluorescencyjnym są przenoszone do szalek wielodołkowych, takich jak szalki czterokomorowe (sekcja 1.3.1). Protokół może być również stosowany w komórkach wykazujących współekspresję białek z różnymi markerami, takimi jak GFP lub RFP. Można to wykorzystać na przykład do monitorowania zachowania różnych elementów systemu kontroli jakości białek (PQC). Komórki wykazujące ekspresję markera agregacji znakowanego GFP i różnych składników PCQ oznaczonych RFP można obserwować za pomocą wielodołkowego wypukłości do obrazowania. Zapewnia to te same warunki naprężeń (szybkość wzrostu/spadku temperatury, czas trwania wzrostu/spadku temperatury) i pozwala na badania porównawcze.

Co więcej, protokół może być wykorzystany do badania wpływu systemu PQC na reakcję na stres cieplny. Aktywność składników może być modulowana poprzez zmianę poziomów ekspresji za pomocą narzędzi genetycznych, takich jak nokaut lub nadekspresja, lub poprzez stosowanie dostępnych na rynku specyficznych inhibitorów⁶. Proteasom można zahamować, dodając MG132 (100 μM) lub laktakystynę (10 μM) do pożywki wzrostowej. Białka opiekuńcze Hsp90 można hamować za pomocą geldanamycyny (6 μM) lub radicykolu (10 μM). Białko opiekuńcze Hsp70 można hamować za pomocą VER-155088, chociaż do tej pory nie udało nam się potwierdzić skuteczności hamowania w naszych warunkach eksperymentalnych. Inhibitory należy dodać dzień przed obrazowaniem, a komórki inkubować przez 14 godzin.

Kluczowe kroki w ramach protokołu
Krytycznym etapem oceny perturbacji wywołanej ciepłem jest stan komórek przed eksperymentem obrazowania. Badania na drożdżach wykazały, że komórki nabywają odporność na różne stresy środowiskowe podczas stacjonarnej fazy¹³. Zaobserwowaliśmy również minimalną reakcję na zastosowany stres cieplny, jeśli komórki D. discoideum osiągnęły fazę stacjonarną przed obrazowaniem. Dlatego utrzymanie stałej liczby komórek <5 x 10⁵ komórek/ml ma kluczowe znaczenie.

Co więcej, wysoka liczba komórek może indukować przejście z cyklu wegetatywnego D. discoideum do cyklu rozwojowego, uruchamiając w ten sposób szlaki głodu, które mogą prowadzić do innej reakcji na stres cieplny. Jeśli w fazie regeneracji po stresie cieplnym zostanie osiągnięta wysoka liczba komórek, strumieniowanie i agregacja komórek może zakłócać analizę danych, gdy komórki przestają być ostre (patrz rysunek 4).

Ograniczenie techniki
Utrata koncentracji jest wąskim gardłem protokołu. Podczas zmian temperatury płaszczyzna ogniskowej może się drastycznie przesunąć, co wymaga ręcznego ponownego ustawiania ostrości w okresie bezpośrednio po zmianie temperatury. Skok ostrości może być czasami zbyt ekstremalny, aby można go było zniwelować za pomocą programowego autofokusa, zwłaszcza jeśli czas między punktami czasowymi jest duży. Jeśli jednak używany mikroskop jest wyposażony w sprzętowy autofokus, to wąskie gardło można obejść.

Znaczenie techniki w odniesieniu do istniejących metod
W porównaniu z istniejącymi konfiguracjami, takimi jak korzystanie z klimatyzowanych pomieszczeń, kabiny inkubacyjne z kontrolowaną temperaturą zakrywające obiektywy i stolik mikroskopu lub stoliki z kontrolowaną temperaturą i kołnierze obiektywów, zastosowanie komory chłodzącej zapewnia bardziej precyzyjną kontrolę temperatury otoczenia. Element Peltiera w komorze chłodzącej może utrzymywać stałą i jednolitą temperaturę przez cały czas trwania eksperymentu. W klasycznych konfiguracjach lokalne różnice temperatur mogą prowadzić do różnych wyników obserwacji. Co więcej, może szybko i szybko reagować na indukowane zmiany temperatury, podczas gdy klasyczne konfiguracje bardzo wolno dostosowują się do indukowanych zmian temperatury, zwłaszcza obniżając temperaturę. Element Peltiera w komorze chłodzenia może również pokrywać szerszy zakres temperatur (15-40 °C) niż klasyczne konfiguracje, w których osiągnięcie temperatur takich jak 15 °C lub 40 °C jest bardzo trudne.

Dictyostelium discoideum jest szczególnie wrażliwe na fototoksyczność. W poprzednich badaniach stosowano askorbinian jako środek zmiatający w celu zmniejszenia fototoksyczności. Jednak długie okresy obrazowania wymagają dodatkowej suplementacji. Co więcej, stosowanie askorbinianu jest ograniczone do badań, w których suplement przeciwutleniający nie ma wpływu na mechanizm będący przedmiotem zainteresowania. Proponujemy, aby obrazowanie w kontrolowanej temperaturze mogło być stosowane jako alternatywne podejście w celu zminimalizowania fototoksyczności i może być połączone z dodatkiem askorbinianu w celu dalszego zmniejszenia toksyczności.

Skutki fototoksyczne można zminimalizować, zapewniając stałą i jednolitą temperaturę 23 °C za pomocą komory chłodzącej. Komórki zobrazowane za pomocą kontroli temperatury wykazują mniej oznak fototoksyczności, takich jak zaokrąglanie komórek, przez dłuższy czas. Umożliwia to również obrazowanie z większą intensywnością, krótszymi odstępami czasu lub większą liczbą pól widzenia (FOV).

Ogólne zastosowanie
Wykazano, że stres cieplny w wyższych temperaturach wyzwala inną reakcję na stres cieplny¹⁴. W związku z tym zwiększenie temperatury do 34 °C lub 37 °C może wywołać inną reakcję. Oprócz zastosowanego stresu temperaturowego, czas trwania określonej sytuacji stresowej może być modyfikowany w celu zbadania natychmiastowej reakcji lub długoterminowej adaptacji do stresu cieplnego.

Ogólnie rzecz biorąc, opisany protokół można rozszerzyć na szeroki zestaw zastosowań. Ponieważ precyzyjna kontrola temperatury znacznie zmniejsza efekty fototoksyczne, protokół może być stosowany w warunkach, które wymagają długich czasów ekspozycji i/lub większego natężenia światła wzbudzającego, np. do wizualizacji białek o niskim poziomie ekspresji lub w połączeniu z krótkimi odstępami czasu między obrazowaniem, np. podczas obrazowania poklatkowego. Może to być również korzystne w przypadku obrazowania obiektów obejmujących całą komórkę, np. mikrotubul, ponieważ te ustawienia wymagają dużej liczby optycznych przekrojów z.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AX Medium	ForMedium	AXM0102
LoFlo medium	ForMedium	LF1001
MG132	Sigma	C2211
Lactacystin	Sigma	L6785
Geldanamycin	Santa Cruz	sc-200617
Radicicol	Santa Cruz	sc-200620
MatTek disch 35 mm	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	Naczynie do obrazowania ze szklanym dnem
Naczynie do hodowli komórkowych CellViell	Greiner	627870	4-komorowa miska do obrazowania ze szklanym dnem
Termiczna nagrzewnica / chłodnica sceniczna Wkładka	Warner Istruments	TB-3/CCD
Bipolarny regulator temperatury	Warner Istruments	CL-100
System chłodzenia cieczą	Warner Instrumenty	LCS-1