Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Dyfuzja molekularna w błonach plazmatycznych limfocytów pierwotnych mierzona za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

10.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54756

⸱

1 lutego 2017

 ,  , 
1Department of Microbiology, Tumor and Cell Biology, Karolinska Institutet

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano metodę pomiaru dyfuzji białek w błonach pierwotnych komórek odpornościowych za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS). W niniejszej pracy zilustrowano zastosowanie przeciwciał do znakowania fluorescencyjnego.

Streszczenie

Spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS) to potężna technika badania dyfuzji cząsteczek w błonach biologicznych z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. FCS może określić ilościowo stężenie molekularne i współczynnik dyfuzji znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek w błonie komórkowej. Technika ta ma możliwość zbadania charakterystyki dyfuzji molekularnej cząsteczek w błonie komórkowej komórek odpornościowych w stanie ustalonym (tj. bez procesów wpływających na wynik w rzeczywistym czasie pomiaru). FCS nadaje się do badania dyfuzji białek, które ulegają ekspresji na poziomach typowych dla większości białek endogennych. W tym miejscu zademonstrowano prostą i solidną metodę określania szybkości dyfuzji białek błony komórkowej na limfocytach pierwotnych. Opisano skuteczny sposób wykonywania pomiarów na żywych komórkach barwionych przeciwciałami oraz powszechnie występujące obserwacje po akwizycji. Ostatnie postępy w rozwoju fotostabilnych barwników fluorescencyjnych można wykorzystać poprzez koniugację interesujących przeciwciał z odpowiednimi barwnikami, które nie wybielają się intensywnie podczas pomiarów. Dodatkowo pozwala to na detekcję jednostek wolno dyfuzyjnych, co jest wspólną cechą białek ulegających ekspresji w błonach komórkowych. Przedstawiono procedurę analizy mającą na celu wyodrębnienie parametrów stężenia molekularnego i dyfuzji z wygenerowanych krzywych autokorelacji. Podsumowując, zapewniony jest podstawowy protokół pomiarów FCS; Może być stosowany przez immunologów ze zrozumieniem mikroskopii konfokalnej, ale bez innego wcześniejszego doświadczenia w technikach pomiaru parametrów dynamicznych, takich jak szybkość dyfuzji molekularnej.

Wprowadzenie

Wiele funkcji komórek odpornościowych opiera się na dyfuzji molekularnej i interakcjach wewnątrz błon. Błony biologiczne są złożone, a wiele czynników, które mogą być ważne dla funkcjonowania komórek odpornościowych, może wpływać na szybkość translacyjnej dyfuzji białek w błonach komórkowych1. Niedawno wykazaliśmy, że komórki NK (natural killer), limfocyty należące do wrodzonego układu odpornościowego, wykazują różnicową dyfuzję dwóch badanych białek na błonie komórkowej w zależności od stanu aktywacji komórek NK2.

Spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS) to technika, która jest w stanie określić ilościowo szybkość dyfuzji molekularnej w błonach biologicznych. Podaje średnią szybkość dyfuzji cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie w stałej objętości, zwykle ostrości mikroskopu konfokalnego. Opiera się na pomiarze fluktuacji fluorescencji, które występują podczas ruchu molekularnego w układzie w stanie ustalonym. FCS jest szeroko stosowany do badania dyfuzji barwników i białek fluorescencyjnych, zarówno w roztworze, jak i w błonach lipidowych. Inne parametry wyjściowe wpływające na szybkość dyfuzji mogą być również pośrednio badane w ten sposób (np. zmiany konformacyjne białek lub oddziaływania cząsteczek na błonach komórkowych)3,4. FCS wyróżnia się na tle innych technik wysoką czułością, co daje możliwość wykrywania pojedynczych cząsteczek. Działa dobrze w przypadku stężeń molekularnych w zakresie od nanomolowych do milimolowych, co jest typowe dla endogennych poziomów ekspresji większości białek5. Co więcej, FCS może dać przybliżenie bezwzględnej liczby białek w badanej objętości, podczas gdy większość innych technik podaje tylko względne informacje o poziomach ekspresji białek. Inne metody pomiaru szybkości dyfuzji molekularnej w membranach obejmują odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP), śledzenie pojedynczych cząstek (SPT), wielootworowy FCS i metody korelacji obrazu. Metody FRAP i korelacji obrazów są technikami zespołowymi, które na ogół nie dostarczają informacji o bezwzględnej liczbie cząsteczek10. W porównaniu z SPT, przepustowość FCS jest wyższa w odniesieniu do charakterystyki średniej populacji. Analiza jest również mniej wymagająca, ponieważ mierzona jest średnia szybkość dyfuzji cząsteczek obecnych w ognisku lasera, a nie szybkość pojedynczych cząsteczek. Ponadto, o ile specjalistyczne mikroskopy nie są dostępne11, SPT nie może podać żadnych informacji o stężeniach, ponieważ standardowe oznakowanie SPT musi być bardzo niskie, aby umożliwić identyfikację pojedynczych cząsteczek. Z drugiej strony, FCS wymaga, aby badane cząsteczki były mobilne. Po prostu nie wykryje żadnych przypuszczalnie nieruchomych frakcji lub cząsteczek poruszających się bardzo wolno. Szybkość dyfuzji cząsteczek, które znajdują się w ognisku dłużej niż około jednej dziesiątej czasu akwizycji, nie będzie poprawnie odwzorowana w pomiarach FCS3,12. W związku z tym współczynniki dyfuzji rejestrowane przez FCS są zwykle szybsze niż szybkości dyfuzji zgłaszane za pomocą technik takich jak FRAP i SPT, w których brane są również pod uwagę frakcje bliskie unieruchomieniu i bardzo wolne. SPT dostarczy również bardziej szczegółowego opisu zmienności szybkości dyfuzji w populacji molekularnej niż FCS.

FCS określa ilościowo fluktuację intensywności fluorescencji w czasie w wzbudzonej objętości. W przypadku pomiarów membranowych przekłada się to na oświetlony obszar membrany. W tym artykule wykorzystujemy fakt, że takie fluktuacje są indukowane przez cząsteczki wykazujące dyfuzję Browna, a zatem poruszają się do i z objętości wzbudzenia. Istnieje również kilka innych możliwych źródeł fluktuacji sygnału fluorescencji, takich jak mruganie lub obecność stanu trypletowego we fluoroforach, efekty środowiskowe, wiązanie-rozwiązywanie ligandu lub ruch całej błony komórkowej. Te domniemane źródła błędów muszą być brane pod uwagę podczas projektowania eksperymentu FCS, aby dokładnie zinterpretować wyniki12,13. Zazwyczaj szybkość dyfuzji bocznej w błonach biologicznych jest niska ze względu na stłoczenie i interakcje, zarówno między białkami błonowymi, jak i między białkami a cytoszkieletem. Historycznie rzecz biorąc, stosowanie FCS w membranach było utrudnione przez brak fotostabilnych fluoroforów, które są wymagane, aby uniknąć bielenia podczas wydłużonego czasu przejścia przez wzbudzenie focus14. Jednak obecnie istnieje wiele opcji odpowiednich barwników fotostabilnych. Znaczne ulepszenia w detektorach i innym sprzęcie pozwalają również na wykrywanie białek fluorescencyjnych i barwników o niższej jasności. W tym miejscu opisano podstawowy protokół stosowania FCS przy użyciu mysich limfocytów pierwotnych, w których białko będące przedmiotem zainteresowania jest znakowane fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem. Przedstawiono również podejście polegające na dopasowaniu krzywych autokorelacji w celu wyodrębnienia współczynnika dyfuzji i gęstości cząsteczkowej. Protokół ma na celu zapewnienie łatwego stosowania przez immunologów, którzy nie mają wcześniejszego doświadczenia w technikach badania dyfuzji cząsteczek. Oczekuje się jednak podstawowej wiedzy na temat mikroskopii konfokalnej (aby uzyskać tę podstawową wiedzę, patrz odniesienie15). Protokół ten można stosunkowo łatwo dostosować do innych komórek zawiesinowych, zarówno linii komórkowych, jak i komórek pierwotnych. Dla bardziej doświadczonych użytkowników FCS istnieją bardziej wyrafinowane metody analizy, z których niektóre zostały opisane w dyskusji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Barwienie do FCS

  1. Izolacja komórek NK myszy z limfocytów śledzionowych przy użyciu znakowania kuleczkami magnetycznymi, zgodnie z protokołem producenta16Użyć 2-3 x 105 liczba komórek na próbkę dla następujących etapów.
    UWAGA: Należy zastosować selekcję negatywną w celu wzbogacenia populacji komórek docelowych, pozostawiając je w stanie nienaruszonym, aby umożliwić ich znakowanie wyłącznie przy użyciu przeciwciał pierwszorzędowych. Patrz referencje2 aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje na temat izolacji komórek z myszy2.
  2. W przypadku komórek mysich wykazujących ekspresję receptorów Fc, należy zablokować receptory Fc za pomocą klonu przeciwciała 2.4G2 w 5 µg/µl w 25 μl z soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) i 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) na próbkę. Inkubować przez 15 min w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotowanie mieszaniny przeciwciał.
    1. Należy użyć przeciwciał bezpośrednio sprzężonych z fotostabilnym fluorophorem. W przypadku zastosowania dwóch przeciwciał przeciwko dwóm różnym białkom należy użyć fluoroforów o wyraźnie rozdzielonych widmach emisji, aby zminimalizować przesłuch (cross-talk)np. pobudzane laserami 48 i 632, w dalszej części protokołu określanych odpowiednio jako lasery i fluorofory „zielone” oraz „czerwone”).
      UWAGA: Jeśli w przypadku wybranych biomarkerów niedostępne są komercyjne przeciwciała znakowane fluoroforami o wysokiej fotostabilności, należy sprzęgać nieznakowane przeciwciała z fluoroforami zgodnie z instrukcjami producenta. Patrz Tabela materiałów dla przeciwciał wykorzystanych w niniejszym badaniu.
    2. Przygotować mieszaninę przeciwciał poprzez rozcieńczenie przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie przeciwko białku lub białkom docelowym w PBS z dodatkiem 1% FBS. Dodać mieszaninę przeciwciał do każdej próbki do uzyskania końcowej objętości wynoszącej 50 μl na próbkę. Inkubować na lodzie przez 45 min w ciemności.
      UWAGA: Wcześniej zoptymalizuj stężenie przeciwciał, aby zapewnić ich użycie w stężeniu nasycającym, zazwyczaj 1-10 μg/ml.
  4. Po inkubacji przemyć komórki, dodając 250 μl z użyciem PBS, a następnie odwiruj z prędkością 150 x g przez 3 min. Odlej supernatant.
  5. Powtórz krok 1.4.
  6. Resuspenduj komórki w 200 μl z PBS + 1% FBS. Przechowywać w lodzie i w ciemności do momentu akwizycji.
    UWAGA: Mysie komórki NK można przechowywać w lodzie przez maksymalnie 10 h.

2. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych z komorą mikroskopową

UWAGA: Należy używać szkiełek nakrywkowych z komorką lub naczyń z taką grubością szkła nakrywkowego, dla której zoptymalizowano mikroskop, tj. #1 lub #1.5. Jeśli mikroskop nie jest ustawiony na konkretną grubość lub jest ona nieznana, należy zoptymalizować pierścień korekcyjny mikroskopu dla aktualnej grubości szkła nakrywkowego17.

  1. Rozcieńczyć poli-L-lizynę wodą destylowaną w stosunku 1:10. Dodać 20 μl rozcieńczonej poli-L-lizyny do komór i inkubować przez 20 min.
  2. Usunąć poli-L-lizynę za pomocą aspiracji i pozostawić komorę do wyschnięcia na powietrzu, zostawiając ją bez pokrywki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20-30 min.

3. Uruchamianie systemu FCS

UWAGA: Niniejszy protokół odnosi się do konkretnego systemu mikroskopowego i oprogramowania (patrz Tabela materiały/odczynniki), choć można wykorzystać również inne konfiguracje mikroskopowe i pakiety oprogramowania.

  1. Włącz konfokalny mikroskop skaningowy z korelatorem FCS. Uruchom oprogramowanie w trybie „Expert mode”. Wybierz obiektyw 40X z imersją wodną.
  2. W karcie „Acquire” kliknij przyciski „Config” oraz „Scan”, aby otworzyć okna „Configuration Control” i „Scan Control” (odpowiednio okna A i B na Rysunku 1). W karcie „Confocor” kliknij „Measure”, aby otworzyć okno „Measurement” (okno C na Rysunku 1).
  3. Utwórz folder do zapisu pomiarów FCS. Rozpocznij nową bazę danych obrazów, klikając „New” w karcie „File”.
  4. Używając przycisku „Laser”, włącz lampę halogenową oraz odpowiednie lasery do wzbudzania fluoroforów (na przykład 48 nm dla „zielonego” lasera wzbudzającego i 63 nm dla „czerwonego” lasera wzbudzającego).
  5. Wybierz odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji oraz aktywuj odpowiadające im detektory.
    1. W oknie „Configuration Control” określ parametry przechwytywania obrazu, w tym laser wzbudzający, filtry wzbudzenia i emisji, ścieżkę światła oraz detektory, które mają zostać użyte.
    2. Podobnie określ odpowiednie parametry dla pomiarów FCS w oknie „Measurement”, w karcie „System Configuration”. Zastosuj jak najbardziej zbliżone ustawienia dla obrazowania i FCS.
    3. Aktywuj kanały detekcji dla zapisów FCS, zaznaczając pole „Ch1” dla kanału zielonego i „Ch2” dla kanału czerwonego w oknie „Measurement”.
      UWAGA: Ustawienia powinny być zoptymalizowane dla użytych fluoroforów, tak jak w standardowym eksperymencie obrazowania konfokalnego. W kolejnych eksperymentach te same ustawienia FCS można wykorzystać ponownie, otwierając stary plik FCS za pomocą menu rozwijanego „Confocor” u góry interfejsu użytkownika i wybierając „Open file”. W pojawiającym się oknie akwizycji kliknij „Reuse”. W podobny sposób można wczytać ustawienia akwizycji obrazu, otwierając zapisany obraz i klikając „Reuse”.
  6. Przed wykonaniem pomiarów FCS odczekaj, aż laser się ustabilizuje. W przypadku laserów gazowych może to zająć do 30 min, natomiast lasery diodowe stabilizują się szybciej. W czasie oczekiwania wyreguluj otwór pinhole.

4. Regulacja otworu (pinhole)

  1. Przygotować roztwory fluoroforów lub barwników fluorescencyjnych o stężeniu 0,2-0,5 μM, odpowiadające widmom wzbudzenia i emisji znaczników obecnych na przeciwciałach. Fluorofory muszą posiadać znane współczynniki dyfuzji18,19.
  2. Nanieść kroplę 50 μl roztworu z fluoroforem wzbudzanym laserem zielonym na środek dołka w szkiełku podstawowym z komorami. Nanieść kroplę wody destylowanej na obiektyw wodny 40X i ustawić szkiełko. Nacisnąć przycisk „Vis”, aby włączyć światło widzialne, a następnie za pomocą okularu zlokalizować kroplę fluoroforu i ustawić ostrość.
    UWAGA: Należy użyć tego samego szkiełka, które będzie wykorzystywane do późniejszych pomiarów komórek, ponieważ potencjalne niewielkie różnice w grubości szkła między różnymi szkiełkami mogą wpływać na kalibrację mikroskopu.
  3. Ustawić płaszczyznę ostrości wewnątrz kropli cieczy (10-10 μm od dna).
  4. W oknie „Measurement” wybrać zakładkę „Acquisition”. Pod sekcją „Positions” nacisnąć „Current position” (okno C na Rysunku 1).
  5. Powrócić do zakładki „System Configuration” w tym samym oknie. Ustawić wysoką moc laser zielonego.
    UWAGA: Wysoka moc lasera odnosi się do mocy nasycenia (tj. sygnał fluorescencyjny nie zwiększa się liniowo przy dalszym zwiększaniu mocy lasera). Zazwyczaj wystarczająca jest moc ustawień systemowych około 1 mW lub 5-10% maksymalnej mocy lasera.
  6. Przetestować stabilność sygnału, naciskając „Start”. Otworzy to osobne okno wyświetlające przebieg czasowy i krzywą autokorelacji dla aktualnego pomiaru. Sprawdzić, czy sygnał fluorescencyjny jest wysoki, stabilny w czasie i czy fluktuacje występują w zakresie kHz, a nie Hz.
  7. W oknie „Measurement” wybrać przycisk „O Adjust”. Sprawdzić, czy wybrano właściwy kanał detekcji (Ch1 lub Ch2). Nacisnąć „AutoAdjust X”. Jeśli otrzymana krzywa nie wykazuje wyraźnego maksimum lub maksimum znajduje się na krawędzi, zaznaczyć opcję „coarse” i ponownie nacisnąć „AutoAdjust X”. Po zakończeniu procedury w kierunku X, wykonać to samo dla Y, naciskając „AutoAdjust Y”.
  8. Odznaczyć opcję „coarse” i naprzemiennie dostrajać X oraz Y, naciskając „AutoAdjust”, aż oba parametry osiągną wyraźne maksima, a wartości nie będą zmieniać się między pomiarami.
  9. Jeśli komórki są znakowane dwoma różnymi fluoroforami, przejść do komory, do której dodano roztwór fluoroforu czerwonego. Ustawić wysoką moc lasera czerwonego i powtórzyć kroki 4.6-4.8 dla kanału wzbudzenia i detekcji czerwonego.
    UWAGA: Jeśli wartości X i Y różnią się pomiędzy kanałami w systemach, w których do obu kanałów detekcji używany jest jeden otwór (pinhole), należy wybrać wartości pośrednie i nacisnąć OK, aby zaakceptować zmiany. W tym przypadku, dla lasera 48 nm z maksimami X = 79 i Y = 189 oraz lasera 63 nm z maksimami X = 80 i Y = 18, wybrano wartości X = 80 i Y = 189. Połączenie laserów 48 nm i 63 nm do wzbudzenia dwóch przeciwciał znakowanych fluoroforami wzbudzanymi przez 488 nm lub 63 nm jest dobrym rozwiązaniem, ponieważ ryzyko przesłuchów (cross-talk) jest zminimalizowane, jeśli widma emisji nie nakładają się na siebie2.

5. Pomiar czasu przejścia wolnego fluoroforu

UWAGA: Poprzez wyznaczenie czasu przejścia przez ognisko (TauD) fluoroforu o znanym współczynniku dyfuzji, można obliczyć objętość detekcji, a tym samym powierzchnię błony komórkowej znajdującą się w obszarze ogniska. Obliczanie TauD opisano w kroku 7.2.

  1. Używając tych samych roztworów, które służyły do regulacji apertury (pinhole), ustaw czas akwizycji na 30 s x 2 powtórzenia w zakładce „Acquisition” w oknie „Measurement” (Rysunek 1, okno C).
  2. Rozpocznij pomiar, klikając „Start” w oknie „Measurement” (Rysunek 1, okno B).
    1. Wykonaj serię pomiarów mocy lasera dla każdego lasera wzbudzającego i odpowiadającego mu fluoroforu w roztworze, zaczynając od mocy nasycenia lub bliskiej niej i zmniejszając ją dwukrotnie przy każdym kolejnym pomiarze. Zmieniaj moc lasera w zakładce „System Configuration” w oknie „Measurement” (Rysunek 1, okno C). Naciśnij przycisk „Start”, aby rozpocząć pomiar.
      UWAGA: Uwzględnij moc lasera dla nadchodzących pomiarów komórkowych w dolnym zakresie (np. pomiary przy mocy 16, 8, 4 i 2 μW przed obiektywem)20. Ustawienia lasera systemowego są zazwyczaj wyższe niż moc wzbudzenia na wyjściu i mogą się znacznie różnić w zależności od mikroskopu i jakości kalibracji. W tym systemie powyższy zakres mocy odpowiada w przybliżeniu 60-50 μW mocy w ustawieniach systemowych. Zaleca się użycie watomierza do zmierzenia mocy wyjściowej przed obiektywem przy pierwszym użyciu nowego mikroskopu. Aktualna maksymalna moc lasera znajduje się pod przyciskiem „Info” w oknie „Measurement”.
    2. Zapisz liczbę zliczeń na cząsteczkę (CPM, jednostka: kHZ) z każdego pomiaru mocy lasera.
    3. Jeśli używane są dwa kanały detekcji, sprawdź w oknie wyświetlającym krzywą autokorelacji występowanie przesłuchów (cross-talk). Użyj roztworu zawierającego tylko fluorofory zielone, aby zmierzyć wykrytą autokorelację FCS w czerwonym kanale detekcji, oraz roztworu z samymi fluoroforami czerwonymi, aby ocenić detekcję w zielonym kanale detekcji. Jako ogólną zasadę przyjmij, aby wartość CPM wykryta z „niewłaściwego” fluoroforu wynosiła poniżej 5% specyficznego sygnału z właściwego fluoroforu.
    4. Sprawdź, czy wartości skalują się liniowo wraz z używaną mocą lasera. Nasycenie CPM przy najwyższej mocy lasera (tzn. wartości nieco niższe niż oczekiwano z zależności liniowej) jest dopuszczalne.
      UWAGA: Dla najwyższej mocy lasera wartość CPM powinna być znacznie wyższa niż 10 w niemal wszystkich systemach mikroskopowych i dla powszechnych fluoroforów; w systemach o wysokiej czułości może być ona znacznie wyższa. Przy pierwszym użyciu nowo sprzężonego przeciwciała fluorescencyjnego wykonaj pomiar FCS przeciwciała swobodnie dyfundującego w roztworze, aby określić oczekiwaną wartość CPM. Przed pomiarem pokryj komorę pomiarową 20 μl poli-L-lizyny szczepionej glikolem polietylenowym (rozcieńczonej do 0,5 mg/ml w PBS) przez 1 h w temperaturze pokojowej. Usuń ciecz pipetą i pozostaw komorę do wyschnięcia na powietrzu. Przechowuj roztwór zapasowy w lodówce (do 2 tygodni), a zapas w proszku w zamrażarce. Przy mikroskopie rozcieńcz przeciwciało do stężenia 1-10 µg/ml w PBS. Postępuj zgodnie z krokami 4.2-4.4 oraz 6.7 w niniejszym protokole. Jeśli powierzchnia nie zostanie pokryta roztworem zapobiegającym przywieraniu, przeciwciała będą oddziaływać z powierzchnią szkła i zostaną szybko usunięte z roztworu.

6. Pomiary komórek

  1. Do jednego dołka szkiełka nakrywki z 8 komorami dodaj 125 μl komórek w PBS + 1% FCS z zawiesiny komórek znakowanych przeciwciałami (krok 1.5) oraz 150 μl przezroczystego medium Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI). Przed rozpoczęciem pomiarów FCS pozostaw komórki w ciemności w temperaturze pomiaru przez co najmniej 20 min.
    UWAGA: Ma to na celu umożliwienie komórkom opadnięcia i przyczepienia się do dna dołków oraz wyrównanie temperatury komórek i roztworu do temperatury pomiaru.
  2. W oknie „Scan Control” (Rysunek 1, okno B) ustaw powiększenie (zoom) 1 i rozpocznij szybkie skanowanie X-Y, naciskając przycisk „Fast XY”. Skoryguj moc lasera tak, aby była jak najniższa, przy jednoczesnym zachowaniu wyraźnej widoczności komórek. Wycentruj obraz na okrągłej komórce o średniej jasności, w której błona jest wyraźnie zdefiniowana i nie występuje sygnał fluorescencyjny w cytoplazmie. Powiększaj obraz, aż komórka zajmie większość pola widzenia.
  3. Wybierz nową komórkę, jeśli obecna się porusza lub wykazuje wypustki, ekstruzje lub ekstremalnie jasne punkty. Zachowaj to samo powiększenie i moc lasera dla wszystkich komórek rejestrowanych podczas tego samego eksperymentu.
    UWAGA:pofalowana błona może być również oznaką nadchodzącej apoptozy.
  4. Ustaw ostrość na górnej części błony komórkowej. W zakładce „Acquisition” okna „Measurement” (Rysunek 1, okno C) wybierz pozycję do pomiaru FCS, aktywując funkcję „Crosshair”. Alternatywnie wybierz zakładkę „LSM Image”, zaznacz wybrany punkt pomiarowy na obrazie lsm i naciśnij „Add position”.
    UWAGA: Górna część błony komórkowej nie będzie pod wpływem przeciwciał fluorescencyjnych ani fluoroforów niespecyficznie związanych z poli-L-lizyną. Ważne jest jednak upewnienie się, że komórka nie przemieszcza się podczas pomiaru (patrz wyniki).
  5. W zakładce „Acquisition” okna „Measurement” (Rysunek 1, okno C) ustaw liczbę powtórzeń na 6-10, a czas pomiaru („Measure Time”) na 10 sec na powtórzenie.
  6. Powróć do zakładki „System Configuration” okna „Measurement”. Dostosuj moc lasera dla pomiaru FCS pod przyciskiem „Laser”. Przed obiektywem, w przypadku pomiarów komórkowych, stosuj niską moc w zakresie od 1 do 10 μW20.
    UWAGA: Zalecane wartości stanowią kompromis między detekcją sygnału a uszkodzeniami fotochemicznymi komórek. Patrz krok 5.2.1. Odnotuj procentową wartość mocy lasera, której odpowiadają te wartości.
  7. Rozpocznij pomiar FCS, naciskając „Start” w oknie „Measurement” (okno C). Jeśli na początku pomiaru nastąpi znaczny bleaching komórki, wykryty jako spadek intensywności sygnału o więcej niż 30% w ciągu pierwszych 10 sec (przykład przedstawiono na Rysunku 3A, panel dolny), przejdź do kolejnej komórki i zmniejsz moc lasera dla przyszłych pomiarów.
    1. W przypadku utraty sygnału dostosuj ostrość w kierunku Z. Po zakończeniu pomiaru użyj okna „Scan Control” (Rysunek 1, okno B), aby sprawdzić, czy komórka jest nadal wycentrowana i czy zmierzono błonę komórkową. Jeśli komórka się przemieściła, odrzuć pomiar.
    2. W oknie autokorelacji, w którym wyświetlany jest pomiar, ręcznie usuń poszczególne powtórzenia zawierające manewry zmiany powiększenia, bleaching, duże klastry lub inne artefakty (patrz przykłady na Rysunku 3). Zrób to poprzez ich zaznaczenie, kliknięcie prawym przyciskiem myszy i wybór „Delete”. Zapisz końcowy plik w formacie .fcs. Zapisz co najmniej cztery powtórzenia na komórkę.
  8. Opcjonalnie, za pomocą okna „Scan Control” wykonaj obraz komórki w przekroju środkowym (z widocznym całym obwodem błony). Wykonaj obraz po pomiarze FCS, aby uniknąć bleachingu. Naciśnij przycisk „Single”, aby rozpocząć przechwytywanie obrazu.
  9. Jeśli używasz funkcji „Add position” do pozycjonowania ostrości FCS, kliknij „Remove position” przed przejściem do następnej komórki.
  10. Wymień alikwot zawiesiny komórkowej maksymalnie co 2 hr pomiarów, aby utrzymać żywotność komórek przez cały czas trwania eksperymentu.

7. Analiza FCS

  1. Otwórz pliki .fcs w oprogramowaniu z funkcją dopasowywania krzywych (patrz Tabela materiałów/odczynników dla oprogramowania użytego w tym protokole).
    UWAGA: Oprogramowanie FCS dostarczane wraz z mikroskopem jest odpowiednim narzędziem do zapoznania się z podstawowym dopasowywaniem krzywych, jednak do dopasowania dwuwymiarowej dyfuzji błonowej niezbędne jest dodatkowe oprogramowanie.
  2. W pierwszej kolejności należy określić objętość wzbudzenia poprzez analizę pomiarów wolnego fluoroforu. Do krzywych autokorelacji należy dopasować trójwymiarową krzywą swobodnej dyfuzji.21.
    Równanie konfokalnej spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS); analiza wygaszania dynamicznego. (Równ. 1)
    UWAGA: Definicja parametrów: N: średnia liczba jednostek fluorescencyjnych w objętości ogniskowej, τ (Tau): czas korelacji, τD (TauD): średni czas przebywania w objętości ogniskowej, T1: prawdopodobieństwo przejścia fluoroforów w stan tripletowy, τT: czas relaksacji dla przejść między stanem singletowym a trypletowym, S: stosunek wysokości do średnicy szerokości objętości ogniskowej.
    1. Wyznacz TauD, czyli czas przejścia cząsteczek przez obszar ogniskowania.
    2. Należy wykorzystać zaobserwowane wartości TauD oraz opublikowane współczyniki dyfuzji (D) fluoroforów użytych do kalibracji18,19 do obliczenia promienia otworu (ω).
      Równania dyfuzji rotacyjnej; ω=√(observed τD/4*D); schemat, analiza naukowa. (Równ. 2)
  3. Analiza krzywych autokorelacji w błonach komórkowych.
    1. Aby zwizualizować fragment krzywej reprezentujący dyfuzję molekularną, należy wybrać przedział czasowy rozpoczynający się przed najstromszym nachyleniem krzywej autokorelacji i kończący się po tym, jak krzywa zbiega do wartości 1 (np. od 0,01 do 5 s dla receptorów powierzchniowych myszy; patrz Rysunek 4).
    2. Wygeneruj średnią krzywą autokorelacji dla poszczególnych powtórzeń zapisanych w kroku 6.7.2.
    3. Dopasuj dwuwymiarową krzywą dyfuzji membranowej do każdej uśrednionej krzywej autokorelacji, korzystając z równania 33.
      Wzór na równowagę statyczną; analiza równania G2D(t), schemat procesów zależnych od czasu.(Równ. 3)
      UWAGA: Ważne parametry wyjściowe są następujące: N to średnia liczba cząsteczek znajdujących się w pobudzanym obszarze błony. Przelicz na gęstość (N/μm2). τD (TauD): średni czas przebywania w obszarze ogniskowym, ograniczony dwuwymiarowością błony (s). Przelicz średni czas przebywania na współczynnik dyfuzji (μm2(/sek) poprzez wyznaczony promień otworu (ω) oraz równanie 2. T1 jest prawdopodobieństwem przejścia fluoroforów w stan tripletowy. Jasność (CPM) oblicza się poprzez podzielenie średniej całkowitej intensywności pomiaru przez N.
    4. Jeśli za pierwszym razem nie uda się uzyskać dobrego dopasowania, należy zmieniać wartości początkowe i/lub górne i dolne granice zmiennych aż do momentu uzyskania dopasowania.
      UWAGA: Typowe górne i dolne granice szybkości dyfuzji białek w pierwotnych błonach komórkowych wynoszą 10–50 ms dla TauD, 0–10% dla T1 oraz 0,1–5 ms dla TauT1. Wartości początkowe dla dopasowania należy wybrać w połowie tych przedziałów. Część krzywej reprezentująca fluktuacje fluorescencji wynikające z dyfuzji znajduje się zazwyczaj między 1 ms a 1 s (patrz Rysunek 4). W zależności od fluoroforu czasami może występować drugi proces, prowadzący do autokorelacji w krótszych skalach czasowych niż parametr dyfuzji. Jest to spowodowane przejściowym stanem ciemnym (trypletowym) lub mruganiem (co często zdarza się w przypadku białek fluorescencyjnych). Stan trypletowy został uwzględniony w równaniu 3, zatem przedstawiony model powinien zapewniać dobry dopasowanie również w takich sytuacjach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Typowy wynik pozwoli na wygenerowanie krzywej autokorelacji z czasem przejścia w zakresie od 10 msec do 40 msec dla białek błonowych. Liczba cząsteczek w przypadku białek ekspresowanych endogennie może wynosić od 0,5 do około 20 na μm2. Należy dokładnie sprawdzić, czy wartość CPM nie jest niższa od oczekiwanej, co może wskazywać na wpływ sygnału tła. Jako ogólną zasadę przyjmuje się, że sygnał CPM na komórkach akceptowany do analizy nie powinien być niższy niż 3% wartości CPM d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ten protokół FCS może być stosowany do oceny dynamiki molekularnej cząsteczek powierzchniowych na wszystkich typach komórek odpornościowych (mysie, ludzkie lub inne gatunki). FCS mierzy przestrzenno-czasową dynamikę molekularną aż do rozdzielczości pojedynczej cząsteczki w żywych komórkach. Gęstość molekularną, a także szybkość dyfuzji i dynamikę grupowania badanych białek można wyodrębnić z krzywych autokorelacji.

Znakowanie fluorescencyjne ma kluczowe znaczenie dla udanych eksperymentów z FC...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy dr Vladanie Vukojeviç, Center for Molecular Medicine, Karolinska Institutet za utrzymanie instrumentu Zeiss Confocor 3 i za pomocne wskazówki dotyczące pomiarów komórek. To badanie zostało sfinansowane z grantów Vetenskapsrådet (numer grantu 2012- 1629), Magnus Bergvalls stiftelse oraz Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
MACS NK Cell Isolation Kit mysz IIMiltenyi Biotec NordenAB130-096-892Negatywna selekcja komórek NK
Płodowa surowica bydlęcaSigma-AdlrichF7524Inaktywowana termicznie
sól fizjologiczna buforowana fosforanem-wyprodukowana w domu 
Roswell Park Memorial Institute medium 1640PAA Firma zajmująca się hodowlą komórkową E15-848Przezroczyste podłoże
Klon przeciwciała 2.4G2Thermo Fischer Scientific553140Do blokowania receptorów Fc.
Przeciwciało anty-Ly49A Przeciwciało monoklonalne wyprodukowane we własnym zakresie i sprzężone w domu z przeciwciałem Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd BD Pharmingen558915Sprzężony we własnym zakresie z MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488MobiotechMFP-A2181Barwnik fluorescencyjny do koniugacji przeciwciał.
Poli-L-LizynaSigma-AldrichP8920Rozcieńczony w wodzie destylowanej (1.10)
Poli-L-lizyna (20 kDa) szczepiona glikolem polietylenowym (2 kDa)SuSoS AGPLL(20)-g[3.5]-PEG(2)Rozcieńczony w PBS (pH 7,4) do 0,5 mg/ml.
Chlorek rodaminy 110Sigma-Aldrich432202Znany współczynnik dyfuzji: 3,3 &razy; 10− 10 m2/sec 19
Alexa fluor 647Thermo Fisher Scientific A20006Znany współczynnik dyfuzji: 4,4 &razy; 10− 10 m2/sec 20
Mikroskop konfokalny Oprogramowanie ZeissLSM510
: Confocor 3Oprogramowanie Zeiss
: Matlab z zestawem narzędzi do dopasowania krzywychMatlabWersja R2013b
Nunc Lab-Tek Komorowe szkło nakrywkoweTermo-naukowe 1554118 studzienek, dno borokrzemianowe 1,0

Bibliografia

  1. Goni, F. M. The basic structure and dynamics of cell membranes: an update of the Singer-Nicolson model. Biochim Biophys Acta. 1838, 1467-1476 (2014).
  2. Bagawath-Singh, S., et al. Cytokines Induce Faster Membrane Diffusion of MHC Class I and the Ly49A Receptor in a Subpopulation of Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, (2016).
  3. Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy for the study of membrane dynamics and protein/lipid interactions. Methods. 46, 116-122 (2008).
  4. Machan, R., Wohland, T. Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems. FEBS Lett. 588, 3571-3584 (2014).
  5. Mutze, J., Ohrt, T., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in vivo. Laser Photon Rev. 5, 52-67 (2011).
  6. Lidke, D. S., Wilson, B. S. Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells. Trends Cell Biol. 19, 566-574 (2009).
  7. Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Rep Prog Phys. 78, 124601(2015).
  8. Wiseman, P. W. Image correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. , 336-348 (2015).
  9. Sankaran, J., Shi, X., Ho, L. Y., Stelzer, E. H., Wohland, T. ImFCS: a software for imaging FCS data analysis and visualization. Opt Express. 18, 25468-25481 (2010).
  10. Liu, P., Ahmed, S., Wohland, T. The F-techniques: advances in receptor protein studies. Trends Endocrinol Metab. 19, 181-190 (2008).
  11. Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 5, 155-157 (2008).
  12. Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. , 709-725 (2014).
  13. Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 151-169 (2007).
  14. Widengren, J., Thyberg, P. FCS cell surface measurements--photophysical limitations and consequences on molecular ensembles with heterogenic mobilities. Cytometry A. 68, 101-112 (2005).
  15. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
  16. Meinhardt, K., et al. Influence of NK cell magnetic bead isolation methods on phenotype and function of murine NK cells. J Immunol Methods. 378, 1-10 (2012).
  17. Bacia, K., Schwille, P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat Protoc. 2, 2842-2856 (2007).
  18. Gendron, P. O., Avaltroni, F., Wilkinson, K. J. Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclear magnetic resonance and fluorescence correlation spectroscopy. J Fluoresc. 18, 1093-1101 (2008).
  19. Petrasek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 94, 1437-1448 (2008).
  20. Stromqvist, J., et al. A modified FCCS procedure applied to Ly49A-MHC class I cis-interaction studies in cell membranes. Biophys J. 101, 1257-1269 (2011).
  21. Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study. J Phys Chem. 99, 13368-13379 (1995).
  22. Humpolickova, J., et al. Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 91, L23-L25 (2006).
  23. Guo, S. M., et al. Bayesian approach to the analysis of fluorescence correlation spectroscopy data II: application to simulated and in vitro data. Anal Chem. 84, 3880-3888 (2012).
  24. Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Opt Express. 18, 11073-11082 (2010).
  25. Chiu, C. L., et al. Intracellular kinetics of the androgen receptor shown by multimodal Image Correlation Spectroscopy (mICS). Sci Rep. 6, 22435(2016).
  26. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Błona komórkowamikroskopia konfokalnakrzywa autokorelacjiwspółczynnik dyfuzjibarwniki fluorescencyjnebarwienie przeciwciałamiobrazowanie żywych komórek
Dyfuzja molekularna w błonach plazmatycznych limfocytów pierwotnych mierzona za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.