Nieinwazyjna ocena funkcji śródbłonka u ludzi może być określona za pomocą techniki dylatacji za pośrednictwem przepływu. Chociaż w tysiącach badań wykorzystano tę technikę, żadne badanie nie wykonywało tej techniki nieinwazyjnie na szczurach. W poniższym artykule opisano nieinwazyjny pomiar dylatacji tętnic ramiennych i udowych powierzchownych szczurów pod wpływem przepływu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena ultrasonograficzna poszerzenia tętnic ramiennych i udowych powierzchownych w zależności od przepływu u szczurów
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rozszerzenie naczyń tętniczych na wzrost szybkości ścinania ścian wskazuje na funkcję śródbłonka naczyniowego. U ludzi nieinwazyjny pomiar funkcji śródbłonka można osiągnąć poprzez zastosowanie techniki rozszerzania za pośrednictwem przepływu, zwykle wykonywanej w tętnicy ramiennej lub powierzchownej kości udowej. Krótko mówiąc, mankiet do pomiaru ciśnienia krwi umieszczony dystalnie do sondy ultradźwiękowej jest nadmuchiwany do ciśnienia nadskurczowego, co powoduje niedokrwienie kończyny. Po 5 minutach od okluzji mankiet zostaje opróżniony, co powoduje reaktywne przekrwienie i wzrost szybkości ścinania ścian, które sygnalizują uwolnienie cząsteczek rozszerzających naczynia krwionośne ze śródbłonka, wywołując rozszerzenie naczyń krwionośnych. Pomimo tysięcy badań przeprowadzających dylatację za pośrednictwem przepływu u ludzi, co zaskakujące, żadne badania nie wykonywały tej techniki nieinwazyjnie na żywych szczurach. Biorąc pod uwagę niedawne przesunięcie punktu ciężkości na badania translacyjne, ustanowienie wytycznych dotyczących nieinwazyjnych pomiarów dylatacji za pośrednictwem przepływu u szczurów i innych gryzoni byłoby niezwykle cenne. W poniższym artykule przedstawiono protokół nieinwazyjnego pomiaru dylatacji zależnej od przepływu w tętnicach ramiennych i powierzchownych udowych szczurów, ponieważ miejsca te są najczęściej mierzone u ludzi.
Wprowadzenie
Śródbłonek naczyniowy to komórkowa monowarstwa, która wyściela światło tętnic i jest ważnym regulatorem funkcji naczyniowych. Ze śródbłonka uwalnia się wiele cząsteczek, które powodują modulację średnicy naczyń krwionośnych. Wśród tych cząsteczek tlenek azotu (NO) wydaje się być główną cząsteczką rozszerzającą naczynia krwionośne uwalnianą ze śródbłonka naczyń krwionośnych w odpowiedzi na stymulację (np. insulinę, acetylocholinę lub zmiany naprężenia ścinającego)1. W śródbłonku naczyniowym NO jest wytwarzany przez enzym śródbłonkową syntazę NO (eNOS), a następnie jest uwalniany z komórek śródbłonka2. NO dyfunduje do mięśni gładkich naczyń krwionośnych, gdzie powoduje rozluźnienie i zwiększenie średnicy naczynia3.
Dysfunkcja śródbłonka może być oceniana nieinwazyjnie u ludzi przy użyciu techniki dylatacji za pośrednictwem przepływu (FMD)4,5. Zaproponowano, że FMD stanowi funkcjonalny test biologiczny na biodostępność NO pochodzącą ze śródbłonka u ludzi i jest zwykle oceniany na tętnicy ramiennej lub powierzchownej kości udowej w odpowiedzi na reaktywne przekrwienie po ~5-minutowym okluzji kończyny6. Reaktywne przekrwienie zwiększa laminarne siły ścinające, które są przenoszone do komórki śródbłonka7, sygnalizując uwolnienie NO8. Chociaż w ostatnich latach odsetek rozszerzenia naczyń krwionośnych zainicjowanego przez uwolnienie NO był dyskutowany9,10, FMD wskazuje na rozszerzenie zależne od śródbłonka i konsekwentnie wykazano, że przewiduje zdarzenia sercowo-naczyniowe11-13.
Do tej pory tysiące badań wykorzystało technikę FMD do nieinwazyjnego pomiaru funkcji śródbłonka u ludzi. Biorąc pod uwagę niedawne przesunięcie nacisku na badania translacyjne, wytyczne dotyczące nieinwazyjnego pomiaru pryszczycy u gryzoni byłyby niezwykle cenne. Zgodnie z podejściem translacyjnym, protokół ten został opracowany do pomiaru pryszczycy w tętnicach ramiennych i powierzchownych udowych szczurów, ponieważ miejsca te są najczęściej mierzone u ludzi. Protokół ten skutkuje solidną i powtarzalną reakcją na pryszczycę u szczurów, jednak pomiar pryszczycy u szczurów jest technicznie wymagający i może być trudny do powtórzenia przez innych badaczy bez demonstracji wideo. Dlatego w poniższym artykule przedstawiona zostanie metoda nieinwazyjnego pomiaru FMD w tętnicach ramiennych i udowych powierzchownych szczurów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury dla zwierząt były zgodne z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych14 i zostały zatwierdzone przez University of Utah i Salt Lake City Veterans Affairs Medical Center Animal Care and Use.
1. Przygotowanie zwierząt
- Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej znieczulenia zawierającej 3% izofluranu w 100% tlenie. Pozostaw zwierzę w komorze indukcyjnej do momentu, gdy przestanie reagować na bodźce zewnętrzne.
- Wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej i umieść je na podgrzewanym stole do badań wyposażonym w elektrody do elektrogramu (EKG). Utrzymuj znieczulenie na poziomie 3% izofluranu w 100% tlenie. FMD tętnicy ramiennej i udowej powierzchownej nie może być wykonywana jednocześnie. Dlatego instrukcje przygotowania do każdego pomiaru znajdują się poniżej.
2. Przygotowanie tętnicy ramiennej
- Ułóż zwierzę na wznak i przymocuj lewą kończynę górną i każdą dolną kończynę zwierzęcia do stołu do badań za pomocą taśmy chirurgicznej.
- Unieruchomić prawą górną kończynę zwierzęcia tak, aby dolna część kończyny górnej była lekko uniesiona (~0,2-0,5 cm) ponad platformę.
- Nałóż środek do depilacji (np. Nair) na prawą kończynę górną zwierzęcia, aby usunąć włosy.
- Umieść mankiet okluzyjny (standardowy okluder naczyniowy o średnicy 10 mm światła) na prawej kończynie górnej dystalnie do łokcia. Nie opieraj okludera na platformie, ponieważ napompowanie/deflacja poruszy kończyną i zakłóci obrazowanie ultrasonograficzne .
- Ustaw ultrasonograf w trybie B za pomocą klawiatury ultradźwiękowej.
- Nałóż niewielką ilość żelu ultradźwiękowego na kończynę górną zwierzęcia, proksymalnie do mankietu okluzyjnego.
- Ręcznie wyrównaj przetwornik liniowy o ultrawysokiej częstotliwości przymocowany do uchwytu stereotaktycznego z kończyną górną. Tętnica ramienna powinna być widoczna na głębokości 2-3 mm.
- Aby potwierdzić, że obrazowana jest tętnica ramienna, a nie żyła ramienna, przełącz się w tryb PW za pomocą klawiatury ultrasonograficznej. Tętnica będzie miała pulsacyjny przepływ krwi, w przeciwieństwie do sąsiedniej żyły, która będzie miała ciągły przepływ krwi.
3. Przygotowanie tętnicy udowej powierzchownej
- Ułóż zwierzę na wznak i przymocuj kończyny górne i lewą kończynę dolną do stołu do badań za pomocą taśmy chirurgicznej.
- Unieruchomić prawą kończynę dolną zwierzęcia w pozycji uniesionej (~0,5-1 cm) nad platformą za pomocą podkładki (np. złożonych ręczników papierowych).
- Nałóż środek do depilacji (np. Nair) na prawą kończynę dolną zwierzęcia, aby usunąć sierść. Po depilacji żyła udowa powinna być wyraźnie widoczna w górnej wewnętrznej części uda.
- Umieść mankiet okluzyjny (standardowy okluder naczyniowy o średnicy 10 mm średnicy) proksymalnie do prawej kostki. Nie opieraj okludera na platformie, ponieważ napompowanie/deflacja poruszy kończyną dolną i zakłóci obrazowanie ultrasonograficzne .
- Ustaw ultrasonograf w trybie B.
- Nałóż niewielką ilość żelu ultradźwiękowego na kończynę dolną zwierzęcia, proksymalnie do mankietu okluzyjnego.
- Ręcznie wyrównaj przetwornik liniowy o ultrawysokiej częstotliwości przymocowany do uchwytu stereotaktycznego z żyłą udową, która jest widoczna przez skórę. Tętnica udowa powierzchowna powinna być widoczna na głębokości <1 mm.
- Aby potwierdzić, że obrazowana jest tętnica udowa powierzchowna, a nie żyła udowa, przełącz na tryb PW. Tętnica będzie miała pulsacyjny przepływ krwi, w przeciwieństwie do sąsiedniej żyły, która będzie miała ciągły przepływ krwi.
4. Faza bazowa
- Zoptymalizuj obraz w trybie B, podobnie jak u ludzi15. Upewnij się, że obserwowany jest poziomy, podłużny obraz naczynia z błoną wewnętrzną uwidocznioną w obu ścianach. Zoptymalizuj obraz, nieznacznie dostosowując umiejscowienie sondy ultradźwiękowej, aby upewnić się, że jak największa część tętnicy jest widoczna w oknie przechwytywania.
- Alternatywnie dostosuj ustawienia ultradźwięków, aby uzyskać lepszy obraz, zmieniając jasność/kontrast, strefy ogniskowania, częstotliwość, zakres dynamiki i gęstość linii. Istnieją inne sposoby optymalizacji obrazu ultrasonograficznego, ale ich szczegółowy opis wykracza poza zakres tego protokołu.
- Po zoptymalizowaniu obrazowania tętnic włącz bramkowanie EKG, aby wyświetlać tylko obrazy uchwycone podczas załamka R, aby upewnić się, że podczas każdej rozkurczowej części cyklu pracy serca pobierana jest tylko jedna klatka o średnicy.
UWAGA: Bramkowanie EKG jest dostępne w ultrasonografie używanym w tym protokole po wybraniu bramkowania EKG w opcji ustawień fizjologicznych, jednak ta funkcja może nie być dostępna we wszystkich aparatach ultrasonograficznych. Bramkowanie EKG powinno być włączone po optymalizacji obrazu, ponieważ trudno jest uzyskać obraz przy niższej liczbie klatek na sekundę (tj. raz na załamek R). Bez bramkowania EKG, połączenie wysokiego tętna u szczurów i wymogu wysokiej liczby klatek na sekundę w celu uchwycenia rozkurczowej części cyklu serca pozwala na klipy tylko ~10-20 sekund. Kłopotliwy rozmiar i ilość danych w każdym klipie znacznie zwiększa obciążenie analizą. - Rejestruj 60-sekundowe dane bazowe za pomocą B-mode.
UWAGA: Aparat ultrasonograficzny zawsze nagrywa, jednak nie wszystkie obrazy są przechowywane w ultrasonografie, ponieważ istnieje ograniczenie liczby klatek, które można nagrać w klipie ultrasonograficznym. Długość klipu (tj. liczbę klatek) można dostosować w ustawieniach. Zaleca się ustawienie maksymalnej liczby klatek na klip. Gdy nagranie znajduje się na końcu klipu (tj. osiągnięto maksymalną liczbę klatek), nagrywanie jest kontynuowane, ale klip toczy się do przodu, przechwytując ostatnie klatki. W takim przypadku wcześniejsze klatki, które zostały przechwycone poza maksymalnym limitem klatek, są następnie usuwane. Chociaż te zawiłości w nagrywaniu różnią się w zależności od maszyny, może być konieczne dostosowanie długości nagrywania. - Przełącz na tryb PW. Umieść kursor na środku prześwitu. Bramki próbek zostaną umieszczone automatycznie w odniesieniu do kursora, ale można je dostosować do szerokości za pomocą klawiatury ultradźwiękowej. Utrzymuj kąt insonacji ≤60°.
- Dostosuj kąt insonacji, zmieniając kąt wiązki Dopplera. Dokonaj precyzyjnej regulacji kąta za pomocą klawiatury ultradźwiękowej. Jeśli żaden z nich nie zapewnia kąta odpowiedniego do pomiaru, ręcznie wyreguluj sondę ultradźwiękową, przechylając tętnicę pod bardziej optymalnym kątem. Jeśli zostanie wykonana jakakolwiek regulacja kąta ultradźwięków, ponownie przechwyć obrazy w trybie B.
- Zapisz 10-sekundowe dane dotyczące prędkości.
5. Faza okluzji
- Napompuj okluder naczyniowy za pomocą wypełnionej powietrzem strzykawki o pojemności 10 ml. Aby utrzymać stałe ciśnienie powietrza w okluderze naczyniowym, złóż rurkę na siebie i umieść klips do segregatora na złożonej rurce.
- Przełącz na tryb PW, aby potwierdzić niedrożność mankietu, o czym świadczy duże zmniejszenie prędkości krwi.
- Przełącz się w tryb B i nagrywaj dane w 60-sekundowych klipach, aż do 4:45 minuty okluzji.
- Przełącz na tryb PW. Zapisuj tętno i czas każdego klipu ultrasonograficznego do analizy.
6. Faza przekrwienna
- Zwolnij mankiet podczas nagrywania w trybie PW, wyjmując klips do segregatora ze złożonej tuby. Nagrywaj 5 sekund przed i 5 sekund po zwolnieniu mankietu.
- Przełącz się w tryb B i nagrywaj dane w 60-sekundowych klipach do 3 minut po okluzji. Zapisuj tętno i czas każdego klipu ultrasonograficznego do analizy.
- Po zakończeniu leczenia pryszczycy należy usunąć zwierzę ze stołu do badań i monitorować do momentu, aż odzyska przytomność na tyle, aby utrzymać pozycję leżącą w mostku.
7. Analiza
- W celu analizy należy wyeksportować dane ultrasonograficzne jako pliki DICOM do komputera offline wyposażonego w oprogramowanie do wykrywania krawędzi, które pozwala na bezstronne określenie średnicy tętnicy w każdej klatce. Analiza jest możliwa na aparacie ultrasonograficznym, jednak nie jest to zalecane, ponieważ jest niezwykle czasochłonna i podatna na stronniczość badacza.
- Analizuj dane dotyczące średnicy tętnicy w 60-sekundowych segmentach podczas fazy podstawowej i okluzji oraz w 10-sekundowych segmentach podczas fazy przekrwiennej.
- Analizuj dane dotyczące prędkości krwi, korzystając z możliwości analizy przepływu w zautomatyzowanym oprogramowaniu do wykrywania krawędzi. Określ średnią prędkość krwi, mierząc 5 lub więcej kolejnych przebiegów o jednolitym wyglądzie podczas fazy podstawowej i okluzji. Określ średnią prędkość krwi podczas reaktywnego przekrwienia dla prędkości krwi natychmiast po zwolnieniu mankietu. Kształt fali o najwyższej prędkości krwi jest uważany za szczytową prędkość krwi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rozszerzenie zależne od przepływu przeprowadzono w tętnicy ramiennej i tętnicy udowej powierzchownej u 8 szczurów linii Wistar. Pozycjonowanie szczura przedstawiono na Rysunku 1.
Reprezentatywne obrazy USG tętnicy udowej powierzchownej przedstawiono na Rysunku 2.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W niniejszym badaniu wykazano nieinwazyjny pomiar FMD w tętnicach ramiennych i udowych powierzchownych szczurów. Podobnie jak u ludzi6, po 5-minutowym okresie okluzji nastąpił gwałtowny wzrost prędkości krwi (tj. reaktywne przekrwienie), zwiększając w ten sposób szybkość ścinania ściany tętnicy, co spowodowało rozszerzenie naczyń krwionośnych tętnicy. FMD obserwowano zarówno w tętnicy ramiennej, jak i powierzchownej tętnicy udowej. Ponadto stwierdzono silny związek w FMD między tętnicami. Chociaż szczytowa szy...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Wszystkie obrazowania zwierząt zostały wykonane w Small Animal Imaging Core Facility, University of Utah.
To badanie zostało częściowo sfinansowane z grantów z National Institutes of Health (R21 AG043952, R01 AG040297, K01 AG046326, K02 AG045339 i R01 DK100505).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Vevo 2100 System obrazowania mikroultradźwiękowego o wysokiej rozdzielczości | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| MicroScan Przetwornik liniowy o ultrawysokiej częstotliwości - MS-700 30-70 MHz | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| Stacja obrazowania Vevo | VisualSonics, Toronto, ON, CAN | ||
| Thermasonic | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | 82-03 | Opcjonalnie |
| Signacreme elektroda | Parker Laboratories, Fairfield, NJ, USA | 17-05 | |
| Taśma chirurgiczna Transpore | 3M, Maplewood, MN, USA | 1527-1 | |
| Krem do depilacji (np. , Nair) | Zaopatrzenie | ||
| Waciki bawełniane | Zaopatrzenie | ||
| Żel do ultradźwięków | Zaopatrzenie ogólne | ||
| Standardowy okluder naczyniowy, średnica światła 10 mm | Aparat Harvard, Holliston, MA, USA | 62-0115 | |
| Strzykawka 10 ml z końcówką Luer-Lok | Zaopatrzenie | Używany do aparatu do mankietu okluzyjnego | |
| Spinacz do papieru | Zaopatrzenie ogólne | Używany do aparatu do mankietu okluzyjnego | |
| Igła podskórna – 18 gauge | Ogólne zaopatrzenie | Używany do aparatu do mankietu okluzyjnego | |
| Średni klips do segregatora | Ogólne zaopatrzenie | Używany do aparatu do mankietu okluzyjnego |
Bibliografia
- Smits, P., et al. Endothelial release of nitric oxide contributes to the vasodilator effect of adenosine in humans. Circulation. 92, 2135-2141 (1995).
- Forstermann, U., et al. Nitric oxide synthase isozymes. Characterization, purification, molecular cloning, and functions. Hypertension. 23, 1121-1131 (1994).
- Gardiner, S. M., Compton, A. M., Bennett, T., Palmer, R. M., Moncada, S. Control of regional blood flow by endothelium-derived nitric oxide. Hypertension. 15, 486-492 (1990).
- Harris, R. A., Nishiyama, S. K., Wray, D. W., Richardson, R. S. Ultrasound assessment of flow-mediated dilation. Hypertension. 55, 1075-1085 (2010).
- Corretti, M. C., et al. Guidelines for the ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery: a report of the International Brachial Artery Reactivity Task Force. J Am Coll Cardiol. 39, 257-265 (2002).
- Celermajer, D. S., et al. Non-invasive detection of endothelial dysfunction in children and adults at risk of atherosclerosis. Lancet. 340, 1111-1115 (1992).
- Niebauer, J., Cooke, J. P. Cardiovascular effects of exercise: role of endothelial shear stress. J Am Coll Cardiol. 28, 1652-1660 (1996).
- Sessa, W. C. eNOS at a glance. J Cell Sci. 117, 2427-2429 (2004).
- Wray, D. W., et al. Does brachial artery flow-mediated vasodilation provide a bioassay for NO? Hypertension. 62, 345-351 (2013).
- Green, D. J., Dawson, E. A., Groenewoud, H. M., Jones, H., Thijssen, D. H. Is flow-mediated dilation nitric oxide mediated? A meta-analysis. Hypertension. 63, 376-382 (2014).
- Green, D. J., Jones, H., Thijssen, D., Cable, N. T., Atkinson, G. Flow-mediated dilation and cardiovascular event prediction: does nitric oxide matter? Hypertension. 57, 363-369 (2011).
- Brevetti, G., Silvestro, A., Schiano, V., Chiariello, M. Endothelial dysfunction and cardiovascular risk prediction in peripheral arterial disease: additive value of flow-mediated dilation to ankle-brachial pressure index. Circulation. , 2093-2098 (2003).
- Gokce, N., et al. Predictive value of noninvasively determined endothelial dysfunction for long-term cardiovascular events in patients with peripheral vascular disease. J Am Coll Cardiol. 41, 1769-1775 (2003).
- National Research Council (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th, National Academies Press. (2011).
- Alley, H., Owens, C. D., Gasper, W. J., Grenon, S. M. Ultrasound assessment of endothelial-dependent flow-mediated vasodilation of the brachial artery in clinical research. J Vis Exp. , e52070(2014).
- Ghiadoni, L., et al. Assessment of flow-mediated dilation reproducibility: a nationwide multicenter study. J Hypertension. 30, 1399-1405 (2012).
- Thijssen, D. H., et al. Heterogeneity in conduit artery function in humans: impact of arterial size. Am J Physiol Heart Circ. 295, H1927-H1934 (2008).
- Green, D. J., et al. Why isn't flow-mediated dilation enhanced in athletes? Med Sci Sports. 45, 75-82 (2013).
- Heiss, C., et al. In vivo measurement of flow-mediated vasodilation in living rats using high-resolution ultrasound. Am J Physiol Heart Circ. 294, H1086-H1093 (2008).
- Chen, Q., et al. Pharmacological inhibition of S-nitrosoglutathione reductase improves endothelial vasodilatory function in rats in vivo. J Appl Physiol. 114, 752-760 (2013).
- Pinnamaneni, K., et al. Brief exposure to secondhand smoke reversibly impairs endothelial vasodilatory function. Nicotine Tob Res. 16, 584-590 (2014).
- Liu, J., et al. Impairment of Endothelial Function by Little Cigar Secondhand Smoke. Tob Regul Sci. 2, 56-63 (2016).
- Schuler, D., et al. Measurement of endothelium-dependent vasodilation in mice--brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 2651-2657 (2014).
- Erkens, R., et al. Left ventricular diastolic dysfunction in Nrf2 knock out mice is associated with cardiac hypertrophy, decreased expression of SERCA2a, and preserved endothelial function. Free Radic Biol Med. 89, 906-917 (2015).
- Harris, S. A., Billmeyer, E. R., Robinson, M. A. Evaluation of repeated measurements of radon-222 concentrations in well water sampled from bedrock aquifers of the Piedmont near Richmond, Virginia, USA: : effects of lithology and well characteristics. Environmental research. 101, 323-333 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
