Method Article

Monitorowanie segregacji przestrzennej w kolonizujących powierzchniowo populacjach drobnoustrojów

DOI:

10.3791/54752

⸱

October 29th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Terrestrial Biofilms Group, Institute of Microbiology, Friedrich Schiller University, Jena

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rola asortymentu (segregacji przestrzennej) w scenariuszach ewolucyjnych może być badana za pomocą prostych systemów mikrobiologicznych w laboratorium, które pozwalają na kontrolowane dostosowanie rozkładu przestrzennego. Modyfikując gęstość komórek założycielskich, można wizualizować różne poziomy asortymentu przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie szczepów bakteryjnych w biofilmach kolonii Bacillus subtilis.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroby dostarczają intrygującego systemu do badania interakcji społecznych między osobnikami w populacji. Krótki czas generacji i stosunkowo proste procedury modyfikacji genetycznej drobnoustrojów ułatwiają rozwój dziedziny socjomikrobiologii. Aby ocenić przydatność niektórych gatunków drobnoustrojów, wybrane szczepy lub ich genetycznie zmodyfikowane pochodne w obrębie jednej populacji można znakować fluorescencyjnie i śledzić za pomocą mikroskopii dostosowanej do odpowiednich filtrów fluorescencyjnych. Ekspansja kolonii różnych gatunków drobnoustrojów na pożywkach agarowych może być wykorzystana do monitorowania rozmieszczenia przestrzennego komórek wytwarzających charakterystyczne białka fluorescencyjne.

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół użycia szczepów bakteryjnych wytwarzających zielone i czerwone białka do śledzenia układu przestrzennego podczas kolonizacji powierzchniowej, w tym ruchu społeczności napędzanego przez wici (rój), rozprzestrzeniania się za pośrednictwem wzrostu zależnego od egzopolisacharydu i hydrofobiny oraz tworzenia złożonego biofilmu kolonii. Nieudomowione izolaty bakterii Gram-dodatniej, Bacillus subtilis, mogą być wykorzystane do zbadania niektórych cech rozprzestrzeniania się powierzchniowego i ich wpływu na dwuwymiarowe rozmieszczenie na pożywce zestalonej z agarem. Zmieniając liczbę komórek używanych do inicjacji biofilmów kolonijnych, poziomy asortymentu mogą być zmieniane w ciągłej skali. Poklatkowa mikroskopia fluorescencyjna może być wykorzystana do obserwacji interakcji między różnymi fenotypami i genotypami na określonym poziomie asortymentu oraz do określenia względnego sukcesu każdego z nich.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich dziesięcioleciach mikroby zostały uznane za społeczności społeczne związane z różnymi ekosystemami na ziemi1,2. W przeciwieństwie do kultur planktonowych stosowanych w ogólnej praktyce laboratoryjnej, mikroorganizmy w środowisku wykazują zróżnicowany zakres przestrzennych struktur zbiorowisk w zależności od środowiska ekologicznego. Proste systemy mikrobiologiczne mogą być wykorzystane do zrozumienia wpływu struktur przestrzennych na ewolucję interakcji społecznych3,4. W publikacjach z ostatnich 2-3 lat, w których wykorzystano zarówno modele eukariotyczne, jak i prokariotyczne, zwrócono uwagę na wpływ struktur przestrzennych na stabilność współpracy w obrębie populacji drobnoustrojów5-8. Dodatkowo, obligatoryjne interakcje między drobnoustrojami, np. metaboliczne karmienie krzyżowe, mogą również zmieniać rozkład przestrzenny oddziałujących partnerów9-11. Wpływ struktury przestrzennej w tych badaniach badany jest najczęściej za pomocą przylegających do powierzchni komórek siedzących zasiedlających tzw. biofilmy lub w koloniach rosnących na powierzchni podłoża agarowego. Dryf genetyczny skutkujący wysokim asortymentem przestrzennym można zaobserwować w koloniach drobnoustrojów, w których niedobór składników odżywczych na krawędzi podziału komórkowego za pośrednictwem ekspansji powoduje szereg wąskich gardeł genetycznych, co powoduje wysokie prawdopodobieństwo miejscowej fiksacji dla niektórych linii klonalnych12. Dryf genetyczny można zatem wykorzystać do zbadania roli segregacji przestrzennej w koloniach drobnoustrojów.

W środowisku biofilmy to wielogatunkowe zbiorowiska otoczone samodzielnie wyprodukowaną matrycą polimerową13. Struktura, funkcja i stabilność biofilmu zależą od złożonej sieci interakcji społecznych, w których bakterie wymieniają sygnały, składniki matrycy i zasoby lub konkurują o przestrzeń i składniki odżywcze za pomocą toksyn i antybiotyków. Bacillus subtilis jest bakterią żyjącą w glebie i kolonizującą korzenie, która rozwija wysoce zorganizowane zbiorowiska biofilmu14. Analogicznie do owadów społecznych, komórki B. subtilis stosują strategię podziału pracy, rozwijając subpopulacje producentów macierzy zewnątrzkomórkowej i kanibali, komórek ruchliwych, uśpionych zarodników i innych typów komórek15,16. Proces różnicowania jest dynamiczny i może być zmieniany przez warunki środowiskowe17,18.

Strategie kolonizacji powierzchni przez bakterie mogą być łatwo manipulowane w warunkach laboratoryjnych poprzez modyfikację stężenia agaru w pożywce wzrostowej. Przy niskich poziomach agaru (0,2-0,3%) bakterie zawierające aktywne wici są w stanie pływać, podczas gdy agar półstały (0,7-1% agar) ułatwia rozprzestrzenianie się społeczności napędzanej wicią, zwanej rojem19-21. W przypadku braku wici niektóre szczepy bakteryjne są w stanie przemieszczać się po półstałym podłożu poprzez przesuwanie, tj. zależną od wzrostu ekspansję populacji ułatwioną przez matrycę egzopolisacharydową i inne wydzielane związki hydrofobinowe22-24. Wreszcie, bakterie, które są zdolne do rozwoju biofilmu, tworzą złożone architektonicznie kolonie na twardym podłożu agarowym (1,2-2%)14,17,25. Podczas gdy cechy te są badane w laboratorium poprzez precyzyjne dostosowanie warunków, w siedliskach naturalnych te strategie rozprzestrzeniania się powierzchniowego mogą stopniowo przechodzić z jednej na drugą w zależności od warunków środowiskowych26. Podczas gdy ruchliwość oparta na pojedynczych komórkach ma kluczowe znaczenie podczas inicjacji rozwoju biofilmu na granicy powietrze-ciecz zarówno u bakterii Gram-dodatnich, jak i -ujemnych27, delecja ruchliwości wici nie ma wpływu na złożone biofilmy kolonii B. subtilis 28. Jednak organizacja przestrzenna podczas rozwoju biofilmów kolonii B. subtilis zależy od gęstości inokulum bakteryjnego użytego do zainicjowania biofilmu8.

Tutaj używamy B. subtilis, aby pokazać, że segregacja przestrzenna podczas kolonizacji powierzchniowej zależy od mechanizmu ruchliwości populacji (tj. roju lub przesuwania), a rozwój biofilmu kolonii zależy od gęstości komórek założycielskich. Przedstawiamy narzędzie do mikroskopii fluorescencyjnej, które można zastosować do ciągłego monitorowania wzrostu biofilmu drobnoustrojów, kolonizacji powierzchni i asortymentu w skali makro. Ponadto przedstawiono metodę kwantyfikacji w celu określenia względnej liczebności szczepów w populacji.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych, półstałych płytek agarowych i biofilmowych, Kultury wstępne

  1. Średnie przygotowanie do rojenia i ślizgania się
    1. Rozpuścić 2 g bulionu Lenox (LB) i 0,7 g agar-agaru w 100 ml wody jonowymiennej i sterylizować w autoklawie przez 20 minut w temperaturze 120 °C. Stosować małe objętości (50-200 ml), aby poprawić odtwarzalność między eksperymentami.
    2. Natychmiast po sterylizacji zamknąć nakrętkę pożywki w celu zmniejszenia parowania i umieścić w inkubatorze o temperaturze 55 °C na co najmniej 2 godziny.
    3. Po podgrzaniu pożywki do 55 °C wlać 20 ml pożywki agarowej LB na polistyrenową szalkę Petriego o średnicy 90 mm pod sterylnym kapturem laboratoryjnym. W przypadku eksperymentów poklatkowych wlej 5 ml pożywki agarowej LB na polistyrenową szalkę Petriego o średnicy 35 mm.
    4. Zamknij szalkę Petriego natychmiast po naleniu, ułóż nie więcej niż 4 płytki jedna na drugiej i pozwól pożywce agarowej zestalać się przez co najmniej 1 godzinę.
  2. 2xSG Pożywka Preparat do Biofilmów Kolonii
    1. Rozpuścić 1,6 g bulionu odżywczego, 0,2 g KCl, 0,05 g MgSO4 7H2O i1,5 g agaru agarowego w 100 ml wody jonowymiennej i autoklawować przez 20 minut w temperaturze 120 °C. Stosować małe objętości (50-200 ml), aby poprawić odtwarzalność między eksperymentami.
    2. Natychmiast po sterylizacji zamknąć nakrętkę pożywki, aby zmniejszyć parowanie i umieścić butelkę w inkubatorze o temperaturze 55 °C na co najmniej 2 godziny.
    3. Po samoczynnym dostosowaniu temperatury medium do 55 °C dodać 0,1 ml wysterylizowanego filtrem roztworu 1M Ca(NO3)2, 0,1 ml wysterylizowanego filtrem 100 mM roztworu MnCl2, 0,1 ml wysterylizowanego filtrem 1 mM roztworu FeSO4 i 0,5 ml sterylnego 20% roztworu glukozy.
    4. Do sterylnego kaptura laboratoryjnego wlać 20 ml agaru 2x pożywki SG na polistyrenową szalkę Petriego o średnicy 90 mm. W przypadku eksperymentów poklatkowych wlej 5 ml pożywki agarowej LB na polistyrenową szalkę Petriego o średnicy 35 mm.
    5. Zamknij szalkę Petriego natychmiast po nalaniu płytkę, ułóż płytkę jedna na drugiej, ale nie więcej niż 4 płytki, i pozwól pożywce agarowej zestalić się przez co najmniej 1 godzinę.
  3. Przygotowanie kultur starterowych
    UWAGA: Szczepy pochodne B. subtilis 168, NCIB 3610 stosowane w metodach opisanych poniżej konstytutywnie wytwarzają białka zielonej lub czerwonej fluorescencji i zostały opisane przed8,27. Szczepy są rutynowo przechowywane w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
    1. Zaszczepić kultury starterowe z zapasów o temperaturze -80 °C w 3 ml pożywki LB i inkubować przez noc (16-18 godzin) w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem poziomym (225 obr./min). Nie inkubuj kultury dłużej niż 18 godzin, ponieważ dzikie izolaty B. subtilis są w większości podatne na agregację i tworzenie biofilmu w probówce.

2. Jednoczesna inokulacja fluorescencyjnie znakowanych szczepów bakteryjnych w celu rozprzestrzeniania się powierzchniowego

  1. Suszenie półstałych płytek agarowych do rojenia i przesuwania B. subtilis.
    1. Suszyć płytki agarowe do rojenia i przesuwania przez 20 minut przed inokulacją. Suche płytki odkryte w okapie z przepływem laminarnym (patrz rysunek 1).
      UWAGA: Rojenie się i ślizganie bakterii zależy od suchości półstałego podłoża agarowego. Niewystarczające suszenie pozwala na gromadzenie się wody na podłożu agarowym, co skutkuje pływaniem za pośrednictwem wici. Wydłużony czas schnięcia powoduje brak rojenia.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Eksperymentalny przepływ pracy. Na rysunku przedstawiono typową procedurę, w tym przygotowanie pożywki do hodowli, suszenie płytki, inokulację i wykrywanie mikroskopią fluorescencyjną (od lewej do prawej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Koinokulacja kultur bakteryjnych w celu rojenia i ślizgania się
    1. Oznaczyć gęstości optyczne nocnych kultur starterowych przy długości fali 600 nm i wymieszać gęstość znormalizowanych szczepów B. subtilis NCIB 3610 lub jego pochodnejΔ hag w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Na przykład zmieszać 100 μl szczepu 1 z (100*[OD600 z nocnej hodowli szczepu 1]/[OD600 z nocnej hodowli szczepu 2]) μl szczepu 2. Łagodne wirowanie (3 sekundy przy maksymalnej prędkości) dla jednorodnego rozkładu.
      UWAGA: Szczepy B. subtilis NCIB 3610 są inokulowane w celu obserwacji roju, podczas gdy ich pochodne Δhag są używane do ślizgania.
    2. Umieścić 2 μl mieszanej kultury na środku wstępnie wysuszonej płytki (patrz rysunek 1) i dalej suszyć płytkę przez 10 minut po inokulacji.
    3. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w pozycji pionowej, aby nadmiar wilgoci mógł skondensować się na pokrywce, a nie na powierzchni agaru.
      UWAGA: Czas inkubacji roju B. subtilis wynosi zwykle od 8 do 16 godzin. Ogólnie rzecz biorąc, krawędź roju dociera do boku szalki Petriego o średnicy 90 mm w ciągu 8 godzin. Przesuwanie jest wolniejszym procesem i wymaga co najmniej 16 do 42 godzin inkubacji. Po 36 godzinach przesuwany przód dociera do boku szalki Petriego o średnicy 90 mm.
    4. W przypadku eksperymentów poklatkowych należy umieścić szalki Petriego o średnicy 35 mm w nagrzanej komorze inkubacyjnej ustawionej na 37 °C. Upewnij się, że pokrywka szalki Petriego pozostaje zdjęta przez cały czas trwania doświadczenia. Ustawić pokrywę inkubatora etapowego na 40 °C, aby uniknąć tworzenia się wilgoci na górze inkubatora.

3. Jednoczesna inokulacja fluorescencyjnie znakowanych szczepów bakteryjnych o różnych początkowych gęstościach komórek

  1. Suszenie płytek agarowych w celu tworzenia biofilmu kolonii B. subtilis.
    1. Wysuszyć płytki w celu rozwoju biofilmu kolonii bez przykrycia w kapturze z przepływem laminarnym przez 15 minut przed inokulacją.
      UWAGA: Niewystarczające suszenie powoduje wzrost wilgotności i może być możliwe pływanie lub rój29. Zbyt długie suszenie powoduje powstawanie małych kolonii biofilmu.
  2. Przygotowanie 10-krotnie rozcieńczonych kultur starterowych do biofilmów kolonii
    1. Wymieszać 100 μl białka o zielonej i czerwonej fluorescencji, które na noc wytwarza kultury starterowe B. subtilis 168 w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml i delikatnie przemieszać w celu uzyskania jednorodnego rozprowadzenia. Przygotować serię 10-krotnych rozcieńczeń w pożywce LB.
    2. Umieścić 2 μl nierozcieńczonych lub 101, 102, 103, 104 rozcieńczonych mieszanych kultur na płytce zawierającej podłoże indukujące biofilm.
      UWAGA: Na pojedynczej szalce Petriego o średnicy 90 mm można zainicjować od 6 do 9 kolonii biofilmu, biorąc pod uwagę, że kolonie są oddzielone od siebie w równej odległości.
    3. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C w pozycji pionowej, aby nadmiar wilgoci skondensował się na pokrywce, a nie na powierzchni agaru.
      UWAGA: Czas inkubacji biofilmu B. subtilis wynosi od 1 do 3 dni. Ogólnie rzecz biorąc, biofilm kolonii B. subtilis osiąga średnią wielkość i złożoną strukturę w ciągu 2 dni.
    4. W przypadku eksperymentów poklatkowych należy umieścić pojedyncze inokulum w środku szalki Petriego o średnicy 35 mm i umieścić szalkę w nagrzanej komorze inkubacyjnej ustawionej na 30 °C. Upewnij się, że górna część szalki Petriego pozostaje usunięta przez cały czas trwania eksperymentu. Ustawić pokrywę inkubatora etapowego na 35 °C, aby uniknąć tworzenia się wilgoci na górze inkubatora.

4. Wykrywanie znakowanych szczepów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

  1. Opis sprzętu do obrazowania.
    1. Do wykrywania kolonizacji powierzchni i sygnału fluorescencji należy użyć zmotoryzowanego mikroskopu stereoskopowego z zoomem fluorescencyjnym (patrz szczegółowa lista w Tabeli Materiałów) wyposażonego w obiektyw PlanApo 0,5X, dwa źródła zimnego światła LED (jedno do wykrywania fluorescencji i jedno do światła widzialnego), zestawy filtrów dla GFP (wzbudzenie przy 470/40 nm i emisja przy 525/50 nm) i mRFP (wzbudzenie przy 572/25 nm i emisja przy 629/62 nm), i monochromatyczny aparat o wysokiej rozdzielczości.
    2. Akwizycja i przetwarzanie obrazu odbywa się za pomocą odpowiedniego oprogramowania dostępnego dla stereoskopowego mikroskopu zmiennoogniskowego, w tym modułów wielokanałowych i poklatkowych. Do eksperymentu poklatkowego użyj standardowego inkubatora ze stopniem grzewczym zamontowanego na stereoskopowym mikroskopie zmiennoogniskowym za pomocą adaptera.
  2. Obrazowanie roju i ślizgającej się ekspansji
    1. Użyj najmniejszego powiększenia, aby uchwycić jak największy obszar płyty 90 mm. Ustawić początek inokulacji (środek płytki Petriego o średnicy 90 mm) w rogu widocznego pola w celu monitorowania promieniowej ekspansji bakterii i fluorescencji.
    2. Dostosuj optymalny czas ekspozycji w zależności od siły sygnału fluorescencji.
      UWAGA: Dla konstytutywnie wyrażonych genów fluorescencji u B. subtilis można zastosować fluorescencję zieloną i czerwoną z czasem ekspozycji odpowiednio 1,5 i 3 sekundy. Dodatkowo czas naświetlania 10 ms jest odpowiedni dla światła widzialnego.
  3. Użyj powiększenia, które pozwala na wykrycie całej kolonii biofilmu i dostosuj kolonię w środku pola widzenia.
    UWAGA: Jeśli chodzi o ekspansje rojowe i ślizgowe, optymalne czasy ekspozycji do wykrywania sygnałów fluorescencyjnych w koloniach biofilmu zależą od poziomu ekspresji genów kodujących białka fluorescencyjne. W przypadku reprezentatywnych wyników poniżej, fluorescencję zieloną i czerwoną wykryto przy użyciu odpowiednio 1 i 3 sekundowych interwałów ekspozycji.
  4. W przypadku obrazowania poklatkowego uzyskuj obrazy w określonych odstępach czasu, używając stałych czasów ekspozycji.
  5. Obrazy zarejestrowane w stereoskopowym mikroskopie fluorescencyjnym można zapisać w formacie pliku rozpoznawanym przez oprogramowanie ImageJ do analizy danych ilościowych.

5. Analiza danych

  1. Aby przeanalizować obszar zajmowany przez każdy inaczej oznakowany szczep fluorescencyjny, otwórz interesujący Cię plik w oprogramowaniu ImageJ rozszerzonym o wtyczkę BioVoxxel.
    1. Gdy pojawi się okno o nazwie "Opcje importu formatów biologicznych", w którym wybrane są tylko opcje "Otwórz wszystkie serie" i "Automatyczne skalowanie", otwórz plik, klikając "OK".
      UWAGA: Pliki są wyświetlane jako stos trzech obrazów, po jednym dla każdego kanału używanego do rejestrowania obrazu w mikroskopie (obrazy z zieloną, czerwoną fluorescencją i jasnym polem).
    2. Podziel stos na poszczególne obrazy kanałów, wybierając "Obraz" - "Stosy" - "Stos do obrazów" w panelu sterowania ImageJ.
      UWAGA: Pojawiają się obrazy ponumerowane jako 1/3 (kanał zielony), 2/3 (kanał czerwony) i 3/3 (jasne pole). W tym przypadku obraz w jasnym polu jest wyłączony z analizy.
  2. Aby przeanalizować obrazy, przekształć każdy z nich w obraz 8-bitowy, wybierając "Obraz" - "Typ" - "8-bitowy".
  3. Aby określić zajęty obszar w pikselu2, zresetuj skalę obrazów za pomocą "Analizuj" - "Ustaw skalę". Gdy pojawi się okno z różnymi opcjami skali, zresetuj skalę, wybierając "Kliknij, aby usunąć skalę". Zaznacz opcję "Globalny", aby usunąć skalę dla wszystkich otwartych obrazów.
  4. Aby usunąć tło, narysuj owalny obszar (obszar zainteresowania, ROI) poza obszarem fluorescencyjnym za pomocą narzędzia "Owal" w panelu sterowania ImageJ.
    1. Aby upewnić się, że rozmiar owalu tła jest taki sam dla wszystkich analizowanych obrazów, dodaj go do menedżera ROI za pomocą znaku [t] na klawiaturze. Pojawi się okno Menedżera ROI, w którym owalny ROI tła można zapisać za pomocą opcji "Więcej" - "Zapisz".
    2. Jeśli na obrazie widoczny jest owalny zwrot z inwestycji w tło, zmierz intensywność obszaru, wybierając "Analizuj" - "Zmierz".
      UWAGA: Pojawi się okno wyników, w którym w kolumnie oznaczonej "Średnia" wyświetlana jest m.in. średnia intensywność fluorescencji.
    3. Odejmij wartość średniej intensywności fluorescencji tła od obrazu, odznaczając owalny ROI tła, klikając "Proces" - "Matematyka" - "Odejmij" i wstawiając zmierzoną wartość.
  5. Zastosuj próg do obrazu za pomocą opcji "Obraz" - "Dostosuj" - "Próg". Wybierz metodę Otsu i czarno-białą (czarno-biało-biało-biało). Zaznacz opcję "Ciemne tło" i zastosuj próg, klikając "Zastosuj".
    UWAGA: Obraz zmieni się w obraz binarny, w którym obszar powyżej progu jest pokazany w kolorze białym, a obszar poniżej progu jest pokazany w kolorze czarnym.
  6. Wybierz wszystko powyżej progu za pomocą opcji "Analizuj" - "Analizuj cząstki". W oknie z ustawieniami zachowaj opcje domyślne i pozostaw zaznaczone opcje "Wyświetl wyniki" i "Podsumuj". Kliknij "OK", aby wyświetlić podsumowanie w oknie wyników i wyświetlić zajęty obszar w kolumnie oznaczonej "Całkowita powierzchnia".

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy laboratoryjne populacji bakteryjnych stanowią atrakcyjne podejście do zgłębiania zagadnień ekologicznych lub ewolucyjnych. W tym przypadku wykorzystano trzy tryby kolonizacji powierzchniowej B. subtilis do zbadania wyglądu asortymentu populacji, tj. segregacji genetycznie identycznych, ale fluorescencyjnie różnych znakowanych szczepów. Rój, który jest zależnym od wici zbiorowym ruchem powierzchniowym B. subtilis, powoduje powstanie wysoce mieszanej populacji. W tych rojach kolonii obszary skolonizowane przez bakterie zielono- i czerwonofluorescencyjne nakładały się na siebie (patrz ryc. 2A). Gwałtowną kolonizację powierzchni można śledzić w czasie (Rysunek Wideo 1). Podczas roju B subtilis, cienka warstwa komórek rozszerza się z centrum inokulacji po kilku godzinach inkubacji (patrz Ryc. 2B).

figure-results-1
Ryc. 2: Ekspansja roju B. subtilis. Kolonia roju zawiera szczepy o zielonej i czerwonej fluorescencji, które zostały zmieszane w stosunku 1:1 przed inokulacją. (A) Po 15 godzinach fluorescencję zieloną i czerwoną (odpowiednio GFP i RFP) wykryto za pomocą odpowiednich filtrów fluorescencyjnych. (B) Obrazy cienkiej warstwy roju B. subtilis pokazane są w wybranych punktach czasowych wyodrębnionych z Rysunku Wideo 1. Podziałka = 5 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Jednakże, gdy szczepy B. subtilis, które nie mają funkcjonalnych wici, ale są w stanie rozprzestrzeniać się za pomocą wyprodukowanego egzopolisacharydu, hydrofobiny i surfaktyny, zostały zauważone na półstałym podłożu agarowym, różnie oznakowane szczepy zostały rozdzielone w pewnych zdefiniowanych sektorach (patrz Rysunek 3A). Rozwój rodziny ślizgowej można zarejestrować w czasie (patrz rysunek 3B lub rysunek wideo 2).

figure-results-2
Rycina 3: Przesuwająca się kolonia B. subtilis. Kolonia zawiera szczepy o zielonej i czerwonej fluorescencji, które przed inokulacją zmieszano w stosunku 1:1. (A) Po 24 godzinach fluorescencję zieloną i czerwoną (odpowiednio GFP i RFP) wykryto za pomocą odpowiednich filtrów fluorescencyjnych. (B) Obrazy przesuwającego się dysku B. subtilis pokazane są w wybranych punktach czasowych wyodrębnionych z Rysunku 2. Podziałka = 5 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Podczas gdy poziomy asortymentu rojących się i przesuwających się rozszerzających się kolonii nie mogły być modyfikowane, na przestrzenną segregację różnie oznakowanych szczepów fluorescencyjnych w biofilmie kolonii można było wpłynąć na początkową gęstość komórek. Gdy zainicjowano biofilm kolonii B. subtilis o dużej gęstości komórek w mieszanych populacjach, szczepy zielono- i czerwono-fluorescencyjne wykazywały niewielki lub żaden asortyment przestrzenny (patrz ryc. 4). Wręcz przeciwnie, gdy gęstość komórek inicjująca biofilm była niska, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej można było wykryć wyraźne sektory zielonej i czerwonej fluorescencji. Poziom asortymentu był wyraźnie zależny od poziomu rozcieńczenia populacji inicjującej biofilm. Na rysunkach 3 i 4 przedstawiono ekspansję kolonii dla najmniejszego i największego rozcieńczenia zaszczepionych szczepów.

figure-results-3
Rycina 4: Poziom asortymentu w biofilmach kolonii B. subtilis przy różnych początkowych gęstościach komórek. Biofilmy kolonii szczepów o zielonej i czerwonej fluorescencji pokazano po 2 dniach, które zostały zaszczepione różnymi początkowymi gęstościami komórek (od góry do dołu: odpowiednio nierozcieńczone do 105 razy rozcieńczonych kultur inicjujących). Podziałka = 5 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Stosunek szczepów zielono- i czerwono-fluorescencyjnych można dodatkowo określić ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ, które pozwala na ilościową charakterystykę struktury populacji i konkurencyjności szczepów użytych do eksperymentów.

figure-results-4
Wideo Rysunek 1: Zdjęcia poklatkowe roju B. subtilis zainicjowane mieszanką 1:1 zielonych i czerwonych fluorescencyjnych szczepów. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.) Film pokazuje przebieg czasowy wynoszący 10 godzin. Podziałka = 7 mm.

figure-results-5
Wideo Rysunek 2: Zdjęcia poklatkowe przesuwającego się B. subtilis zainicjowane mieszanką 1:1 zielonych i czerwonych fluorescencyjnych szczepów. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.) Film pokazuje przebieg czasowy trwający 24 godziny. Podziałka = 5 mm.

figure-results-6
Wideo Rysunek 3: Obrazy poklatkowe biofilmów kolonii B. subtilis zainicjowanych mieszanką 1:1 szczepów zielono- i czerwono-fluorescencyjnych przy dużej gęstości komórek. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.) Film pokazuje przebieg czasowy wynoszący 48 godzin. Podziałka = 5 mm.

figure-results-7
Wideo Rysunek 4: Obrazy poklatkowe biofilmów kolonii B. subtilis zainicjowane mieszanką 1:1 szczepów zielono- i czerwono-fluorescencyjnych przy niskiej gęstości komórek. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.) Film pokazuje przebieg czasowy wynoszący 48 godzin. Podziałka = 5 mm.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostępność zestawu narzędzi fluorescencyjnych dla bakterii ułatwia nie tylko badanie heterogenicznej ekspresji genów30,31 i lokalizacji białek32, ale także analizę przestrzennego rozmieszczenia szczepów w populacji8. Markery fluorescencyjne o wystarczająco różnych długościach fal wzbudzenia i emisji pozwalają na wyraźną lokalizację dwóch szczepów, które w przeciwnym razie są nie do odróżnienia od siebie po zmieszaniu. Opisany protokół może być wykorzystany do obserwacji dynamiki populacji w kulturach mieszanych, np. eksperymentów konkurencyjnych lub synergii między szczepami lub gatunkami. Zdolność do określenia względnej liczebności szczepów znakowanych fluorescencyjnie w populacji mieszanej nie jest ograniczona do kolonii roju, ślizgania się lub biofilmu przyczepionych do powierzchni, ale może być również wykorzystana do innych wielokomórkowych systemów biofilmu, w tym biofilmów zanurzonych, komórek przepływowych lub biofilmów na granicy faz powietrze-medium27,33-35.

Prezentowana technika jest potężnym narzędziem do wykrywania przestrzennego rozmieszczenia szczepów i projektowania eksperymentów konkursowych, ale pozwala również śledzić niejednorodność ekspresji genów w rozrastających się koloniach. Opisane tutaj warunki hodowli mają zastosowanie do B. subtilis, a dokładne parametry ekspansji na podłożach agarowych mogą wymagać optymalizacji dla innych gatunków lub szczepów20. Umieszczenie próbek w komorze inkubacyjnej podczas obrazowania pozwala eksperymentatorowi śledzić dynamikę populacji w czasie, chociaż należy zwrócić uwagę na poziom wilgotności w komorze podczas inkubacji.

Opisane tu techniki wymagają również modyfikacji genetycznej badanych szczepów bakteryjnych tak, aby szczepy wykazywały ekspresję markerów fluorescencyjnych, które można od siebie odróżnić. Ponadto, oprócz odrębnych widm wzbudzenia i emisji, zaleca się, aby dwa wybrane markery fluorescencyjne miały podobną wydajność kwantową (tj. stosunek emitowanych pochłoniętych fotonów) i były wyrażone na porównywalnym poziomie. Ponadto względne zmiany intensywności w czasie mogą być mierzone i normalizowane do wczesnego punktu czasowego eksperymentu. Względny wzrost lub spadek można następnie porównać między różnymi fluoroforami o różnej wydajności kwantowej. W przedstawionym systemie eksperymentalnym przetestowano wcześniej różne białka zielonej i czerwonej fluorescencji36,37 w celu wybrania najbardziej optymalnych par fluorescencyjnych, które można wykryć u B. subtilis. Dla każdego białka fluorescencyjnego i próbki należy określić optymalny czas ekspozycji. Do skutecznego wykrycia sygnału w populacji mogą być wymagane pewne gęstości komórek lub wiele warstw komórek. Niektóre białka fluorescencyjne mogą mieć niską intensywność w komórkach bakteryjnych z powodu nieefektywnej ekspresji i/lub translacji białka, a tym samym niskiej wydajności kwantowej. Takie nieefektywne markery fluorescencyjne mogą zmniejszyć czułość systemu i wydłużyć czas potrzebny do wykrycia szczepów bakterii, co może prowadzić do cytotoksyczności przez światło wzbudzające. Natężenia fluorescencji można odpowiednio modyfikować poprzez zmianę promotora używanego do ekspresji fluorescencyjnego genu kodującego reporter. Zbyt wysoki poziom ekspresji może spowodować niepotrzebną nadprodukcję białka fluorescencyjnego, co prowadzi do szkodliwych kosztów dopasowania dla bakterii. Przeprowadzając eksperymenty konkursowe, należy wziąć pod uwagę koszt produkcji poszczególnych białek fluorescencyjnych w komórkach. Eksperymenty kontrolne, w których markery fluorescencyjne są zamieniane między konkurencyjnymi szczepami lub gdzie dwa szczepy izogeniczne różniące się tylko markerami fluorescencyjnymi są konkurujące ze sobą, są zawsze wymagane w celu określenia ewentualnego odchylenia w kierunku jednego markera. Czas życia białek fluorescencyjnych w komórkach może również wpływać na zmierzoną intensywność. Ponadto autofluorescencja niektórych gatunków bakterii może wymagać użycia innych markerów fluorescencyjnych niż opisane tutaj.

W celu precyzyjnego określenia rozkładów przestrzennych i liczebności odrębnych szczepów bakterii, sygnał tła pochodzący z pierwszego białka fluorescencyjnego przy użyciu filtra fluorescencyjnego dla drugiego markera fluorescencyjnego i odwrotnie powinien być indywidualnie badany na próbkach monokulturowych (zawierających bakterie wytwarzające tylko jeden marker). Pozwala to na odejmowanie nakładających się na siebie intensywności sygnału fluorescencyjnego. Co ważne, ponieważ stereomikroskop rejestruje sygnał fluorescencyjny znad rozszerzającej się kolonii, prezentowany protokół jest wygodny do wyznaczenia układu przestrzennego w dwóch wymiarach. Architektura powiększającej się populacji bakterii może skutkować różnymi poziomami fluorescencji (tj. struktury przypominające zmarszczki mogą zawierać więcej komórek wykazujących wyższą miejscową intensywność fluorescencji). W związku z tym opisana analiza obrazów określa rozkład przestrzenny, ale nie obfitość szczepów w określonej lokalizacji. Poprzednie protokoły opisywały przygotowanie próbki do roju20 lub obrazowanie fluorescencyjne dynamiki populacji w koloniach bakteryjnych38, ale nasz protokół łączy te techniki. Inne techniki mikroskopowe, które pozwalają na obserwację trójwymiarowej rozdzielczości struktury populacji (np. konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa39,40 lub mikroskopia oświetlenia strukturalnego41) mogą być stosowane do próbek o zwiększonej złożoności strukturalnej. Te dodatkowe techniki wspierają również wykrywanie szczepów31 w oparciu o pojedyncze komórki, które nie jest dostępne przy użyciu mikroskopów stereoskopowych.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otwarty dostęp do tego artykułu wideo został opłacony przez Carl Zeiss Microscopy GmbH.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana z grantu KO4741/3-1 od Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Ponadto laboratorium Á.T.K. otrzymało wsparcie z grantu Marie Skłodowska Curie na integrację zawodową (PheHetBacBiofilm) oraz grantu KO4741/2-1 z DFG. T.H., A.D., R.G.-M. i E.M. byli wspierani odpowiednio przez Międzynarodową Szkołę Badawczą Maxa Plancka, Fundację Alexandra von Humboldta, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa-Niemiecką Służbę Wymiany Akademickiej (CONACyT-DAAD) oraz stypendia JSMC.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lennox Bulion (LB)Carl Roth GmbHX964
Agar-agar, Kobe ICarl Roth GmbH5210
Petriego (średnica 90 mm)dowolnabrak danychStosować szalki Petriego bez krzywek wentylacyjnych
Szalka Petriego (średnica 35 mm)dowolnabrak danychStosować szalki Petriego bez krzywek wentylacyjnych
Difco Nutrient BulionBD Europe234000
KClanyNA
MgSO,4 7H2OanyNA
Ca(NO3)2 4H2OanyNA
MnCl24H2OanyNA
FeSO4dowolnyNA
D-GlucosedowolnyNA
silny>Fluorescencyjny mikroskop poklatkowy AxioZoom V16Carl Zeiss Microscopy GmbHpatrz poniżej szczegółowy opis
AxioZoom V16 Korpus mikroskopuCarl Zeiss Microscopy GmbH435080 9030 000
Tuba Fototube Z 100:0 do Axio Zoom V16Carl Zeiss Microscopy GmbH435180 9020 000bez okularów
Fluar Illuminator Z mot Fluorescencyjna rurka pośrednia do Axio Zoom.V16Carl Zeiss Microscopy GmbH435180 9060 000
Kontroler EMS 3Carl Zeiss Microscopy GmbH435610 9010 000
Panel sterowania systemu SYCOP 3Carl Zeiss Microscopy GmbH435611 9010 000
Moduł reflektora ZCarl Zeiss Microscopy GmbH435180 9160 000Do oświetlacza fluarnego Z mot na Axio Zoom.V16 i SYCOP 3
Zestaw filtrów 38 HE eGFP shift free (E)Carl Zeiss Microscopy GmbH489038 9901 000EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50
Zestaw filtrów 63 HE mRFP shift free (E)Carl Zeiss Microscopy GmbH489063 0000 000EX BP 572/25, BS FT 590, EM BP 629/62
Mount SCarl Zeiss Microscopy GmbH435402 0000 000
Objektive PlanApo Z 0,5x/0,125 FWD 114 mmCarl Zeiss Microscopy GmbH435280 9050 000164 mm długość parafokalna; Gwint M62x0,75 z przodu
Napęd zgrubny/precyzyjny z kolumną profilowąCarl Zeiss Microscopy GmbH435400 0000 000490 mm, udźwig 10 kg, kompatybilny z podstawami statywowymi 300/450
Podstawa statywu 450Carl Zeiss Microscopy GmbH435430 9902 000
Źródło zimnego światła Zeiss CL 9000 LED CANCarl Zeiss Microscopy GmbH435700 9000 000
magistrali CANCarl Zeiss Microscopy GmbH457411 9011 000Długość 2,5 m
Oświetlacz szczelinowyCarl Zeiss Microscopy GmbH417075 9010 000d = 66 mm
Elastyczny światłowód 1500Carl Zeiss Microscopy GmbH417063 9901 0008/1.000 mm 
Adapter oświetlenia do światłowoduCarl Zeiss Microscopy GmbH000000 1370 927
Lightguide HXP z wypełnieniem płynemCarl Zeiss Microscopy GmbH000000 0482 760ø Adapter do aparatu 3 mm x 2 000 mm
60N-C Carl Zeiss Microscopy GmbH426113 0000 0002/3" 0,63X
Kamera mikroskopowa o wysokiej rozdzielczości AxioCam MRm Rev. 3 FireWireCarl Zeiss Microscopy GmbH426509 9901 000
Zestaw spustowych AxioCam FireWireCarl Zeiss Microscopy GmbH426506 0002 000do bezpośredniej synchronizacji migawki
ZEN pro 2012Carl Zeiss Microscopy GmbH410135 1002 120Edycja niebieska, wymaga min. Windows 7 64-bitowy
moduł ZEN Upływ czasuCarl Zeiss Microscopy GmbH410136 1031 110
Standardowy inkubator górny ze stopniem grzewczymTokai HitINUL-MS1-F1
Adapter bazowy mikroskopu stereoskopowego ZeissTokai HitMS-V12
Softwares
ImageJNarodowy Instytut Zdrowia, Bethesda, MD, USAv 1.49m
BioVoxxel wtyczkaBioVoxxelhttp://www.biovoxxel.de/development/
szalka <

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The sociobiology of biofilms. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).">Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. The sociobiology of biofilms. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).
  2. Social evolution theory for microorganisms. Nat Rev Microbiol. 4 (8), 597-607 (2006).">West, S. A., Griffin, A. S., Gardner, A., Diggle, S. P. Social evolution theory for microorganisms. Nat Rev Microbiol. 4 (8), 597-607 (2006).
  3. Impact of spatial distribution on the development of mutualism in microbes. Front Microbiol. 5, 649(2014).">Kovács, ÁT. Impact of spatial distribution on the development of mutualism in microbes. Front Microbiol. 5, 649(2014).
  4. Laboratory evolution of microbial interactions in bacterial biofilms. J Bacteriol. , (2016).">Martin, M., Hölscher, T., Dragoš, A., Cooper, V. S., Kovács, ÁT. Laboratory evolution of microbial interactions in bacterial biofilms. J Bacteriol. , (2016).
  5. Solutions to the public goods dilemma in bacterial biofilms. Curr Biol. 24 (1), 50-55 (2014).">Drescher, K., Nadell, C. D., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Solutions to the public goods dilemma in bacterial biofilms. Curr Biol. 24 (1), 50-55 (2014).
  6. Spatial self-organization favors heterotypic cooperation over cheating. Elife. 2, e00960(2013).">Momeni, B., Waite, A. J., Shou, W. Spatial self-organization favors heterotypic cooperation over cheating. Elife. 2, e00960(2013).
  7. Spatial population expansion promotes the evolution of cooperation in an experimental Prisoner's Dilemma. Curr Biol. 23 (10), 919-923 (2013).">van Dyken, J. D., Müller, M. J., Mack, K. M., Desai, M. M. Spatial population expansion promotes the evolution of cooperation in an experimental Prisoner's Dilemma. Curr Biol. 23 (10), 919-923 (2013).
  8. Density of founder cells affects spatial pattern formation and cooperation in Bacillus subtilis biofilms. ISME J. 8 (10), 2069-2079 (2014).">van Gestel, J., Weissing, F. J., Kuipers, O. P., Kovács, ÁT. Density of founder cells affects spatial pattern formation and cooperation in Bacillus subtilis biofilms. ISME J. 8 (10), 2069-2079 (2014).
  9. Strong inter-population cooperation leads to partner intermixing in microbial communities. Elife. 2, e00230(2013).">Momeni, B., Brileya, K. A., Fields, M. W., Shou, W. Strong inter-population cooperation leads to partner intermixing in microbial communities. Elife. 2, e00230(2013).
  10. Genetic drift opposes mutualism during spatial population expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (3), 1037-1042 (2014).">Müller, M. J., Neugeboren, B. I., Nelson, D. R., Murray, A. W. Genetic drift opposes mutualism during spatial population expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (3), 1037-1042 (2014).
  11. Privatization of cooperative benefits stabilizes mutualistic cross-feeding interactions in spatially structured environments. ISME J. 10, 1413-1423 (2016).">Pande, S., et al. Privatization of cooperative benefits stabilizes mutualistic cross-feeding interactions in spatially structured environments. ISME J. 10, 1413-1423 (2016).
  12. Genetic drift at expanding frontiers promotes gene segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (50), 19926-19930 (2007).">Hallatschek, O., Hersen, P., Ramanathan, S., Nelson, D. R. Genetic drift at expanding frontiers promotes gene segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (50), 19926-19930 (2007).
  13. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).">Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
  14. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 157-168 (2013).">Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 157-168 (2013).
  15. Extracellular signals that define distinct and coexisting cell fates in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 34 (2), 134-149 (2010).">Lopez, D., Kolter, R. Extracellular signals that define distinct and coexisting cell fates in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 34 (2), 134-149 (2010).
  16. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 152-163 (2009).">Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 152-163 (2009).
  17. From environmental signals to regulators: Modulation of biofilm development in Gram-positive bacteria. J Basic Microbiol. , (2014).">Mhatre, E., Monterrosa, R. G., Kovács, ÁT. From environmental signals to regulators: Modulation of biofilm development in Gram-positive bacteria. J Basic Microbiol. , (2014).
  18. Nutrient depletion in Bacillus subtilis biofilms triggers matrix production. New J Physics. 16, 015028(2014).">Zhang, W., et al. Nutrient depletion in Bacillus subtilis biofilms triggers matrix production. New J Physics. 16, 015028(2014).
  19. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).">Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
  20. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. J Vis Exp. (98), (2015).">Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. J Vis Exp. (98), (2015).
  21. Bacillus subtilis spreads by surfing on waves of surfactant. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (43), 18109-18113 (2009).">Angelini, T. E., Roper, M., Kolter, R., Weitz, D. A., Brenner, M. P. Bacillus subtilis spreads by surfing on waves of surfactant. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (43), 18109-18113 (2009).
  22. A Duo of Potassium-Responsive Histidine Kinases Govern the Multicellular Destiny of Bacillus subtilis. MBio. 6 (4), e00581(2015).">Grau, R. R., et al. A Duo of Potassium-Responsive Histidine Kinases Govern the Multicellular Destiny of Bacillus subtilis. MBio. 6 (4), e00581(2015).
  23. Flagella-independent surface motility in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1850-1855 (2015).">Park, S. Y., Pontes, M. H., Groisman, E. A. Flagella-independent surface motility in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1850-1855 (2015).
  24. From cell differentiation to cell collectives: Bacillus subtilis uses division of labor to migrate. PLoS Biol. 13 (4), e1002141(2015).">van Gestel, J., Vlamakis, H., Kolter, R. From cell differentiation to cell collectives: Bacillus subtilis uses division of labor to migrate. PLoS Biol. 13 (4), e1002141(2015).
  25. Biofilm formation and dispersal in Gram-positive bacteria. Curr Opin Biotechnol. 22 (2), 172-179 (2011).">Abee, T., Kovács, ÁT., Kuipers, O. P., van der Veen, S. Biofilm formation and dispersal in Gram-positive bacteria. Curr Opin Biotechnol. 22 (2), 172-179 (2011).
  26. Bacterial differentiation via gradual activation of global regulators. Curr Genet. 62 (1), 125-128 (2016).">Kovács, ÁT. Bacterial differentiation via gradual activation of global regulators. Curr Genet. 62 (1), 125-128 (2016).
  27. Motility, chemotaxis and aerotaxis contribute to competitiveness during bacterial pellicle biofilm development. J Mol Biol. 427 (23), 3695-3708 (2015).">Hölscher, T., et al. Motility, chemotaxis and aerotaxis contribute to competitiveness during bacterial pellicle biofilm development. J Mol Biol. 427 (23), 3695-3708 (2015).
  28. Osmotic spreading of Bacillus subtilis biofilms driven by an extracellular matrix. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1116-1121 (2012).">Seminara, A., et al. Osmotic spreading of Bacillus subtilis biofilms driven by an extracellular matrix. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1116-1121 (2012).
  29. Laboratory strains of Bacillus subtilis do not exhibit swarming motility. J Bacteriol. 191 (22), 7129-7133 (2009).">Patrick, J. E., Kearns, D. B. Laboratory strains of Bacillus subtilis do not exhibit swarming motility. J Bacteriol. 191 (22), 7129-7133 (2009).
  30. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), e3145(2011).">de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), e3145(2011).
  31. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. (60), (2012).">Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. (60), (2012).
  32. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469(2014).">Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469(2014).
  33. Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Environ Microbiol. 10 (9), 2331-2343 (2008).">Barken, K. B., et al. Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Environ Microbiol. 10 (9), 2331-2343 (2008).
  34. Biofilm formation as a response to ecological competition. PLoS Biol. 13 (7), e1002191(2015).">Oliveira, N. M., et al. Biofilm formation as a response to ecological competition. PLoS Biol. 13 (7), e1002191(2015).
  35. Probing phenotypic growth in expanding Bacillus subtilis biofilms. Appl Microbiol Biotechnol. 100, 4607-4615 (2016).">Wang, X., et al. Probing phenotypic growth in expanding Bacillus subtilis biofilms. Appl Microbiol Biotechnol. 100, 4607-4615 (2016).
  36. Single cell FRET analysis for the identification of optimal FRET-pairs in Bacillus subtilis using a prototype MEM-FLIM system. PLoS One. 10 (4), e0123239(2015).">Detert Oude Weme, R. G., et al. Single cell FRET analysis for the identification of optimal FRET-pairs in Bacillus subtilis using a prototype MEM-FLIM system. PLoS One. 10 (4), e0123239(2015).
  37. Benchmarking various green fluorescent protein variants in Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae, and Lactococcus lactis for live cell imaging. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6481-6490 (2013).">Overkamp, W., et al. Benchmarking various green fluorescent protein variants in Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae, and Lactococcus lactis for live cell imaging. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6481-6490 (2013).
  38. Monitoring intraspecies competition in a bacterial cell population by cocultivation of fluorescently labelled strains. J Vis Exp. (83), e51196(2014).">Stannek, L., Egelkamp, R., Gunka, K., Commichau, F. M. Monitoring intraspecies competition in a bacterial cell population by cocultivation of fluorescently labelled strains. J Vis Exp. (83), e51196(2014).
  39. Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity. Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).">Bridier, A., Briandet, R. Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity. Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).
  40. Concurrent quantification of cellular and extracellular components of biofilms. J Vis Exp. (82), e50639(2013).">Khajotia, S. S., Smart, K. H., Pilula, M., Thompson, D. M. Concurrent quantification of cellular and extracellular components of biofilms. J Vis Exp. (82), e50639(2013).
  41. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).">Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Spatial SegregationFluorescent MicroscopyBacillus SubtilisSwarming SlidingColony BiofilmFluorescent Protein StrainsTime lapse ImagingSurface ColonizationMicrobial InteractionFounder Cell Density

Related Articles