Artykuł metodologiczny

Monitorowanie segregacji przestrzennej w kolonizujących powierzchniowo populacjach drobnoustrojów

13.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54752

⸱

29 października 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Terrestrial Biofilms Group, Institute of Microbiology, Friedrich Schiller University, Jena

W tym artykule

Podsumowanie

Rola asortymentu (segregacji przestrzennej) w scenariuszach ewolucyjnych może być badana za pomocą prostych systemów mikrobiologicznych w laboratorium, które pozwalają na kontrolowane dostosowanie rozkładu przestrzennego. Modyfikując gęstość komórek założycielskich, można wizualizować różne poziomy asortymentu przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie szczepów bakteryjnych w biofilmach kolonii Bacillus subtilis.

Streszczenie

Mikroby dostarczają intrygującego systemu do badania interakcji społecznych między osobnikami w populacji. Krótki czas generacji i stosunkowo proste procedury modyfikacji genetycznej drobnoustrojów ułatwiają rozwój dziedziny socjomikrobiologii. Aby ocenić przydatność niektórych gatunków drobnoustrojów, wybrane szczepy lub ich genetycznie zmodyfikowane pochodne w obrębie jednej populacji można znakować fluorescencyjnie i śledzić za pomocą mikroskopii dostosowanej do odpowiednich filtrów fluorescencyjnych. Ekspansja kolonii różnych gatunków drobnoustrojów na pożywkach agarowych może być wykorzystana do monitorowania rozmieszczenia przestrzennego komórek wytwarzających charakterystyczne białka fluorescencyjne.

Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół użycia szczepów bakteryjnych wytwarzających zielone i czerwone białka do śledzenia układu przestrzennego podczas kolonizacji powierzchniowej, w tym ruchu społeczności napędzanego przez wici (rój), rozprzestrzeniania się za pośrednictwem wzrostu zależnego od egzopolisacharydu i hydrofobiny oraz tworzenia złożonego biofilmu kolonii. Nieudomowione izolaty bakterii Gram-dodatniej, Bacillus subtilis, mogą być wykorzystane do zbadania niektórych cech rozprzestrzeniania się powierzchniowego i ich wpływu na dwuwymiarowe rozmieszczenie na pożywce zestalonej z agarem. Zmieniając liczbę komórek używanych do inicjacji biofilmów kolonijnych, poziomy asortymentu mogą być zmieniane w ciągłej skali. Poklatkowa mikroskopia fluorescencyjna może być wykorzystana do obserwacji interakcji między różnymi fenotypami i genotypami na określonym poziomie asortymentu oraz do określenia względnego sukcesu każdego z nich.

Wprowadzenie

W ostatnich dziesięcioleciach mikroby zostały uznane za społeczności społeczne związane z różnymi ekosystemami na ziemi1,2. W przeciwieństwie do kultur planktonowych stosowanych w ogólnej praktyce laboratoryjnej, mikroorganizmy w środowisku wykazują zróżnicowany zakres przestrzennych struktur zbiorowisk w zależności od środowiska ekologicznego. Proste systemy mikrobiologiczne mogą być wykorzystane do zrozumienia wpływu struktur przestrzennych na ewolucję interakcji społecznych3,4. W publikacjach z ostatnich 2-3 lat, w których wykorzystano zarówno modele eukariotyczne, jak i prokariotyczne, zwrócono uwagę na wpływ struktur przestrzennych na stabilność współpracy w obrębie populacji drobnoustrojów5-8. Dodatkowo, obligatoryjne interakcje między drobnoustrojami, np. metaboliczne karmienie krzyżowe, mogą również zmieniać rozkład przestrzenny oddziałujących partnerów9-11. Wpływ struktury przestrzennej w tych badaniach badany jest najczęściej za pomocą przylegających do powierzchni komórek siedzących zasiedlających tzw. biofilmy lub w koloniach rosnących na powierzchni podłoża agarowego. Dryf genetyczny skutkujący wysokim asortymentem przestrzennym można zaobserwować w koloniach drobnoustrojów, w których niedobór składników odżywczych na krawędzi podziału komórkowego za pośrednictwem ekspansji powoduje szereg wąskich gardeł genetycznych, co powoduje wysokie prawdopodobieństwo miejscowej fiksacji dla niektórych linii klonalnych12. Dryf genetyczny można zatem wykorzystać do zbadania roli segregacji przestrzennej w koloniach drobnoustrojów.

W środowisku biofilmy to wielogatunkowe zbiorowiska otoczone samodzielnie wyprodukowaną matrycą polimerową13. Struktura, funkcja i stabilność biofilmu zależą od złożonej sieci interakcji społecznych, w których bakterie wymieniają sygnały, składniki matrycy i zasoby lub konkurują o przestrzeń i składniki odżywcze za pomocą toksyn i antybiotyków. Bacillus subtilis jest bakterią żyjącą w glebie i kolonizującą korzenie, która rozwija wysoce zorganizowane zbiorowiska biofilmu14. Analogicznie do owadów społecznych, komórki B. subtilis stosują strategię podziału pracy, rozwijając subpopulacje producentów macierzy zewnątrzkomórkowej i kanibali, komórek ruchliwych, uśpionych zarodników i innych typów komórek15,16. Proces różnicowania jest dynamiczny i może być zmieniany przez warunki środowiskowe17,18.

Strategie kolonizacji powierzchni przez bakterie mogą być łatwo manipulowane w warunkach laboratoryjnych poprzez modyfikację stężenia agaru w pożywce wzrostowej. Przy niskich poziomach agaru (0,2-0,3%) bakterie zawierające aktywne wici są w stanie pływać, podczas gdy agar półstały (0,7-1% agar) ułatwia rozprzestrzenianie się społeczności napędzanej wicią, zwanej rojem19-21. W przypadku braku wici niektóre szczepy bakteryjne są w stanie przemieszczać się po półstałym podłożu poprzez przesuwanie, tj. zależną od wzrostu ekspansję populacji ułatwioną przez matrycę egzopolisacharydową i inne wydzielane związki hydrofobinowe22-24. Wreszcie, bakterie, które są zdolne do rozwoju biofilmu, tworzą złożone architektonicznie kolonie na twardym podłożu agarowym (1,2-2%)14,17,25. Podczas gdy cechy te są badane w laboratorium poprzez precyzyjne dostosowanie warunków, w siedliskach naturalnych te strategie rozprzestrzeniania się powierzchniowego mogą stopniowo przechodzić z jednej na drugą w zależności od warunków środowiskowych26. Podczas gdy ruchliwość oparta na pojedynczych komórkach ma kluczowe znaczenie podczas inicjacji rozwoju biofilmu na granicy powietrze-ciecz zarówno u bakterii Gram-dodatnich, jak i -ujemnych27, delecja ruchliwości wici nie ma wpływu na złożone biofilmy kolonii B. subtilis 28. Jednak organizacja przestrzenna podczas rozwoju biofilmów kolonii B. subtilis zależy od gęstości inokulum bakteryjnego użytego do zainicjowania biofilmu8.

Tutaj używamy B. subtilis, aby pokazać, że segregacja przestrzenna podczas kolonizacji powierzchniowej zależy od mechanizmu ruchliwości populacji (tj. roju lub przesuwania), a rozwój biofilmu kolonii zależy od gęstości komórek założycielskich. Przedstawiamy narzędzie do mikroskopii fluorescencyjnej, które można zastosować do ciągłego monitorowania wzrostu biofilmu drobnoustrojów, kolonizacji powierzchni i asortymentu w skali makro. Ponadto przedstawiono metodę kwantyfikacji w celu określenia względnej liczebności szczepów w populacji.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych, agaru półpłynnego i płytek do biofilmu, prekultury

  1. Przygotowanie pożywki do swarmingu i slidingu
    1. Rozpuścić 2 g bulionu Lenox (LB) oraz 0,7 g agaru w 100 ml wody dejonizowanej i autoklawować przez 20 min w 120 °C. Należy stosować małe objętości (50-200 ml), aby zwiększyć powtarzalność między eksperymentami.
    2. Niezwłocznie po sterylizacji zamknąć korek butelki z pożywką w celu ograniczenia parowania i umieścić ją w inkubatorze w 55 °C na co najmniej 2 h.
    3. Po ostygnięciu pożywki do temperatury 55 °C, wlać 20 ml pożywki LB z agarem do polistyrenowej szalki Petriego o średnicy 90 mm w sterylnych warunkach komory z laminarnym przepływem powietrza. W przypadku eksperymentów time-lapse wlać 5 ml pożywki LB z agarem do polistyrenowej szalki Petriego o średnicy 35 mm.
    4. Zamknąć szalkę Petriego niezwłocznie po wlaniu pożywki, ułożyć maksymalnie 4 szalki jedna na drugiej i pozostawić pożywkę agarową do stężenia przez co najmniej 1 h.
  2. Przygotowanie pożywki 2xSG do biofilmów kolonijnych
    1. Rozpuścić 1,6 g bulionu Nutrient Broth, 0,2 g KCl, 0,05 g MgSO47H2O oraz 1,5 g agaru w 100 ml wody dejonizowanej i autoklawować przez 20 min w 120 °C. Należy stosować małe objętości (50-200 ml), aby zwiększyć powtarzalność między eksperymentami.
    2. Niezwłocznie po sterylizacji zamknąć korek butelki z pożywką w celu ograniczenia parowania i umieścić butelkę w inkubatorze w 55 °C na co najmniej 2 h.
    3. Po wyrównaniu temperatury pożywki do 55 °C dodać 0,1 ml sterylnego (filtrowanego) roztworu 1M Ca(NO3)2, 0,1 ml sterylnego (filtrowanego) roztworu 100 mM MnCl2, 0,1 ml sterylnego (filtrowanego) roztworu 1 mM FeSO4 oraz 0,5 ml sterylnego 20% roztworu glukozy.
    4. W sterylnych warunkach komory z laminarnym przepływem powietrza wlać 20 ml pożywki 2x SG z agarem do polistyrenowej szalki Petriego o średnicy 90 mm. W przypadku eksperymentów time-lapse wlać 5 ml pożywki LB z agarem do polistyrenowej szalki Petriego o średnicy 35 mm.
    5. Zamknąć szalkę Petriego niezwłocznie po wlaniu pożywki, ułożyć szalki jedna na drugiej (nie więcej niż 4) i pozostawić pożywkę agarową do stężenia przez co najmniej 1 h.
  3. Przygotowanie kultur starterowych
    UWAGA: Szczepy pochodne B. subtilis 168 i NCIB 3610 użyte w opisanych poniżej metodach konstytutywnie produkują białka zielonej lub czerwonej fluorescencji i zostały opisane wcześniej8,27. Szczepy są rutynowo przechowywane w zamrażarce w -80 °C.
    1. Zaszczepić kultury starterowe z zapasów przechowywanych w -80 °C w 3 ml pożywki LB i inkubować przez noc (16-18 h) w 37 °C przy poziomym wytrząsaniu (225 rpm). Nie należy inkubować kultury dłużej niż 18 h, ponieważ dzikie izolaty B. subtilis mają tendencję do agregacji i tworzenia biofilmu w probówce.

2. Współinokulacja szczepów bakteryjnych znakowanych fluorescencyjnie w celu wysiewu powierzchniowego

  1. Suszenie półstałych płytek agarowych do badania swarmingowania i ślizgania B. subtilis.
    1. Przed inokulacją suszyć płytki agarowe do swarmingowania i ślizgania przez 20 min. Płytki suszyć bez przykrycia w komorze z laminarnym przepływem powietrza (patrz Rysunek 1).
      UWAGA: Bakteryjne swarmingowanie i ślizganie zależą od stopnia wysuszenia półstałego podłoża agarowego. Niedostateczne suszenie prowadzi do gromadzenia się wody na podłożu agarowym, co skutkuje pływaniem (swimming) za pomocą wici. Zbyt długi czas suszenia prowadzi do braku swarmingowania.

Proces hodowli na szalce Petriego: wlewanie pożywki, suszenie płytki, nanoszenie kultury, inkubacja pod mikroskopem.
Rysunek 1: Schemat doświadczenia. Na rysunku przedstawiono standardową procedurę, obejmującą przygotowanie pożywki hodowlanej, suszenie płytki, inokulację oraz detekcję za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (od lewej do prawej). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Współinokulacja kultur bakteryjnych w celu badania swarming i slidingu
    1. Wyznaczyć gęstość optyczną nocnych kultur starterowych przy 600 nm i wymieszać znormalizowane pod względem gęstości szczepy B. subtilis NCIB 3610 lub jego pochodną Δhag produkujące zielone i czerwone białko fluorescencyjne w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Na przykład, zmieszać 100 μl szczepu 1 z (100*[OD600 nocnej kultury szczepu 1]/[OD600 nocnej kultury szczepu 2]) μl szczepu 2. Delikatnie wymieszać na wirówce typu vortex (3 s z maksymalną prędkością), aby uzyskać jednorodny rozkład.
      UWAGA: Szczepy B. subtilis NCIB 3610 są inokulowane w celu obserwacji swarmingu, natomiast ich pochodne Δhag są stosowane do badania slidingu.
    2. Nanieść 2 μl zmieszanej kultury na środek uprzednio wysuszonej płytki (patrz Rysunek 1) i pozostawić płytkę do dalszego wyschnięcia na 10 min po inokulacji.
    3. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w pozycji pionowej, aby nadmiar wilgoci skraplał się na pokrywce, a nie na powierzchni agaru.
      UWAGA: Czas inkubacji dla swarmingu B. subtilis wynosi zazwyczaj od 8 do 16 hr. Zazwyczaj krawędź swarmu dociera do brzegu 90 mm szalki Petriego w ciągu 8 hr. Sliding jest procesem wolniejszym i wymaga inkubacji od co najmniej 16 do 42 hr. Po 36 hr front slidingu dociera do brzegu 90 mm szalki Petriego.
    4. W przypadku eksperymentów time-lapse, umieścić szalki Petriego o średnicy 35 mm w wstępnie podgrzanej komorze inkubacyjnej stolika mikroskopu ustawionej na 37 °C. Należy upewnić się, że pokrywka szalki Petriego pozostaje zdjęta przez cały czas trwania eksperymentu. Ustawić pokrywę inkubatora stolikowego na 40 °C, aby zapobiec tworzeniu się wilgoci na górnej części inkubatora.

3. Współinokulacja szczepów bakteryjnych znakowanych fluorescencyjnie o różnych początkowych gęstościach komórek

  1. Suszenie płytek z agarem do tworzenia biofilmu kolonijnego B. subtilis.
    1. Przed inokulacją suszyć płytki do rozwoju biofilmu kolonijnego bez przykrycia w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez 15 min.
      UWAGA: Niewystarczające suszenie prowadzi do zwiększonej wilgotności, co może umożliwić pływanie lub rozprzestrzenianie się (swarming) bakterii29. Zbyt długie suszenie skutkuje powstaniem małych kolonii biofilmu.
  2. Przygotowanie 10-krotnych rozcieńczeń kultur startowych do biofilmów kolonijnych
    1. W probówce reakcyjnej o pojemności 1.5 ml wymieszać 100 μl nocnych kultur startowych B. subtilis 168 produkujących zielone i czerwone białka fluorescencyjne, a następnie delikatnie wymieszać na wortexie w celu uzyskania homogennej zawiesiny. Przygotować szereg 10-krotnych rozcieńczeń w podłożu LB.
    2. Nanieść kropkowo 2 μl nierozcieńczonej lub rozcieńczonych 101, 102, 103, 104 kultur mieszanych na płytkę zawierającą podłoże indukujące biofilm.
      UWAGA: Na jednej szalce Petri o średnicy 90 mm można zainicjować od 6 do 9 kolonii biofilmu, przyjmując, że kolonie są oddzielone od siebie równymi odstępami.
    3. Inkubować płytki w pozycji pionowej w temperaturze 30 °C, aby nadmiar wilgoci skraplał się na pokrywce, a nie na powierzchni agaru.
      UWAGA: Czas inkubacji biofilmu B. subtilis wynosi od 1 do 3 dni. Zazwyczaj biofilm kolonijny B. subtilis osiąga średnią wielkość i złożoną strukturę w ciągu 2 dni.
    4. W przypadku eksperymentów time-lapse, nanieść pojedynczy inokulum na środek szalki Petri o średnicy 35 mm i umieścić szalkę w wstępnie podgrzanej komorze inkubacyjnej stolika mikroskopowego ustawionej na 30 °C. Należy upewnić się, że pokrywa szalki Petri pozostaje zdjęta przez cały czas trwania eksperymentu. Pokrywę inkubatora stolikowego ustawić na 35 °C, aby zapobiec tworzeniu się wilgoci na górnej części inkubatora.

4. Detekcja szczepów znakowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

  1. Opis sprzętu do obrazowania.
    1. W celu wykrycia kolonizacji powierzchni i sygnału fluorescencji należy użyć zmotoryzowanego stereomikroskopu fluorescencyjnego z zoomem (szczegółowa lista w Tabeli Materiałów) wyposażonego w obiektyw 0.5X PlanApo, dwa źródła zimnego światła LED (jedno do detekcji fluorescencji i jedno do światła widzialnego), zestawy filtrów dla GFP (pobudzenie przy 470/40 nm i emisja przy 525/50 nm) oraz mRFP (pobudzenie przy 572/25 nm i emisja przy 629/62 nm) oraz monochromatyczną kamerę o wysokiej rozdzielczości.
    2. Akwizycję i przetwarzanie obrazów należy przeprowadzić za pomocą odpowiedniego oprogramowania dostępnego dla stereomikroskopu z zoomem, zawierającego moduły wielokanałowe i do rejestracji czasowej (time-lapse). W eksperymentach typu time-lapse należy zastosować standardowy inkubator z podgrzewanym stolikiem, zamontowany do stereomikroskopu z zoomem za pomocą adaptera.
  2. Obrazowanie ekspansji typu swarming i sliding
    1. Należy użyć najniższego powiększenia, aby uchwycić jak największy obszar płytki 90 mm. Miejsce inokulacji (środek szalki Petriego 90 mm) należy ustawić w narożniku widocznego pola, aby monitorować radialną ekspansję bakterii oraz fluorescencję.
    2. Należy dostosować optymalny czas ekspozycji w zależności od natężenia sygnału fluorescencji.
      UWAGA: W przypadku konstytutywnie ekspresyjnych genów fluorescencji u B. subtilis można zastosować odpowiednio czas ekspozycji 1.5 s dla fluorescencji zielonej i 3 s dla czerwonej. Dodatkowo, dla światła widzialnego odpowiedni jest czas ekspozycji 10 msec.
  3. Należy zastosować powiększenie pozwalające na detekcję całej kolonii biofilmu i wycentrować kolonię w polu widzenia.
    UWAGA: Podobnie jak w przypadku ekspansji swarming i sliding, optymalne czasy ekspozycji w celu wykrycia sygnałów fluorescencji w koloniach biofilmu zależą od poziomu ekspresji genów kodujących białka fluorescencyjne. Dla reprezentatywnych wyników przedstawionych poniżej, fluorescencję zieloną i czerwoną wykrywano odpowiednio przy interwałach ekspozycji 1 s i 3 s.
  4. W przypadku obrazowania time-lapse należy pozyskiwać obrazy w określonych odstępach czasu, stosując stałe czasy ekspozycji.
  5. Obrazy zarejestrowane za pomocą stereomikroskopu fluorescencyjnego należy zapisać w formacie pliku rozpoznawanym przez oprogramowanie ImageJ w celu ilościowej analizy danych.

5. Analiza danych

  1. Aby przeanalizować obszar zajmowany przez każdy szczep fluorescencyjny o innym znakowaniu, otwórz odpowiedni plik w oprogramowaniu ImageJ rozszerzonym o wtyczkę BioVoxxel.
    1. Gdy pojawi się okno „Bio-Formats Import Options”, w którym zaznaczone są tylko opcje „Open all series” i „Autoscale”, otwórz plik, klikając „OK”.
      UWAGA: Pliki są wyświetlane jako stos trzech obrazów, po jednym dla każdego kanału użytego do rejestracji obrazu w mikroskopie (obrazy w fluorescencji zielonej, czerwonej oraz obraz w jasnym polu).
    2. Rozdziel stos na poszczególne obrazy kanałów, wybierając „Image” - „Stacks” - „Stack to Images” w panelu sterowania ImageJ.
      UWAGA: Obrazy pojawiają się i są numerowane jako 1/3 (kanał zielony), 2/3 (kanał czerwony) i 3/3 (jasne pole). W tym przypadku obraz w jasnym polu jest wykluczony z analizy.
  2. Aby przeanalizować obrazy, przekształć każdy z nich w obraz 8-bitowy, wybierając „Image” - „Type” - „8-bit”.
  3. Aby wyznaczyć zajęty obszar w pixel2, zresetuj skalę obrazów za pomocą opcji „Analyze” - „Set Scale”. Gdy pojawi się okno z różnymi opcjami skali, zresetuj skalę, wybierając „Click to Remove Scale”. Zaznacz opcję „Global”, aby usunąć skalę dla wszystkich otwartych obrazów.
  4. Aby usunąć tło, narysuj owalny obszar (region zainteresowania, ROI) poza obszarem fluorescencyjnym, korzystając z narzędzia „Oval” w panelu sterowania ImageJ.
    1. Aby upewnić się, że rozmiar owalu tła jest taki sam dla wszystkich analizowanych obrazów, dodaj go do menedżera ROI za pomocą klawisza [t] na klawiaturze. Pojawi się okno ROI Manager, w którym owalny ROI tła można zapisać poprzez opcje „More” - „Save”.
    2. Jeśli owalny ROI tła jest widoczny na obrazie, zmierz intensywność obszaru, wybierając „Analyze” - „Measure”.
      UWAGA: Pojawia się okno wyników, w którym między innymi średnia intensywność fluorescencji jest wyświetlana w kolumnie oznaczonej jako „Mean”.
    3. Odejmij wartość średniej intensywności fluorescencji tła z obrazu, odznaczając owalny ROI tła, klikając „Process” - „Math” - „Subtract” i wprowadzając zmierzoną wartość.
  5. Zastosuj próg do obrazu za pomocą opcji „Image” - „Adjust” - „Threshold”. Wybierz metodę Otsu oraz tryb czarno-biały (B&W). Zaznacz opcję „Dark background” i zatwierdź próg, klikając „Apply”.
    UWAGA: Obraz zmienia się w obraz binarny, w którym obszar powyżej progu jest wyświetlany na biało, a obszar poniżej progu na czarno.
  6. Zaznacz wszystko powyżej progu za pomocą opcji „Analyze” - „Analyze Particles”. W oknie ustawień pozostaw opcje domyślne oraz zaznaczone opcje „Display results” i „Summarize”. Kliknij „OK”, aby wyświetlić podsumowanie w oknie wyników i zaprezentować zajęty obszar w kolumnie oznaczonej jako „Total Area”.

Wyniki

Laboratoryjne systemy populacji bakteryjnych stanowią atrakcyjny sposób badania zagadnień ekologicznych lub ewolucyjnych. W niniejszej pracy wykorzystano trzy tryby kolonizacji powierzchni przez B. subtilis w celu zbadania występowania sortowania populacji, i.e. segregacji szczepów identycznych genetycznie, ale różniących się fluorescencyjnym znakowaniem. Swarming, będący zależnym od wici zbiorowym ruchem powierzchniowym B. subtilis, prowadzi do powstania silnie wymieszanej populacji. W tych koloniach swarmingowych obszary skolonizowane przez bakterie fluorescencyjne zielone i czerwone nakładały się na siebie (patrz Rycina 2A). Szybką kolonizację powierzchni można śledzić w czasie (Wideo Rycina 1). Podczas swarmingu B subtilis, po kilku godzinach inkubacji, z centrum inokulacji rozprzestrzenia się cienka warstwa komórek (patrz Rycina 2B).

Mikroskopia fluorescencyjna time-lapse pokazująca ekspresję GFP i RFP w kulturach drobnoustrojów.
Rysunek 2: Ekspansja swarmingowa B. subtilis. Kolonia swarmingowa zawiera szczepy fluorescencyjne zielone i czerwone, które zostały zmieszane w stosunku 1:1 przed inokulacją. (A) Po 15 h wykryto fluorescencję zieloną i czerwoną (odpowiednio GFP i RFP) przy użyciu odpowiednich filtrów fluorescencyjnych. (B) Przedstawiono obrazy cienkiej warstwy swarmingowych B. subtilis w wybranych punktach czasowych wyodrębnionych z Video Figure 1. Pasek skali = 5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Jednakże, gdy szczepy B. subtilis, które nie posiadają funkcjonalnych wici, lecz są zdolne do rozprzestrzeniania się dzięki produkowanemu egzopolisacharydowi, hydrofobinie i surfaktynie, naniesiono punktowo na półpłynne podłoże agarowe, szczepy oznakowane w różny sposób oddzieliły się w określonych sektorach (patrz Rysunek 3A). Rozwój kolonii przesuwającej się można rejestrować w czasie (patrz Rysunek 3B lub Wideo Rysunek 2).

Mikroskopia fluorescencyjna, ekspresja GFP i RFP, pole jasne, obrazy kompozytowe, analiza time-lapse.
Rycina 3: Przesuwająca się kolonia B. subtilis. Kolonia zawiera szczepy fluorescencyjne zielone i czerwone, które zostały zmieszane w stosunku 1:1 przed inokulacją. (A) Po 24 h wykryto fluorescencję zieloną i czerwoną (odpowiednio GFP i RFP) przy użyciu odpowiednich filtrów fluorescencyjnych. (B) Obrazy przesuwającego się dysku B. subtilis pokazano w wybranych punktach czasowych wyodrębnionych z Video Rycina 2. Pasek skali = 5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Podczas gdy poziomy segregacji w koloniach rozprzestrzeniających się poprzez swarming i sliding nie mogły zostać zmodyfikowane, na przestrzenną segregację różnie znakowanych szczepów fluorescencyjnych w biofilmie kolonii mógł wpływać początkowy zagęszczenie komórek. Gdy biofilm kolonii B. subtilis był inicjowany przy wysokim zagęszczeniu komórek populacji mieszanych, szczepy fluorescencyjne zielone i czerwone wykazywały niewielką lub żadną segregację przestrzenną (patrz Rycina 4). Przeciwnie, gdy zagęszczenie komórek inicjujących biofilm było niskie, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej można było wykryć wyraźne sektory fluorescencji zielonej i czerwonej. Poziom segregacji był wyraźnie zależny od stopnia rozcieńczenia populacji inicjującej biofilm. Wideo Rycina 3 i 4 przedstawiają ekspansję kolonii dla najniższego i najwyższego rozcieńczenia zaszczepionych szczepów.

Seria rozcieńczeń w mikroskopii: Pole jasne vs. GFP, RFP, obraz kompozytowy dla analizy fluorescencji.
Rysunek 4: Poziom asortymentu w biofilmach kolonialnych B. subtilis przy różnych początkowych gęstościach komórek. Przedstawiono biofilmy kolonialne szczepów wykazujących fluorescencję zieloną i czerwoną po 2 dniach od inokulacji przy różnych początkowych gęstościach komórek (od góry do dołu: odpowiednio od kultur startowych nierozcieńczonych do rozcieńczonych 105 razy). Pasek skali = 5 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Stosunek szczepów fluorescencyjnych zielonych i czerwonych można dodatkowo określić ilościowo za pomocą oprogramowania ImageJ, które umożliwia ilościową charakterystykę struktury populacji oraz konkurencyjności szczepów wykorzystanych w eksperymentach.

Płytka z hodowlą bakterii, test fluorescencyjny, eksperyment na szalce Petriego, badania mikrobiologiczne.
Wideo Rysunek 1: Obrazy time-lapse rojenia B. subtilis zainicjowanego mieszaniną szczepów zielono- i czerwono-fluorescencyjnych w stosunku 1:1. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.) Wideo przedstawia przebieg czasowy z 10 hr. Pasek skali = 7 mm.

Wzorzec wzrostu bakterii w eksperymencie na szalce Petriego; wykazuje radialną dyfuzję pigmentów; mikrobiologia.
Wideo Rysunek 2: Obrazy z lapse czasu dla ślizgających się B. subtilis, zainicjowane mieszanką szczepów zielono- i czerwono-fluorescencyjnych w stosunku 1:1. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.) Wideo przedstawia przebieg czasowy z 24 hr. Pasek skali = 5 mm.

Kultura bakterii na płytce agarowej w szalce Petriego, wykazująca radialny wzór wzrostu z zabarwieniem.
Wideo Rycina 3: Obrazy z lapse-time biofilmów kolonii B. subtilis zainicjowanych mieszaniną szczepów zielono- i czerwono-fluorescencyjnych w stosunku 1:1 przy wysokiej gęstości komórek. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.) Wideo przedstawia przebieg czasowy z 48 hr. Pasek skali = 5 mm.

Wzorzec wzrostu bakterii, markery fluorescencyjne, szalka Petriego, eksperyment mikrobiologiczny, badanie biofilmu.
Rycina wideo 4: Obrazy time-lapse biofilmów kolonii B. subtilis zainicjowanych mieszaniną szczepów fluorescencyjnych zielonych i czerwonych w stosunku 1:1 przy niskiej gęstości komórek. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.) Wideo przedstawia przebieg czasowy z 48 hr. Pasek skali = 5 mm.

Dyskusja

Dostępność zestawu narzędzi fluorescencyjnych dla bakterii ułatwia nie tylko badanie heterogenicznej ekspresji genów30,31 i lokalizacji białek32, ale także analizę przestrzennego rozmieszczenia szczepów w populacji8. Markery fluorescencyjne o wystarczająco różnych długościach fal wzbudzenia i emisji pozwalają na wyraźną lokalizację dwóch szczepów, które w przeciwnym razie są nie do odróżnienia od siebie po zmieszaniu. Opisany protokół może być wykorzystany do obserwacji dynamiki populacji w kulturach mieszanych, np. eksperymentów konkurencyjnych lub synergii między szczepami lub gatunkami. Zdolność do określenia względnej liczebności szczepów znakowanych fluorescencyjnie w populacji mieszanej nie jest ograniczona do kolonii roju, ślizgania się lub biofilmu przyczepionych do powierzchni, ale może być również wykorzystana do innych wielokomórkowych systemów biofilmu, w tym biofilmów zanurzonych, komórek przepływowych lub biofilmów na granicy faz powietrze-medium27,33-35.

Prezentowana technika jest potężnym narzędziem do wykrywania przestrzennego rozmieszczenia szczepów i projektowania eksperymentów konkursowych, ale pozwala również śledzić niejednorodność ekspresji genów w rozrastających się koloniach. Opisane tutaj warunki hodowli mają zastosowanie do B. subtilis, a dokładne parametry ekspansji na podłożach agarowych mogą wymagać optymalizacji dla innych gatunków lub szczepów20. Umieszczenie próbek w komorze inkubacyjnej podczas obrazowania pozwala eksperymentatorowi śledzić dynamikę populacji w czasie, chociaż należy zwrócić uwagę na poziom wilgotności w komorze podczas inkubacji.

Opisane tu techniki wymagają również modyfikacji genetycznej badanych szczepów bakteryjnych tak, aby szczepy wykazywały ekspresję markerów fluorescencyjnych, które można od siebie odróżnić. Ponadto, oprócz odrębnych widm wzbudzenia i emisji, zaleca się, aby dwa wybrane markery fluorescencyjne miały podobną wydajność kwantową (tj. stosunek emitowanych pochłoniętych fotonów) i były wyrażone na porównywalnym poziomie. Ponadto względne zmiany intensywności w czasie mogą być mierzone i normalizowane do wczesnego punktu czasowego eksperymentu. Względny wzrost lub spadek można następnie porównać między różnymi fluoroforami o różnej wydajności kwantowej. W przedstawionym systemie eksperymentalnym przetestowano wcześniej różne białka zielonej i czerwonej fluorescencji36,37 w celu wybrania najbardziej optymalnych par fluorescencyjnych, które można wykryć u B. subtilis. Dla każdego białka fluorescencyjnego i próbki należy określić optymalny czas ekspozycji. Do skutecznego wykrycia sygnału w populacji mogą być wymagane pewne gęstości komórek lub wiele warstw komórek. Niektóre białka fluorescencyjne mogą mieć niską intensywność w komórkach bakteryjnych z powodu nieefektywnej ekspresji i/lub translacji białka, a tym samym niskiej wydajności kwantowej. Takie nieefektywne markery fluorescencyjne mogą zmniejszyć czułość systemu i wydłużyć czas potrzebny do wykrycia szczepów bakterii, co może prowadzić do cytotoksyczności przez światło wzbudzające. Natężenia fluorescencji można odpowiednio modyfikować poprzez zmianę promotora używanego do ekspresji fluorescencyjnego genu kodującego reporter. Zbyt wysoki poziom ekspresji może spowodować niepotrzebną nadprodukcję białka fluorescencyjnego, co prowadzi do szkodliwych kosztów dopasowania dla bakterii. Przeprowadzając eksperymenty konkursowe, należy wziąć pod uwagę koszt produkcji poszczególnych białek fluorescencyjnych w komórkach. Eksperymenty kontrolne, w których markery fluorescencyjne są zamieniane między konkurencyjnymi szczepami lub gdzie dwa szczepy izogeniczne różniące się tylko markerami fluorescencyjnymi są konkurujące ze sobą, są zawsze wymagane w celu określenia ewentualnego odchylenia w kierunku jednego markera. Czas życia białek fluorescencyjnych w komórkach może również wpływać na zmierzoną intensywność. Ponadto autofluorescencja niektórych gatunków bakterii może wymagać użycia innych markerów fluorescencyjnych niż opisane tutaj.

W celu precyzyjnego określenia rozkładów przestrzennych i liczebności odrębnych szczepów bakterii, sygnał tła pochodzący z pierwszego białka fluorescencyjnego przy użyciu filtra fluorescencyjnego dla drugiego markera fluorescencyjnego i odwrotnie powinien być indywidualnie badany na próbkach monokulturowych (zawierających bakterie wytwarzające tylko jeden marker). Pozwala to na odejmowanie nakładających się na siebie intensywności sygnału fluorescencyjnego. Co ważne, ponieważ stereomikroskop rejestruje sygnał fluorescencyjny znad rozszerzającej się kolonii, prezentowany protokół jest wygodny do wyznaczenia układu przestrzennego w dwóch wymiarach. Architektura powiększającej się populacji bakterii może skutkować różnymi poziomami fluorescencji (tj. struktury przypominające zmarszczki mogą zawierać więcej komórek wykazujących wyższą miejscową intensywność fluorescencji). W związku z tym opisana analiza obrazów określa rozkład przestrzenny, ale nie obfitość szczepów w określonej lokalizacji. Poprzednie protokoły opisywały przygotowanie próbki do roju20 lub obrazowanie fluorescencyjne dynamiki populacji w koloniach bakteryjnych38, ale nasz protokół łączy te techniki. Inne techniki mikroskopowe, które pozwalają na obserwację trójwymiarowej rozdzielczości struktury populacji (np. konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa39,40 lub mikroskopia oświetlenia strukturalnego41) mogą być stosowane do próbek o zwiększonej złożoności strukturalnej. Te dodatkowe techniki wspierają również wykrywanie szczepów31 w oparciu o pojedyncze komórki, które nie jest dostępne przy użyciu mikroskopów stereoskopowych.

Oświadczenia

Otwarty dostęp do tego artykułu wideo został opłacony przez Carl Zeiss Microscopy GmbH.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana z grantu KO4741/3-1 od Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Ponadto laboratorium Á.T.K. otrzymało wsparcie z grantu Marie Skłodowska Curie na integrację zawodową (PheHetBacBiofilm) oraz grantu KO4741/2-1 z DFG. T.H., A.D., R.G.-M. i E.M. byli wspierani odpowiednio przez Międzynarodową Szkołę Badawczą Maxa Plancka, Fundację Alexandra von Humboldta, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa-Niemiecką Służbę Wymiany Akademickiej (CONACyT-DAAD) oraz stypendia JSMC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Lennox Bulion (LB)Carl Roth GmbHX964
Agar-agar, Kobe ICarl Roth GmbH5210
Petriego (średnica 90 mm)dowolnabrak danychStosować szalki Petriego bez krzywek wentylacyjnych
Szalka Petriego (średnica 35 mm)dowolnabrak danychStosować szalki Petriego bez krzywek wentylacyjnych
Difco Nutrient BulionBD Europe234000
KClanyNA
MgSO,4 7H2OanyNA
Ca(NO3)2 4H2OanyNA
MnCl24H2OanyNA
FeSO4dowolnyNA
D-GlucosedowolnyNA
silny>Fluorescencyjny mikroskop poklatkowy AxioZoom V16Carl Zeiss Microscopy GmbHpatrz poniżej szczegółowy opis
AxioZoom V16 Korpus mikroskopuCarl Zeiss Microscopy GmbH435080 9030 000
Tuba Fototube Z 100:0 do Axio Zoom V16Carl Zeiss Microscopy GmbH435180 9020 000bez okularów
Fluar Illuminator Z mot Fluorescencyjna rurka pośrednia do Axio Zoom.V16Carl Zeiss Microscopy GmbH435180 9060 000
Kontroler EMS 3Carl Zeiss Microscopy GmbH435610 9010 000
Panel sterowania systemu SYCOP 3Carl Zeiss Microscopy GmbH435611 9010 000
Moduł reflektora ZCarl Zeiss Microscopy GmbH435180 9160 000Do oświetlacza fluarnego Z mot na Axio Zoom.V16 i SYCOP 3
Zestaw filtrów 38 HE eGFP shift free (E)Carl Zeiss Microscopy GmbH489038 9901 000EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50
Zestaw filtrów 63 HE mRFP shift free (E)Carl Zeiss Microscopy GmbH489063 0000 000EX BP 572/25, BS FT 590, EM BP 629/62
Mount SCarl Zeiss Microscopy GmbH435402 0000 000
Objektive PlanApo Z 0,5x/0,125 FWD 114 mmCarl Zeiss Microscopy GmbH435280 9050 000164 mm długość parafokalna; Gwint M62x0,75 z przodu
Napęd zgrubny/precyzyjny z kolumną profilowąCarl Zeiss Microscopy GmbH435400 0000 000490 mm, udźwig 10 kg, kompatybilny z podstawami statywowymi 300/450
Podstawa statywu 450Carl Zeiss Microscopy GmbH435430 9902 000
Źródło zimnego światła Zeiss CL 9000 LED CANCarl Zeiss Microscopy GmbH435700 9000 000
magistrali CANCarl Zeiss Microscopy GmbH457411 9011 000Długość 2,5 m
Oświetlacz szczelinowyCarl Zeiss Microscopy GmbH417075 9010 000d = 66 mm
Elastyczny światłowód 1500Carl Zeiss Microscopy GmbH417063 9901 0008/1.000 mm 
Adapter oświetlenia do światłowoduCarl Zeiss Microscopy GmbH000000 1370 927
Lightguide HXP z wypełnieniem płynemCarl Zeiss Microscopy GmbH000000 0482 760ø Adapter do aparatu 3 mm x 2 000 mm
60N-C Carl Zeiss Microscopy GmbH426113 0000 0002/3" 0,63X
Kamera mikroskopowa o wysokiej rozdzielczości AxioCam MRm Rev. 3 FireWireCarl Zeiss Microscopy GmbH426509 9901 000
Zestaw spustowych AxioCam FireWireCarl Zeiss Microscopy GmbH426506 0002 000do bezpośredniej synchronizacji migawki
ZEN pro 2012Carl Zeiss Microscopy GmbH410135 1002 120Edycja niebieska, wymaga min. Windows 7 64-bitowy
moduł ZEN Upływ czasuCarl Zeiss Microscopy GmbH410136 1031 110
Standardowy inkubator górny ze stopniem grzewczymTokai HitINUL-MS1-F1
Adapter bazowy mikroskopu stereoskopowego ZeissTokai HitMS-V12
Softwares
ImageJNarodowy Instytut Zdrowia, Bethesda, MD, USAv 1.49m
BioVoxxel wtyczkaBioVoxxelhttp://www.biovoxxel.de/development/
szalka <

Bibliografia

  1. Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. The sociobiology of biofilms. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).
  2. West, S. A., Griffin, A. S., Gardner, A., Diggle, S. P. Social evolution theory for microorganisms. Nat Rev Microbiol. 4 (8), 597-607 (2006).
  3. Kovács, ÁT. Impact of spatial distribution on the development of mutualism in microbes. Front Microbiol. 5, 649(2014).
  4. Martin, M., Hölscher, T., Dragoš, A., Cooper, V. S., Kovács, ÁT. Laboratory evolution of microbial interactions in bacterial biofilms. J Bacteriol. , (2016).
  5. Drescher, K., Nadell, C. D., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Solutions to the public goods dilemma in bacterial biofilms. Curr Biol. 24 (1), 50-55 (2014).
  6. Momeni, B., Waite, A. J., Shou, W. Spatial self-organization favors heterotypic cooperation over cheating. Elife. 2, e00960(2013).
  7. van Dyken, J. D., Müller, M. J., Mack, K. M., Desai, M. M. Spatial population expansion promotes the evolution of cooperation in an experimental Prisoner's Dilemma. Curr Biol. 23 (10), 919-923 (2013).
  8. van Gestel, J., Weissing, F. J., Kuipers, O. P., Kovács, ÁT. Density of founder cells affects spatial pattern formation and cooperation in Bacillus subtilis biofilms. ISME J. 8 (10), 2069-2079 (2014).
  9. Momeni, B., Brileya, K. A., Fields, M. W., Shou, W. Strong inter-population cooperation leads to partner intermixing in microbial communities. Elife. 2, e00230(2013).
  10. Müller, M. J., Neugeboren, B. I., Nelson, D. R., Murray, A. W. Genetic drift opposes mutualism during spatial population expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (3), 1037-1042 (2014).
  11. Pande, S., et al. Privatization of cooperative benefits stabilizes mutualistic cross-feeding interactions in spatially structured environments. ISME J. 10, 1413-1423 (2016).
  12. Hallatschek, O., Hersen, P., Ramanathan, S., Nelson, D. R. Genetic drift at expanding frontiers promotes gene segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (50), 19926-19930 (2007).
  13. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
  14. Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 157-168 (2013).
  15. Lopez, D., Kolter, R. Extracellular signals that define distinct and coexisting cell fates in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 34 (2), 134-149 (2010).
  16. Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 152-163 (2009).
  17. Mhatre, E., Monterrosa, R. G., Kovács, ÁT. From environmental signals to regulators: Modulation of biofilm development in Gram-positive bacteria. J Basic Microbiol. , (2014).
  18. Zhang, W., et al. Nutrient depletion in Bacillus subtilis biofilms triggers matrix production. New J Physics. 16, 015028(2014).
  19. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
  20. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. J Vis Exp. (98), (2015).
  21. Angelini, T. E., Roper, M., Kolter, R., Weitz, D. A., Brenner, M. P. Bacillus subtilis spreads by surfing on waves of surfactant. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (43), 18109-18113 (2009).
  22. Grau, R. R., et al. A Duo of Potassium-Responsive Histidine Kinases Govern the Multicellular Destiny of Bacillus subtilis. MBio. 6 (4), e00581(2015).
  23. Park, S. Y., Pontes, M. H., Groisman, E. A. Flagella-independent surface motility in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1850-1855 (2015).
  24. van Gestel, J., Vlamakis, H., Kolter, R. From cell differentiation to cell collectives: Bacillus subtilis uses division of labor to migrate. PLoS Biol. 13 (4), e1002141(2015).
  25. Abee, T., Kovács, ÁT., Kuipers, O. P., van der Veen, S. Biofilm formation and dispersal in Gram-positive bacteria. Curr Opin Biotechnol. 22 (2), 172-179 (2011).
  26. Kovács, ÁT. Bacterial differentiation via gradual activation of global regulators. Curr Genet. 62 (1), 125-128 (2016).
  27. Hölscher, T., et al. Motility, chemotaxis and aerotaxis contribute to competitiveness during bacterial pellicle biofilm development. J Mol Biol. 427 (23), 3695-3708 (2015).
  28. Seminara, A., et al. Osmotic spreading of Bacillus subtilis biofilms driven by an extracellular matrix. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1116-1121 (2012).
  29. Patrick, J. E., Kearns, D. B. Laboratory strains of Bacillus subtilis do not exhibit swarming motility. J Bacteriol. 191 (22), 7129-7133 (2009).
  30. de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), e3145(2011).
  31. Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. (60), (2012).
  32. Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469(2014).
  33. Barken, K. B., et al. Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Environ Microbiol. 10 (9), 2331-2343 (2008).
  34. Oliveira, N. M., et al. Biofilm formation as a response to ecological competition. PLoS Biol. 13 (7), e1002191(2015).
  35. Wang, X., et al. Probing phenotypic growth in expanding Bacillus subtilis biofilms. Appl Microbiol Biotechnol. 100, 4607-4615 (2016).
  36. Detert Oude Weme, R. G., et al. Single cell FRET analysis for the identification of optimal FRET-pairs in Bacillus subtilis using a prototype MEM-FLIM system. PLoS One. 10 (4), e0123239(2015).
  37. Overkamp, W., et al. Benchmarking various green fluorescent protein variants in Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae, and Lactococcus lactis for live cell imaging. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6481-6490 (2013).
  38. Stannek, L., Egelkamp, R., Gunka, K., Commichau, F. M. Monitoring intraspecies competition in a bacterial cell population by cocultivation of fluorescently labelled strains. J Vis Exp. (83), e51196(2014).
  39. Bridier, A., Briandet, R. Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity. Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).
  40. Khajotia, S. S., Smart, K. H., Pilula, M., Thompson, D. M. Concurrent quantification of cellular and extracellular components of biofilms. J Vis Exp. (82), e50639(2013).
  41. Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mikroskopia fluorescencyjnaBacillus subtilisswarming i slidingbiofilm koloniiszczepy z bia kami fluorescencyjnymiobrazowanie time lapsekolonizacja powierzchnioddzia ywania mikrobiologiczneg sto kom rek za o ycielskich
Monitorowanie segregacji przestrzennej w kolonizujących powierzchniowo populacjach drobnoustrojów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.