Artykuł metodologiczny

Skuteczna metoda syntezy peptoidów z monomerami typu mieszanego lizyny/argininy i oceny ich aktywności przeciwleiszmanicznej

DOI:

10.3791/54750

⸱

2 listopada 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry, Durham University, 2School of Medicine, Pharmacy and Health, Durham University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół syntezy peptoidów o mieszanej funkcjonalności kationowej w tej samej sekwencji (monomery typu lizyny i argininy). Opisano również późniejsze testy tych związków przeciwko Leishmania mexicana, pasożytniczym pierwotniakom wywołującym leiszmaniozę skórną.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje ręczną syntezę w fazie stałej liniowych peptoidów, które zawierają dwa różnie funkcjonalizowane monomery kationowe. W tej procedurze funkcjonalizowane aminami monomery peptoidowe "lizyny" i guanido funkcjonalizowane "argininą" mogą być włączone do tej samej sekwencji peptoidowej. W tej procedurze wykorzystuje się ochronę na żywicy (N-(1-(4,4-dimetylo-2,6-dioksocykloheksylideno)etylu) lub Dde, warunki ortogonalne do ochrony Boc monomerów lizyny. Późniejsza deprotekcja pozwala na wydajną reakcję guanidyniylacji na żywicy w celu wytworzenia reszt argininy. Procedura jest zgodna z powszechnie stosowaną metodą syntezy peptoidów submonomerów, co pozwala na wytwarzanie prostych peptoidów przy użyciu powszechnie dostępnego sprzętu laboratoryjnego i dostępnych na rynku odczynników. Opisano reprezentatywną syntezę, oczyszczanie i charakterystykę dwóch mieszanych peptoidów. Opisano również ocenę tych związków jako potencjalnych środków przeciwinfekcyjnych w testach przesiewowych przeciwko Leishmania mexicana. Pasożytniczy pierwotniak L. mexicana jest czynnikiem wywołującym leiszmaniozę skórną, zaniedbaną chorobę tropikalną, która dotyka nawet 12 milionów ludzi na całym świecie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptoidy (lub glicyny z podstawionymi poli-N) to klasa mimetyki peptydów, które oferują podobne właściwości do peptydów i jako takie są coraz częściej badane pod kątem zastosowań medycznych i materiałowych. W peptydach łańcuch boczny każdego aminokwasu jest połączony z α-węglem szkieletu amidowego; W peptydach łańcuchy boczne są przesunięte na atom azotu szkieletu. Co najważniejsze, daje to peptoidom większą odporność na proteolizę.

Peptoidy są powszechnie syntetyzowane przy użyciu metody submonomerów zapoczątkowanej przez Zuckermanna i wsp., gdzie monomery peptoidowe mogą być budowane przez sekwencyjną haloacetylację funkcji aminy przyłączonej do stałego nośnika, a następnie przemieszczenie halogenu za pomocą pierwotnej aminy. 1 Nasza grupa opracowała niedawno adaptację do tej metody submonomerów, aby umożliwić po raz pierwszy włączenie reszt peptoidowych typu lizyny i argininy do tej samej sekwencji peptoidów. 2 To ręczne podejście do syntezy peptoidów w fazie stałej wykorzystuje dostępne na rynku odczynniki i powszechny sprzęt laboratoryjny, dzięki czemu jest dostępne dla większości laboratoriów. Wykazano, że peptoidy mają obiecujące działanie przeciwko szerokiej gamie bakterii Gram-ujemnych, bakterii Gram-dodatnich i gatunków grzybów, które są porównywalne z wieloma znanymi peptydami przeciwdrobnoustrojowymi. 3-9

W naszej pracy, peptoidy zostały użyte jako nowe związki przeciwinfekcyjne do leczenia zaniedbanej choroby tropikalnej leiszmaniozy. Leiszmanioza jest chorobą endemiczną w ponad 80 krajach na całym świecie i szacuje się, że na całym świecie zarażonych jest ponad 12 milionów ludzi. 11 Choroba jest wywoływana przez pasożyty pierwotniaków, które są przenoszone przez ukąszenie muchy piaskowej. Gatunki Leishmania mogą powodować leiszmaniozę skórną, stan, który prowadzi do bliznowacenia i uszkodzenia błon śluzowych, lub zagrażającą życiu leiszmaniozę trzewną, która powoduje śmiertelne uszkodzenie narządów. Obecnie nie jest dostępna żadna szczepionka przeciwko tej chorobie, a istniejące metody leczenia opierają się na niewielkiej liczbie leków, które mają poważne skutki uboczne. Ponadto oporność na istniejące leki jest pojawiającym się i poważnym problemem, dlatego pilnie potrzebne są nowe metody leczenia, aby skutecznie leczyć leiszmaniozę w przyszłości. 12-16

W tych przeciwbakteryjnych zastosowaniach, peptoidy są często projektowane jako amfipatyczne z mieszaniną kationowych i hydrofobowych monomerów. 3,4 Może to nadać peptoidom pewien stopień selektywności w stosunku do komórek bakteryjnych, zmniejszyć toksyczność dla komórek ssaków i poprawić ich aktywność jako transporterów molekularnych. 17-20 Większość peptoidów przeciwinfekcyjnych w literaturze zawiera kationowe łańcuchy boczne, które składają się wyłącznie z funkcjonalizowanych aminowo monomerów typu lizyny lub reszt typu argininy. Chimery peptydowo-peptoidowe, w których łańcuchy kationowe składają się z aminokwasów lizyny lub argininy, zostały również zsyntetyzowane w celu zbadania wpływu grup kationowych na aktywność i toksyczność. 21-25

Peptoidy polilizynowe mogą być łatwo syntetyzowane przy użyciu dostępnych na rynku amin chronionych przez Boc. Opisywane peptoidy poli-argininy można wytworzyć przy użyciu metody wykorzystującej pirazolo-1-karboksyamidynę jako czynnik guanidynylu. 18 Można to jednak zrobić dopiero po odcięciu peptoidu od żywicy i usunięciu ochrony Boc na łańcuchach bocznych, tak że każda reszta typu lizyny w sekwencji jest przekształcana w resztę argininy. Starając się dostroić właściwości chemiczne i biologiczne związków, opracowaliśmy metodę, która po raz pierwszy pozwala na włączenie podwójnej funkcjonalności kationowej (np. NLys i NArg) do dowolnej sekwencji peptoidów. cyfra arabska

Tutaj opisujemy syntezę, oczyszczanie i charakterystykę dwóch nowych peptoidów, które zawierają zarówno reszty typu lizyny, jak i argininy w tej samej sekwencji. Metoda wykorzystuje ortogonalną ochronę N-Boc i N-Dde na żywicy za pomocą pirazolu-1-karboksyamidyny jako odczynnika guanidynylu. Biologiczna ocena tych peptoidów jest również opisana w testach cytotoksyczności przeciwko Leishmania mexicana, czynnikowi wywołującemu leiszmaniozę skórną. Zapewnia to praktyczną metodę dostępu do peptoidów o podwójnej funkcjonalności kationowej i oceny ich aktywności biologicznej. Oczekuje się, że metoda ta pomoże w przyszłości w syntezie peptydów amfipatycznych przez społeczność peptoidów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Synteza peptoidów w fazie stałej

UWAGA: Peptoidy są syntetyzowane ręcznie przy użyciu procedury submonomeru syntezy peptoidów w fazie stałej. Ta metoda pozwala na wysoką wydajność sprzęgania i dobrą wydajność produktu końcowego. Synteza w fazie stałej pozwala również na łatwe usunięcie nadmiaru reagentów na końcu każdego etapu, a metoda została tutaj zmodyfikowana, aby umożliwić włączenie różnych funkcjonalizowanych monomerów kationowych (tj. reszt typu argininy i lizyny) do tej samej sekwencji. 1,2

  1. Synteza liniowego peptoidu
    Uwaga: Przed rozpoczęciem syntezy należy przeprowadzić ocenę bezpieczeństwa. Wszystkie reakcje należy przeprowadzać pod wyciągiem i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (tj. jednorazowe rękawice nitrylowe, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny). Zachowaj szczególną ostrożność podczas korzystania z następujących odczynników i rozpuszczalników. Podejrzewa się, że dimetyloformamid (DMF) jest teratogenem, a dichlorometan (DCM) jest czynnikiem rakotwórczym. N,N'-diizopropylokarbodimid (DIC) i piperydyna są niebezpieczne dla oczu, skóry, poprzez wdychanie oddechowe i mogą powodować uczulenie skóry. Hydrazyna jest podejrzewana o działanie rakotwórcze, śmiertelne w przypadku wdychania i powoduje poważne oparzenia skóry lub oczu. Kwas bromooctowy jest również niebezpieczny dla skóry, oczu i dróg oddechowych i może powodować oparzenia w kontakcie. Kwas trifluorooctowy (TFA) jest lotną cieczą i może powodować poważne oparzenia, dlatego należy obchodzić się z nim ostrożnie. Zalecane są rękawice o dużej wytrzymałości.
    1. Dodać 0,12 g żywicy Rink Amide zabezpieczonej przed Fmoc (0,1 mmol, typowe obciążenie 0,7 mmol/g) do zakorkowanego 20 ml polipropylenowego naczynia reakcyjnego z dwoma frytkami. Dodać 5 ml dimetyloformamidu (DMF) w celu spęcznienia żywicy i pozostawić naczynie na co najmniej 60 minut w temperaturze pokojowej. Opróżnij DMF za pomocą platformy próżniowej do ekstrakcji do fazy stałej.
    2. Aby zdezprotect grupę Fmoc na spęczniałej żywicy, dodaj 2 ml roztworu piperydyny (20% w DMF v/v). Umieść naczynie na platformie wytrząsarki w temperaturze pokojowej (450 obr./min) i potrząsaj przez 5 minut. Usuń roztwór za pomocą stacji próżniowej.
      1. Powtórz deochronę Fmoc z 2 ml roztworu piperydyny i wstrząsaj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odcedź roztwór jak poprzednio.
    3. Umyj żywicę, dodając 2 ml DMF i mieszając żywicę przez 30 sekund. Odcedź DMF i powtórz jeszcze trzy razy.
    4. Do acetylacji dodać 1 ml roztworu kwasu bromooctowego (0,6 M w DMF) i 0,2 ml roztworu N,N'-diizopropylokarbidiimidu (DIC, 50% w DMF v/v). Pozostawić naczynie reakcyjne do wstrząsania przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Odcedź roztwór i trzykrotnie przemyj żywicę 2 ml DMF.
    5. Do wyporności dodać 1 ml roztworu aminy (1,5 M w DMF). Wstrząsaj żywicą przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Odcedź roztwór i trzykrotnie przemyj żywicę 2 ml DMF.
      1. Aby dodać monomer typu argininy, wykonaj krok 1.7. W zależności od pożądanej sekwencji peptoidowej zostaną dodane różne aminy.
    6. Powtórz kroki 1.1.4 i 1.1.5.
    7. Aby dodać monomer funkcjonalizowany guanidyną (tj. NArg), dodaj 1 ml niezabezpieczonego roztworu diaminy (1,5 M w DMF) do żywicy i wstrząsaj przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
      1. Odcedź roztwór i trzykrotnie przemyj żywicę 2 ml DMF.
      2. Dodać 2-acetylodimedon (0,2 g, 1 mmol w 0,5 ml DMF, 10 równoważników), aby dodać grupę Dde do wolnej pierwszorzędowej aminy i wstrząsać przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Odcedź roztwór i trzykrotnie przemyj żywicę 2 ml DMF.
    8. Kontynuować syntezę submonomeru jak w ppkt 1.1.4 do 1.1.7, aż do uzyskania pożądanej sekwencji. Dodaj 2 ml DMF, aby umyć żywicę i powtórz trzy razy.
    9. Aby zdezprotect grupę Dde na żywicy, dodaj 4 ml 2% roztworu hydrazyny (w DMF v/v) i wstrząsaj przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odcedź roztwór i powtórz trzy razy.
    10. Odcedź roztwór i trzykrotnie przemyj żywicę 2 ml DMF.
    11. Dodać pirazolo-1-karboksyamidynę (6 równoważników na wolną aminę, tj. na monomery NArg, w minimalnej objętości DMF) i N,N-diizopropyloetyloaminę lub DIPEA (6 równoważników na wolną aminę) i wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 60 minut.
    12. Odcedzić roztwór i trzykrotnie przemyć żywicę 2 ml dichlorometanu. Pozostaw żywicę do wyschnięcia na powietrzu na 10 minut, a następnie żywicę można przechowywać do momentu rozszczepienia (sekcja 2).
    13. Aby wstrzymać syntezę, należy trzykrotnie przemyć żywicę 2 ml DMF. Dodać 2 ml DMF, zakorkować naczynie syntezy i pozostawić w temperaturze pokojowej w dygestoriach.
      UWAGA: Synteza może być wstrzymana po każdym etapie przemieszczenia (z wyjątkiem drugiego etapu przemieszczenia, w którym mogą powstawać diketopiperazyny).
  2. Deprotekcja łańcucha bocznego i rozszczepienie z żywicy
    1. Przeprowadzić próbne rozszczepienie w celu sprawdzenia postępu syntezy (czystość i masa) w dowolnym momencie syntezy po etapach przemieszczenia, dodaniu lub usunięciu grupy chroniącej przed Dde lub po wykonaniu końcowej sekwencji.
      1. Przenieś około 10 kulek żywicy z naczynia reakcyjnego do nowego wkładu ze spiekanego polipropylenu o pojemności 8 ml.
      2. Dodać 1 ml koktajlu rozszczepiającego kwas trifluorooctowy (zawierającego 95% TFA, 2,5%H2O, 2,5% triizopropylosililanu) i wstrząsać przez 90 minut w temperaturze pokojowej.
      3. Przefiltrować koktajl rozszczepienia TFA z żywicy za pomocą spiekanego naczynia reakcyjnego do kolby o okrągłym dnie o pojemności 10 ml.
      4. Odparować koktajl łupliwy za pomocą wyparki obrotowej i ponownie rozpuścić powstały olej w 1 ml acetonitrylu/wody w celu poddania LC-MS lub analitycznej HPLC.
    2. Do końcowego rozszczepienia: w tym samym spiekanym polipropylenowym kartridżu reakcyjnym, który jest używany do syntezy, dodać 4 ml koktajlu rozszczepienia TFA (95% TFA, 2,5%H2O, 2,5% triizopropylosilanu) i przykryć naczynie. Wstrząsaj przez 90 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Przefiltrować koktajl rozszczepienia TFA z żywicy za pomocą spiekanego naczynia reakcyjnego do kolby o okrągłym dnie o pojemności 50 ml.
    4. Odparuj koktajl łupliwy za pomocą parownika obrotowego. Po usunięciu TFA produkt powinien być otrzymywany w postaci oleju. Aby wspomóc usuwanie tłuszczów tłuszczowych z tej ropy naftowej, dodaj 2 ml bezwodnego eteru dietylowego, a peptoid powinien się wytrącić.
      1. Usunąć eter dietylowy za pomocą pipety i wyrzucić lub odparować za pomocą wyparki obrotowej. Powtórz trzykrotne wytrącanie eteru dietylowego.
    5. Rozpuścić surowy peptoid w 10 ml acetonitrylu/zakwaszonego roztworu wodnego (50% acetonitrylu, 0,1% TFA w wodzie v/v). Przenieść do wstępnie zważonego pojemnika, zamrozić w temperaturze 20 °C i liofilizować do postaci suchego proszku.

2. Charakterystyka i Oczyszczanie

UWAGA: Synteza peptoidów może być monitorowana, a końcowy peptoid oceniany za pomocą analitycznego HPLC z odwróconą fazą przy użyciu kolumny C18 i spektrometrii mas metodą chromatografii cieczowej metodą elektrorozpylania (LC-MS). Wszystkie rozpuszczalniki HPLC rozpuszczalników do LC-MS powinny być świeżo przygotowane

.
  1. Analityczna HPLC
    1. Odważyć 1 mg peptoidu w małej szklanej fiolce. Dodać minimalną objętość acetonitrylu do rozpuszczenia i rozcieńczyć wodą do 1 ml. Upewnij się, że peptoid całkowicie się rozpuścił.
    2. Wstrzyknąć 10 μl do analitycznej HPLC (sugerowany gradient 0 - 100% rozpuszczalnika B przez 30 minut, gdzie rozpuszczalnik A = 95% wody, 5% acetonitrylu, 0,05% TFA i rozpuszczalnik B = 95% acetonitrylu, 5% wody, 0,03% TFA), zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Wizualizacja widma UV przy 220 nm.
  2. ESI LC-MS
    1. Przygotować 1 mg/ml roztworu peptydu, jak w kroku 2.1.1.
    2. Wstrzyknąć 1 μl do elektrosprayu LC-MS w celu określenia, czy obecna jest masa cząsteczkowa docelowego peptoidu, korzystając z instrukcji producenta.
    3. Sprawdź masę docelową sekwencji peptoidów za pomocą kalkulatora peptoidów, zgodnie z instrukcjami na kalkulatorze. 26 To narzędzie internetowe umożliwia również przypisanie dowolnych produktów usuwania/dodawania widocznych w spektrum masowym. 26
  3. Preparatywna HPLC z odwróconą fazą
    1. Surowe peptoidy rozpuścić w 2 ml zakwaszonej wody/acetonitrylu (95% wody, 5% MeCN, 0,1% TFA) i oczyścić preparatywnym RP-HPLC przy użyciu protokołu producenta. Określić gradient na podstawie czasu elucji uzyskanego z analitycznej HPLC, a wstrzyknięta ilość będzie zależeć od wymiarów kolumny.
    2. Wizualizacja za pomocą detektora ustawionego na 220 nm.
    3. Zebrać frakcje do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml, zamrozić w temperaturze 20 °C i poddać liofilizacji.
    4. Ponowna analiza frakcji za pomocą LC-MS i analitycznej HPLC zgodnie z protokołem producenta. Rekombinuj oczyszczone frakcje.

3. Testy biologiczne przeciwko pasożytom Leishmania mexicana

Uwaga: Oceny bezpieczeństwa muszą być przeprowadzone przed rozpoczęciem syntezy. Leishmania mexicana jest sklasyfikowana w Wielkiej Brytanii jako patogen grupy zagrożenia 2 i przed rozpoczęciem badań należy zastosować odpowiednie środki kontroli. Wszystkie prace muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego klasy 2 i w odpowiednim sprzęcie ochrony indywidualnej noszonym (tj. rękawicach nitrylowych, okularach ochronnych i fartuchu laboratoryjnym).

  1. Subkultura pasożytów
    1. Rozmrozić 1 ml zamrożonego bulionu Leishmania mexicana M379 w temperaturze -150 °C, umieszczając fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 sekund.
    2. Przenieść roztwór podstawowy do 10 ml pożywki Schneidera (o pH 7,0 uzupełnionej 15% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliny/streptomycyny) w kolbie do hodowli 3 komórek o średnicy 25 cm z niewentylowaną nasadką.
    3. Inkubować w temperaturze 26 °C przez 72 godziny.
    4. Zbadaj pasożyty pod mikroskopem (powiększenie 400x), aby sprawdzić stan. Powinny to być promastigoty w stadium owada, formy procykliczne w fazie logarytmicznej z wieloma dzielącymi się komórkami.
    5. Utrzymuj procykliczne promastygoty poprzez hodowlę pasożytów do stężenia 5 x 105 pasożytów/ml co trzy dni. Policz komórki za pomocą ulepszonego hemocytometru Neubauera.
  2. Przekształcenie stadium owada L. mexicana w stadium ssaka forma aksoniczna amastigoty 27
    1. Dzień 0: Przygotować 10 ml kultury pasożytów w stadium logarytmicznym przy 5 x 105 pasożytów/ml w pożywce Schneider's Insect (o pH 7,0 uzupełnionej 15% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny) w kolbie do hodowli 3-komórkowej o średnicy 25 cm z niewentylowaną nasadką.
    2. Inkubować w temperaturze 26 °C przez 48 godzin.
    3. Dzień 3: Przenieść 10 ml kultury do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować przy 447 x g przez 5 minut.
    4. Odlej starą pożywkę i dodaj 10 ml pożywki Schneider's Insect (o pH 5,5, uzupełnionej 20% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny). Delikatnie zawiesić osad pasożytów w nowym podłożu za pomocą pipety.
    5. Policz liczbę pasożytów za pomocą ulepszonego hemocytometru Neubauera. Rozcieńczyć do stężenia 5 x 105 pasożytów/ml pożywką o pH 5,5 i przenieść do kolby do hodowli 3 komórek o średnicy 25 cm.
    6. Inkubować w temperaturze 26 °C przez około 6 dni.
    7. Dzień 9: Zbadaj pasożyty pod mikroskopem (400X). Powinny znajdować się w niereplikującym, zakaźnym stadium metacyklicznej promastygoty.
    8. Policz liczbę pasożytów za pomocą ulepszonego hemocytometru Neubauera. Rozcieńczyć do stężenia 5 x 105 pasożytów/ml pożywką o pH 5,5.
    9. Usunąć 10 ml hodowli komórkowej i przenieść do kolby do hodowli komórkowej. Inkubować w temperaturze 32 °C przez 5 dni.
    10. Dzień 14: Sprawdź wygląd pasożytów pod mikroskopem (400X). Powinny znajdować się w stadium patogennej amastigoty, pozbawione wici charakterystycznej dla promastigotów i gotowe do testu.
  3. Test cytotoksyczności na amasztygotach aksenowych L. mexicana.
    UWAGA: Testy biologiczne peptydów wykorzystują testy wysokoprzepustowe przeprowadzane na płytkach 96-dołkowych. Protokół ten opisuje badanie amestigoty L. mexicana axisticate, ale identyczne testy można również przeprowadzić na pasożytach w stadium promastigoty w odpowiednich pożywkach. Związki inkubuje się z pasożytami w stężeniach od 3 do 100 μM przez 60 minut, a następnie inkubuje przez 24 godziny po 10-krotnym rozcieńczeniu. Wyniki uzyskuje się poprzez pomiar fluorescencji studzienek po inkubacji za pomocą roztworu żywotności komórek na bazie resazuryny (np. alamarBlue).
    1. Przygotować złożone roztwory podstawowe. Odważyć 1 mg końcowego oczyszczonego produktu peptyidowego za pomocą wagi analitycznej. Dodać odpowiednią objętość dimetylosulfotlenku (DMSO) klasy biologii molekularnej do stężenia 5 mM. Przygotować 6 μl porcji i zamrozić w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotować roztwory związków na 96-dołkowych płytkach (zalecany układ płytek można zobaczyć w sekcji wyników, rysunek 6) w trzech powtórzeniach od 100 do 3 μM. Dodać 2 μl 5 mM roztworu podstawowego każdego związku w górnym rzędzie (tj. A). Dodaj 48 μl świeżej pożywki Schneider's Insect (o pH 5,5 i 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny/streptomycyny(P/S)) do górnego rzędu za pomocą pipety wielokanałowej. Dodaj 25 μl pożywki Schneider's Insect do wszystkich pozostałych rzędów (B - F).
      1. Przeprowadzić rozcieńczenie seryjne, pipetując 25 μl roztworu z górnego rzędu. Dodaj do poniższego rzędu i wymieszaj. Rozcieńczenia przeprowadzać do ostatniego rzędu, w którym należy wyrzucić ostatnie 25 μl roztworu.
      2. Stosować amfoterycynę B (zapasy 5 mM) jako kontrolę pozytywną i DMSO (2% roztwór) jako kontrolę ujemną w trzech egzemplarzach.
    3. Przygotować roztwór dla pasożytów: przenieść kulturę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i wirować przy 447 x g przez 5 minut. Odleć starą pożywkę i dodać 10 ml pożywki Schneider's Insect (o pH 5,5 i 20% FBS, 1% P/S).
    4. Delikatnie rozpuść osad pasożytów w nowej pożywce za pomocą pipety i policz za pomocą ulepszonego hemocytometru Neubauera. Rozcieńczyć kulturę do 8 x 106 pasożytów/ml.
    5. Do każdej studzienki dodać 25 μl kultury L. mexicana. Inkubować płytki przez 60 minut w temperaturze 32 °C.
    6. Wyjąć płytkę z inkubatora i pobrać 40 μl roztworu z każdej studzienki.
    7. Dodać 90 μl świeżej pożywki i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 32 °C.
    8. Do każdej studzienki dodać 10 μl roztworu żywotności komórek na bazie resazuryny. Inkubować przez 4 godziny w temperaturze 32 °C.
    9. Zmierzyć fluorescencję za pomocą czytnika płytek (λex = 540 nm, λem = 600 nm), zgodnie z instrukcjami producenta. Analizuj dane, usuwając średnie tło (tylko ze średnich odwiertów) i porównując fluorescencję studzienek po normalizacji w odniesieniu do kontroli DMSO.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako reprezentatywny wynik, opisana zostanie synteza i charakterystyka dwóch 12-resztowych peptoidów zawierających dwa monomery typu lizyny i dwa monomery typu argininy. Pokazane są również późniejsze wyniki testu cytotoksyczności.

Dwa peptoidy [(NnArgNspeNspe)(NaeNspeNspe)]2 (a) i [(NhArgNspeNspe)(NLysNspeNspe)]2 (b) zostały zsyntetyzowane przy użyciu 120 mg żywicy Rink Amide każdy (obciążenie = 0,79 mmol/g). Wszystkie etapy acetylacji i wypierania przeprowadzono zgodnie z powyższym opisem, przy użyciu wszystkich odczynników zakupionych komercyjnie. Dla tych pozostałości na etapie wypierania zastosowano następujące aminy: Nspe (S)-(-)-α-metylobenzyloamina, Nae N-(tert-butoksykarbonylo)-1,2-diaminoetan N ae, N Lys N-(tert-butoksykarbonylo)-1,4-diaminobutan. Dla reszt pochodnych argininy sprzężono następujące niezabezpieczone diaminy: NhArg 1,4-diaminobutan lub NnArg 1,2-diaminoetan, a następnie zabezpieczono na żywicy 2-acetylodimedonem (Dde-OH). Po zsyntetyzowaniu całej sekwencji, deprotekcja hydrazyny Dde daje wolne aminy do guanidynylanu.

figure-results-1
Rysunek 1. Struktury peptoidalne (a) [(NnArgNspeNspe) (NaeNspeNspe)]2 i (b) [(NhArgNspeNspe)(NLysNspeNspe)]2. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Metoda stosowana do syntezy mieszanych peptoidów argininy/lizyny.ja. Standardowy stopień przemieszczenia w metodzie submonomeru z diaminą; ii. Dodanie Dde-OH, 90 minut w celu ochrony wolnej aminy; iii. Dalsze dodatki w celu wydłużenia łańcucha peptoidalnego przy użyciu metody submonomeru; iv. Deprotekcja Dde przy użyciu 2% hydrazyny w DMF; v. Guanidynilacja wolnej aminy na żywicy za pomocą pirazolo-1-karboksyamidyny i DIPEA w DMF; vi. Kwaśne rozszczepienie od żywicy i deprotekcja grup Boc. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po rozszczepieniu z żywicy i liofilizacji, surowe produkty otrzymano w postaci białych proszków: (a) 154 mg, (b) 163 mg. Produkty zostały oczyszczone za pomocą RP-HPLC zgodnie z opisem z maksymalnymi iniekcjami 50 mg przy użyciu pompy LC z detektorem UV-vis (λ = 250 nm) na kolumnie analitycznej, 250 mm x 10 mm, 5 μm; natężenie przepływu = 2 ml/min. Frakcje odpowiadające masie docelowej połączono i otrzymano w postaci białych proszków: a) 54 mg, b) 65 mg, końcowa wydajność około 30% dla frakcji o czystości >90%.

Ostateczna tożsamość związku po oczyszczeniu została potwierdzona przez LC-MS (patrz Rysunek 3) przy użyciu potrójnego kwadrupolowego spektrometru masowego wyposażonego w UPLC i detektor fotodiodowy. Dokładną spektrometrię mas przeprowadzono przy użyciu tego samego spektrometru na jonach [M+2H]2+. Następujące obliczone i zaobserwowane masy zostały znalezione w ścisłej zgodności (rysunek 4): (a) obliczone = 896,0026 amu, obserwowane = 896,0038 amu; (b) Obliczone = 952,0691 amu, obserwowane = 952,0730 amu.

figure-results-3
Rysunek 3. LC-MS dla oczyszczonych peptyidów. a) m/z = 1,792 i b) m/z = 1,903. Gdzie góra to TIC, środkowe widmo LC-MS, dolny chromatogram UV przy 220 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Dokładne dane ze spektrometrii mas dla peptyidów (a) i (b). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Czystość produktu została oceniona za pomocą analitycznego RP-HPLC (pompa LC z detektorem UV-vis na kolumnie analitycznej, 4,6 mm x 100 mm, 3,5 μm; natężenie przepływu = 1 ml/min) i zobrazowana przy 220 nm, absorbancji amidowego szkieletu. Rysunki 5a i 5b pokazują, że związki są jednorodne.

figure-results-5
Rysunek 5. Analityczna HPLC dla oczyszczonych peptyidów (a) i (b). Występuje gradient 0-100% B w ciągu 30 minut, piec kolumnowy w temperaturze 40 °C (A = 95%H2O, 5% MeCN, 0,05% TFA; B = 95% MeCN, 5% H2O, 0,03% TFA). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Oczyszczone peptoidy (a) i (b) zostały przetestowane w testach cytotoksyczności przeciwko L. mexicana axenic amastigotes. Zamrożone zapasy L. mexicana zostały rozmrożone i przekształcone w stadium amastigoty, gotowe do testu. 72 godziny po rozmrożeniu pasożyty powinny być promastigotykami w stadium owada w postaci procyklicznej, w fazie logarytmicznej z wieloma dzielącymi się komórkami. Na tym etapie pasożyty mogą zostać przekształcone w stadium amastigoty za pomocą opisanej zmiany pH i temperatury. 27 W dziewiątym dniu transformacji pasożyty znajdą się w stadium niereplikującej się zakaźnej metacyklicznej promastigoty. Wreszcie w dniu 14 pasożyty powinny znajdować się w stadium patogennej amastigoty, w której pasożyty nie mają charakterystycznych wici promastigoty. 28

5 mM roztwory podstawowe związków zostały wykonane w DMSO klasy hodowli komórkowej i przetestowane w trzech egzemplarzach co najmniej dwa razy, aby upewnić się, że zebrano solidny zestaw danych. Reprezentatywny plan płytki 96-dołkowej przedstawiono na rysunku 6. Pod koniec testu do każdej studzienki dodano odczynnik do żywotności komórek i zmierzono fluorescencję zgodnie z opisem w celu obliczenia żywotności pasożytów przy każdym badanym stężeniu (patrz rysunek 7). Wartości ED50 obliczono odpowiednio jako peptoid (a) >100 μM i peptoid (b) 37 μM. Wykreślone słupki błędów pokazują zmienność między dołkami jako odchylenie standardowe i widać, że są one rozsądne dla większości słupków.

figure-results-6
Rysunek 6. Reprezentatywny plan płytki 96-dołkowej do oznaczania cytotoksyczności na 2 roztworach peptydów (w tym kontrole dodatnie i ujemne). med+ = pożywka (pożywka Schneidera, pH 5,5, 20% FBS, 1% P/S). L. mex. = 8 x 106/ml hodowli pasożytów w Med+. AmfoB = 5 mM w DMSO. Peptoid = 5 mM roztworu podstawowego w DMSO. Puste studnie powinny zawierać sterylną wodę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7. Wyniki testu cytotoksyczności wobec pasożytów L. mexicana axnic amastigote przy użyciu peptoidu (a) i (b).Można zauważyć, że peptoid (b) jest bardziej skuteczny niż peptoid (a) w zmniejszaniu odsetka żywotnych pasożytów, przy czym oba związki mają działanie zależne od dawki. Wykreślone słupki błędów pokazują zmienność między odwiertami jako odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptoidy są coraz częściej badane w dziedzinach biologii chemicznej i chemii medycznej w zastosowaniach takich jak nowe terapie3-5, środki do dostarczania komórek18,20 i narzędzia diagnostyczne. 29 Zazwyczaj sekwencje te są kationowe, aby zapewnić pewien stopień selektywności patogenu w stosunku do komórek ssaków, zdolność przenikania przez błony komórkowe, a także wspomagać rozpuszczalność w układach wodnych. W literaturze istnieje wiele przykładów peptydów kationowych, które zawierają wyłącznie reszty mimetyczne lizyny lub argininy. Jednak do tej pory synteza peptoidów, które zawierają obie te reszty kationowe w tej samej sekwencji, była utrudniona z powodu braku odpowiedniej procedury syntezy. Opisany tutaj protokół pozwala na wydajną syntezę mieszanych peptydów kationowych i jest wysoce pożądany, ponieważ oferuje drogę do modulacji właściwości biologicznych i chemicznych peptydów amfipatycznych.

Nasza metoda wykorzystuje adaptację do powszechnie stosowanej syntezy peptydów submonomerów i pozwala na dodanie monomerów typu lizyny i argininy w tej samej sekwencji. Wykorzystuje ona sprzężenia temperatury pokojowej i ustaloną chemię grup ochronnych, więc przewiduje się, że metoda ta będzie przydatna dla większości grup badawczych. Aby dodać ortogonalną ochronę dla reszty typu argininy, niezabezpieczona diamina jest dodawana w standardowych warunkach wypierania, a następnie zabezpieczana w 60-minutowym sprzężeniu z Dde-OH. Można stosować różne diaminy, co pozwala na zainstalowanie łańcuchów bocznych o długości od 2 atomów węgla do 6 atomów węgla, tj. odpowiednio 1,2-diaminoetan do 1,6-diaminoheksanu. Ochronny Dde-OH dobrze rozpuszcza się w DMF i jest bardzo wydajną i selektywną grupą ochronną dla amin pierwszorzędowych. Grupa ochrony Dde pozostawia nienaruszone aminy drugorzędowe, np. niechroniony koniec N łańcucha peptoidalnego. 30 Jednym z ograniczeń jest to, że cała synteza została przeprowadzona ręcznie; Przewiduje się jednak, że opracowane warunki sprzężenia sprawiają, że metoda ta może być stosowana w zautomatyzowanych syntezatorach peptydów/peptydów.

Deprotekcja grup Dde na żywicy jest przeprowadzana przy użyciu 2% roztworu hydrazyny w DMF w celu pozostawienia wolnych amin, które mogą być guanidynylowane na żywicy przy użyciu pirazolu-1-karboksyamidyny. Na każdą wolną aminę na żywicy stosuje się sześć równoważników pirazolo-1-karboksyamidyny i sześć równoważników DIPEA (tj. sześć równoważników dla każdego monomeru typu NArg, który ma być zainstalowany). Ponownie, ta reakcja jest również wydajna, a odczynnik pirazolo-1-karboksyamidyny ma dobrą rozpuszczalność w DMF. Zakończenie reakcji jest zwykle obserwowane przez LC-MS po 60 minutach w temperaturze pokojowej.

Ze względu na wszechstronność metody submonomerów, na etapie przemieszczenia można stosować szeroką gamę amin pierwszorzędowych, więc może być konieczna optymalizacja warunków w celu zwiększenia wydajności sprzęgania i ogólnej wydajności lub czystości produktu. 31 W przypadku omówionych powyżej sekwencji nie były konieczne żadne specjalne warunki dla udanego sprzężenia. Jednak dłuższe czasy przemieszczenia lub wyższe stężenia amin mogą być stosowane do problematycznych przemieszczeń (tj. do słabo nukleofilowych lub sterycznie masywnych amin). Niektóre aminy mogą nie być całkowicie rozpuszczalne w DMF, w takim przypadku zaleca się ich rozpuszczenie w N-metylo-2-pirolidonie (NMP) lub innych odpowiednich rozpuszczalnikach do reakcji w fazie stałej, tak jak w poprzedniej kompleksowej metodzie syntezy submonomerów peptoidów. 32 Wykazano, że w celu włączenia monomerów, które zawierają niezabezpieczone heteroatomy w łańcuchach bocznych, acetylacja przy użyciu kwasu chlorooctowego jest skuteczna w innych grupach. 33 Dodatkowo, inne żywice mogą być używane tą metodą do otrzymywania peptoidów o różnej funkcjonalizacji C-końca. Żywice Wang i żywice chlorku 2-chlorotrytylu są rutynowo stosowane w syntezie submonomerów peptoidów. Na przykład metoda ta jest z powodzeniem stosowana w przypadku żywicy chlorku 2-chlorotrytylu w naszej grupie. 2 Różne stałe podłoża będą wymagały innej procedury ładowania niż omówiona tutaj Rink Amide (w zależności od konkretnej użytej żywicy), dlatego przed syntezą należy to sprawdzić w literaturze.

Podobnie jak w przypadku syntezy peptydów, warunki ostatecznego rozszczepienia peptoidu z żywicy mogą być również zoptymalizowane pod kątem określonej sekwencji. W tym protokole użyto koktajlu rozszczepienia TFA (z triizopropylosilanem i wodą jako padlinożercami). Przedstawione tutaj peptoidy zawierały tylko ochronę Boc, która jest dość kwasowo-labilną grupą. Aby zapewnić całkowitą deprotekcję sekwencji z większym udziałem chronionych pozostałości lub mniej kwasowo-labilnych grup ochronnych, konieczne mogą być dłuższe czasy rozszczepienia (tj. czasy rozszczepienia przekraczające 2 godziny są zalecane dla sekwencji zawierających grupy chronione Pbf lub trzeciorzędowe estru butylowe). Alternatywne zmiatacze mogą być również stosowane do wyspecjalizowanych łańcuchów bocznych (na przykład etanedithiol lub 2-merkaptoetanol są często stosowane w peptydach, które mają łańcuchy boczne zawierające siarkę, takie jak cysteina lub metionina).

Przedstawiony test biologiczny jest standardowym testem cytotoksyczności, który można zmienić w celu dopasowania do różnych linii komórkowych. Ważne jest, aby pamiętać, że każda 96-dołkowa płytka powinna zawierać wystarczającą ilość kontrol, aby dać pewność uzyskanym wynikom. W tym przypadku amfoterycyna B jest stosowana jako kontrola pozytywna, ponieważ jest znanym lekiem stosowanym w leczeniu choroby, a DMSO jest stosowany jako kontrola ujemna, ponieważ jest to rozpuszczalnik używany do wytwarzania związków wyjściowych do testu. Jeżeli wykorzystywane są inne linie komórkowe, przed użyciem należy uzyskać alternatywne, odpowiednie kontrole i je zwalidować. L. mexicana inkubuje się z peptyidem w stężeniach od 100 do 2 μM przez jedną godzinę, a następnie roztwór pasożyta/peptoidu rozcieńcza się dziesięciokrotnie w celu inkubacji przez noc (tj. studzienki początkowo zawierające 100 μM peptydu rozcieńcza się do 10 μM).

Odczynnik żywotności komórek dodaje się do każdego dołka (10% całkowitej objętości studzienki) na koniec testu. Widoczna zmiana koloru jest widoczna między studzienkami z żywotnymi pasożytami (różowy), studzienkami kontrolnymi bez żywotnych pasożytów (niebieski) i widmem pomiędzy ze średnią liczbą żywotnych pasożytów. Fluorescencja jest proporcjonalna do liczby żywych komórek i odpowiada aktywności metabolicznej komórek; Barwnik resazurynowy (niefluorescencyjny) jest przekształcany w fluorescencyjną rezorufinę w reakcjach redukcji w komórkach aktywnych metabolicznie. 34 W tym teście czas inkubacji z odczynnikiem żywotności komórek został zoptymalizowany dla L. mexicana. Czas inkubacji z odczynnikiem żywotności będzie różny dla płytek wysiewanych w różnych stężeniach komórek lub z różnymi liniami komórkowymi (na przykład ta metoda może być również stosowana w przypadku komórek ssaków). W zależności od dokładnego zastosowanego czytnika płytek, przed wykonaniem pomiarów fluorescencji należy wziąć pod uwagę te kwestie. Wszelkie pęcherzyki powietrza w studzienkach należy usunąć, aby zapewnić dokładne odczyty. Niektóre czytniki płytek odczytują od spodu płytek, w takim przypadku należy użyć 96-dołkowych płytek z płaskim dnem. Inne maszyny mogą odczytywać od góry płytki, dlatego pokrywę płytki należy zdjąć przed pomiarem.

Wreszcie, w przyszłości protokół ten może być kompatybilny z automatycznymi syntezatorami, które są w stanie tworzyć wiele sekwencji równolegle. Dodatkowo przy użyciu tej metody możliwa jest również synteza cyklicznych peptoidów. Protokół ten powinien zapewnić naukowcom praktyczną procedurę syntezy, którą można wykorzystać do uzyskania dostępu do nowych rusztowań peptyidowych z monomerami typu lizyny i argininy, które mogą być przydatne w wielu zastosowaniach, w tym w materiałach lub dziedzinach medycznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Radzie Badań nad Naukami Inżynieryjnymi i Fizycznymi (EPSRC) za wsparcie finansowe (HLB). Dziękujemy również Sridévi Maalika Ramanoudjame za jej pomoc podczas filmowania tego zabiegu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Polipropylenowe wkłady ekstrakcyjne do fazy stałej z dwiema frytamiCrawford Scientific12131017 i 12131015wkłady 20 ml i 6 ml stosowane w tym preparacie
kwas trifluorooctowyTokyo Chemical Industry (Europe)T0431-100g>98%; UWAGA: może powodować poważne oparzenia i podrażnienia dróg oddechowych
N,N'-diizopropylokarbodimideSigma Aldrich38370-100ML98%; UWAGA: stwarza zagrożenie dla oczu, skóry i dróg oddechowych, może również powodować uczulenie
DimetyloformamidFischer Scientific10346180stopniu HPLC; UWAGA: podejrzenie teratogenu
AcetonitrylFischer Scientific10407440klasy HPLC
DichlorometanFischer Scientific1035426399,8%; UWAGA: podejrzenie rakotwórczości
Kwas bromacetycznySigma Aldrich17000-100G>99%; UWAGA: powoduje oparzenia i stwarza zagrożenie dla skóry, oczu i dróg oddechowych
(S)-(-)-alfa metylobenzyloaminaSigmaAldrich 115568-100G98%; UWAGA: szkodliwy po połknięciu, toksyczny w kontakcie ze skórą, powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu, stosowany do syntezy monomeru Nspe
N-Boc 1,4-diaminobutanTokyo Chemical Industry (Europa)A1373-25g>98%; UWAGA: powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu, stosowany do syntezy monomeru NLys
N-Boc 1,2-diaminoetanTokyo Chemical Industry (Europa)A1371-25g>97%; UWAGA: powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu, stosowany do syntezy monomeru Nae
1,2-diaminobutanSigma AldrichD13208-100G99%; UWAGA: łatwopalna ciecz i para, szkodliwa po połknięciu lub wdychaniu toksyczna w kontakcie ze skórą, powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu, stosowana w syntezie monomeru NhArg
1,4-diaminoetanSigma Aldrich03550-250ML99,5%; UWAGA: łatwopalna ciecz i para, szkodliwa po połknięciu lub wdychaniu toksyczna w kontakcie ze skórą, powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu, stosowana w syntezie monomeru NnArg
 
 
1H-pirazolo-1-karboksyamidyna HClSigma Aldrich402516-10Gjako sól HCl; UWAGA: działa szkodliwie po połknięciu i może powodować reakcję alergiczną skóry, powoduje poważne uszkodzenie oczu
Monohydrat hydrazynySigma Aldrich207942-5Godczynnik; UWAGA: podejrzewa się działanie rakotwórcze, śmiertelne w przypadku wdychania i powoduje poważne oparzenia skóry i oczu
2-acetylodimedonNovabiochem8510150005Dde-OH
Rink Żywica amidowaNovabiochem8551190005100-200 mesh, o dużym obciążeniu
PiperidineSigma Aldrich411027-1L>99,5%, substancja kontrolowana, dlatego przed zakupem należy uzyskać odpowiednie pozwolenie; UWAGA: wysoce łatwopalna ciecz i para, szkodliwa w przypadku połknięcia i toksyczna w kontakcie ze skórą lub wdychana, powoduje poważne oparzenia skóry i uszkodzenia oczu, szkodliwa dla organizmów wodnych o długotrwałych skutkach
TriizopropylosilanSigma Aldrich233781-50G98%; UWAGA: łatwopalna ciecz i para, działa drażniąco na skórę i powoduje poważne podrażnienie oczu
alamarBlueThermoFischer DAL1025Nie klasyfikowane jako niebezpieczne
Pożywka dla owadówSchneidera Sigma AldrichS9895-1LSproszkowane podłoże należy przygotować przed użyciem zgodnie z instrukcjami producenta; Pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej przed użyciem w testach biologicznych
96-dołkowe płytkiVWR734-1793Płaskie dno (aby umożliwić pomiar fluorescencji od dołu), poddane działaniu kultur tkankowych
Zbiorniki rozpuszczalnikówVWR613-1182Używany z pipetą wielokanałową
Pipeta wielokanałowaEppendorf3122000043
Końcówki do pipetStarlab GroupS1111-3810, S1113-1810, S1111-6810Objętość końcówki zależy od użytej pipety. 10  &mikro; l, 10 - 200  &mikro; l oraz 1,000  &mikro; l zalecane do testów
25 cm3 kolby do hodowli komórkowychVWR734-2312
50 ml probówki wirówkoweVWR525-0791
dimetylosulfotlenek (klasa biologii molekularnej)Sigma AldrichD8418-50MLNie sklasyfikowany jako niebezpieczny
Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęcaThermoFischer 10082139-100mLGibco
Penicylina/StreptomycynaThermoFischer 15140148-20mLSkrót: P/S
Amfoterycyna BSigma Aldrich46006-100mgAmfoterycyna B trójwodzian, wzorzec analityczny VetranalTM
, , , >>

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids oligo(N-substituted glycines) by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114, 10646-10647 (1992).
  2. Bolt, H. L., Cobb, S. L. A practical method for the synthesis of peptoids containing both lysine-type and arginine-type monomers. Org. Biomol. Chem. 14, 1211-1215 (2016).
  3. Mojsoska, B., Zuckermann, R. N., Jenssen, H. Structure-activity relationship study of novel peptoids that mimic the structure of antimicrobial peptides. Antimicrob Agents Chemother. , (2015).
  4. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 2794-2799 (2008).
  5. Eggimann, G. A., Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S. L. Investigating the Anti-leishmanial Effects of Linear Peptoids. Chem Med Chem. 10, 233-237 (2015).
  6. Kapoor, R., et al. Antimicrobial Peptoids Are Effective against Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 3054-3057 (2011).
  7. Ryge, T. S., Frimodt-Moller, N., Hansen, P. R. Antimicrobial activities of twenty lysine-peptoid hybrids against clinically relevant bacteria and fungi. Chemotherapy. 54, 152-156 (2008).
  8. Huang, M. L., Benson, M. A., Shin, S. B. Y., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. Amphiphilic Cyclic Peptoids That Exhibit Antimicrobial Activity by Disrupting Staphylococcus aureus Membranes. Eur. J. Org. Chem. , 3560-3566 (2013).
  9. Huang, M. L., Shin, S. B. Y., Benson, M. A., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. A Comparison of Linear and Cyclic Peptoid Oligomers as Potent Antimicrobial Agents. Chem Med Chem. 7, 114-122 (2012).
  10. Bolt, H. L., Eggimann, G. A., Denny, P. W., Cobb, S. L. Enlarging the Chemical Space of Anti-leishmanials: a Structure-Activity Relationship Study of Peptoids against Leishmania mexicana, a Causative Agent of Cutaneous Leishmaniasis. Med Chem Comm. , (2016).
  11. The World Health Organisation. Leishmaniasis. , Available from: http://www.who.int/leishmaniasis/en/ (2016).
  12. Chon, S. Y., et al. Antibiotic overuse and resistance in dermatology. Dermatologic therapy. 25, 55-69 (2012).
  13. Alvar, J., et al. Leishmaniasis Worldwide and Global Estimates of Its Incidence. PLOS ONE. 7, (2012).
  14. Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends Parasitol. 21, 508-512 (2005).
  15. Kedzierski, L. Leishmaniasis Vaccine: Where are We Today? J Global Infect Dis. 2, 177-185 (2010).
  16. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clin Microbiol Rev. 19, 111-126 (2006).
  17. Huang, W., et al. Learning from Host-Defense Peptides: Cationic, Amphipathic Peptoids with Potent Anticancer Activity. PLOS ONE. 9, (2014).
  18. Wender, P. A., et al. The Design, Synthesis, and Evaluation of Molecules That Enable or Enhance Cellular Uptake: Peptoid Molecular Transporters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 13003-13008 (2000).
  19. Schröder, T., et al. Peptoidic Amino- and Guanidinium-Carrier Systems: Targeted Drug Delivery into the Cell Cytosol or the Nucleus. J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).
  20. Kömel, D. K., et al. Cell-penetrating peptoids: Introduction of novel cationic side chains. Eur. J. Med. Chem. 79, 231-243 (2014).
  21. Hein-Kristensen, L., Knapp, K. M., Franzyk, H., Gram, L. Bacterial membrane activity of α-peptide/β-peptoid chimeras: Influence of amino acid composition and chain length on the activity against different bacterial strains. BMC Microbiology. 11, 1-12 (2011).
  22. Su, Y., Doherty, T., Waring, A. J., Ruchala, P., Hong, M. Roles of Arginine and Lysine Residues in the Translocation of a Cell-Penetrating Peptide from (13)C, (31)P and (19)F Solid-State NMR. Biochem. 48, 4587-4595 (2009).
  23. Andreev, K., et al. Guanidino groups greatly enhance the action of antimicrobial peptidomimetics against bacterial cytoplasmic membranes. BBA Biomembranes. 1838, 2492-2502 (2014).
  24. Foged, C., et al. Cellular uptake and membrane-destabilising properties of alpha-peptide/beta-peptoid chimeras: lessons for the design of new cell-penetrating peptides. BBA Biomembranes. 1778, 2487-2495 (2008).
  25. Vedel, L., et al. Antiplasmodial and prehemolytic activities of alpha-peptide-beta-peptoid chimeras. Chem Bio Chem. 8, 1781-1784 (2007).
  26. Lear, S., Cobb, S. L. Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment. J Computer-Aided Mol Des. , 1-7 (2016).
  27. Bates, P. A. Complete developmental cycle of Leishmania mexicana in axenic culture. Parasitol. 108, 1-9 (1994).
  28. Gossage, S. M., Rogers, M. E., Bates, P. A. Two separate growth phases during the development of Leishmania in sand flies: implications for understanding the life cycle. Int J Parasitology. 33, 1027-1034 (2003).
  29. Seo, J., Lee, B. C., Zuckermann, R. N., et al. Comp Biomaterials. Ducheyne, P., et al. 2, Elsevier. 53-76 (2011).
  30. Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates. Tetrahedron Lett. 37, 2625-2628 (1996).
  31. Culf, A. S., Ouellette, R. J. Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (alpha-peptoids) and derivatives. Molecules. 15, 5282-5335 (2010).
  32. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets. J Vis Exp. , e3373(2011).
  33. Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis. J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).
  34. Nakayama, G. R., Caton, M. C., Nova, M. P., Parandoosh, Z. Assessment of the Alamar Blue assay for cellular growth and viability in vitro. J Immunol Methods. 204, 205-208 (1997).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Synteza peptoid wsynteza w fazie sta ejmetoda submonomerowamonomery lizynowemonomery argininowereakcja guanidynowaniaHPLC w fazie odwr conejtest cytotoksyczno ciLeishmania mexicana

Powiązane artykuły