Artykuł metodologiczny

Zastosowanie wkładu filtracyjnego do filtracji próbek wody i ekstrakcji środowiskowego DNA

DOI:

10.3791/54741

⸱

25 listopada 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ecology and Environmental Sciences, Natural History Museum and Institute, Chiba, 2Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 3Faculty of Science and Technology, Ryukoku University, 4Okinawa Churashima Research Center, 5Graduate School of Simulation Studies, University of Hyogo

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół filtracji próbek wody za pomocą wkładu filtrującego i ekstrakcji środowiskowego DNA (eDNA) bez konieczności rozcinania obudowy w celu wyjęcia filtra. Protokół ten został opracowany do metabarkodowania eDNA ryb, ale ma również zastosowanie do eDNA z innych organizmów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie badania wykazały, że wykorzystanie środowiskowego DNA (eDNA) od ryb jest odpowiednie jako nieinwazyjne narzędzie do monitorowania. W większości tych badań wykorzystano filtry z włókien dyskowych do zbierania eDNA z próbek wody, chociaż w wielu badaniach mikrobiologicznych w środowiskach wodnych wykorzystano wkłady filtracyjne, ponieważ wkład ma tę zaletę, że mieści duże ilości wody i jest ogólnie łatwy w użyciu. W tym miejscu udostępniamy protokół filtracji próbek wody za pomocą wkładu filtracyjnego i ekstrakcji eDNA z filtra bez konieczności rozcinania obudowy. Główne części tego protokołu obejmują: 1) filtrację próbek wody (objętości wody ≤4 l lub >4 l); (2) ekstrakcja DNA z filtra za pomocą wytrząsarki rolkowej umieszczonej we wstępnie podgrzanym inkubatorze; oraz (3) oczyszczanie DNA przy użyciu komercyjnego zestawu. Za pomocą tego i poprzednio stosowanych protokołów przeprowadzamy analizę metabarcodingową eDNA pobranego z ogromnego zbiornika akwariowego (7 500 m3) o znanym składzie gatunkowym i pokazujemy liczbę wykrytych gatunków w bibliotece z dwóch protokołów jako reprezentatywne wyniki. Protokół ten został opracowany do metabarkodowania eDNA ryb, ale ma również zastosowanie do eDNA z innych organizmów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Środowiskowe DNA (eDNA) w środowisku wodnym odnosi się do materiału genetycznego znajdującego się w słupie wody. Ostatnie badania wykazały przydatność eDNA do wykrywania ryb z różnych środowisk wodnych, w tym stawów1-3, rzek4-8, strumieni9 i wody morskiej10-14. Większość z tych badań koncentrowała się na wykrywaniu pojedynczego lub kilku inwazyjnychgatunków 1,4-6,8,14 oraz rzadkich lub zagrożonych3,9, podczas gdy niektóre ostatnie badania próbowały jednoczesnego wykrywania wielu gatunków w lokalnych zbiorowiskach ryb7,9,12,13,15 i mezokosmosach11,12.

Drugie podejście nazywa się "metabarcoding", a metabarcoding eDNA wykorzystuje jeden lub wiele zestawów starterów PCR do koamplifikacji regionu genu w taksonomicznie zróżnicowanych próbkach. Następnie następuje przygotowanie biblioteki z indeksowaniem i dodawaniem adapterów, a indeksowane biblioteki są analizowane przez platformę sekwencjonowania równoległego o wysokiej przepustowości. Ostatnio Miya i wsp.Firma 12 opracowała uniwersalne startery PCR do metabarkodowania eDNA ryb (zwane "MiFish"). Startery MiFish są ukierunkowane na hiperzmienny region mitochondrialnego genu 12S rRNA (163-185 pz), który zawiera wystarczające informacje do identyfikacji ryb do rodziny taksonomicznej, rodzaju i gatunku, z wyjątkiem niektórych blisko spokrewnionych kongenerów. Wykorzystując te startery w metakodowaniu eDNA, Miya i wsp.12 wykryło ponad 230 subtropikalnych gatunków morskich ze zbiorników akwariowych o znanym składzie gatunkowym i raf koralowych w pobliżu akwarium.

Optymalizując protokół metabarcodingu, aby dostosować się do naturalnej wody morskiej o różnych poziomach stężenia eDNA od ryb, zauważyliśmy, że startery MiFish czasami nie wzmacniały regionu docelowego do późniejszego przygotowania biblioteki. Jedną z bardziej prawdopodobnych przyczyn tej nieudanej amplifikacji PCR jest brak odpowiedniej ilości matrycowego DNA zawartego w małych objętościach przefiltrowanej wody (tj. 1-2 L). Chociaż stężenie eDNA z określonej grupy taksonomicznej jest nieznane przed amplifikacją, filtracja dużych objętości wody (>1-2 l) byłaby prostym i skutecznym sposobem na zebranie większej ilości eDNA ze środowisk wodnych o ograniczonej liczebności ryb i biomasie, takich jak ekosystemy otwarte oceany i ekosystemy głębinowe.

W porównaniu do konwencjonalnie używanych w wielu badaniach eDNA ryb16, wkłady filtrujące mają tę zaletę, że przyjmują większe objętości wody przed zatkaniem17. W rzeczywistości niedawne badanie wykazało dużą objętość (>20 l) filtracji przybrzeżnych próbek wody morskiej przy użyciu wkładów filtracyjnych18. Ponadto są one pakowane pojedynczo i sterylne, a w obudowie filtra można przeprowadzić kilka etapów eksperymentalnego przepływu pracy, zmniejszając w ten sposób prawdopodobieństwo zanieczyszczenia z laboratorium19. Ta ostatnia cecha ma kluczowe znaczenie dla metabarcodingu eDNA, w którym ryzyko zanieczyszczenia pozostaje jednym z największych wyzwań eksperymentalnych20,21. Pomimo tych technicznych zalet wkładów filtracyjnych, nie zostały one wykorzystane w badaniach eDNA ryb z dwoma wyjątkami8,15.

Tutaj udostępniamy protokół filtracji próbek wody za pomocą wkładu filtrującego i ekstrakcji eDNA z jego filtra bez konieczności otwierania obudowy. Oferujemy również dwa alternatywne systemy filtracji wody w zależności od objętości wody (≤4 L lub >4 L). Aby porównać wydajność nowo opracowanego protokołu z poprzednio używanym protokołem z wykorzystaniem filtra z włókna szklanego w naszej grupie badawczej12,14,22,23, przeprowadzamy analizę metabarkodowania eDNA wody morskiej z ogromnego zbiornika akwariowego (7,500 m3) o znanym składzie gatunkowym i pokazujemy liczbę wykrytych gatunków pochodzących z obu protokołów jako reprezentatywne wyniki. Protokół ten został opracowany do metabarkodowania eDNA ryb, ale ma również zastosowanie do eDNA z innych organizmów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ten protokół nie zajmuje się próbkowaniem wody i metodami metabarkodowania. Próbki wody mogą być pobierane w różny sposób w zależności od celów badania16 i zob. Miya i wsp.12 dla szczegółowych informacji na temat metod metabarcodingu z wykorzystaniem starterów MiFish. Należy pamiętać, że próbka wody powinna być przechowywana w bardzo niskiej temperaturze i przefiltrowana w ciągu kilku godzin, aby uniknąć degradacji eDNA. Należy również pamiętać, że protokół ten obejmuje użycie wytrząsarki obrotowej i inkubatora, przy czym ten ostatni musi być wystarczająco duży, aby pomieścić ten pierwszy. Ponadto wirówka, która może pomieścić zarówno stożkowe probówki o pojemności 15 ml, jak i 50 ml, jest niezbędna do usunięcia pozostałej cieczy z filtra końcowego i zebrania wyekstrahowanego DNA we wkładzie

odpowiednio.

1. Przetwarzanie nakrętki i plastikowej torby o pojemności 1 l

UWAGA: Pomiń ten krok, jeśli objętość filtracji wynosi >4 L.

  1. Wywierć otwór przez środek nakrętki (przymocowanej do jednorazowej plastikowej torby o pojemności 1 l) o tej samej średnicy (4.8 mm) co rurka wystająca z męskiego złącza luer-lock. Za pomocą szczypiec ukośnych skróć rurkę męskiego złącza luer-lock do odpowiedniej długości (ok. 3 mm), aby uniknąć zatkania niewielkiej ilości wody wewnątrz nasadki po filtracji.
  2. Nałóż klej klejowy przeznaczony do polietylenu (PE) i polipropylenu (PP) zarówno na spód, jak i powierzchnię męskiego złącza luer-lock i nakrętki. Odczekaj kilka minut, aby klej był dobrze wiążący (patrz instrukcje producenta).
  3. Włóż męskie złącze luer-lock do otworu w nakrętce. Poczekaj, aż obie części zostaną całkowicie połączone klejem (zwykle >24 godziny). Przed użyciem wysterylizuj nakrętkę z męskim złączem luer-lock z 10% dostępnym w handlu wybielaczem (ok. 0,6% podchlorynu sodu).
  4. Zrób dwa otwory w dwóch dolnych rogach plastikowej torby o pojemności 1 l, aby zawiesić ją na panelu z siatki (krok 3). Upewnij się, że średnica otworów jest większa niż średnica zębów na panelu z siatki.

2. Montaż systemu filtracji

  1. Podłącz rurkę wysokiego podciśnienia do złącza wejściowego pompy aspiratora, a drugi koniec rurki podłącz do kolektora. Upewnij się, że trzy czerwone zawory teowe kolektora są w pozycji "wyłączonej" (tj. poziomej).
  2. Zakładając czysty zestaw rękawiczek, włóż żeńską złączkę luer i złącze próżniowe odpowiednio na górnym i dolnym końcu gumowej rurki próżniowej w celu filtracji.
  3. Ostrożnie przymocuj żeńską złączkę luer do portu wylotowego wkładu filtra i przymocuj złącze próżniowe do silikonowego korka.

3. Filtracja próbek wody (≤4 L) za pomocą wkładu filtrującego

UWAGA: Pomiń ten krok, jeśli objętość filtracji wynosi >4 L. Ten system filtracji wymaga wolnostojącego panelu do zawieszenia plastikowej torby wypełnionej 1 litrem wody. Do montażu tego urządzenia przydałby się panel siatkowy, wiele zębów i stojak na panel, wszystkie dostępne w sklepach internetowych. Przed użyciem należy w autoklawie wlotowe i wylotowe nasadki luer wkładu filtra.

  1. Wlej 1 l próbki wody do plastikowej torebki i zamknij nakrętkę za pomocą męskiego złącza luer-lock.
  2. Ostrożnie połącz port wlotowy zmontowanego wkładu filtrującego z męskim złączem luer-lock plastikowej torby. Nie dokręcaj zbyt mocno złącza luer-lock; W przeciwnym razie urządzenie będzie przeciekać po rozpoczęciu pompowania. Upewnij się, że wszystkie połączenia są bezpieczne przed powieszeniem plastikowej torby na panelu z siatki.
  3. Ostrożnie zawieś plastikową torbę z wkładem filtra na dwóch bolcach na panelu siatkowym i włóż silikonowy korek do portu wlotowego kolektora.
  4. Włącz aspirator. Otwórz czerwone zawory T w celu filtracji. Uruchom kolektor, aż wkład filtra wyschnie, a następnie przekręć czerwony zawór T do pozycji wyłączonej.
  5. Powtarzaj kroki 3.1-3.4, aż żądana ilość wody zostanie przefiltrowana.
    UWAGA: Na 1 l wody pobranej z subtropikalnych raf koralowych filtracja trwa około trzech minut.
  6. Ostrożnie wyjmij wkład filtra z plastikowej torby i złącza próżniowego.
  7. Zakryj oba końce wkładu nasadkami luer wlotowymi i wylotowymi.
  8. Odpowiednio oznacz wkład i nasadkę luer wlotową za pomocą pisaka odpornego na rozpuszczalniki, aby uzyskać szybkoschnące i nierozmazujące się etykiety.
  9. Przechowywać wkład filtra w temperaturze -20 °C przed ekstrakcją DNA.

4. Filtracja próbek wody (>4 L) za pomocą wkładu filtrującego

Uwaga: Pomiń ten krok, jeśli objętość filtracji wody wynosi ≤4 L. Ten system filtracji wymaga 10-litrowej butelki książkowej wyposażonej w zawór i jednorazową końcówkę do pipety o pojemności 10 ml. Średnica wewnętrzna końcówki pipety o pojemności 10 ml (15,0 mm) i stożek końcówki powinny pasować odpowiednio do średnicy zewnętrznej zaworu (15,0 mm) i króćca wlotowego wkładu filtrującego. Oba połączenia są bezpiecznie utrzymywane podczas filtracji w pasowaniu ciernym. Wysterylizuj końcówkę pipety 10% dostępnym w handlu wybielaczem (ok. 0,6% podchlorynu sodu) przed użyciem.

  1. Przygotuj odpowiednią ilość próbki wody w butelce z książką. Szczelnie włóż końcówkę pipety o pojemności 10 ml do zaworu 10-litrowej butelki książkowej.
  2. Szczelnie włóż port wylotowy wkładu filtra do końcówki pipety i włóż silikonowy korek do portu wlotowego kolektora. Włącz aspirator. Otwórz czerwone zawory T w celu filtracji. Uruchom kolektor, aż wkład filtra wyschnie, a następnie przekręć czerwony zawór T do pozycji wyłączone.
    UWAGA: W przypadku 10 l wody morskiej pobranej z subtropikalnych zewnętrznych raf koralowych filtracja zajmuje około 30-40 minut.
  3. Ostrożnie wyjmij wkład filtra z plastikowej torby i złącza próżniowego. Zakryj oba końce wkładu nasadkami luer wlotowymi i wylotowymi. Odpowiednio oznacz wkład i nasadkę luer wlotową za pomocą pisaka odpornego na rozpuszczalniki, aby uzyskać szybkoschnące i nierozmazujące się etykiety. Przechowywać wkład filtra w temperaturze -20 °C przed ekstrakcją DNA.

5. Ekstrakcja eDNA z filtra

UWAGA: W krokach 4 i 5 używamy komercyjnego zestawu, w dużej mierze przestrzegając protokołu dla "krwi jądrowej" dostarczonego przez zestaw. Dla uproszczenia opisujemy procedurę przetwarzania pojedynczego wkładu. W praktyce zalecamy przetwarzanie 8 (lub maksymalnej liczby wirówek) lub mniej filtrów na raz.

  1. Rozgrzej inkubator do temperatury 56 °C.
  2. Przygotuj probówkę o pojemności 2,0 ml, odcinając nakrętkę na zawiasach z tuby. Wyrzuć nasadkę.
    UWAGA: Ta rurka służy jako rurka zbiorcza dla pozostałej cieczy w filtrze.
  3. Zdejmij wlotową (NIE wylotową) nasadkę luer z wkładu filtra i włóż port wlotowy do rurki zbiorczej. Szczelnie uszczelnić połączenie między wkładem a rurką zbiorczą za pomocą folii samouszczelniającej.
  4. Włóż kombinowaną jednostkę do adaptera wirówki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować wkład o stężeniu 5 000 x g przez 1 minutę, aby usunąć pozostałą ciecz z filtra.
  5. Wyjmij rurkę zbiorczą z wkładu filtra i wyrzuć rurkę. Ponownie zamknij otwór wlotowy wkładu.
  6. Przygotować mieszaninę 20 μl roztworu proteinazy-K, 220 μl PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami; brak w zestawie) i 200 μl buforu AL.
    UWAGA: Wkład filtrujący mieści do czterech razy większą objętość mieszanki (ok. 1,8 ml).
  7. Zdjąć nasadkę wlotową i dodać mieszaninę (440 μl) do wkładu filtra za pomocą końcówki pipety. Włóż pipetę całkowicie do portu wlotowego tak, aby końcówka pipety była widoczna wewnątrz wkładu tuż nad membraną.
  8. Ponownie zakryj otwór wlotowy i umieść wkład filtra na wytrząsarce obrotowej.
  9. Umieścić wytrząsarkę obrotową w nagrzanym inkubatorze w temperaturze 56 °C i włączyć wytrząsarkę z prędkością 20 obr./min na 20 minut.
  10. Podczas inkubacji należy przygotować nową probówkę o pojemności 2,0 ml, odpowiednio oznaczyć probówkę za pomocą pisaka odpornego na działanie rozpuszczalników i umieścić ją w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Pierwsza (2,0 ml) i druga probówka (50 ml) są używane odpowiednio do pobierania wyekstrahowanego DNA i do przechowywania probówki o pojemności 2,0 ml.
  11. Po inkubacji zdjąć nasadkę wlotową i włożyć otwór wlotowy (NIE wylotowy) wkładu do probówki o pojemności 2,0 ml w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Zamknąć stożkową probówkę o pojemności 50 ml nakrętką.
  12. Odwirować stożkową probówkę o pojemności 50 ml o pojemności 5 000 x g przez 1 minutę w celu zebrania wyekstrahowanego DNA z wkładu. Wyjmij wkład filtra i probówkę o pojemności 2,0 ml za pomocą wysterylizowanych kleszczyków i zakryj probówkę. Wyrzuć wkład filtra.

6. Oczyszczanie wyekstrahowanego DNA

UWAGA: Eluujemy eDNA za pomocą buforu AE o pojemności 100 μl zamiast 200 μl podanych w instrukcji zestawu komercyjnego.

  1. Dodać 200 μl etanolu (96-100%) do wyekstrahowanego DNA w probówce o pojemności 2,0 ml z powyższego etapu (ok. 440 μl) i dokładnie wymieszać przez wirowanie.
  2. Odpipetować mieszaninę do kolumny wirowej umieszczonej w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Wirować przy 5 000 x g przez 1 min. Wyrzucić przelew i probówkę zbiorczą.
  3. Umieścić kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml, dodać 500 μl buforu AW1 i wirować przez 1 minutę przy 5 000 x g. Wyrzucić przepływowy przepływ i probówkę zbiorczą.
  4. Umieścić kolumnę wirową w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml, dodać 500 μl buforu AW2 i wirować przez 3 minuty przy 20 000 x g. Wyrzucić przepływowy i probówkę zbiorczą.
  5. Przygotuj nową tubkę o pojemności 1,5 ml (brak w zestawie) i odpowiednio oznacz probówkę za pomocą wodoodpornego pisaka do szybkiego schnięcia i nierozmazywania etykietowania. Przenieść kolumnę wirową do probówki o pojemności 1,5 ml.
  6. Eluuj DNA, dodając 100 μl buforu AE do środka błony kolumny spinowej. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, a następnie odwirować przy 6 000 x g przez 1 minutę.
  7. Wyrzuć kolumnę wirującą i zakryj rurkę. Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja i kwantyfikacja wyłącznie eDNA ryb z wyekstrahowanego całkowitego eDNA jest technicznie trudna, ponieważ startery MiFish współamplifikują region docelowy u niektórych kręgowców innych niż ryby, np. u ptaków i ssaków, dając produkty PCR o tej samej wielkości (ca. 170 bp)12. Zamiast kwantyfikacji eDNA ryb, przeprowadzamy analizę metabarkodingu MiFish eDNA z akwarium o znanym składzie gatunkowym, stosując dwie różne metody filtracji i ekstrakcji DNA, a następnie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W wielu badaniach metabarcodingu wykorzystujących próbki środowiskowe, takie jak woda i gleba, obróbka pofiltracyjna wkładu filtracyjnego przebiega na ogół w następujący sposób24,25: 1) rozcięcie lub pęknięcie obudowy za pomocą narzędzi ręcznych (obcinak do rurek lub szczypce); 2) wyjęcie filtra z wkładu; oraz 3) pocięcie filtra na małe kawałki za pomocą żyletki w celu ekstrakcji DNA. Aby uniknąć takich kłopotliwych i czasochłonnych procedur, które są podatne na zanieczyszczenie w laboratorium, wypróbowaliśmy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane jako badania podstawowe przez CREST z Japońskiej Agencji Nauki i Technologii (JST) oraz przez granty od JSPS/MEXT KAKENHI (Numer 26291083) i Fundacji Canon dla M.M. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, zbieraniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Panel siatkowyIris OhyamaMPP-3060-BE
Metalowy bolecIris OhyamaMR12F
Stojak na panel siatkowy Nrmarki4184-9507dostępny w Amazon Japan
Plastikowa torba 1 L z zakrętkąYanagiDP16-TN1000
Męskie złącze luer-lockISIS11620
Końcówka do pipety 10 mlEppendorf0030 000.765
Butelka na książki 10 l z zaworemAs One1-2169-01
Filtr Sterivex-HVMilliporeSVHVL10RCoznaczany jako "wkład filtrujący" w całym ms i stosowany w protokole
Męska złączka LuerAs One1-7379-04
Żeńska złączkaLuer As One5-1043-14   
Nasadka luer wlotowaISISVRMP6
Nasadka luer wylotowaISISVRFP6
Rurka wysokopróżniowaAs One6-590-01
Złącze próżnioweAs One6-663-02
Korek silikonowyAs One1-7650-07
RozdzielaczAs One2-258-01
Aspirator-GAS-1As One1-7483-21
DNeasy Blood & Zestaw tkanek (250)Qiagen69506
Zestaw do izolacji DNA PowerWater SterivexMO BIO14600-50-NFoznaczony jako "zestaw opcjonalny" w wirówce stołowej ms
KubotaModel 4000Maksymalna prędkość obrotowa 6 000 obr./min
Rotor o stałym kącie nachyleniaKubotaAT-508C
Adapter do probówki stożkowej 15 mlKubota055-1280
Roztwór stabilizujący RNAlaterThermo Fisher ScientificAM7020
ParafilmPM992oznaczony jako "folia samouszczelniająca"

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584(2013).
  2. Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868(2012).
  3. Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
  4. Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
  5. Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
  6. Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316(2013).
  7. Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
  8. Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
  9. Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520(2013).
  10. Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732(2012).
  11. Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
  12. Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088(2015).
  13. Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
  14. Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a 'snapshot' of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786(2016).
  15. Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
  16. Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
  17. Stewart, F. J. Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. DeLong, E. E. 10, Elsevier. Ch. 10 187-218 (2013).
  18. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161(2009).
  19. Smalla, K. Molecular Microbial Ecology Manual. Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. , Springer. 13-22 (1995).
  20. Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA - An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
  21. Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383(2015).
  22. Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
  23. Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
  24. Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
  25. Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
  26. Deiner, K., Walser, J. -C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
  27. Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
  28. Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A. Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples'Springer Protocols Handbooks. Micic, M. , Springer. 325-339 (2016).
  29. Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
  30. Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
  31. Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
  32. Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Filtracja wodyekstrakcja DNAanaliza metabarcodingowawytrz sarka orbitalnaprotok inkubacjiz czka Luerfiltracja pr niowawykrywanie gatunk w

Powiązane artykuły