Dyfuzja molekularna w błonach plazmatycznych limfocytów pierwotnych mierzona za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Podsumowanie

Opisano metodę pomiaru dyfuzji białek w błonach pierwotnych komórek odpornościowych za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS). W niniejszej pracy zilustrowano zastosowanie przeciwciał do znakowania fluorescencyjnego.

Streszczenie

Spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS) to potężna technika badania dyfuzji cząsteczek w błonach biologicznych z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową. FCS może określić ilościowo stężenie molekularne i współczynnik dyfuzji znakowanych fluorescencyjnie cząsteczek w błonie komórkowej. Technika ta ma możliwość zbadania charakterystyki dyfuzji molekularnej cząsteczek w błonie komórkowej komórek odpornościowych w stanie ustalonym (tj. bez procesów wpływających na wynik w rzeczywistym czasie pomiaru). FCS nadaje się do badania dyfuzji białek, które ulegają ekspresji na poziomach typowych dla większości białek endogennych. W tym miejscu zademonstrowano prostą i solidną metodę określania szybkości dyfuzji białek błony komórkowej na limfocytach pierwotnych. Opisano skuteczny sposób wykonywania pomiarów na żywych komórkach barwionych przeciwciałami oraz powszechnie występujące obserwacje po akwizycji. Ostatnie postępy w rozwoju fotostabilnych barwników fluorescencyjnych można wykorzystać poprzez koniugację interesujących przeciwciał z odpowiednimi barwnikami, które nie wybielają się intensywnie podczas pomiarów. Dodatkowo pozwala to na detekcję jednostek wolno dyfuzyjnych, co jest wspólną cechą białek ulegających ekspresji w błonach komórkowych. Przedstawiono procedurę analizy mającą na celu wyodrębnienie parametrów stężenia molekularnego i dyfuzji z wygenerowanych krzywych autokorelacji. Podsumowując, zapewniony jest podstawowy protokół pomiarów FCS; Może być stosowany przez immunologów ze zrozumieniem mikroskopii konfokalnej, ale bez innego wcześniejszego doświadczenia w technikach pomiaru parametrów dynamicznych, takich jak szybkość dyfuzji molekularnej.

Wprowadzenie

Wiele funkcji komórek odpornościowych opiera się na dyfuzji molekularnej i interakcjach wewnątrz błon. Błony biologiczne są złożone, a wiele czynników, które mogą być ważne dla funkcjonowania komórek odpornościowych, może wpływać na szybkość translacyjnej dyfuzji białek w błonach komórkowych¹. Niedawno wykazaliśmy, że komórki NK (natural killer), limfocyty należące do wrodzonego układu odpornościowego, wykazują różnicową dyfuzję dwóch badanych białek na błonie komórkowej w zależności od stanu aktywacji komórek NK².

Spektroskopia korelacji fluorescencji (FCS) to technika, która jest w stanie określić ilościowo szybkość dyfuzji molekularnej w błonach biologicznych. Podaje średnią szybkość dyfuzji cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie w stałej objętości, zwykle ostrości mikroskopu konfokalnego. Opiera się na pomiarze fluktuacji fluorescencji, które występują podczas ruchu molekularnego w układzie w stanie ustalonym. FCS jest szeroko stosowany do badania dyfuzji barwników i białek fluorescencyjnych, zarówno w roztworze, jak i w błonach lipidowych. Inne parametry wyjściowe wpływające na szybkość dyfuzji mogą być również pośrednio badane w ten sposób (np. zmiany konformacyjne białek lub oddziaływania cząsteczek na błonach komórkowych)^3,4. FCS wyróżnia się na tle innych technik wysoką czułością, co daje możliwość wykrywania pojedynczych cząsteczek. Działa dobrze w przypadku stężeń molekularnych w zakresie od nanomolowych do milimolowych, co jest typowe dla endogennych poziomów ekspresji większości białek⁵. Co więcej, FCS może dać przybliżenie bezwzględnej liczby białek w badanej objętości, podczas gdy większość innych technik podaje tylko względne informacje o poziomach ekspresji białek. Inne metody pomiaru szybkości dyfuzji molekularnej w membranach obejmują odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP), śledzenie pojedynczych cząstek (SPT), wielootworowy FCS i metody korelacji obrazu. Metody FRAP i korelacji obrazów są technikami zespołowymi, które na ogół nie dostarczają informacji o bezwzględnej liczbie cząsteczek¹⁰. W porównaniu z SPT, przepustowość FCS jest wyższa w odniesieniu do charakterystyki średniej populacji. Analiza jest również mniej wymagająca, ponieważ mierzona jest średnia szybkość dyfuzji cząsteczek obecnych w ognisku lasera, a nie szybkość pojedynczych cząsteczek. Ponadto, o ile specjalistyczne mikroskopy nie są dostępne¹¹, SPT nie może podać żadnych informacji o stężeniach, ponieważ standardowe oznakowanie SPT musi być bardzo niskie, aby umożliwić identyfikację pojedynczych cząsteczek. Z drugiej strony, FCS wymaga, aby badane cząsteczki były mobilne. Po prostu nie wykryje żadnych przypuszczalnie nieruchomych frakcji lub cząsteczek poruszających się bardzo wolno. Szybkość dyfuzji cząsteczek, które znajdują się w ognisku dłużej niż około jednej dziesiątej czasu akwizycji, nie będzie poprawnie odwzorowana w pomiarach FCS^3,12. W związku z tym współczynniki dyfuzji rejestrowane przez FCS są zwykle szybsze niż szybkości dyfuzji zgłaszane za pomocą technik takich jak FRAP i SPT, w których brane są również pod uwagę frakcje bliskie unieruchomieniu i bardzo wolne. SPT dostarczy również bardziej szczegółowego opisu zmienności szybkości dyfuzji w populacji molekularnej niż FCS.

FCS określa ilościowo fluktuację intensywności fluorescencji w czasie w wzbudzonej objętości. W przypadku pomiarów membranowych przekłada się to na oświetlony obszar membrany. W tym artykule wykorzystujemy fakt, że takie fluktuacje są indukowane przez cząsteczki wykazujące dyfuzję Browna, a zatem poruszają się do i z objętości wzbudzenia. Istnieje również kilka innych możliwych źródeł fluktuacji sygnału fluorescencji, takich jak mruganie lub obecność stanu trypletowego we fluoroforach, efekty środowiskowe, wiązanie-rozwiązywanie ligandu lub ruch całej błony komórkowej. Te domniemane źródła błędów muszą być brane pod uwagę podczas projektowania eksperymentu FCS, aby dokładnie zinterpretować wyniki^12,13. Zazwyczaj szybkość dyfuzji bocznej w błonach biologicznych jest niska ze względu na stłoczenie i interakcje, zarówno między białkami błonowymi, jak i między białkami a cytoszkieletem. Historycznie rzecz biorąc, stosowanie FCS w membranach było utrudnione przez brak fotostabilnych fluoroforów, które są wymagane, aby uniknąć bielenia podczas wydłużonego czasu przejścia przez wzbudzenie focus¹⁴. Jednak obecnie istnieje wiele opcji odpowiednich barwników fotostabilnych. Znaczne ulepszenia w detektorach i innym sprzęcie pozwalają również na wykrywanie białek fluorescencyjnych i barwników o niższej jasności. W tym miejscu opisano podstawowy protokół stosowania FCS przy użyciu mysich limfocytów pierwotnych, w których białko będące przedmiotem zainteresowania jest znakowane fluorescencyjnie znakowanym przeciwciałem. Przedstawiono również podejście polegające na dopasowaniu krzywych autokorelacji w celu wyodrębnienia współczynnika dyfuzji i gęstości cząsteczkowej. Protokół ma na celu zapewnienie łatwego stosowania przez immunologów, którzy nie mają wcześniejszego doświadczenia w technikach badania dyfuzji cząsteczek. Oczekuje się jednak podstawowej wiedzy na temat mikroskopii konfokalnej (aby uzyskać tę podstawową wiedzę, patrz odniesienie¹⁵). Protokół ten można stosunkowo łatwo dostosować do innych komórek zawiesinowych, zarówno linii komórkowych, jak i komórek pierwotnych. Dla bardziej doświadczonych użytkowników FCS istnieją bardziej wyrafinowane metody analizy, z których niektóre zostały opisane w dyskusji.

Protokół

1. Barwienie dla FCS

1. Wyizoluj mysie komórki NK z limfocytów śledziony za pomocą magnetycznego znakowania kulkowego, zgodnie z protokołem producenta¹⁶. Użyj 2-3 x 10⁵ komórek na próbkę, aby wykonać następujące czynności.
   UWAGA: Użyj selekcji negatywnej, aby wzbogacić docelową populację komórek, pozostawiając ją nietkniętą, tak aby komórki można było znakować przy użyciu samych przeciwciał pierwszorzędowych. Zobacz reference², aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje na temat izolacji komórek od myszy².
2. W przypadku komórek mysich wykazujących ekspresję receptorów Fc należy zablokować receptory Fc za pomocą klonu przeciwciała 2,4G2 w stężeniu 5 μg/μl w 25 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) na próbkę. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
3. Przygotowanie mieszaniny przeciwciał.
   1. Stosować przeciwciała bezpośrednio sprzężone z fotostabilnym fluoroforem. Jeśli używane są dwa przeciwciała przeciwko dwóm różnym białkom, użyj fluoroforów, które mają dobrze oddzielone widma emisyjne, aby zminimalizować przesłuchy (np. wzbudzone przez lasery 488 i 6332, w dalszej części protokołu określane odpowiednio jako "zielone" i "czerwone" lasery i fluorofory).
      UWAGA: Jeśli komercyjne przeciwciała znakowane fotostabilnymi fluoroforami nie są dostępne dla wybranych biomarkerów, należy skoniugować nieznakowane przeciwciała przeciwko fluoroforom zgodnie z instrukcjami producenta. Zobacz tabelę materiałów, aby zapoznać się z przeciwciałami użytymi w tym badaniu.
   2. Przygotować mieszaninę przeciwciał, rozcieńczając znakowane fluorescencyjnie przeciwciała przeciwko białku lub białkom będącym przedmiotem zainteresowania w PBS + 1% FBS. Dodać mieszaninę przeciwciał do każdej próbki do końcowej objętości 50 μl na próbkę. Inkubować na lodzie przez 45 minut w ciemności.
      UWAGA: Zoptymalizuj stężenie przeciwciał z wyprzedzeniem, aby upewnić się, że przeciwciało jest używane w stężeniu nasycającym, zwykle 1-10 μg/ml.
4. Po inkubacji przemyć komórki, dodając 250 μl PBS i odwirować je przy 150 x g przez 3 minuty. Odrzucić supernatant.
5. Powtórz krok 1.4.
6. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl PBS + 1% FBS. Trzymaj na lodzie i w ciemności aż do nabycia.
   UWAGA: Mysie komórki NK mogą być trzymane na lodzie do 10 godzin.

2. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych z komorą mikroskopową

UWAGA: Używaj szkiełek nakrywkowych lub naczyń o grubości szkła nakrywkowego, dla której mikroskop został zoptymalizowany, zarówno #1, jak i #1.5. Jeśli mikroskop nie jest ustawiony na określoną grubość lub jeśli jest ona nieznana, pierścień kołnierza mikroskopu należy zoptymalizować pod kątem bieżącej grubości szkła nakrywkowego¹⁷.

1. Rozcieńczyć poli-L-lizynę wodą destylowaną w stosunku 1:10. Dodać 200 μl rozcieńczonej poli-L-lizyny do komór i inkubować przez 20 minut.
2. Usuń poli-L-lizynę przez aspirację i pozostaw komorę do wyschnięcia na powietrzu, pozostawiając ją bez pokrywki w temperaturze pokojowej na co najmniej 20-30 minut.

3. Uruchamianie systemu SKO

UWAGA: Ten protokół odnosi się do konkretnego systemu mikroskopowego i oprogramowania (patrz Tabela materiałów/odczynników), chociaż można również używać innych ustawień mikroskopowych i pakietów oprogramowania.

1. Włącz konfokalny laserowy mikroskop skaningowy z korelatorem FCS. Otwórz oprogramowanie w "Trybie eksperta". Wybierz obiektyw 40X do zanurzenia w wodzie.
2. Na karcie "Pobierz" naciśnij przyciski "Konfiguracja" i "Skanuj", aby otworzyć okna "Kontrola konfiguracji" i "Kontrola skanowania" (odpowiednio okna A i B na rysunku 1). W zakładce "Confocor" naciśnij "Pomiar", aby otworzyć okno "Pomiar" (okno C na rysunku 1).
3. Utwórz folder, w którym zostaną zapisane pomiary FCS. Uruchom nową bazę danych obrazów, klikając "Nowy" w zakładce "Plik".
4. Za pomocą przycisku "Laser" włącz lampę halogenową i odpowiednie lasery do wzbudzania fluoroforów (na przykład 488 nm dla "zielonego" lasera wzbudzającego i 633 nm dla "czerwonego" lasera wzbudzającego).
5. Wybierz odpowiednie filtry wzbudzenia i emisji i aktywuj odpowiednie detektory.
   1. Określ ustawienia przechwytywania obrazu, w tym laser wzbudzenia, filtry wzbudzenia i emisji, ścieżkę światła i detektory, które mają być używane, w oknie "Kontrola konfiguracji".
   2. Podobnie określ odpowiednie ustawienia dla pomiarów FCS w oknie "Pomiar", w zakładce "Konfiguracja systemu". Użyj jak najbardziej podobnych ustawień dla obrazowania i FCS.
   3. Aktywuj kanały detekcji dla nagrań FCS, zaznaczając pole "Ch1" dla kanału zielonego i "Ch2" dla kanału czerwonego w oknie "Pomiar".
      UWAGA: Ustawienia powinny być zoptymalizowane pod kątem użytego fluoroforu(ów), tak jak w standardowym eksperymencie obrazowania konfokalnego. W kolejnych eksperymentach te same ustawienia FCS mogą być ponownie wykorzystane, otwierając stary plik FCS, korzystając z menu rozwijanego "Confocor" w górnej części interfejsu użytkownika i wybierając "Otwórz plik". Naciśnij "Użyj ponownie" w pojawiającym się oknie akwizycji. Podobnie ustawienia akwizycji obrazu można załadować, otwierając zapisany obraz i naciskając "Użyj ponownie".
6. Poczekaj, aż laser się ustabilizuje, zanim wykonasz pomiary FCS. W przypadku laserów gazowych może to zająć do 30 minut, podczas gdy lasery diodowe stabilizują się szybciej. Wyreguluj otwór podczas oczekiwania.

4. Regulacja otworka

1. Przygotować 0,2-0,5 μM roztwory fluoroforów lub barwników fluorescencyjnych odpowiadające widmom wzbudzenia i emisji etykiet na przeciwciałach. Fluorofory muszą mieć znane współczynniki dyfuzji^18,19.
2. Umieść kroplę 50 μl roztworu z fluoroforem wzbudzonym przez zielony laser w środku studzienki w komorze na szkiełku nakrywkowym. Umieść kroplę wody destylowanej na obiektywie wodnym 40X i ustaw szkiełko. Naciśnij przycisk "Vis", aby uruchomić światło widzialne i użyj okularu, aby znaleźć i skupić się na kropli fluoroforu.
   UWAGA: Użyj tego samego szkiełka, co w przypadku późniejszych pomiarów celi, ponieważ przypuszczalne niewielkie różnice w grubości szkła między szkiełkami mogą wpływać na wyrównanie mikroskopu.
3. Umieść ostrość dobrze w kropli cieczy (10-100 μm od dna).
4. W oknie "Pomiar" wybierz zakładkę "Akwizycja". Naciśnij "Bieżąca pozycja" pod "Pozycje" (okno C na rysunku 1).
5. Wróć do zakładki "Konfiguracja systemu" w tym samym oknie. Ustaw wysoką moc dla zielonego lasera.
   UWAGA: Wysoka moc lasera odnosi się do mocy nasycenia (tj. sygnał fluorescencyjny nie wzrasta liniowo, jeśli moc lasera jest dalej zwiększana). Zazwyczaj wystarcza około 1 mW mocy ustawień systemowych lub 5-10% maksymalnej mocy lasera.
6. Przetestuj stabilność sygnału, naciskając "Start". Spowoduje to otwarcie osobnego okna wyświetlającego ślad czasowy i krzywą autokorelacji dla bieżącego pomiaru. Sprawdź, czy sygnał fluorescencyjny jest wysoki, stabilny w czasie i wykazuje wahania w zakresie kHz, a nie Hz.
7. Wybierz przycisk "O Adjust" w oknie "Pomiar". Sprawdź, czy wybrano właściwy kanał detekcji (Ch1 lub Ch2). Naciśnij "AutoDostosuj X". Jeśli wynikowa krzywa nie pokazuje wyraźnego maksimum lub maksimum znajduje się na krawędzi, zaznacz opcję "zgrubny" i ponownie naciśnij "AutoDostosuj X". Gdy wynikowy ekran w kierunku x zostanie zakończony, zrób to samo dla Y, naciskając "AutoDostosuj Y".
8. Usuń zaznaczenie opcji "zgrubny" i naprzemiennie reguluj X i Y, naciskając "Autoregulacja", aż oba będą miały wyraźne maksima, a wartości nie będą się zmieniać między pomiarami.
9. Jeśli komórki są znakowane dwoma różnymi fluoroforami, przenieś się do komory, w której dodano czerwony roztwór fluoroforu. Wybierz wysoką moc lasera dla czerwonego lasera i powtórz kroki 4.6-4.8 dla czerwonego kanału wzbudzenia i detekcji.
   UWAGA: Jeśli wartości X i Y różnią się między kanałami w systemach, w których dla obu kanałów detekcji używany jest tylko jeden otwór, wybierz wartości pośrednie i naciśnij OK, aby zaakceptować zmiany. Tutaj dla lasera 488 nm z maksimami przy X = 79 i Y = 189 oraz lasera 633 nm z maksimami przy X = 80 i Y = 188 wybrano wartości X = 80 i Y = 189. Połączenie laserów o długości fali 488 nm i 633 nm do wzbudzenia dwóch przeciwciał znakowanych fluoroforami wzbudzonymi przez 488 nm lub 633 nm jest dobrym wyborem, ponieważ ryzyko przesłuchów jest zminimalizowane, jeśli widma emisyjne nie nakładają się na siebie².

5. Zmierz czas przejścia wolnego fluoroforu

UWAGA: Określając czas przejścia przez ognisko (TauD) fluoroforu o znanym współczynniku dyfuzji, można obliczyć wielkość objętości detekcji, a tym samym obszar błony komórkowej, który znajduje się w ognisku. Obliczanie TauD opisano w kroku 7.2.

1. Korzystając z tych samych rozwiązań, które są używane do regulacji otworka, ustaw czas akwizycji na 30 sekund x 2 powtórzenia w zakładce "Akwizycja" w oknie "Pomiar" (Rysunek 1, okno C).
2. Rozpocznij pomiar, klikając "Start" w oknie "Pomiar" (Rysunek 1, okno B).
   1. Wykonaj serię mocy lasera dla każdego lasera wzbudzającego i odpowiadającego mu fluoroforu w roztworze, zaczynając od lub blisko mocy nasycenia i zmniejszając o połowę dla każdego pomiaru. Zmień moc lasera w zakładce "Konfiguracja systemu" w oknie "Pomiar" (Rysunek 1, okno C). Naciśnij przycisk "Start", aby rozpocząć pomiar.
      UWAGA: Uwzględnij moc lasera dla nadchodzących pomiarów ogniw w dolnym zakresie (np. zmierz przy mocy 16, 8, 4 i 2 μW, przed obiektywem)²⁰. Ustawienia lasera systemowego są na ogół wyższe niż wzbudzenie wyjściowe i mogą się znacznie różnić w zależności od mikroskopu i jakości osiowania. W tym systemie powyższy zakres mocy odpowiada około 60-500 μW mocy ustawień systemu. Zaleca się użycie miernika mocy do pomiaru mocy wyjściowej przed obiektywem przy pierwszym użyciu nowego mikroskopu. Aktualna maksymalna moc lasera znajduje się pod przyciskiem "Info" w oknie "Pomiar".
   2. Zapisz liczby na cząsteczkę (CPM, jednostka: kHZ) z każdego pomiaru mocy lasera.
   3. Jeśli używane są dwa kanały detekcji, sprawdź okno wyświetlające krzywą autokorelacji dla przesłuchów. Użyj roztworu zawierającego tylko zielone fluorofory do pomiaru wykrytej autokorelacji FCS w czerwonym kanale detekcji i roztworu zawierającego tylko czerwone fluorofory do oceny wykrycia w zielonym kanale detekcji. Z reguły utrzymuj CPM wykryty przez "niewłaściwy" fluorofor poniżej 5% specyficznego sygnału z właściwego fluoroforu.
   4. Sprawdź, czy wartości skalują się liniowo wraz z używaną mocą lasera. Dopuszczalne jest nasycenie CPM przy najwyższej mocy lasera (tj. nieco niższe wartości niż oczekiwane na podstawie zależności liniowej).
      UWAGA: CPM powinien być znacznie powyżej 10, aby uzyskać najwyższą moc lasera dla prawie wszystkich systemów mikroskopowych i popularnych fluoroforów i może być znacznie wyższy dla wrażliwych systemów. Przy pierwszym użyciu nowo sprzężonego przeciwciała fluorescencyjnego należy wykonać pomiar FCS przeciwciała swobodnie dyfundującego w roztworze, aby określić ilościowo oczekiwany CPM. Przed pomiarem pokryj komorę pomiarową 200 μl poli-L-lizyny szczepionej glikolem polietylenowym (rozcieńczonym do 0,5 mg/ml w PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Usuń płyn za pomocą pipety i pozostaw komorę do wyschnięcia na powietrzu. Roztwór podstawowy przechowuj w lodówce (do 2 tygodni), a bulion w proszku w zamrażarce. Pod mikroskopem rozcieńczyć przeciwciało do 1-10 μg/ml w PBS. Wykonaj kroki 4.2-4.4 i 6.7 w tym protokole. Jeśli powierzchnia nie zostanie pokryta nieprzywierającym roztworem, przeciwciała będą oddziaływać z powierzchnią szkła i szybko ulegną wyczerpaniu z roztworu.

6. Pomiary komórek

1. Dodać 125 μl komórek w PBS + 1% FCS z zawiesiny komórek znakowanej przeciwciałami (krok 1.5) i 150 μl przezroczystego podłoża Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) do jednego dołka 8-dołkowego szkiełka nakrywkowego. Pozostaw ogniwa w ciemności w temperaturze pomiaru na co najmniej 20 minut przed rozpoczęciem pomiarów FCS.
   UWAGA: Ma to na celu umożliwienie ogniwom osiadania i przyczepienia się do dna studzienek oraz zrównoważenie komórek i roztworu do temperatury pomiaru.
2. W oknie "Scan Control" (Rysunek 1, okno B) ustaw powiększenie 1 i rozpocznij szybkie skanowanie X-Y, naciskając przycisk "Fast XY". Zmodyfikuj moc lasera tak, aby była jak najniższa, podczas gdy ogniwa są nadal wyraźnie widoczne. Wyśrodkuj obraz na okrągłej komórce o średniej jasności, gdzie błona jest wyraźnie zdefiniowana, a w cytoplazmie nie ma sygnału fluorescencyjnego. Powiększanie obrazu do momentu, gdy komórka pokryje większą część obrazu.
3. Zaznacz nową komórkę, jeśli bieżąca komórka jest ruchoma lub wyświetla wąsy, wyciągnięcia lub bardzo jasne punkty. Zachowaj ten sam zoom i moc lasera dla wszystkich komórek uchwyconych podczas tego samego eksperymentu.
   UWAGA: Pomarszczona błona może być również oznaką zbliżającej się apoptozy.
4. Skoncentruj się na górnej części błony komórkowej. W zakładce "Akwizycja" w oknie "Pomiar" (Rysunek 1, okno C) wybierz pozycję do pomiaru SKO, aktywując "Celownik". Alternatywnie wybierz zakładkę "Obraz LSM", zaznacz żądane miejsce pomiaru na obrazie lsm i naciśnij "Dodaj pozycję"."
   UWAGA: Na górną część błony komórkowej nie będą miały wpływu przeciwciała fluorescencyjne ani fluorofory niespecyficznie związane z poli-L-lizyną. Jednak ważne jest, aby upewnić się, że ogniwo nie porusza się podczas pomiaru (patrz wyniki).
5. W zakładce "Akwizycja" w oknie "Pomiar" (Rysunek 1, okno C) ustaw liczbę powtórzeń na 6-10, przy czym "Czas pomiaru" jest ustawiony na 10 sekund na powtórzenie.
6. Wróć do zakładki "Konfiguracja systemu" w oknie "Pomiar". Dostosuj moc lasera do pomiaru FCS pod przyciskiem "Laser". Przed obiektywem użyj niskiej mocy do pomiarów ogniw, w zakresie od 1 do 10 μW²⁰.
   UWAGA: Zalecane wartości to kompromis między wykrywaniem sygnału a fotouszkodzeniem komórek. Patrz krok 5.2.1 Zwróć uwagę na procentową moc lasera, której odpowiadają te wartości.
7. Rozpocznij pomiar SKO poprzez naciśnięcie przycisku "Start" w oknie "Pomiar" (okno C). Jeśli ogniwo znacznie blednie na początku pomiaru, co zostało wykryte przez spadek śladu intensywności o ponad 30% w ciągu pierwszych 10 sekund (przykład pokazano na rysunku 3A, dolny panel), przejdź do innego ogniwa i zmniejsz moc lasera do przyszłych pomiarów.
   1. Jeśli sygnał zostanie utracony, ustaw ostrość w kierunku Z. Po zakończeniu pomiaru użyj okna "Kontrola skanowania" (Rysunek 1, okno B), aby sprawdzić, czy komórka jest nadal wyśrodkowana i czy błona komórkowa została zmierzona. Jeśli komórka się przesunęła, odrzuć pomiar.
   2. W oknie automatycznej korelacji, w którym wyświetlany jest pomiar, ręcznie usuń pojedyncze powtórzenia, które zawierają manewry powiększania, bielenia, duże klastry lub inne artefakty (patrz przykłady na rysunku 3). Zrób to, zaznaczając je, klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając "Usuń". Zapisz końcowy plik w formacie .fcs. Zapisz co najmniej cztery powtórzenia na komórkę.
8. Opcjonalnie uzyskaj obraz komórki w środkowej części (z widocznym całym obwodem błony) za pomocą okna "Scan Control". Uchwyć obraz po pomiarze FCS, aby uniknąć wybielania. Naciśnij przycisk "Pojedynczy", aby rozpocząć przechwytywanie obrazu.
9. Jeśli używasz opcji "Dodaj pozycję" do pozycjonowania fokusu, kliknij "Usuń pozycję" przed przejściem do następnej komórki.
10. Zmienić na nową podwielokrotność zawiesiny komórek po maksymalnie 2 godzinach pomiaru, aby utrzymać komórki przy życiu przez cały czas trwania eksperymentu.

7. Analiza FCS

1. Otwórz pliki .fcs w oprogramowaniu z możliwością dopasowania krzywej (patrz Tabela materiałów/odczynników, aby zapoznać się z oprogramowaniem używanym w tym protokole).
   UWAGA: Oprogramowanie FCS dołączone do mikroskopu jest dobrym miejscem do zapoznania się z podstawowymi dopasowaniami, ale dodatkowe oprogramowanie jest niezbędne do dopasowania dwuwymiarowej dyfuzji membranowej.
2. Najpierw określ wielkość objętości wzbudzenia, analizując pomiary wolnego fluoroforu. Dopasuj 3-wymiarową krzywą dyfuzji swobodnej do krzywych autokorelacji²¹.
   (Równanie 1)
   UWAGA: Definicja parametrów: N: średnia liczba elementów fluorescencyjnych w objętości ogniskowej, τ (Tau): czas korelacji, τ_D (TauD): średni czas przebywania w objętości ogniskowej, T1: prawdopodobieństwo, że fluorofory znajdują się w stanie trypletowym, τ_T: czas relaksacji dla przejść stanu singlet-tryplet, S: stosunek wysokości do średnicy szerokości dla objętości ogniskowej.
   1. Wyodrębnij TauD, czas tranzytu cząsteczek w celu przeniesienia ogniska.
   2. Użyj obserwowanych TauD i opublikowanych współczynników dyfuzji (D) fluoroforów używanych do kalibracji^18,19, aby obliczyć promień otworu (ω).
      (Równanie 2)
3. Analiza krzywych autokorelacji na błonach komórkowych.
   1. Aby zobrazować część krzywej reprezentującą dyfuzję molekularną, wybierz przedział czasowy rozpoczynający się przed najbardziej stromym nachyleniem krzywej autokorelacji i kończący się po zbieżności krzywej w punkcie 1 (np. 0,001 do 5 sekund dla mysich receptorów powierzchniowych; patrz rysunek 4).
   2. Wygeneruj średnią krzywą autokorelacji dla poszczególnych powtórzeń zapisanych w kroku 6.7.2.
   3. Dopasuj 2-wymiarową krzywą dyfuzji membrany do każdej uśrednionej krzywej autokorelacji, korzystając z równania 3³,
      (Równanie 3)
      UWAGA: Ważne parametry wyjściowe są następujące: N to średnia liczba cząsteczek znajdujących się w wzbudzonym obszarze błony. Przelicz na gęstość (N/μm²). _{τ D} (TauD): średni czas przebywania w obszarze ogniskowania, ograniczony dwuwymiarowością membrany (s). Przelicz średni czas przebywania do współczynnika dyfuzji (μm²/s) za pomocą wyznaczonego promienia otworka (ω) i równania 2. T1 to prawdopodobieństwo, że fluorofory znajdują się w stanie trypletowym. Jasność (CPM) oblicza się, dzieląc średnią ogólną intensywność pomiaru przez N.
   4. Jeśli dobre dopasowanie nie zostanie osiągnięte za pierwszym razem, zmień wartości początkowe i/lub górną i dolną granicę zmiennych, aż do osiągnięcia tego celu.
      UWAGA: Typowe górne-dolne granice szybkości dyfuzji białek w pierwotnych błonach komórkowych wynoszą 10-500 ms dla TauD, 0-100% dla T1 i 0,1-5 ms dla TauT1. Należy wybrać wartości początkowe łącznika w środku tych przedziałów. Część krzywej reprezentująca fluktuacje fluorescencji wynikające z dyfuzji znajduje się zwykle w przedziale od 1 ms do 1 s (patrz rysunek 4). W zależności od fluoroforu czasami może zachodzić drugi proces, powodujący autokorelację w krótszych skalach czasowych niż parametr dyfuzji. Jest to spowodowane przejściowym stanem ciemności (tryplet) lub mruganiem (jak to często ma miejsce w przypadku białek fluorescencyjnych). Stan trypletowy jest uwzględniony w równaniu 3, a zatem prezentowany model powinien również dobrze pasować do tych sytuacji.

Wyniki

Typowy wynik wygeneruje krzywą autokorelacji z czasem przejścia w zakresie od 10 ms do 400 ms dla białek błonowych. Liczba cząsteczek może wahać się od 0,5 do około 200 na^μm2 dla białek o endogennej ekspresji. Sprawdź dokładnie, czy CPM nie jest niższy niż oczekiwano. Może to oznaczać, że istnieje wpływ sygnału tła. Z reguły sygnał CPM na komórkach, który jest akceptowany do analizy, nie powinien być niższy niż 33% CPM dla swobodnie dyfuzujących przeciwciał przy tej samej mocy ...

Dyskusja

Ten protokół FCS może być stosowany do oceny dynamiki molekularnej cząsteczek powierzchniowych na wszystkich typach komórek odpornościowych (mysie, ludzkie lub inne gatunki). FCS mierzy przestrzenno-czasową dynamikę molekularną aż do rozdzielczości pojedynczej cząsteczki w żywych komórkach. Gęstość molekularną, a także szybkość dyfuzji i dynamikę grupowania badanych białek można wyodrębnić z krzywych autokorelacji.

Znakowanie fluorescencyjne ma kluczowe znaczenie dla udanych eksperymentów z FC...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
MACS NK Cell Isolation Kit mysz II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	Negatywna selekcja komórek NK
Płodowa surowica bydlęca	Sigma-Adlrich	F7524	Inaktywowana termicznie
sól fizjologiczna buforowana fosforanem	-		wyprodukowana w domu
Roswell Park Memorial Institute medium 1640	PAA Firma zajmująca się hodowlą komórkową	E15-848	Przezroczyste podłoże
Klon przeciwciała 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	Do blokowania receptorów Fc.
Przeciwciało anty-Ly49A			Przeciwciało monoklonalne wyprodukowane we własnym zakresie i sprzężone w domu z przeciwciałem Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd	BD Pharmingen	558915	Sprzężony we własnym zakresie z MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	Barwnik fluorescencyjny do koniugacji przeciwciał.
Poli-L-Lizyna	Sigma-Aldrich	P8920	Rozcieńczony w wodzie destylowanej (1.10)
Poli-L-lizyna (20 kDa) szczepiona glikolem polietylenowym (2 kDa)	SuSoS AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)	Rozcieńczony w PBS (pH 7,4) do 0,5 mg/ml.
Chlorek rodaminy 110	Sigma-Aldrich	432202	Znany współczynnik dyfuzji: 3,3 &razy; 10− 10 m2/sec 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	Znany współczynnik dyfuzji: 4,4 &razy; 10− 10 m2/sec 20
Mikroskop konfokalny	Oprogramowanie Zeiss	LSM510
: Confocor 3	Oprogramowanie Zeiss
: Matlab z zestawem narzędzi do dopasowania krzywych	Matlab	Wersja R2013b
Nunc Lab-Tek Komorowe szkło nakrywkowe	Termo-naukowe	155411	8 studzienek, dno borokrzemianowe 1,0