Artykuł metodologiczny

Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/54732

⸱

28 września 2016

 ,  ,  ,  , 
1Département de Physiologie Moléculaire et Intégrative, Montreal Heart Institute Research Centre, 2Département de Microbiologie, Infectiologie, Immunologie, Centre de recherche de l'Hôpital Maisonneuve-Rosemont

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziedziczne lub de novo mutacje w kanałach selektywnych kationów mogą prowadzić do nagłej śmierci sercowej. Często postuluje się, że zmiana w transporcie błony komórkowej tych wielozakresowych białek transbłonowych, ze zmianą lub bez zmiany w bramkowaniu kanałów, znacząco przyczynia się do tego procesu. W związku z tym kluczowe stało się opracowanie metody ilościowego określania zmiany względnej ekspresji powierzchni komórek w kanałach jonowych serca na dużą skalę. W niniejszym dokumencie przedstawiono szczegółowy protokół w celu określenia względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji komórek sercowych kanałów wapniowych typu L CaV1.2 i podjednostek związanych z błoną w komórkach tsA-201 za pomocą dwukolorowych testów cytometrii fluorescencyjnej. W porównaniu z innymi metodami jakościowymi opartymi na mikroskopii lub immunoblottingu, eksperymenty cytometrii przepływowej są szybkimi, powtarzalnymi i dużymi testami, które dostarczają mierzalnych punktów końcowych na dużych próbkach żywych komórek (w zakresie od 104 do 106 komórek) o podobnych cechach komórkowych w jednym przepływie. Konstrukty zaprojektowano tak, aby konstytutywnie wyrażać mCherry na wewnątrzkomórkowym C-końcu (umożliwiając w ten sposób szybką ocenę całkowitej ekspresji białka) i wyrażać zewnątrzkomórkowy epitop hemaglutyniny (HA) w celu oszacowania ekspresji białek błonowych na powierzchni komórki przy użyciu przeciwciała sprzężonego z fluorescencją anty-HA. Aby uniknąć wyników fałszywie ujemnych, przeprowadzono również eksperymenty w przepuszczalnych komórkach, aby potwierdzić dostępność i prawidłową ekspresję epitopu HA. Szczegółowa procedura zapewnia: (1) projektowanie znakowanych konstruktów DNA (kwasu dezoksyrybonukleinowego), (2) transfekcję konstruktów za pośrednictwem lipidów w komórkach tsA-201, (3) hodowlę, pobieranie i barwienie komórek nieprzepuszczalnych i przepuszczalnych oraz (4) pozyskiwanie i analizę sygnałów fluorescencyjnych. Dodatkowo wyjaśniono podstawowe zasady cytometrii przepływowej oraz szczegółowo omówiono projekt eksperymentu, w tym dobór fluoroforów, miareczkowanie przeciwciała HA i eksperymenty kontrolne. To specyficzne podejście oferuje obiektywną względną kwantyfikację całkowitej i powierzchniowej ekspresji kanałów jonowych, którą można rozszerzyć w celu badania pomp jonowych i transporterów błony plazmatycznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł dostarcza wiarygodnego testu do raportowania względnej ekspresji powierzchni komórek białek błonowych, takich jak kanały jonowe, wyrażanych w rekombinowanych komórkach przy użyciu istniejącej technologii cytometrii przepływowej. Kanały jonowe to tworzące pory białka błonowe, które są odpowiedzialne za kontrolowanie sygnałów elektrycznych poprzez bramkowanie przepływu jonów przez błonę komórkową. Są one klasyfikowane ze względu na mechanizm aktywacji, charakter i selektywność form jonów przechodzących przez pory, w których są zlokalizowane. Na poziomie komórkowym i tkankowym makroskopowe strumienie jonów przez kanały jonowe są produktem właściwości biofizycznych (bramkowanie i przenikanie), biochemicznych (fosforylacja) i biogenezy (synteza, glikozylacja, transport i degradacja)1. Każdy z tych procesów jest unikalny dla każdego typu kanałów jonowych i jest zoptymalizowany pod kątem spełniania fizjologicznej roli kanału jonowego. W związku z tym zmiany w którymkolwiek z tych precyzyjnie dostrojonych procesów poprzez dziedziczną lub genetyczną modyfikację, często określane jako "kanałopatia", mogą być szkodliwe dla homeostazy komórki. Ważne jest, aby podkreślić, że dostarczenie "odpowiedniej" ilości kanałów jonowych na powierzchni komórki ma kluczowe znaczenie dla homeostazy komórki. Nawet niewielkie wzrosty (wzmocnienie funkcji) i niewielkie spadki (utrata funkcji) aktywności kanałów jonowych mogą potencjalnie spowodować poważną patologię w ciągu całego życia. Defekty w dostarczaniu dojrzałych kanałów jonowych na powierzchnię komórki są ważnym czynnikiem determinującym w licznych kanałopatiach, takich jak mukowiscydoza (kanał jonowy CFTR)2 i zaburzenia rytmu serca w postaci zespołu wydłużonego odstępu QT (sercowe kanały potasowe)3.

Channelopatie są związane z nagłą śmiercią serca4. Uważa się, że obecna na całym świecie częstość występowania wszystkich kanałopatii sercowych wynosi co najmniej 1:2 000-1:3 000 na osobę5 i jest odpowiedzialna za około połowę przypadków nagłej arytmicznej śmierci sercowej6. Wiadomo, że dysfunkcja kanałów jonowych selektywnych sodowo, potasowo i wapniowo-selektywnych w sercu, odgrywa kluczową rolę w tym procesie. Kanał wapniowy bramkowany napięciem CaV1,2 typu L jest wymagany do zainicjowania zsynchronizowanego skurczu mięśnia sercowego. Sercowy kanał CaV1,2 typu L jest wielopodjednostkowym kompleksem białkowym złożonym z głównej podjednostki CaVα1 tworzącej pory oraz podjednostek pomocniczych CaVß i CaVα2δ17-12. Należy zauważyć, że pełny zestaw podjednostek pomocniczych jest wymagany do wytworzenia funkcjonalnych kanałów CaV1.2 na błonie plazmatycznej, a dynamiczne interakcje między tymi podjednostkami są niezbędne do wspierania normalnej funkcji elektrycznej serca13. CaVß promuje ekspresję na powierzchni komórki kanałów CaV1.2 poprzez niekowalencyjną nanomolową interakcję hydrofobową14. Koekspresja podjednostki CaVα2δ1z CaV α1 związanym z ß CaVα1 stymuluje ekspresję prądu szczytowego (od 5 do 10 razy) i sprzyja aktywacji kanału przy bardziej ujemnych napięciach. Mutacje związane ze wzmocnieniem funkcji podjednostki tworzącej pory CaV1.2 są związane z postacią komorowych zaburzeń rytmu serca zwaną zespołem wydłużonego odstępuQT 15, podczas gdy u osób cierpiących na zaburzenia rytmu w postaci krótkiego odstępu QT zidentyfikowano szereg mutacji punktowych w trzech głównych podjednostkach tworzących kanał CaV1.2 typuL16,17. Kanały jonowe to białka błonowe, które można badać z perspektywy biochemicznej (chemia białek) lub za pomocą narzędzi elektrofizjologicznych (maszyny generujące prąd) i często przy użyciu tych uzupełniających się podejść. Elektrofizjologia, a w szczególności zaciskanie plam w całych komórkach, jest odpowiednim podejściem do wyjaśnienia funkcji kanałów jonowych15, ale nie jest w stanie rozwiązać problemów związanych z modyfikacjami białek wynikającymi ze zmian ich właściwości biofizycznych. Chemia białek ma jednak często ograniczone zastosowanie ze względu na stosunkowo niską ekspresję dużych białek błonowych w porównaniu z mniejszymi białkami rozpuszczalnymi. Konieczne jest opracowanie solidnych, wysokoprzepustowych metod wykorzystujących odczyt fluorescencji, aby zająć się defektami w biogenezie białek powodującymi zmiany w ekspresji kanałów jonowych na powierzchni komórki.

Cytometria przepływowa to biofizyczna technologia stosowana w liczeniu komórek, sortowaniu, wykrywaniu biomarkerów i inżynierii białkowej18. Gdy roztwór próbki żywych komórek lub cząstek jest wstrzykiwany do cytometru przepływowego, komórki są porządkowane w pojedynczy strumień, który może być badany przez system wykrywania maszyny (rysunek 1). Pierwszy cytometr przepływowy wyprodukowany w 1956 roku19 wykrył tylko jeden parametr, ale nowoczesne cytometry przepływowe mają wiele laserów i detektorów fluorescencyjnych, które pozwalają na wykrycie ponad 30 parametrów fluorescencyjnych20,21. Filtry i lustra (optyka emisyjna) kierują światło rozproszone lub fluorescencyjne komórek do sieci elektronicznej (fotodiody i detektorów), która przekształca światło proporcjonalnie do jego natężenia. Dane cyfrowe są analizowane za pomocą specjalistycznego oprogramowania, a pierwotne dane wyjściowe są wyświetlane jako wykres punktowy21.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Biofizyczne zasady sortowania metodą cytometrii przepływowej. Pojedyncze komórki są przepychane przez dyszę pod wysokim ciśnieniem w strumieniu płynu osłonowego, który przesuwa je przez jeden lub więcej punktów badania laserowego. Wiązka światła jest odchylana przez przechodzące komórki, a światło zebrane w kierunku do przodu (Forward Scatter, FCS) jest wysyłane do fotodiody, która przekształca światło w sygnał proporcjonalny do wielkości ogniwa. Światło jest również zbierane pod kątem 90° do ścieżki lasera i wysyłane do detektorów (zwanych również fotopowielaczami (PMT)). Światło to jest kierowane przez lustra dichroiczne, które umożliwiają wykrycie sygnału rozpraszania bocznego (SSC), który odzwierciedla ziarnistość w komórkach, oraz emisje fluorescencyjne, jeśli w komórce obecne są wzbudzone fluorochromy. Trzy detektory (zielony, żółty i czerwony) są reprezentowane przez filtry pasmowoprzepustowe o różnej długości fali, co pozwala na jednoczesne wykrywanie różnych fluorochromów. Różne sygnały są digitalizowane przez zewnętrzny komputer i przekształcane w dane, które będą analizowane w celu ilościowego określenia charakterystyki komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wysoka przepustowość cytometrów przepływowych została wykorzystana do ilościowego określenia względnej ekspresji błonowej rekombinowanych kanałów CaV 1.2typu dzikiego i z niedoborem ruchu, bramkowanych napięciem typu L i powiązanych podjednostek w żywych komórkach. Konstrukty cDNA kodujące białka zostały podwójnie oznaczone, aby jednocześnie przenosić zewnątrzkomórkowy niefluorescencyjny epitop, który może być wykryty przez nieprzepuszczalne fluorescencyjne sprzężone przeciwciało i wewnątrzkomórkowy fluorofor który jest konstytutywnie fluorescencyjny. Zarówno epitop zewnątrzkomórkowy, umieszczony w pętli zewnątrzkomórkowej białka, jak i fluorofor wewnątrzkomórkowy, wstawiony za C-końcem, ulegają translacji z białkiem. W tej serii eksperymentów białko CaVα2δ1 zostało zmodyfikowane w celu ekspresji zewnątrzkomórkowego epitopu hemaglutyniny (HA) (YPYDVPDYA) wykrytego przez nieprzepuszczalny anty-HA i mCherry sprzężony z FITC (izotiocyjanianem fluoresceiny) jako wewnętrzny wewnątrzkomórkowy fluorofor. Aby określić względny poziom ekspresji na powierzchni komórki białka znakowanego HA mCherry-CaVα2δ1, rekombinowane komórki wyrażające białko fuzyjne zebrano po transfekcji i wybarwiono mysim monoklonalnym przeciwciałem znacznikowym anty-HA monoklonalnym anty-HA sprzężonym z FITC (Figura 2). FITC jest organicznym związkiem fluorescencyjnym, który jest znacznie mniejszy niż reportery enzymatyczne, a zatem nie jest tak prawdopodobne, że zakłóci funkcje biologiczne. mCherry-CaVα2δ1-HA ulega nadekspresji w komórkach tsA-201, powoduje znaczny wzrost fluorescencji FITC i fluorescencji mCherry o 3 log na dwuwymiarowych wykresach22. Biorąc pod uwagę, że epitop HA znajduje się w zewnątrzkomórkowej części białka, intensywność fluorescencji FITC uzyskana w obecności nienaruszonych komórek odzwierciedla względny wskaźnik ekspresji powierzchni komórki białka znakowanego HA. Dostępność epitopu HA w konstruktach jest systematycznie weryfikowana poprzez pomiar sygnału FITC po przepuszczalności komórki. Miara ta służy również do potwierdzenia znormalizowanej całkowitej ekspresji białka, ponieważ względne intensywności fluorescencji dla FITC oszacowane w komórkach przepuszczalnych są jakościowo porównywalne ze względnymi wartościami fluorescencji dla mCherry mierzonymi w warunkach przepuszczalnych i nieprzepuszczalnych22,23. Ważne jest, aby zauważyć, że wewnętrzne widmo fluorescencji jest przesunięte w kierunku wyższych wartości po przepuszczalności, ale jedyną zgłaszaną wartością jest zmiana intensywności fluorescencji w porównaniu z konstruktem kontrolnym. Względne zmiany intensywności fluorescencji dla badanych konstruktów są szacowane przy użyciu wartości intensywności fluorescencji ΔMean (ΔMFI) dla każdego fluoroforu (mCherry lub FITC). Doświadczenia mają na celu pomiar intensywności fluorescencji badanego konstruktu w stosunku do intensywności fluorescencji konstruktu kontrolnego wyrażonej w tych samych warunkach, aby ograniczyć eksperymentalne zmiany w wewnętrznej fluorescencji przeciwciała sprzężonego z fluoroforem. Za pomocą tego testu z powodzeniem zbadano dwa białka błonowe: podjednostkę tworzącą pory bramkowanego napięciem kanału wapniowego typu L CaV1,214,22 oraz w innej serii eksperymentów zewnątrzkomórkową pomocniczą podjednostkę CaVα2δ122,23. Do określenia ekspresji powierzchniowej komórki podjednostki CaVα2δ1 kanału sercowego CaV 1,2typu L zastosowano następujący protokół w warunkach kontrolnych i po mutacjach wpływających na potranslacyjną modyfikację kanału jonowego. W standaryzowanych warunkach eksperymentalnych fluorescencja powierzchni komórki FITC wzrasta quasi-liniowo wraz z ekspresją cDNA kodującego białka mCherry-CaVα2δ1-HA (ryc. 5 z odnośnika22).

figure-introduction-2
Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie znakowania całkowitego i błonowego w protokole eksperymentalnym cytometrii przepływowej. Schemat przedstawia niektóre z głównych kroków niezbędnych do ilościowego określenia względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych na powierzchni komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki są transfekowane podwójnie znakowaną konstrukcją mCherry-CaVα2δ1-HA w komórkach tsA-201 (1) i barwione przed lub po permeabilizacji (2). Dane wieloparametrowe są pozyskiwane w cytometrze przepływowym (3) do analizy wielowymiarowej (4). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Podwójnie oznaczone konstrukcje DNA

  1. Wstaw epitop HA (YPYDVPDYA) do zewnątrzkomórkowego łącznika CaVα2δ1 między D676 i R677 przez mutagenezę skierowaną na miejsce (Figura 3B)20. Użyj startera do przodu gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC i startera odwrotnego acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAAAATTC.
  2. Subklonować sekwencję cDNA znakowanego HA CaVα2δ1 do wektora ekspresyjnego pmCherry-N1 ssaków zaprojektowanego do ekspresji białka połączonego z N-końcem mCherry między miejscami SacI i SalI (Figura 3B) 20,
    UWAGA: Odpowiednie działanie kanału musi być przetestowane za pomocą konstruktu kontrolnego przy użyciu standardowych metod elektrofizjologicznych24.

2. Transfekcja przejściowa za pośrednictwem liposomów (30 min, wszystkie kroki wykonywane są pod kapturem z przepływem laminarnym)

  1. Dzień 1: Umieść pół miliona komórek tsA-201 (lub HEKT) w 35-milimetrowych szalkach hodowlanych z 2 ml pożywki Dulbecco o minimalnej zawartości glukozy (DMEM-HG) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% pożywką hodowlaną penicyliny-streptomycyny (PS). Policz komórki za pomocą standardowego hemekytometru. Ocenić żywotność komórek na podstawie frakcji próbki komórki za pomocą błękitu trypanowego. Umieść wystarczającą liczbę komórek, aby osiągnąć 90% konfluencji w momencie transfekcji.
  2. Dzień 2: Zmienić pożywkę na 2 ml świeżej, wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki hodowlanej bez PS.
  3. Dla każdej próbki do transfekcji należy przygotować dwie probówki o pojemności 1,5 ml. W probówce 1 rozcieńczyć 4 μg DNA w 250 μl zredukowanej pożywki surowicy. W probówce 2 zmieszać 10 μl odczynnika do transfekcji za pośrednictwem liposomów z 250 μl pożywki hodowlanej o zredukowanej surowicy. Przed użyciem delikatnie wymieszać odczynnik do transfekcji.
  4. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Połączyć zawartość probówki 1 i probówki 2, delikatnie wymieszać i inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Dodaj kompleksy liposomów/DNA do hodowanych komórek i delikatnie kołysz szalką hodowlaną, aby wymieszać.
  7. Inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 24 godziny.

3. Barwienie komórek do cytometrii przepływowej (3 godz.)

  1. Przygotowanie próbek komórek
    1. Dzień 3: Ostrożnie wyjmij pożywkę z naczynia hodowlanego i umyj komórki 400 μl wstępnie podgrzanej (37 °C) 0,05% trypsyny-1x EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy).
    2. Dodać 400 μl trypsyny-EDTA i inkubować naczynie w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 5 minut, aby umożliwić oderwanie komórek od naczynia.
    3. Zatrzymaj trawienie enzymatyczne, dodając 1 ml zimnej pożywki hodowlanej bez PS i wypłucz wszystkie komórki z powierzchni, delikatnie pipetując 4-5 razy. Unikaj nadmiernego trawienia i nadmiernego pipetowania, aby zmniejszyć śmierć komórek.
    4. Zebrać komórki w probówkach o pojemności 1,5 ml i natychmiast umieścić na lodzie. Używaj lodowatych roztworów i utrzymuj komórki w temperaturze 4 °C, aby zapobiec internalizacji antygenów powierzchniowych. Zmniejsz oświetlenie, aby ograniczyć fotowybielanie sygnału fluorescencyjnego.
    5. Probówki wirować o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zassać i wyrzucić supernatant.
    6. Zawiesić osad w 1 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami 1x (PBS) w celu przygotowania zawiesiny jednokomórkowej.
    7. Krótko bardzo delikatnie wymieszać probówki i powtórzyć kroki 3.1.5 i 3.1.6, aby całkowicie usunąć pożywkę hodowlaną.
    8. Ponownie zawiesić osad w 600 μl 1x PBS i dostosować stężenie komórek do minimum 3 x 106 komórek/ml.
    9. Podziel komórki w dwóch nowych probówkach o pojemności 1,5 ml do barwienia zewnątrzkomórkowego i wewnątrzkomórkowego. Uwzględnij odpowiednie kontrole, aby odróżnić specyficzne barwienie od niespecyficznego barwienia.
      UWAGA: Przeciwciało kontrolne izotypu pomaga ocenić poziom barwienia tła i powinno idealnie pasować do gatunku gospodarza, izotypu i fluoroforu każdego przeciwciała pierwszorzędowego. Stosować kontrolę izotypu i sprzężone przeciwciało o tym samym stężeniu białka.

figure-protocol-1
Tabela 1: Próbki kontrolne eksperymentu cytometrii przepływowej dla komórek nieprzepuszczalnych i przepuszczalnych. Każdy eksperyment musi obejmować następujące kontrole ujemne: (1) Komórki nietransfekowane (bez przeciwciała, z izotypem lub z przeciwciałem sprzężonym). (2) Transfekowane komórki z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania subklonowane w plazmidzie bez konstytutywnego fluorescencyjnego fluorochromu wewnątrzkomórkowego (pCMV-CaVα2δ1-HA) lub z podwójnie znakowaną konstrukcją (pmCherry-CaVα2δ1 i inkubowane bez przeciwciała, z izotypem lub z przeciwciałem sprzężonym). Kontrolki pojedynczego koloru służą do kompensacji nakładania się emisji fluorochromu. Te same kontrole są przeprowadzane dla warunków nieprzepuszczalnych i przepuszczalnych w każdej serii eksperymentów.

  1. Barwienie powierzchni komórek nienaruszonych żywych komórek
    1. Podwielokrotność 1 x 106 komórek/100 μl w probówkach o pojemności 1,5 ml.
    2. Dodać sprzężone z FITC przeciwciało monoklonalne anty-HA w stężeniu 5 μg/ml i wirować przed inkubacją komórek na platformie kołyskowej (200 obr./min) w ciemności w temperaturze 4 °C przez 45 min.
      UWAGA: Optymalne stężenie przeciwciała określono we wstępnych eksperymentach miareczkowania (ryc. 4).
    3. Usuń komórki z ciemności i dodaj 900 μl 1x PBS / probówkę. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml 1 x PBS, odwirować i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Powtórzyć płukanie (krok 3.2.4) dwukrotnie, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała. Jeśli stosuje się niesprzężone przeciwciało pierwszorzędowe, należy inkubować z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym.
    6. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić komórki w 500 μl 1x PBS i przenieść zawiesinę pojedynczej komórki w probówkach do cytometrii przepływowej o pojemności 5 ml. Utrzymuj komórki w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu uruchomienia próbki.
    7. Pobrać próbki na cytometrze przepływowym. Aby uzyskać najlepsze wyniki, przeanalizuj komórki na cytometrze przepływowym tak szybko, jak to możliwe i nie później niż 24 godziny później.
  2. Barwienie wewnątrzkomórkowe: utrwalanie, przepuszczalność i barwienie
    1. Podwielokrotność 1 x 106 komórek/100 μl w probówkach o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl roztworu utrwalająco-przepuszczalnego bezpośrednio z podkładki.
    3. Inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
    4. Dodać 100 μl świeżo przygotowanego 1x buforu do przemywania permeabilizacji (rozcieńczyć 10x bufor do przemywania permeabilizacji w destylowanymH2O). Wirować komórki i osad za pomocą wirówki stołowej o sile 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Odessać i wyrzucić supernatant.
    6. Powtórz kroki 3.3.4 i 3.3.5.
    7. Dodać sprzężone z FITC przeciwciało monoklonalne anty-HA w stężeniu 5 μg/ml w 100 μl 1x buforu do przemywania permeabilizacji i wirować przed inkubacją komórek w ciemności w temperaturze 4 °C przez 30 min.
      UWAGA: Barwienie wewnątrzkomórkowe przeprowadza się zgodnie z tą samą procedurą, co barwienie powierzchni komórek. Permeabilizacja komórek za pośrednictwem saponin jest jednak procesem szybko odwracalnym, dlatego ważne jest, aby zastąpić 1x PBS 1x buforem Perm/Wash, aby utrzymać komórki w stałej obecności saponiny podczas barwienia wewnątrzkomórkowego.
    8. Usuń komórki z ciemności i dodaj 100 μl buforu do przemywania przepuszczalności. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    9. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl buforu do przemywania permeabilizacyjnego, wirować i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    10. Powtórzyć płukanie (krok 3.3.9) jeszcze raz, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała.
    11. Po ostatnim płukaniu ponownie zawiesić komórki w 500 μl 1x PBS i przenieść zawiesinę pojedynczej komórki do probówek do cytometrii przepływowej o pojemności 5 ml. Utrzymywać komórki w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu wstrzyknięcia próbki do cytometru przepływowego.
    12. Pobrać próbki na cytometrze przepływowym. Utrwalone próbki należy umieścić na cytometrze tak szybko, jak to możliwe, ale nie później niż 1 tydzień po barwieniu. Uruchom komórki nieprzepuszczalne i przepuszczalne tego samego dnia.

4. Cytometria przepływowa

  1. Codzienna konfiguracja sortownika komórek cytometru przepływowego
    1. Włącz oprogramowanie do cytometrii przepływowej. Przed eksperymentem należy skalibrować i skonfigurować sortownik komórek cytometru przepływowego, aby zapewnić optymalną wydajność przyrządu (tj. laser i optyka działają zgodnie ze specyfikacją, laser i komórka przepływowa są prawidłowo wyrównane) za pomocą koralików konfiguracyjnych przyrządu.
    2. Użyj dyszy 100 μm o ciśnieniu w osłonie 20 psi.
      UWAGA: Dyszy nie trzeba wymieniać na cytometrze przepływowym laboratoryjnym.
    3. Ustaw natężenie przepływu cytometru zgodnie ze specyfikacją producenta. Nadmiernie wysokie natężenia przepływu zmniejszą czułość wykrywania zmian fluorescencji.
    4. Wybierz lasery niebieskie (488 nm do wzbudzenia izotiocyjanianu fluoresceiny lub FITC) i żółto-zielone (561 nm do wzbudzenia mCherry). Zbierz poziomy fluorescencji FITC i mCherry odpowiednio za pomocą filtra pasmowego 530/30 nm i filtra pasmowoprzepustowego 610/20 nm.
    5. Uzyskaj wykres punktowy rozproszenia do przodu (FCS) w porównaniu z rozproszeniem bocznym (SSC) dla komórek niebarwionych przy użyciu skali liniowej. Dostosuj wzmocnienie każdego detektora, aby zwizualizować komórki w lewym dolnym kwadrancie wykresu punktowego.
  2. Odczyt próbki nienaruszonych nieprzepuszczalnych komórek
    1. Ustaw bramkę P1 dla żywych, nieprzepuszczalnych komórek, wyznaczając swobodną formę wokół komórek, które mają być analizowane, z wyłączeniem resztek komórkowych i agregatów komórkowych, ograniczając w ten sposób sygnał fluorescencji do nienaruszonych komórek.
      UWAGA: Żywe/martwe barwniki wykluczające mogą być używane w celu ułatwienia umieszczania bramek na żywych komórkach. Ustaw 10 000 zdarzeń do zarejestrowania w bramce zatrzymania P1. W razie potrzeby ustaw tę opcję na większą liczbę zdarzeń.
    2. Uzyskaj dwuparametrowy wykres konturowy mCherry i FITC, aby wykryć wyjściową autofluorescencję niebarwionych komórek. Użyj skali bilogarytmicznej, aby pokazać wartości ujemne i poprawić rozdzielczość między populacjami25. Dostosuj napięcie każdego detektora, aby ustawić niebarwione ujemne komórki w dolnej części pierwszych dziesięciu jednostek wykresów logarytmicznej intensywności fluorescencji.
    3. Pobrać wszystkie nienaruszone nieprzepuszczalne próbki przy użyciu ustawień ustalonych w ppkt 4.1.5 i 4.1.6 i zebrać FSC, SSC i sygnały w detektorach fluorescencyjnych.
    4. Eksportuj i zapisuj pliki *.fcs do wykorzystania do analizy za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.
  3. Odczyt próbki komórek przepuszczalnych
    1. Przesunąć bramkę P1, aby wybrać żywe komórki w permeabilizowanych próbkach i wyregulować napięcie FSC i SSC, jak pokazano w 4.1.5 i 4.1.6.
    2. Pobrać wszystkie przepuszczalne próbki i zebrać FSC, SSC i sygnały w detektorach fluorescencyjnych.
    3. Eksportuj i zapisuj pliki *.fcs do wykorzystania do analizy za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.
  4. analiza danych
    1. Uruchom oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej i zaimportuj pliki *.fcs zapisane w 4.2.4 i 4.3.3.
    2. Kliknij pierwszy przykład wymieniony w oknie obszaru roboczego. Automatycznie otworzy się nowe okno o nazwie pochodzącej od numeru identyfikacyjnego tuby. Rozpocznij proces bramkowania na wykresie SSC kontra FSC. Narysuj bramkę (P1) za pomocą ikony elipsy wokół żywych komórek i wyeliminuj wszelkie zanieczyszczenia, martwe komórki lub agregaty, które mają inne rozproszenie do przodu i rozrzut boczny niż żywe komórki
    3. Aby narysować dwuparametrowy wykres konturowy intensywności fluorescencji mCherry (oś y) w funkcji FITC (oś x) żywych komórek, kliknij najpierw oś x i wybierz kanał FITC-A, a następnie kliknij oś y i wybierz kanał PE-mCherry-A. Kliknij ikonę "Quad", aby ustawić znacznik kwadrantu na krawędzi komórek autofluorescencyjnych w każdym kanale fluorescencyjnym.
      UWAGA: Bramka ustawiona wokół dodatnich komórek FITC i mCherry to bramka P2. Populacja komórek ujemnych pod względem fluorescencji jest określana jako bramka P3. Na rysunku 5 przedstawiono reprezentatywną metodę bramkowania zastosowaną w tym artykule.
    4. Wybierz bramki P2 i P3 i kliknij ikonę "Dodaj statystyki" w oryginalnym oknie obszaru roboczego. Kliknij "Liczba" (liczba komórek dodatnich) i kliknij statystyki "Średnia" (średnia intensywność fluorescencji każdego fluorochromu) lub "Mediana" (mediana intensywności fluorescencji każdego fluorochromu) z listy opcji. Kliknij ponownie ikonę "Dodaj statystyki". Wszystkie te wartości są automatycznie przenoszone do oryginalnego okna przestrzeni roboczej.
      UWAGA: "Średnia" jest używana tylko wtedy, gdy intensywność fluorescencji jest zgodna z rozkładem normalnym. W każdym innym przypadku kliknij zakładkę "Mediana". MFI może zatem odnosić się do średniej intensywności fluorescencji lub mediany intensywności fluorescencji.
      UWAGA: Następnym krokiem jest zastosowanie parametrów i statystyk bramek do wszystkich próbek badanych przez cytometr.
    5. W oknie obszaru roboczego użyj myszki, aby przeciągnąć i upuścić parametry bramek i statystyk na wiersz oznaczony jako WSZYSTKIE PRÓBKI.
    6. Wygeneruj raport partii dwuwymiarowych wykresów konturowych (mCherry vs FITC) i histogramów (liczba komórek w funkcji intensywności fluorescencji) dla komórek nieprzepuszczalnych i przepuszczalnych (ryc. 6A-B).
    7. Na podstawie danych statystycznych wygenerowanych w kroku 4.4.4 obliczyć średnią intensywność fluorescencji (MFI) dla każdego fluorochromu dla barwionych komórek. Od tej wartości odejmij wartość MFI uzyskaną z niebarwionych komórek, aby określić ilościowo powierzchnię i całkowitą ekspresję białka będącego przedmiotem zainteresowania.
    8. Należy podać wartości ΔMFI dla każdego fluoroforu (mCherry i FITC) (Rysunek 6C-D). Znormalizować ΔMFI zmierzone dla mutantów konstruktu CaVα2δ1 do wartości ΔMFI uzyskanej dla FITC i mCherry za pomocą konstruktu WT.
      UWAGA: Bezwzględna wartość intensywności fluorescencji może się znacznie różnić w zależności od partii przeciwciał i możliwości technicznych każdego pracownika laboratorium, stąd potrzeba normalizacji intensywności fluorescencji zmutowanego konstruktu za pomocą konstruktu WT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje niezawodny protokół do ilościowego oznaczania całkowitej i powierzchni komórek rekombinowanych kanałów jonowych wyrażonych w komórkach tsA-201 za pomocą dwukolorowego testu cytometrii przepływowej. Na przykład względną powierzchnię komórki i całkowitą ekspresję białka określono ilościowo dla podjednostki CaVα2δ1. W celu przeprowadzenia testu dwukolorowej cytometrii przepływowej, CaVα2δ1 został podwójnie oznaczony w celu ekspresji zewnątrzkomórkowe...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten test oparty na cytometrii przepływowej został z powodzeniem zastosowany do pomiaru względnych poziomów całkowitych i powierzchni komórek znakowanych fluorescencyjnie porów tworzących pory i powiązanych podjednostek kanałów wapniowych bramkowanych napięciem14,22,26. Najlepiej sprawdza się przy badaniu wpływu mutacji genetycznych, a zatem wymaga, aby wewnętrzna intensywność fluorescencji znakowanego fluorescencyjnie konstruktu typu dzikiego znakowanego była co najmniej 10 do 100 razy większa niż w przypadku ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Panu Serge'owi Sénéchalowi i Dr. Jacques'owi Thibodeau za podzielenie się swoją wiedzą i udzielenie nam dostępu do ich platformy do cytometrii przepływowej i sortowania komórek. Prace te zostały zrealizowane dzięki grantowi operacyjnemu 130256 z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem, grantowi z Canadian Heart and Stroke Foundation oraz wsparciu z "Fondation de l'Institut de Cardiologie de Montréal" dla L.P.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Q5 Zestaw do mutagenezy ukierunkowanejna miejsce New England BiolabsE0554SMożna zastąpić zestawem mutagenezy ukierunkowanej na miejsce QuickChange (Agilent, #200523).
Probówki 1,5 mlSarstedt72-690-001
Probówki 15 ml Sarstedt  62-554-002
Jednorazowe pipety przepływowe z podziałką VWR160001-192 
Naczynie hodowlane 100 mmCorning430167Do standardowej hodowli komórek HEKT.
Naczynie hodowlane 35 mmFalcon353001Do standardowej hodowli komórek HEKT.
Pipeta serologiczna 1 mlSarstedt86.1251.001
Pipeta serologiczna 5 mlSarstedt86.1253.001
Pipeta serologiczna 10 mlSarstedt86.1254.001
Pipeta serologiczna 25 mlSarstedt86.1285.001
Dulbecco's high-glucosemedium Life Technologies12100-046Warm in 37 & Stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.
Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, inaktywowana termicznie, pochodzenie amerykańskieLife Technologies16140-071
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Life Technologies15140-122
Lipofektamina 2000 Life Technologies11668-019Do transfekcji liposomalnej. Można zastąpić transfekcją fosforanu wapnia.
Opti-MEM I Zredukowane Technologie Średniej Żywotności w Surowicy31985-070Ciepłe w 37 & stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.
Trypsyna-EDTA (1x) 0,05%, czerwień fenolowaLife Technologies25300-062
1,5 ml mikroprobówkiSarstedt72.690.001
  Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 1xFisherBP661-10Może być "domowej roboty".
Przeciwciało sprzężone anty-HA FITCSigmaH7411
IgG1− Przeciwciało kontrolujące izotyp FITCSigmaF6397
BD Cytofix/Cytoperm Zestaw roztworów do utrwalania/permeabilizacjiBD Biosciences554714Utrwalanie/Permeabilizacja. Roztwór przepuszczalny/myjący, przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
HemacytometrFisher49105161
Trypan BlueFisher15250061Aby uzyskać dostęp do żywotności komórek.
Mikrowirówka z chłodzeniem, 5430REppendorf 
Forma Steri-Cycle CO2 InkubatorFisher370
Platforma laboratoryjna RockerFisher545034
Kąpiel wodnaVWR89032-216
BD FACSARIA III BD Biosciences648282Cytometr przepływowy.
Oprogramowanie FlowJo v10FlowJoFlowJo v10 DongleDo analizy danych.
A14H172200

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking. Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).
  2. Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. Correctors of the basic trafficking defect of the mutant F508del-CFTR that causes cystic fibrosis. Curr Opin Chem Biol. 17, 353-360 (2013).
  3. Balijepalli, S. Y., Anderson, C. L., Lin, E. C., January, C. T. Rescue of Mutated Cardiac Ion Channels in Inherited Arrhythmia Syndromes. J. Cardiovas Pharm. 56, 113-122 (2010).
  4. Gargus, J. J. Unraveling Monogenic Channelopathies and Their Implications for Complex Polygenic Disease. Am. J. Hum. Genet. 72, 785-803 (2003).
  5. Abriel, H., Zaklyazminskaya, E. V. Cardiac channelopathies: Genetic and molecular mechanisms. Gene. 517, 1-11 (2013).
  6. Behr, E. R., et al. Sudden arrhythmic death syndrome: familial evaluation identifies inheritable heart disease in the majority of families. Eur Heart J. 29, 1670-1680 (2008).
  7. Catterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell Dev.Biol. 16, 521-555 (2000).
  8. Peterson, B. Z., DeMaria, C. D., Adelman, J. P., Yue, D. T. Calmodulin is the Ca2+ sensor for Ca2+ -dependent inactivation of L- type calcium channels. Neuron. 22, 549-558 (1999).
  9. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr.Opin.Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  10. Dai, S., Hall, D. D., Hell, J. W. Supramolecular assemblies and localized regulation of voltage-gated ion channels. Physiol Rev. 89, 411-452 (2009).
  11. Gao, T., et al. Identification and subcellular localization of the subunits of L-type calcium channels and adenylyl cyclase in cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 272, 19401-19407 (1997).
  12. Carl, S. L., et al. Immunolocalization of sarcolemmal dihydropyridine receptor and sarcoplasmic reticular triadin and ryanodine receptor in rabbit ventricle and atrium. J. Cell Biol. 129, 673-682 (1995).
  13. Abriel, H., Rougier, J. S., Jalife, J. Ion Channel Macromolecular Complexes in Cardiomyocytes: Roles in Sudden Cardiac Death. Circ. Res. 116, 1971-1988 (2015).
  14. Bourdin, B., et al. Molecular Determinants of the Cavb-induced Plasma Membrane Targeting of the Cav1.2 Channel. J. Biol. Chem. 285, 22853-22863 (2010).
  15. Raybaud, A., et al. The Role of the GX9GX3G Motif in the Gating of High Voltage-activated Calcium Channels. J. Biol. Chem. 281, 39424-39436 (2006).
  16. Burashnikov, E., et al. Mutations in the cardiac L-type calcium channel associated with inherited J-wave syndromes and sudden cardiac death. Heart Rhythm. 7, 1872-1882 (2010).
  17. Hennessey, J. A., et al. A CACNA1C Variant Associated with Reduced Voltage-Dependent Inactivation, Increased Cav1.2 Channel Window Current, and Arrhythmogenesis. PLoS ONE. 9, e106982(2014).
  18. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).
  19. Graham, M. D. The Coulter Principle: Foundation of an Industry. J. Lab. Autom. 8, 72-81 (2003).
  20. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243, 77-97 (2000).
  21. Rothe, G. Cellular Diagnostics. Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Sack, U., Tarnok, A., Rothe, G. , Karger. Basel. 53-88 (2009).
  22. Bourdin, B., et al. Functional Characterization of Cavalpha2delta Mutations Associated with Sudden Cardiac Death. J. Biol. Chem. 290, 2854-2869 (2015).
  23. Tetreault, M. P., et al. Identification of glycosylation sites essential for surface expression of the Cavalpha2delta1 subunit and modulation of the cardiac Cav1.2 channel activity. J. Biol. Chem. 291, 4826-4843 (2016).
  24. Senatore, A., Boone, A. N., Spafford, J. D. Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells. J Vis Exp. (47), (2011).
  25. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat.Immunol. 7, 681-685 (2006).
  26. Shakeri, B., Bourdin, B., Demers-Giroux, P. O., Sauve, R., Parent, L. A quartet of Leucine residues in the Guanylate Kinase domain of Cavbeta determines the plasma membrane density of the Cav2.3 channel. J Biol Chem. 287, 32835-32847 (2012).
  27. Morton, R. A., Baptista-Hon, D. T., Hales, T. G., Lovinger, D. M. Agonist- and antagonist-induced up-regulation of surface 5-HT3A receptors. Br. J. Pharmacol. 172, 4066-4077 (2015).
  28. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetracysteine-tagged proteins in intact cells. Nat. Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  29. Cockcroft, C. J. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. Totowa, NJ. 233-241 (2013).
  30. Gonzalez-Gutierrez, G., Miranda-Laferte, E., Neely, A., Hidalgo, P. The Src Homology 3 Domain of the beta-Subunit of Voltage-gated Calcium Channels Promotes Endocytosis via Dynamin Interaction. J. Biol.Chem. 282, 2156-2162 (2007).
  31. Galizzi, J. P., Borsotto, M., Barhanin, J., Fosset, M., Lazdunski, M. Characterization and photoaffinity labeling of receptor sites for the Calcium channel inhibitors d-cis-diltiazem, (+/-)-bepridil, desmethoxyverapamil, and (+)-PN 200-110 in skeletal muscle transverse tubule membranes. J. Biol.Chem. 261, 1393-1397 (1986).
  32. Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiol.Rev. 80, 555-592 (2000).
  33. Sigworth, F. J. The variance of sodium current fluctuations at the node of Ranvier. J Physiol. 307, 97-129 (1980).
  34. Bailey, M. A., Grabe, M., Devor, D. C. Characterization of the PCMBS-dependent modification of KCa3.1 channel gating. J. Gen. Physiol. 136, 367-387 (2010).
  35. Fletcher, P. A., Scriven, D. R., Schulson, M. N., Moore, E. D. Multi-Image Colocalization and Its Statistical Significance. Biophys. J. 99, 1996-2005 (2010).
  36. Lizotte, E., Tremblay, A., Allen, B. G., Fiset, C. Isolation and characterization of subcellular protein fractions from mouse heart. Anal. Biochem. 345, 47-54 (2005).
  37. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  38. Yamamura, H., Suzuki, Y., Imaizumi, Y. New light on ion channel imaging by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. J. Pharmacol. Sci. 128, 1-7 (2015).
  39. Wible, B. A., et al. HERG-Lite-R: A novel comprehensive high-throughput screen for drug-induced hERG risk. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 52, 136-145 (2005).
  40. Wilde, A. A. M., Brugada, R. Phenotypical Manifestations of Mutations in the Genes Encoding Subunits of the Cardiac Sodium Channel. Circ. Res. 108, 884-887 (2011).
  41. Milano, A., et al. Sudden Cardiac Arrest and Rare Genetic Variants in the Community. Circ Cardiovasc Genet. , (2016).
  42. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat. Meth. 9, 152-158 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Flow CytometryCell Surface ExpressionTotal Protein ExpressionFluorescent Antibody StainingDNA TransfectiontsA 201 CellsmCherry TaggingHA Epitope DetectionPermeabilized CellsNon Permeabilized Cells

Powiązane artykuły