Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie stentgraftów małego kalibru przy użyciu elektroprzędzenia i stentów z gołego metalu rozprężalnych balonem

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54731

⸱

26 października 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Engineering, Mayo Clinic, 2Department of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 3Department of Cardioangiology, ICRC, St. Anne's University Hospital, 4Department of Vascular Surgery, Mayo Clinic, 5Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

W tym artykule

Podsumowanie

W protokole prezentujemy metodę wytwarzania stent-graftu małego kalibru poprzez umieszczenie stentu z możliwością rozbudowy balonu pomiędzy dwiema elektroprzędzonymi warstwami nanofibrowego poliuretanu.

Streszczenie

Stent-grafty są szeroko stosowane w leczeniu różnych schorzeń, takich jak zmiany w aorcie, tętniaki, zatory spowodowane zabiegami wieńcowymi i perforacjami w naczyniach krwionośnych. Takie stentgrafty są wytwarzane przez pokrycie stentu membraną polimerową. Idealny stentgraft powinien mieć biokompatybilny stent pokryty porowatą, tromboodporną i biokompatybilną membraną polimerową, która naśladuje macierz zewnątrzkomórkową, ułatwiając w ten sposób gojenie się miejsca urazu. Celem tego protokołu jest wyprodukowanie stent-przeszczepu małego kalibru poprzez zamknięcie stentu rozprężalnego balonu w dwóch warstwach elektroprzędzonych nanowłókien poliuretanowych. Wykazano, że elektroprzędzenie poliuretanu pomaga w gojeniu poprzez naśladowanie natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej, promując w ten sposób śródbłonek. Elektroprzędzenie nanowłókien poliuretanowych na wolno obracającym się trzpieniu umożliwiło nam precyzyjną kontrolę grubości membrany nanowłóknistej, co jest niezbędne do uzyskania stentgraftu rozprężalnego balonu małego kalibru. Walidacja mechaniczna poprzez zaciskanie i rozszerzanie stentgraftu wykazała, że nanowłóknista membrana poliuretanowa jest wystarczająco elastyczna, aby zaciskać się i rozszerzać, pozostając jednocześnie opatentowana, nie wykazując żadnych oznak rozdarcia lub rozwarstwienia. Ponadto stentgrafty wytworzone przy użyciu opisanych tutaj metod mogą być wszczepione przy użyciu procedury interwencji wieńcowej przy użyciu cewników prowadzących o standardowym rozmiarze.

Wprowadzenie

Procedury interwencji wieńcowej powodują znaczne uszkodzenie ściany naczynia z powodu przerwania płytki naczyniowej i ściany naczynia. Powoduje to restenozy, zatorowość obwodową w przeszczepach żylnych i przerwanie ciągłości światła naczyń wieńcowych1-4. Aby uniknąć tych powikłań, obiecującą strategią będzie pokrycie powierzchni naczynia w miejscu angioplastyki, co potencjalnie zahamuje restenozę, zmniejszy ryzyko nieciągłości światła naczynia i zapobiegnie zatorowości obwodowej. W poprzednich badaniach porównywano stenty z gołego metalu ze stentgraftami z dodatnimi wynikami dla stentgraftów5. Naukowcy wykorzystali kilka materiałów do produkcji membran pokrywających stenty. Obejmuje to materiały syntetyczne, takie jak tetraftalan etylenu (PET), politetrafluoroetylen (PTFE), poliuretan (PU) oraz krzem lub autologiczna tkanka naczyniowa do produkcji pokrytych stentów6-9. Idealny materiał do przeszczepu stosowany do pokrycia stentu powinien być tromboodporny, nieulegający biodegradacji i powinien integrować się z tkanką natywną bez nadmiernej proliferacji i stanu zapalnego10. Materiał do przeszczepu stosowany do pokrycia stentu powinien również wspomagać gojenie się stentgraftu.

Stent-grafty są szeroko stosowane w leczeniu koarktacji aorty, pseudo-tętniaków tętnicy szyjnej, przetok tętniczo-żylnych, zwyrodniałych przeszczepów żył oraz dużych i gigantycznych tętniaków mózgu. Jednak rozwój stentgraftów małego kalibru jest ograniczony przez zdolność do utrzymania niskiego profilu i elastyczności, co pomaga w rozmieszczeniu stentgraftów11-14. PU jest polimerem elastomerowym o dobrej wytrzymałości mechanicznej, która jest pożądaną cechą dla uzyskania niskiego profilu i dobrej elastyczności15,16. Oprócz dobrej dostarczalności, stentgrafty powinny również sprzyjać szybkiemu gojeniu i endotelializacji. Stentgrafty pokryte poliuretanem wykazały lepszą biokompatybilność i zwiększoną śródbłonek17. Naukowcy wcześniej próbowali śródbłonkować stentgrafty pokryte PU, umieszczając je komórkami śródbłonka17. Wykazano, że elektroprzędzenie poliuretanu w celu stworzenia matrycy z nanowłókien jest cenną techniką produkcji przeszczepów naczyniowych18,19. Wiadomo również, że istnienie nanowłókien, które naśladują architekturę natywnej macierzy zewnątrzkomórkowej, sprzyja proliferacji komórek śródbłonka20,21. Elektroprzędzenie pozwala również na kontrolę nad grubością materiału22. Przeszczepy naczyniowe małego kalibru wykonane z PU zostały przebadane pod kątem wspomagania gojenia poprzez zastosowanie modyfikacji, takich jak powłoki powierzchniowe, antykoagulanty i środki hamujące proliferację komórek. Wszystkie te modyfikacje mają na celu pośredniczenie w akceptacji gospodarza i wspomaganie gojenia się przeszczepu23.

Nasza grupa opracowała balonowy stent z gołego metalu, który może być stosowany w modelach zwierzęcych24-26. Połączenie elektroprzędzonej siatki poliuretanowej i stentu rozprężnego balonem umożliwiło nam wygenerowanie stent-graftów rozprężalnych w balonach małego kalibru. Większość obecnie dostępnych stentgraftów jest wprowadzana przez tętnicę udową podczas zabiegu interwencyjnego, ale tylko kilka komercyjnych stentów pokrytych może być wprowadzonych o 1 rozmiar francuski większy niż wymagany dla nienapompowanego balonu27. W tym badaniu opracowaliśmy stent-przeszczep naczyniowy małego kalibru, umieszczając stent rozprężalny balonem między dwiema warstwami elektroprzędzonego PU, który może być dostarczony do tętnicy wieńcowej za pomocą standardowego francuskiego cewnika prowadzącego 8-9 w przezskórnej procedurze interwencyjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Elektroprzędzenie poliuretanu na kolektorze trzpieniowym

  1. Przygotuj trzpień do elektroprzędzenia
    1. Stopić około 8 ml biokompatybilnego, dopuszczonego do kontaktu z żywnością, rozpuszczalnego w wodzie materiału podporowego w cylindrze miarowym (o średnicy około 9 mm i głębokości 110 mm) w temperaturze 155 °C za pomocą pieca.
    2. Zanurz trzpień ze stali nierdzewnej o średnicy 3 mm i długości 100 mm, aby uzyskać powłokę z materiału nośnego na powierzchni trzpienia. Przed zanurzeniem należy umieścić trzpienie w piecu w temperaturze 155 °C na około 15 minut, aby podnieść temperaturę powierzchni trzpienia, co pomaga w zwilżeniu powierzchni stopionym materiałem podporowym.
    3. Pozwól zanurzonemu trzpieniowi ostygnąć do około 140 °C, podczas gdy stopiony materiał nośny zestala się, tworząc jednolitą cienką powłokę na powierzchni trzpienia. Podczas procesu chłodzenia zawieś trzpień pionowo, aby grawitacja spowodowała spływanie nadmiaru materiału nośnego. Powłoka ta umożliwia łatwe usunięcie gotowego stentgraftu z trzpienia.
  2. Ustawienie kolektora trzpieniowego systemu elektroprzędzenia (jak pokazano na rysunku 1)
    1. Ustaw mikser laboratoryjny poziomo i podłącz plastikowy pręt, który utrzyma trzpień ze stali nierdzewnej na przeciwległym końcu wewnątrz okapu wyciągowego.
    2. Rozpuść materiał podporowy z końcówki trzpienia, zanurzając w wodzie tylko końcówkę trzpienia, aby pomieścić plastikowy pręt nośny na końcu trzpienia. Podeprzyj plastikowy pręt nośny na wolnym końcu trzpienia, aby pomóc w równomiernym obracaniu się kolektora trzpienia.
    3. Użyj ustalających w plastikowych prętach nośnych, aby zabezpieczyć trzpień ze stali nierdzewnej i uniknąć ślizgania się podczas elektroprzędzenia.
    4. Uziemić kolektor trzpieniowy, podłączając przewód uziemiający w kształcie litery U do trzpienia ze stali nierdzewnej. Użyj gumowych O-ringów, aby przytrzymać przewód uziemiający po bokach trzpienia.
  3. Konfiguracja systemu wytłaczania ciekłego poliuretanu w systemie elektroprzędzenia
    1. Zmieszać dimetyloacetamid (DMA) z 25% (m/v) roztworem podstawowym poliuretanu (PU), aby otrzymać 15% (m/v) PU w roztworze DMA (np. dodać 6 ml DMA do 9 ml 25% roztworu PU).
      OSTROŻNOŚĆ! Pracować wewnątrz dygestorium z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.
    2. Napełnij szklaną strzykawkę o pojemności 5 ml igłą ze stali nierdzewnej (dyszą przędzalniczą) 15% roztworem PU.
    3. Zaprogramuj pompę strzykawkową tak, aby wytłaczała z prędkością 0,01 ml/min w oparciu o wewnętrzną średnicę strzykawki.
    4. Zamontuj strzykawkę z dyszą przędzalniczą na pompie strzykawkowej poziomo z końcówką igły w odległości około 20 cm od kolektora trzpienia. Zaizolować strzykawkę od przewodzących części pompy strzykawkowej za pomocą gumowych arkuszy, aby uniknąć wyładowania łukowego.
    5. Podłączyć generator wysokiego napięcia do dyszy przędzalniczej strzykawki za pomocą zacisku krokodylkowego.
  4. Uruchomić pompę strzykawkową z prędkością 0,01 ml/min i obrócić trzpień z mieszalnikiem laboratoryjnym pracującym z wolną prędkością (np. 50 obr./min).
  5. Zastosować różnicę napięć 20 kV na dyszy przędzalniczej i trzpieniu kolektora. Nanowłókna PU zaczną osadzać się na obracającym się trzpieniu, a cienka warstwa będzie widoczna w ciągu kilku minut. Upewnij się, że wyciąg jest wyłączony, a wydech jest zamknięty, aby uniknąć utraty elektroprzędzonych nanowłókien.

2. Elektrowirowanie stent-graftu

  1. Electrospin PU nanowłókna na obracającym się trzpieniu przez 2 godziny, aby stworzyć jednolitą rurkę (jak wyjaśniono w kroku 1).
  2. Zdejmij trzpień z plastikowego pręta podłączonego do miksera laboratoryjnego, aby zainstalować stent z gołego metalu. Włącz wyciąg i otwórz wydech przed zdjęciem trzpienia, aby upewnić się, że resztki oparów rozpuszczalnika zostały usunięte.
  3. Wsuń balonowy stent ze stali nierdzewnej26 do rozprężania na rurkę elektroprzędzoną w żądane miejsce. Może być konieczne nieznaczne rozszerzenie stentu, aby zsunął się bez uszkodzenia elektroprzędzonej rurki.
  4. Zaciśnij stent, aby upewnić się, że stent jest ściśle osadzony na materiale rurki na trzpieniu i nie jest wystarczająco luźny, aby się ślizgać. Pomoże to również zapobiec rozwarstwieniu warstwy wewnętrznej i zewnętrznej.
  5. Załadować trzpień z rurką i stentem ponownie na plastikowy pręt mieszalnika laboratoryjnego w celu elektroprzędzenia zewnętrznej warstwy stentgraftu.
  6. Elektrospin nanowłókna przez 3 godziny, jak wyjaśniono w kroku 1, aby wytworzyć zewnętrzną warstwę stentgraftu.
  7. Po elektrowirowaniu zewnętrznej części należy przeciąć materiał PU na obwodzie około 1 mm od końców stentu za pomocą skalpela.
  8. Namocz trzpień ze stentgraftem w wodzie dejonizowanej, aby rozpuścić materiał podporowy z trzpienia, który uwolni stent-przeszczep ze stent-graftu. W razie potrzeby zastąp świeżą wodą, aby całkowicie rozpuścić materiał podporowy.
  9. Po rozpuszczeniu materiału podporowego delikatnie usunąć stent-graft z trzpienia i pozostawić do wyschnięcia. Rozważ namoczenie usuniętego stentgraftu w dejonizowanej wodzie, aby rozpuścić pozostały materiał podporowy przed pozostawieniem do wyschnięcia na powietrzu.

3. Testowanie wyprodukowanych stent-graftów

  1. Nasunąć stent-przeszczep na potrójnie składany balon o średnicy 3 mm.
  2. Zaciśnij stent-przeszczep na balonie za pomocą ręcznego narzędzia do zaciskania.
  3. Sprawdź zaciśnięty stent-przeszczep za pomocą mikroskopu pod kątem równomiernego zaciskania i wszelkich innych oznak awarii, takich jak rozwarstwienie lub przebicie materiału pokrycia z powodu deformacji stentu.
  4. Rozszerz stent-przeszczep do zaprojektowanej średnicy 3 mm, zwiększając ciśnienie w balonie potrójnym za pomocą urządzenia do napełniania i wody. Ponownie zbadaj rozszerzony stentgraft pod kątem równomiernej ekspansji i oznak awarii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Nasza konfiguracja do elektroprzędzenia (Rysunek 1) pozwoliła na uzyskanie wysokiej jakości nanowłókien poliuretanowych (Rysunek 2). Stent-graft wytwarzany jest poprzez elektroprzędzenie wewnętrznej warstwy poliuretanu na trzpieniu, nasunięcie na tę warstwę gołego stentu metalowego, a następnie elektroprzędzenie drugiej, zewnętrznej warstwy poliuretanu (Rysunek 3). Nanowłókna poliuretanowe są elektroprzędzone z prędkością 50 µm/hr, co pozwala na uzyskanie wewnętrznej war...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opracowaliśmy technikę wytwarzania stentgraftu małego kalibru, który może być wdrożony przy użyciu standardowej procedury przezskórnej interwencji wieńcowej (PCI). Obecnie dostępne stentgrafty mają ograniczoną zdolność do utrzymania niskiego profilu i elastyczności przy wdrażaniu. Udowodniono, że stenty z gołego metalu opracowane przez naszą grupę w naszych poprzednich badaniach pomagają w szybkim gojeniu się stentowanej tętnicy24,26. Różne polimery były elektroprzędzone przez inne grupy, a poliuretan okazał s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Wydziałowi Inżynierii, Mayo Clinic za ich wsparcie techniczne. Badanie to było wspierane finansowo przez Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego - FNUSA-ICRC (nr CZ.1.05/1.100/02.0123), National Institutes of Health (T32 HL007111), American Heart Association Scientist Development Grant (AHA #06-35185N) oraz The Grainger Innovation Fund - Grainger Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szklana strzykawkaAir Tite7.140-33Strzykawka do dyszy przędzalniczej
Cylinder z podziałką 5 mlFisher Scientific08-552-4Gml pyrex z podziałką cylinder o średnicy około 9 mm i długości 11 cm
Generator wysokiego napięciaBertan Accociates, Inc.205A-30PSłuży do przyłożenia różnicy napięcia na dyszy przędzalniczej i kolektorze
Mikser laboratoryjny z kontrolą prędkości obrotowejScilogexSCI-84010201Dostępne u różnych dostawców sprzętu laboratoryjnego
PoliuretanDSM BioSpan SPUBiospan Segmentowy arkusz gumy poliuretanowej
McMaster Carr1370N11Służy do izolacji strzykawki podczas elektroprzędzenia
Trzpień ze stali nierdzewnejN/A/AWyprodukowano 
Igła ze stali nierdzewnejHamilton91018Używana jako dysza przędzalnicza w elektroprzędzeniu
Materiał nośnyEnvisionTecB04-HT-DEMOMATBiokompatybilny materiał rozpuszczalny w wodzie
Pompa strzykawkowaAparat Harvard55-3333
5 N

Bibliografia

  1. Elsner, M., et al. Coronary stent grafts covered by a polytetrafluoroethylene membrane. Am. J. Cardiol. 84 (3), 335-338 (1999).
  2. Störger, H., Haase, J. Polytetrafluoroethylene-Covered Stents: Indications, Advantages, and Limitations. J. Interv. Cardiol. 12 (6), 451-456 (1999).
  3. Moreno, P. R., et al. Macrophage infiltration predicts restenosis after coronary intervention in patients with unstable angina. Circulation. 94 (12), 3098-3102 (1996).
  4. Briguori, C., Sarais, C., Colombo, A. The polytetrafluoroethylene-covered stent: a device with multiple potential advantages. Int. J. Cardiovasc. Interv. 4 (3), 145-149 (2001).
  5. Qureshi, M. A., Martin, Z., Greenberg, R. K. Endovascular management of patients with Takayasu arteritis: stents versus stent grafts. Semin. Vasc. Surg. 24 (1), 44-52 (2011).
  6. Ahmadi, R., Schillinger, M., Maca, T., Minar, E. Femoropopliteal arteries: immediate and long-term results with a Dacron-covered stent-graft. Radiology. 223 (2), 345-350 (2002).
  7. Geremia, G., et al. Experimental arteriovenous fistulas: treatment with silicone-covered metallic stents. AJNR. Am. J. Neuroradiol. 18 (2), 271-277 (1997).
  8. Saatci, I., et al. Treatment of internal carotid artery aneurysms with a covered stent: experience in 24 patients with mid-term follow-up results. AJNR. Am. J. Neuroradiol. 25 (10), 1742-1749 (2004).
  9. Stefanadis, C., et al. Stents Wrapped in Autologous Vein: An Experimental Study1. J. Am. Coll. Cardiol. 28 (4), 1039-1046 (1996).
  10. Palmaz, J. C. Review of polymeric graft materials for endovascular applications. J. Vasc. Interv. Radiol. 9, 7-13 (1998).
  11. Bruckheimer, E., Dagan, T., Amir, G., Birk, E. Covered Cheatham-Platinum stents for serial dilation of severe native aortic coarctation. Catheter Cardiovasc. Interv. 74 (1), 117-123 (2009).
  12. Tzifa, A., et al. Covered Cheatham-platinum stents for aortic coarctation: early and intermediate-term results. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (7), 1457-1463 (2006).
  13. Kuraishi, K., et al. Development of nanofiber-covered stents using electrospinning: in vitro and acute phase in vivo experiments. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 88 (1), 230-239 (2009).
  14. Pant, S., Bressloff, N. W., Limbert, G. Geometry parameterization and multidisciplinary constrained optimization of coronary stents. Biomech. Model Mechanobiol. 11 (1-2), 61-82 (2012).
  15. Muller-Hulsbeck, S., et al. Experience on endothelial cell adhesion on vascular stents and stent-grafts: first in vitro results. Invest. Radiol. 37 (6), 314-320 (2002).
  16. Sarkar, S., Salacinski, H. J., Hamilton, G., Seifalian, A. M. The mechanical properties of infrainguinal vascular bypass grafts: their role in influencing patency. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 31 (6), 627-636 (2006).
  17. Shirota, T., Yasui, H., Shimokawa, H., Matsuda, T. Fabrication of endothelial progenitor cell (EPC)-seeded intravascular stent devices and in vitro endothelialization on hybrid vascular tissue. Biomaterials. 24 (13), 2295-2302 (2003).
  18. Grasl, C., et al. Electrospun polyurethane vascular grafts: in vitro mechanical behavior and endothelial adhesion molecule expression. J. Biomed. Mater. Res. A. 93 (2), 716-723 (2010).
  19. Kidoaki, S., Kwon, I. K., Matsuda, T. Structural features and mechanical properties of in situ-bonded meshes of segmented polyurethane electrospun from mixed solvents. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 76 (1), 219-229 (2006).
  20. Stegemann, J. P., Kaszuba, S. N., Rowe, S. L. Review: advances in vascular tissue engineering using protein-based biomaterials. Tissue Eng. 13 (11), 2601-2613 (2007).
  21. Sankaran, K. K., Subramanian, A., Krishnan, U. M., Sethuraman, S. Nanoarchitecture of scaffolds and endothelial cells in engineering small diameter vascular grafts. Biotechnol. J. 10 (1), 96-108 (2015).
  22. Gibson, P., Schreuder-Gibson, H., Rivin, D. Transport properties of porous membranes based on electrospun nanofibers. Colloid Surf., A. 187, 469-481 (2001).
  23. Zdrahala, R. J. Small caliber vascular grafts. Part II: Polyurethanes revisited. J. Biomater. Appl. 11 (1), 37-61 (1996).
  24. Uthamaraj, S., et al. Design and validation of a novel ferromagnetic bare metal stent capable of capturing and retaining endothelial cells. Ann. Biomed. Eng. 42 (12), 2416-2424 (2014).
  25. Tefft, B. J., et al. Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles. J. Vis. Exp. (105), e53099(2015).
  26. Uthamaraj, S., et al. Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention. J. Vis. Exp. (103), e53100(2015).
  27. de Giovanni, J. V. Covered stents in the treatment of aortic coarctation. J. Interv. Cardiol. 14 (2), 187-190 (2001).
  28. Hans, F. J., et al. Treatment of wide-necked aneurysms with balloon-expandable polyurethane-covered stentgrafts: experience in an animal model. Acta. Neurochir. (Wien). 147 (8), 871-876 (2005).
  29. Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta. Biomater. 10 (1), 11-25 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wytwarzanie stentu pokrytego graftemelektroprz dzenie poliuretanustent rozszerzalny balonemmembrana nanofibrowawalidacja mechanicznarozszerzanie po zaciskaniunanofibry polimeroweuk ad do elektroprz dzeniaimplantacja stentu

Powiązane artykuły