Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

13K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54732

⸱

28 września 2016

 ,  ,  ,  , 
1Département de Physiologie Moléculaire et Intégrative, Montreal Heart Institute Research Centre, 2Département de Microbiologie, Infectiologie, Immunologie, Centre de recherche de l'Hôpital Maisonneuve-Rosemont

W tym artykule

Podsumowanie

Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.

Streszczenie

Dziedziczne lub de novo mutacje w kanałach selektywnych kationów mogą prowadzić do nagłej śmierci sercowej. Często postuluje się, że zmiana w transporcie błony komórkowej tych wielozakresowych białek transbłonowych, ze zmianą lub bez zmiany w bramkowaniu kanałów, znacząco przyczynia się do tego procesu. W związku z tym kluczowe stało się opracowanie metody ilościowego określania zmiany względnej ekspresji powierzchni komórek w kanałach jonowych serca na dużą skalę. W niniejszym dokumencie przedstawiono szczegółowy protokół w celu określenia względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji komórek sercowych kanałów wapniowych typu L CaV1.2 i podjednostek związanych z błoną w komórkach tsA-201 za pomocą dwukolorowych testów cytometrii fluorescencyjnej. W porównaniu z innymi metodami jakościowymi opartymi na mikroskopii lub immunoblottingu, eksperymenty cytometrii przepływowej są szybkimi, powtarzalnymi i dużymi testami, które dostarczają mierzalnych punktów końcowych na dużych próbkach żywych komórek (w zakresie od 104 do 106 komórek) o podobnych cechach komórkowych w jednym przepływie. Konstrukty zaprojektowano tak, aby konstytutywnie wyrażać mCherry na wewnątrzkomórkowym C-końcu (umożliwiając w ten sposób szybką ocenę całkowitej ekspresji białka) i wyrażać zewnątrzkomórkowy epitop hemaglutyniny (HA) w celu oszacowania ekspresji białek błonowych na powierzchni komórki przy użyciu przeciwciała sprzężonego z fluorescencją anty-HA. Aby uniknąć wyników fałszywie ujemnych, przeprowadzono również eksperymenty w przepuszczalnych komórkach, aby potwierdzić dostępność i prawidłową ekspresję epitopu HA. Szczegółowa procedura zapewnia: (1) projektowanie znakowanych konstruktów DNA (kwasu dezoksyrybonukleinowego), (2) transfekcję konstruktów za pośrednictwem lipidów w komórkach tsA-201, (3) hodowlę, pobieranie i barwienie komórek nieprzepuszczalnych i przepuszczalnych oraz (4) pozyskiwanie i analizę sygnałów fluorescencyjnych. Dodatkowo wyjaśniono podstawowe zasady cytometrii przepływowej oraz szczegółowo omówiono projekt eksperymentu, w tym dobór fluoroforów, miareczkowanie przeciwciała HA i eksperymenty kontrolne. To specyficzne podejście oferuje obiektywną względną kwantyfikację całkowitej i powierzchniowej ekspresji kanałów jonowych, którą można rozszerzyć w celu badania pomp jonowych i transporterów błony plazmatycznej.

Wprowadzenie

Niniejsza praca przedstawia niezawodny test służący do określania względnej ekspresji białek błonowych, takich jak kanały jonowe, na powierzchni komórek rekombinowanych z wykorzystaniem istniejącej technologii cytometrii przepływowej. Kanały jonowe są białkami błonowymi tworzącymi pory, które odpowiadają za kontrolowanie sygnałów elektrycznych poprzez bramkowanie przepływu jonów przez błonę komórkową. Są one klasyfikowane według mechanizmu aktywacji, rodzaju i selektywności gatunków jonów przechodzących przez pory, w których są zlokalizowane. Na poziomie komórkowym i tkankowym makroskopowe strumienie jonowe przez kanały jonowe są wynikiem właściwości biofizycznych (bramkowanie i permeacja), biochemicznych (fosforylacja) oraz biogenezy (synteza, glikozylacja, transport i degradacja)1. Każdy z tych procesów jest unikalny dla każdego rodzaju kanałów jonowych i jest zoptymalizowany tak, aby spełniać fizjologiczną rolę kanału jonowego. W konsekwencji zmiany w którymkolwiek z tych precyzyjnie dostrojonych procesów w wyniku modyfikacji dziedzicznej lub genetycznej, często określane jako „kanalopatia”, mogą być szkodliwe dla homeostazy komórkowej. Należy podkreślić, że dostarczenie „odpowiedniej” ilości kanałów jonowych na powierzchnię komórki jest krytyczne dla homeostazy komórkowej. Nawet niewielkie zwiększenia (gain-of-function) i niewielkie zmniejszenia (loss-of-function) aktywności kanałów jonowych mają potencjał wywoływania poważnych patologii w ciągu całego życia. Defekty w dostarczaniu dojrzałych kanałów jonowych na powierzchnię komórki są istotnym czynnikiem w licznych kanalopatiach, takich jak mukowiscydoza (kanał jonowy CFTR)2 oraz arytmie serca w formie zespołu długiego QT (sercowe kanały potasowe)3.

Kanalopatie są powiązane z nagłym zgonem sercowym4. Obecnie uważa się, że światowa rozpowszechnienie wszystkich kanalopatii serca wynosi co najmniej 1:2,000-1:3,000 osób5 i odpowiadają one za około połowę przypadków nagłej arytmicznej śmierci sercowej6. Dysfunkcje sercowych napięciowo zależnych kanałów jonowych selektywnych dla sodu, potasu i wapnia odgrywają kluczową rolę w tym procesie. Napięciowo zależny kanał wapniowy typu L CaV1.2 jest niezbędny do zainicjowania zsynchronizowanego skurczu mięśnia sercowego. Sercowy kanał CaV1.2 typu L jest wielopodjednostkowym kompleksem białkowym składającym się z głównej podjednostki CaVα1 tworzącej por oraz pomocniczych podjednostek CaVß i CaVα2δ17-12. Należy zauważyć, że pełny zestaw podjednostek pomocniczych jest wymagany do wytworzenia funkcjonalnych kanałów CaV1.2 w błonie plazmatycznej, a dynamiczne oddziaływania między tymi podjednostkami są niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania elektrycznego serca13. CaVß promuje ekspresję kanałów CaV1.2 na powierzchni komórki poprzez niewalencyjne nanomolarne oddziaływanie hydrofobowe14. Koekspresja podjednostki CaVα2δ1 z CaVα1 związanym z CaVß stymuluje ekspresję prądu szczytowego (5- do 10-krotnie) i promuje aktywację kanałów przy bardziej ujemnych napięciach. Mutacje typu gain-of-function podjednostki tworzącej por CaV1.2 powiązano z postacią arytmii komorowych nazywaną zespołem długiego QT15, podczas gdy szereg mutacji punktowych w trzech głównych podjednostkach tworzących kanał CaV1.2 typu L zidentyfikowano u osób cierpiących na arytmie w postaci zespołu krótkiego QT16,17. Kanały jonowe są białkami błonowymi, które można badać z perspektywy biochemicznej (chemia białek) lub za pomocą narzędzi elektrofizjologicznych (aparatura do pomiaru prądów), często stosując te komplementarne podejścia. Elektrofizjologia, w szczególności metoda patch-clamp w konfiguracji whole-cell, jest odpowiednim podejściem do wyjaśnienia funkcji kanałów jonowych15, lecz nie pozwala odróżnić modyfikacji w transporcie białek od zmian w ich właściwościach biofizycznych. Chemia białek ma jednak często ograniczone zastosowanie ze względu na stosunkowo niską ekspresję dużych białek błonowych w porównaniu z mniejszymi białkami rozpuszczalnymi. Niezbędne jest opracowanie niezawodnych metod wysokoprzepustowych z odczytem fluorescencyjnym, aby specyficznie zająć się defektami biogenezy białek powodującymi zmiany w ekspresji kanałów jonowych na powierzchni komórek.

Cytometria przepływowa to technologia biofizyczna wykorzystywana w liczeniu komórek, sortowaniu, detekcji biomarkerów oraz inżynierii białek18. Po wstrzyknięciu do cytometru przepływowego roztworu próbki zawierającego żywe komórki lub cząsteczki, komórki są ustawiane w pojedynczy strumień, który może być badany przez system detekcyjny urządzenia (Rysunek 1). Pierwszy instrument do cytometrii przepływowej, wyprodukowany w 1956 roku19, wykrywał tylko jeden parametr, natomiast nowoczesne cytometry przepływowe posiadają wiele laserów i detektorów fluorescencji, co pozwala na detekcję ponad 30 parametrów fluorescencyjnych20,21. Filtry i lustra (optyka emisyjna) kierują rozproszone światło lub światło fluorescencyjne komórek do sieci elektronicznej (fotodiody i detektorów), która przekształca światło proporcjonalnie do jego intensywności. Dane cyfrowe są analizowane za pomocą specjalistycznego oprogramowania, a główny wynik prezentowany jest w formie wykresu punktowego (dot plot)21.

Układ cytometrii przepływowej z laserami niebieskimi/czerwonymi, kształtowaniem wiązki i PMT do detekcji fluorescencji.
Rycina 1: Biofizyczne zasady sortowania w cytometrii przepływowej. Pojedyncze komórki są przepychane przez dyszę pod wysokim ciśnieniem w strumieniu płynu osłaniającego, który przesuwa je przez jeden lub więcej punktów przesłuchania laserowego. Wiązka światła jest odchylana przez przechodzące komórki, a światło zbierane w kierunku przednim (rozproszenie przednie, FCS) jest przesyłane do fotodiody, która przekształca światło w sygnał proporcjonalny do wielkości komórki. Światło jest również zbierane pod kątem 90° względem ścieżki lasera i przesyłane do detektorów (zwanych również fotopowielaczami (PMT)). Światło to jest kierowane przez lustra dichroiczne, które umożliwiają detekcję sygnału rozproszenia bocznego (SSC), odzwierciedlającego ziarnistość wewnątrz komórek, oraz emisji fluorescencyjnych, jeśli w komórce obecne są wzbudzone fluorochromy. Trzy detektory (zielony, żółty i czerwony) są reprezentowane przez różne filtry pasmowe, co pozwala na jednoczesną detekcję różnych fluorochromów. Różne sygnały są cyfryzowane przez zewnętrzny komputer i przekształcane w dane, które zostaną przeanalizowane w celu ilościowego określenia charakterystyki komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wysoka przepustowość cytometrów przepływowych została wykorzystana do ilościowego określenia względnej ekspresji błonowej rekombinowanych kanałów wapniowych typu L CaV1.2 i powiązanych z nimi podjednostek, zarówno w wersji dzikiej, jak i w wariantach z zaburzeniem transportu wewnątrzkomórkowego, w żywych komórkach. Konstrukcje cDNA kodujące białka zostały podwójnie oznakowane, aby jednocześnie posiadały pozakomórkowy niefluorescencyjny epitop, który może być wykrywany przez nieprzenikające przez błonę przeciwciało koniugowane z fluorophorem, oraz wewnątrzkomórkowy fluorofor o stałej fluorescencji. Zarówno epitop pozakomórkowy, wstawiony w pętlę pozakomórkową białka, jak i fluorofor wewnątrzkomórkowy, wstawiony za końcem C, są translądowane wraz z białkiem. W tej serii doświadczeń białko CaVα2δ1 zostało zmodyfikowane tak, aby wyrażało pozakomórkowy epitop hemaglutyniny (HA) (YPYDVPDYA), wykrywany przez nieprzenikające przeciwciało anty-HA koniugowane z FITC (izotiocyjanianem fluoresceiny), oraz mCherry jako wewnętrzny fluorofor wewnątrzkomórkowy. Aby określić względny poziom ekspresji białka mCherry-CaVα2δ1 z tagiem HA na powierzchni komórki, rekombinowane komórki wyrażające białko fuzyjne zostały zebrane po transfekcji i zabarwione mysim monoklonalnym przeciwciałem anty-epitopowym przeciwko tagowi HA koniugowanym z FITC (Rysunek 2). FITC jest organicznym związkiem fluorescencyjnym, który jest znacznie mniejszy niż reportery enzymatyczne, a zatem z mniejszym prawdopodobieństwem zakłóca funkcje biologiczne. mCherry-CaVα2δ1-HA nadekspresjonowane w komórkach tsA-201 powoduje znaczący 3-log wzrost fluorescencji FITC i fluorescencji mCherry na wykresach dwuwymiarowych22. Biorąc pod uwagę, że epitop HA znajduje się w części pozakomórkowej białka, natężenie fluorescencji FITC uzyskane w obecności nienaruszonych komórek odzwierciedla względny indeks ekspresji białka z tagiem HA na powierzchni komórki. Dostępność epitopu HA w konstrukcjach jest systematycznie walidowana poprzez pomiar sygnału FITC po permeabilizacji komórek. Pomiar ten służy również do potwierdzenia znormalizowanej całkowitej ekspresji białka, ponieważ względne natężenia fluorescencji FITC oszacowane w komórkach permeabilizowanych są jakościowo porównywalne z względnymi wartościami fluorescencji mCherry zmierzonymi w warunkach permeabilizowanych i niepermeabilizowanych22,23. Należy zauważyć, że wewnętrzne widmo fluorescencji przesuwa się w stronę wyższych wartości po permeabilizacji, jednak jedyną raportowaną wartością jest zmiana natężenia fluorescencji w porównaniu z konstrukcją kontrolną. Względne zmiany natężenia fluorescencji dla konstrukcjami testowych są szacowane przy użyciu wartości ΔMean Fluorescence Intensity (ΔMFI) dla każdego fluoroforu (mCherry lub FITC). Doświadczenia zostały zaprojektowane tak, aby mierzyć natężenie fluorescencji konstrukcji testowej w stosunku do natężenia fluorescencji konstrukcji kontrolnej wyrażanej w tych samych warunkach, co pozwala ograniczyć zmienność eksperymentalną wewnętrznej fluorescencji przeciwciała koniugowanego z fluoroforem. Za pomocą tego testu pomyślnie przebadano dwa białka błonowe: podjednostkę tworzącą por kanału wapniowego typu L sterowanego napięciem CaV1.214,22, a w innej serii doświadczeń, pozakomórkową podjednostkę pomocniczą CaVα2δ122,23. Poniższy protokół został zastosowany do określenia ekspresji powierzchniowej podjednostki CaVα2δ1 kardiologicznego kanału typu L CaV1.2 w warunkach kontrolnych oraz po wprowadzeniu mutacji wpływających na modyfikacje potranslacyjne kanału jonowego. W standaryzowanych warunkach eksperymentalnych fluorescencja FITC na powierzchni komórki wzrasta quasi-liniowo wraz z ekspresją cDNA kodującego białka mCherry-CaVα2δ1-HA (Rysunek 5 z referencji22).

Schemat procesu transfekcji komórek; permeabilizacja, barwienie, cytometr przepływowy, analiza danych.
Rysunek 2: Schematyczne przedstawienie całkowitego i błonowego znakowania w protokole eksperymentalnym z użyciem cytometrii przepływowej. Schemat przedstawia główne kroki niezbędne do ilościowego oznaczenia względnej całkowitej ekspresji oraz ekspresji na powierzchni komórki rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki tsA-201 są transfektowane konstruktem z podwójnym znacznikiem mCherry-CaVα2δ1-HA (1), a następnie barwione przed lub po permeabilizacji (2). Dane wieloparametrowe są pozyskiwane w cytometrze przepływowym (3) w celu przeprowadzenia analizy wielowymiarowej (4). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Konstrukcje DNA z podwójnym znacznikiem

  1. Wprowadź epitop HA (YPYDVPDYA) do zewnątrzkomórkowego łącznika CaVα2δ1 pomiędzy pozycjami D676 i R677 za pomocą mutagenezy ukierunkowanej (Rycina 3B)20. Wykorzystaj starter Forward gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC oraz starter Reverse acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC.
  2. Subklonuj sekwencję cDNA znakowanego HA CaVα2δ1 do ssaczego wektora ekspresyjnego pmCherry-N1, zaprojektowanego do ekspresji białka połączonego z N-końcem mCherry, pomiędzy miejscami SacI i SalI (Rycina 3B)20.
    UWAGA: Należy przetestować odpowiednią funkcję kanału przy użyciu konstrukcji kontrolnej, stosując standardowe metody elektrofizjologiczne24.

2. Przejściowa transfekcja za pomocą liposomów (30 min, wszystkie etapy są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza)

  1. Dzień 1: Wysiać pół miliona komórek tsA-201 (lub HEKT) w naczyniach hodowlanych o średnicy 35 mm w 2 mL pożywki DMEM-HG (Dulbecco's high-glucose minimum essential medium) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny i streptomycyny (PS). Policzyć komórki przy użyciu standardnego komory licznikowej (hemacytometru). Ocenić żywotność komórek w części próbki za pomocą błękitu trypanu. Wysiać odpowiednią liczbę komórek, aby osiągnąć 90% konfluencji w momencie transfekcji.
  2. Dzień 2: Wymienić pożywkę hodowlaną na 2 ml świeżej, uprzednio ogrzanej (37 °C) pożywki bez PS.
  3. Dla każdej próbki do transfekcji przygotować dwie probówki o pojemności 1,5 ml. W probówce 1 rozpuścić 4 µg DNA w 250 µl pożywki z obniżoną zawartością surowicy. W probówce 2 zmieszać 10 µl odczynnika do transfekcji liposomalnej z 250 µl pożywki z obniżoną zawartością surowicy. Przed użyciem delikatnie wymieszać odczynnik do transfekcji.
  4. Inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  5. Połączyć zawartości probówki 1 i probówki 2, delikatnie wymieszać i inkubować przez co najmniej 20 min w temperaturze pokojowej.
  6. Dodać kompleksy liposomów/DNA do hodowanych komórek i delikatnie potrząsać naczyniem hodowlanym, aby wymieszać zawartość.
  7. Inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 24 hr.

3. Barwienie komórek do cytometrii przepływowej (3 godz.)

  1. Przygotowanie próbek komórek
    1. Dzień 3: Ostrożnie usuń medium z naczynia hodowlanego i przemyj komórki 400 µl podgrzanej (37 °C) 0,05% trypsyny-1x EDTA (kwasu etylenodiaminotetraoctowego).
    2. Dodaj 400 µl trypsyny-EDTA i inkubuj naczynie w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 5 min, aby umożliwić odklejenie się komórek od dna naczynia.
    3. Zatrzymaj trawienie enzymatyczne, dodając 1 ml zimnego medium hodowlanego bez PS, a następnie wypłucz wszystkie komórki z powierzchni, delikatnie pipetując 4-5 razy. Unikaj nadmiernego trawienia i zbyt częstego pipetowania, aby ograniczyć śmierć komórek.
    4. Zbierz komórki do probótek 1,5 ml i natychmiast umieść je na lodzie. Używaj lodowatych roztworów i utrzymuj komórki w temperaturze 4 °C, aby zapobiec internalizacji antygenów powierzchniowych. Zmniejsz oświetlenie, aby ograniczyć fotoblaknięcie sygnału fluorescencyjnego.
    5. Wirowuj probótki przy 400 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odessij i odrzuć nadsącz.
    6. Resuspenduj osad w 1 ml 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), aby przygotować zawiesinę pojedynczych komórek.
    7. Krótko i bardzo delikatnie wymieszaj probótki na wirówce typu vortex i powtórz kroki 3.1.5 oraz 3.1.6, aby całkowicie usunąć medium hodowlane.
    8. Resuspenduj osad w 600 µl 1x PBS i dostosuj stężenie komórek do minimum 3 x 106 komórek/ml.
    9. Podziel komórki do dwóch nowych probótek 1,5 ml w celu barwienia zewnątrzkomórkowego i wewnątrzkomórkowego. Uwzględnij odpowiednie kontrole, aby odróżnić barwienie specyficzne od niespecyficznego.
      UWAGA: Przeciwciało kontrolne izotypowe pomaga ocenić poziom tła i idealnie powinno odpowiadać gatunkowi gospodarza, izotypowi i fluoroforowi każdego przeciwciała pierwszorzędowego. Używaj kontroli izotypowej i przeciwciała koniugowanego w tym samym stężeniu białka.

Tabela barwienia przeciwciałami po transfekcji komórek; kontrole i wyniki kolorystyczne dla analizy ekspresji białka HA.
Tabela 1: Próbki kontrolne w eksperymencie cytometrii przepływowej dla komórek niepermeabilizowanych i permeabilizowanych. Każdy eksperyment musi obejmować następujące kontrole negatywne: (1) komórki nietransfekowane (bez przeciwciała, z przeciwciałem izotypowym lub z przeciwciałem koniugowanym). (2) komórki transfekowane białkiem docelowym subklonowanym w plazmidzie bez konstytutywnego wewnątrzkomórkowego fluorochromu fluorescencyjnego (pCMV- CaVα2δ1-HA) lub z konstrukcją z podwójnym tagiem (pmCherry-CaVα2δ1), inkubowane bez przeciwciała, z przeciwciałem izotypowym lub z przeciwciałem koniugowanym. Kontrole jednobarwne są stosowane do kompensacji nakładania się emisji fluorochromów. Te same kontrole są wykonywane dla warunków niepermeabilizowanych i permeabilizowanych w każdej serii eksperymentów.

  1. Barwienie powierzchni komórek w nienaruszonych żywych komórkach
    1. Odpowiednio odmierzyć 1 x 106 komórki/100 µl w probówkach o pojemności 1,5 ml.
    2. Dodaj przeciwciało monoklonalne anty-HA sprzężone z FITC w 5 µg/ml następnie wymieszać w wirówce typu vortex przed inkubacją komórek na platformie kołyszącej (200 obr./min) w ciemności w temperaturze 4 °C przez 45 min.
      UWAGA: Optymalne stężenie przeciwciał określono w wstępnych eksperymentach miareczkowania (Rycina 4).
    3. Wyjąć komórki z ciemności i dodać 900 µl 1x PBS/probówkę. Centryfuguj przy 400 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
    4. Odssać nadsącz i resuspender osad w 1 ml 1x PBS, wymieszać na vortexie, a następnie wirować z prędkością 400 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
    5. Powtórz płukanie (krok 3.2.4) dwukrotnie, aby usunąć niewiążące się przeciwciała. W przypadku użycia nieznakowanego przeciwciała pierwszorzędowego przeprowadź inkubację z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym.
    6. Po ostatnim przemyciu ponownie zawiesić komórki w 500 µl 1x PBS i przenieść zawiesinę pojedynczych komórek do probówek do cytometrii przepływowej o pojemności 5 ml. Przechowywać komórki w ciemności w temperaturze 4 °C do momentu analizy próbki.
    7. Przeanalizuj próbki za pomocą cytometru przepływowego. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy przeprowadzić analizę komórek w cytometrze przepływowym jak najszybciej, nie później niż 24 godziny po przygotowaniu.
  2. Barwienie wewnątrzkomórkowe: fiksacja, permeabilizacja i barwienie
    1. Odpowiednia objętość 1 x 106 komórki/100 µl w probówkach 1,5 ml i odwiruj przy 400 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
    2. Odrzucić nadsącz i resuspendować komórki w 100 µl roztworu do fiksacji i permeabilizacji bezpośrednio ze stoku.
    3. Inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 20 min.
    4. Dodaj 100 µl świeżo przygotowanego 1x buforu do permeabilizacji i płukania (rozcieńczyć 10x bufor do permeabilizacji i płukania w destylowanej wodzie H2O)2O). Wymieszać próbki w wirówce typu vortex, a następnie odwirować w wirówce stołowej z przyspieszeniem 400 x g przez 5 min w temp. 4 °C.
    5. Odssać i usunąć nadsącz.
    6. Powtórz kroki 3.3.4 i 3.3.5.
    7. Dodaj przeciwciało monoklonalne anty-HA sprzężone z FITC w ilości 5 µg/ml w 100 µl buforu do permeabilizacji i płukania 1x, a następnie wymieszać w wstrząsarze wirowym (vortex) przed inkubacją komórek w ciemności w temperaturze 4 °C przez 30 min.
      UWAGA: Barwienie wewnątrzkomórkowe przeprowadza się zgodnie z tą samą procedurą, która jest stosowana do barwienia powierzchni komórek. Należy jednak pamiętać, że permeabilizacja komórek za pomocą saponiny jest procesem szybko odwracalnym, dlatego ważne jest zastąpienie 1x PBS buforem 1x Perm/Wash, aby zapewnić stałą obecność saponiny podczas barwienia wewnątrzkomórkowego.
    8. Wyjąć komórki z ciemności i dodać 100 µl bufor do permeabilizacji i płukania. Wirować z prędkością 400 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C.
    9. Ostrożnie odessaj nadsącz i resuspenduj osad w 100 µl bufor do permeabilizacji i płukania, wymieszać na wortexie i wirować przy 400 x g przez 5 min w 4 °C.
    10. Powtórzyć płukanie (krok 3.3.9) jeszcze raz, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała.
    11. Po końcowym płukaniu resuspendować komórki w 500 µl 1x PBS i przenieść zawiesinę pojedynczych komórek do probówek do cytometrii przepływowej o pojemności 5 ml. Przechowywać komórki w ciemności w temperaturze 4 °C do momentu wstrzyknięcia próbki do cytometru przepływowego.
    12. Przeanalizuj próbki za pomocą cytometru przepływowego. Próbki utrwalone należy poddać analizie jak najszybciej, nie później niż tydzień po barwieniu. Komórki niepermeabilizowane oraz permeabilizowane należy analizować tego samego dnia.

4. Cytometria przepływowa

  1. Codzienne przygotowanie sortera komórek do cytometrii przepływowej
    1. Uruchom oprogramowanie do cytometrii przepływowej. Przed eksperymentem skalibruj i przygotuj sorter komórek do cytometrii przepływowej, aby zapewnić optymalną sprawność instrumentu (t.j. działanie lasera i optyki zgodnie ze specyfikacją, prawidłowe wyrównanie lasera i celi przepływowej), używając kulek kalibracyjnych do konfiguracji instrumentu.
    2. Użyj dyszy 100 µm przy ciśnieniu osłonki 20 psi.
      UWAGA: W przypadku stacjonarnego cytometru przepływowego wymiana dyszy nie jest konieczna.
    3. Ustaw szybkość przepływu cytometru zgodnie ze specyfikacją producenta. Nadmiernie wysoka szybkość przepływu zmniejszy czułość w detekcji zmienności fluorescencji.
    4. Wybierz lasery niebieski (488 nm do wzbudzenia izotiocyjanianu fluoresceiny lub FITC) i żółto-zielony (561 nm do wzbudzenia mCherry). Zbieraj poziomy fluorescencji FITC i mCherry odpowiednio za pomocą filtrów pasmowych 530/30 nm i 610/20 nm.
    5. Pozyskaj wykres kropkowy rozpraszania w przód (FSC) względem rozpraszania bocznego (SSC) dla niebarwionych komórek w skali liniowej. Dostosuj wzmocnienie każdego detektora, aby zwizualizować komórki w dolnym lewym kwadrancie wykresu kropkowego.
  2. Odczyt próbek nienaruszonych komórek niepermeabilizowanych
    1. Ustaw bramkę P1 dla żywych komórek niepermeabilizowanych, wyznaczając obszar o dowolnym kształcie wokół analizowanych komórek, z wyłączeniem debris i agregatów komórkowych, ograniczając tym samym sygnał fluorescencji do nienaruszonych komórek.
      UWAGA: Do ułatwienia rozmieszczenia bramki na żywych komórkach można użyć barwników wykluczających komórki martwe. Ustaw rejestrację 10 000 zdarzeń w bramce zatrzymującej P1. W razie potrzeby ustaw większą liczbę zdarzeń.
    2. Pozyskaj dwuparametryczny wykres konturowy mCherry względem FITC, aby wykryć bazową autofluorescencję niebarwionych komórek. Użyj skali bi-logarytmicznej, aby pokazać wartości ujemne i poprawić rozdzielczość między populacjami25. Dostosuj napięcie każdego detektora, aby ustawić niebarwione komórki ujemne w dolnej części pierwszych dziesięciu jednostek wykresów logarytmicznej intensywności fluorescencji.
    3. Pozyskaj wszystkie nienaruszone próbki niepermeabilizowane, korzystając z ustawień ustalonych w punktach 4.1.5 i 4.1.6, i zbierz sygnały FSC, SSC oraz sygnały w detektorach fluorescencji.
    4. Wyeksportuj i zapisz pliki *.fcs, które zostaną wykorzystane do analizy za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.
  3. Odczyt próbek komórek permeabilizowanych
    1. Przesuń bramkę P1, aby wybrać żywe komórki w próbkach permeabilizowanych, i dostosuj napięcia FSC i SSC, jak pokazano w punktach 4.1.5 i 4.1.6.
    2. Pozyskaj wszystkie próbki permeabilizowane i zbierz sygnały FSC, SSC oraz sygnały w detektorach fluorescencji.
    3. Wyeksportuj i zapisz pliki *.fcs, które zostaną wykorzystane do analizy za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.
  4. Analiza danych
    1. Uruchom oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej i zaimportuj pliki *.fcs zapisane w punktach 4.2.4 i 4.3.3.
    2. Kliknij pierwszą próbkę wymienioną w oknie obszaru roboczego. Automatycznie otworzy się nowe okno nazwane zgodnie z numerem identyfikacyjnym probówki. Rozpocznij proces bramkowania na wykresie SSC względem FSC. Narysuj bramkę (P1) za pomocą ikony elipsy wokół żywych komórek i wyeliminuj wszelki debris, martwe komórki lub agregaty, które mają inne rozpraszanie w przód i rozpraszanie boczne niż żywe komórki.
    3. Aby narysować dwuparametryczny wykres konturowy intensywności fluorescencji mCherry (oś y) względem FITC (oś x) dla żywych komórek, kliknij najpierw w oś x i wybierz kanał FITC-A, a następnie kliknij w oś y i wybierz kanał PE-mCherry-A. Kliknij ikonę „Quad”, aby ustawić marker kwadrantów na krawędzi komórek autofluorescencyjnych w każdym kanale fluorescencji.
      UWAGA: Bramka ustawiona wokół komórek dodatnich dla FITC i mCherry to bramka P2. Populacja komórek ujemnych pod względem fluorescencji jest określana jako bramka P3. Reprezentatywną metodę bramkowania zastosowaną w tym artykule przedstawiono na Rysunku 5.
    4. Wybierz bramki P2 i P3, a następnie kliknij ikonę „Add Statistics” w oryginalnym oknie obszaru roboczego. Z listy opcji kliknij „Count” (liczba komórek dodatnich) oraz kliknij statystykę „Mean” (średnia intensywność fluorescencji każdego fluorochromu) lub „Median” (mediana intensywności fluorescencji każdego fluorochromu). Ponownie kliknij ikonę „Add Statistics”. Wszystkie te wartości zostaną automatycznie przeniesione do oryginalnego okna obszaru roboczego.
      UWAGA: Wartość „Mean” jest stosowana tylko wtedy, gdy intensywność fluorescencji ma rozkład normalny. W każdym innym przypadku kliknij zakładkę „Median”. MFI może zatem odnosić się do średniej intensywności fluorescencji (Mean Fluorescence Intensity) lub mediany intensywności fluorescencji (Median Fluorescence Intensity).
      UWAGA: Następnym krokiem jest zastosowanie parametrów i statystyk bramek do wszystkich próbek badanych przez cytometr.
    5. W oknie obszaru roboczego przeciągnij za pomocą myszy bramki i parametry statystyczne na linię oznaczoną jako ALL SAMPLES.
    6. Wygeneruj raport zbiorczy dwuwymiarowych wykresów konturowych (mCherry vs FITC) i histogramów (liczba komórek względem intensywności fluorescencji) dla komórek niepermeabilizowanych i permeabilizowanych (Rysunki 6A-B).
    7. Na podstawie statystyk wygenerowanych w kroku 4.4.4 oblicz średnią intensywność fluorescencji (MFI) dla każdego fluorochromu dla komórek barwionych. Od tej wartości odejmij wartość MFI uzyskaną dla komórek niebarwionych, aby określić poziom ekspresji powierzchniowej i całkowitej badanego białka.
    8. Przedstaw wartości ΔMFI dla każdego fluoroforu (mCherry i FITC) (Rysunek 6C-D). Znormalizuj ΔMFI zmierzone dla mutantów konstruktu CaVα2δ1 do wartości ΔMFI uzyskanej dla FITC i mCherry z konstruktem WT.
      UWAGA: Bezwzględna wartość intensywności fluorescencji może znacząco różnić się w zależności od partii przeciwciał i umiejętności technicznych każdego pracownika laboratorium, stąd konieczność normalizacji intensywności fluorescencji konstruktu mutanta przy użyciu konstruktu WT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejszy artykuł opisuje niezawodny protokół do ilościowego oznaczania całkowitej oraz powierzchniowej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych w komórkach tsA-201 za pomocą dwukolorowej analizy cytometrii przepływowej. Jako przykład określono względną ekspresję białka całkowitego i powierzchniowego dla podjednostki CaVα2δ1. Aby przeprowadzić dwukolorową analizę cytometrii przepływowej, podjednostkę CaVα2δ1 podwójnie oznakowano, aby wyrażała zewnątrzkomórkowy nief...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten test oparty na cytometrii przepływowej został z powodzeniem zastosowany do pomiaru względnych poziomów całkowitych i powierzchni komórek znakowanych fluorescencyjnie porów tworzących pory i powiązanych podjednostek kanałów wapniowych bramkowanych napięciem14,22,26. Najlepiej sprawdza się przy badaniu wpływu mutacji genetycznych, a zatem wymaga, aby wewnętrzna intensywność fluorescencji znakowanego fluorescencyjnie konstruktu typu dzikiego znakowanego była co najmniej 10 do 100 razy większa niż w przypadku ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy Panu Serge'owi Sénéchalowi i Dr. Jacques'owi Thibodeau za podzielenie się swoją wiedzą i udzielenie nam dostępu do ich platformy do cytometrii przepływowej i sortowania komórek. Prace te zostały zrealizowane dzięki grantowi operacyjnemu 130256 z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem, grantowi z Canadian Heart and Stroke Foundation oraz wsparciu z "Fondation de l'Institut de Cardiologie de Montréal" dla L.P.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Q5 Zestaw do mutagenezy ukierunkowanejna miejsce New England BiolabsE0554SMożna zastąpić zestawem mutagenezy ukierunkowanej na miejsce QuickChange (Agilent, #200523).
Probówki 1,5 mlSarstedt72-690-001
Probówki 15 ml Sarstedt  62-554-002
Jednorazowe pipety przepływowe z podziałką VWR160001-192 
Naczynie hodowlane 100 mmCorning430167Do standardowej hodowli komórek HEKT.
Naczynie hodowlane 35 mmFalcon353001Do standardowej hodowli komórek HEKT.
Pipeta serologiczna 1 mlSarstedt86.1251.001
Pipeta serologiczna 5 mlSarstedt86.1253.001
Pipeta serologiczna 10 mlSarstedt86.1254.001
Pipeta serologiczna 25 mlSarstedt86.1285.001
Dulbecco's high-glucosemedium Life Technologies12100-046Warm in 37 & Stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.
Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, inaktywowana termicznie, pochodzenie amerykańskieLife Technologies16140-071
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Life Technologies15140-122
Lipofektamina 2000 Life Technologies11668-019Do transfekcji liposomalnej. Można zastąpić transfekcją fosforanu wapnia.
Opti-MEM I Zredukowane Technologie Średniej Żywotności w Surowicy31985-070Ciepłe w 37 & stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem.
Trypsyna-EDTA (1x) 0,05%, czerwień fenolowaLife Technologies25300-062
1,5 ml mikroprobówkiSarstedt72.690.001
  Sól fizjologiczna buforowana fosforanami 1xFisherBP661-10Może być "domowej roboty".
Przeciwciało sprzężone anty-HA FITCSigmaH7411
IgG1− Przeciwciało kontrolujące izotyp FITCSigmaF6397
BD Cytofix/Cytoperm Zestaw roztworów do utrwalania/permeabilizacjiBD Biosciences554714Utrwalanie/Permeabilizacja. Roztwór przepuszczalny/myjący, przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
HemacytometrFisher49105161
Trypan BlueFisher15250061Aby uzyskać dostęp do żywotności komórek.
Mikrowirówka z chłodzeniem, 5430REppendorf 
Forma Steri-Cycle CO2 InkubatorFisher370
Platforma laboratoryjna RockerFisher545034
Kąpiel wodnaVWR89032-216
BD FACSARIA III BD Biosciences648282Cytometr przepływowy.
Oprogramowanie FlowJo v10FlowJoFlowJo v10 DongleDo analizy danych.
A14H172200

Bibliografia

  1. Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking. Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).
  2. Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. Correctors of the basic trafficking defect of the mutant F508del-CFTR that causes cystic fibrosis. Curr Opin Chem Biol. 17, 353-360 (2013).
  3. Balijepalli, S. Y., Anderson, C. L., Lin, E. C., January, C. T. Rescue of Mutated Cardiac Ion Channels in Inherited Arrhythmia Syndromes. J. Cardiovas Pharm. 56, 113-122 (2010).
  4. Gargus, J. J. Unraveling Monogenic Channelopathies and Their Implications for Complex Polygenic Disease. Am. J. Hum. Genet. 72, 785-803 (2003).
  5. Abriel, H., Zaklyazminskaya, E. V. Cardiac channelopathies: Genetic and molecular mechanisms. Gene. 517, 1-11 (2013).
  6. Behr, E. R., et al. Sudden arrhythmic death syndrome: familial evaluation identifies inheritable heart disease in the majority of families. Eur Heart J. 29, 1670-1680 (2008).
  7. Catterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell Dev.Biol. 16, 521-555 (2000).
  8. Peterson, B. Z., DeMaria, C. D., Adelman, J. P., Yue, D. T. Calmodulin is the Ca2+ sensor for Ca2+ -dependent inactivation of L- type calcium channels. Neuron. 22, 549-558 (1999).
  9. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr.Opin.Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  10. Dai, S., Hall, D. D., Hell, J. W. Supramolecular assemblies and localized regulation of voltage-gated ion channels. Physiol Rev. 89, 411-452 (2009).
  11. Gao, T., et al. Identification and subcellular localization of the subunits of L-type calcium channels and adenylyl cyclase in cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 272, 19401-19407 (1997).
  12. Carl, S. L., et al. Immunolocalization of sarcolemmal dihydropyridine receptor and sarcoplasmic reticular triadin and ryanodine receptor in rabbit ventricle and atrium. J. Cell Biol. 129, 673-682 (1995).
  13. Abriel, H., Rougier, J. S., Jalife, J. Ion Channel Macromolecular Complexes in Cardiomyocytes: Roles in Sudden Cardiac Death. Circ. Res. 116, 1971-1988 (2015).
  14. Bourdin, B., et al. Molecular Determinants of the Cavb-induced Plasma Membrane Targeting of the Cav1.2 Channel. J. Biol. Chem. 285, 22853-22863 (2010).
  15. Raybaud, A., et al. The Role of the GX9GX3G Motif in the Gating of High Voltage-activated Calcium Channels. J. Biol. Chem. 281, 39424-39436 (2006).
  16. Burashnikov, E., et al. Mutations in the cardiac L-type calcium channel associated with inherited J-wave syndromes and sudden cardiac death. Heart Rhythm. 7, 1872-1882 (2010).
  17. Hennessey, J. A., et al. A CACNA1C Variant Associated with Reduced Voltage-Dependent Inactivation, Increased Cav1.2 Channel Window Current, and Arrhythmogenesis. PLoS ONE. 9, e106982(2014).
  18. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).
  19. Graham, M. D. The Coulter Principle: Foundation of an Industry. J. Lab. Autom. 8, 72-81 (2003).
  20. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243, 77-97 (2000).
  21. Rothe, G. Cellular Diagnostics. Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Sack, U., Tarnok, A., Rothe, G. , Karger. Basel. 53-88 (2009).
  22. Bourdin, B., et al. Functional Characterization of Cavalpha2delta Mutations Associated with Sudden Cardiac Death. J. Biol. Chem. 290, 2854-2869 (2015).
  23. Tetreault, M. P., et al. Identification of glycosylation sites essential for surface expression of the Cavalpha2delta1 subunit and modulation of the cardiac Cav1.2 channel activity. J. Biol. Chem. 291, 4826-4843 (2016).
  24. Senatore, A., Boone, A. N., Spafford, J. D. Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells. J Vis Exp. (47), (2011).
  25. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat.Immunol. 7, 681-685 (2006).
  26. Shakeri, B., Bourdin, B., Demers-Giroux, P. O., Sauve, R., Parent, L. A quartet of Leucine residues in the Guanylate Kinase domain of Cavbeta determines the plasma membrane density of the Cav2.3 channel. J Biol Chem. 287, 32835-32847 (2012).
  27. Morton, R. A., Baptista-Hon, D. T., Hales, T. G., Lovinger, D. M. Agonist- and antagonist-induced up-regulation of surface 5-HT3A receptors. Br. J. Pharmacol. 172, 4066-4077 (2015).
  28. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetracysteine-tagged proteins in intact cells. Nat. Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  29. Cockcroft, C. J. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. Totowa, NJ. 233-241 (2013).
  30. Gonzalez-Gutierrez, G., Miranda-Laferte, E., Neely, A., Hidalgo, P. The Src Homology 3 Domain of the beta-Subunit of Voltage-gated Calcium Channels Promotes Endocytosis via Dynamin Interaction. J. Biol.Chem. 282, 2156-2162 (2007).
  31. Galizzi, J. P., Borsotto, M., Barhanin, J., Fosset, M., Lazdunski, M. Characterization and photoaffinity labeling of receptor sites for the Calcium channel inhibitors d-cis-diltiazem, (+/-)-bepridil, desmethoxyverapamil, and (+)-PN 200-110 in skeletal muscle transverse tubule membranes. J. Biol.Chem. 261, 1393-1397 (1986).
  32. Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiol.Rev. 80, 555-592 (2000).
  33. Sigworth, F. J. The variance of sodium current fluctuations at the node of Ranvier. J Physiol. 307, 97-129 (1980).
  34. Bailey, M. A., Grabe, M., Devor, D. C. Characterization of the PCMBS-dependent modification of KCa3.1 channel gating. J. Gen. Physiol. 136, 367-387 (2010).
  35. Fletcher, P. A., Scriven, D. R., Schulson, M. N., Moore, E. D. Multi-Image Colocalization and Its Statistical Significance. Biophys. J. 99, 1996-2005 (2010).
  36. Lizotte, E., Tremblay, A., Allen, B. G., Fiset, C. Isolation and characterization of subcellular protein fractions from mouse heart. Anal. Biochem. 345, 47-54 (2005).
  37. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  38. Yamamura, H., Suzuki, Y., Imaizumi, Y. New light on ion channel imaging by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. J. Pharmacol. Sci. 128, 1-7 (2015).
  39. Wible, B. A., et al. HERG-Lite-R: A novel comprehensive high-throughput screen for drug-induced hERG risk. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 52, 136-145 (2005).
  40. Wilde, A. A. M., Brugada, R. Phenotypical Manifestations of Mutations in the Genes Encoding Subunits of the Cardiac Sodium Channel. Circ. Res. 108, 884-887 (2011).
  41. Milano, A., et al. Sudden Cardiac Arrest and Rare Genetic Variants in the Community. Circ Cardiovasc Genet. , (2016).
  42. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat. Meth. 9, 152-158 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspresja powierzchniowa komórkicałkowita ekspresja białkafluorescencyjne barwienie przeciwciałamitransfekcja DNAkomórki tsA-201znakowanie mCherrydetekcja epitopu HAkomórki permeabilizowanekomórki niepermeabilizowane
Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.