Artykuł metodologiczny

System zakaźnych hodowli komórek wirusa Zika i profilaktyczne działanie interferonów in vitro

20.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54767

⸱

23 sierpnia 2016

 , 
1Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

Wirus Zika (ZIKV), nowy patogen, jest powiązany z nieprawidłowościami rozwojowymi płodu i małogłowiem. Stworzenie skutecznego systemu hodowli komórek zakaźnych ma kluczowe znaczenie dla badań nad replikacją ZIKV, a także dla opracowywania szczepionek i leków. W niniejszej pracy zilustrowano i omówiono różne testy wirusologiczne dotyczące ZIKV.

Streszczenie

Wirus Zika (ZIKV) to nowy patogen, który jest powiązany z nieprawidłowościami rozwojowymi płodu, takimi jak małogłowie, wady wzroku i zaburzenia wzrostu. ZIKV jest wirusem RNA z rodziny Flaviviridae. ZIKV jest przenoszony głównie przez komary, ale może być również przenoszony przez pionową transmisję z matki na płód, a także przez kontakt seksualny. Do tej pory nie ma niezawodnych metod leczenia ani szczepionek, które chroniłyby osoby zakażone wirusem. Opracowanie powtarzalnego, skutecznego systemu hodowli komórek zakaźnych wirusa Zika ma kluczowe znaczenie dla badania mechanizmów molekularnych replikacji wirusa Zikov, a także opracowywania leków i szczepionek. W związku z tym przedstawiono tutaj protokół opisujący system hodowli in vitro wirusa Zika oparty na komórkach ssaków do produkcji wirusa i analizy wzrostu. Przedstawiono szczegółowe informacje na temat tworzenia się blaszek miażdżycowych przez wirusa Zika na monowarstwie komórkowej oraz testu płytkiowego do pomiaru miana wirusa. Określa się kinetykę replikacji genomu wirusa i dwuniciowe produkty pośrednie replikacji genomu RNA. Ta platforma hodowlana została wykorzystana do badań przesiewowych biblioteki małego zestawu cytokin, co zaowocowało identyfikacją interferonu-α (IFN-α), IFN-β i IFN-γ jako silnych inhibitorów wzrostu wirusa Zika. Podsumowując, w badaniu tym przedstawiono system hodowli wirusa Zika in vitro i różne testy wirusologiczne, które mogą przynieść ogromne korzyści społeczności naukowej w dalszym wyjaśnianiu mechanizmów patogenezy wirusa i ewolucji zjadliwości wirusów. Przeciwwirusowy IFN-alfa może być dalej oceniany jako opcja profilaktyczna, profilaktyczna i lecznicza w przypadku zakażeń wirusem Zika w populacjach wysokiego ryzyka, w tym u zakażonych kobiet w ciąży.

Wprowadzenie

Wirus Zika (ZIKV) jest ważnym ludzkim patogenem związanym z małogłowiem i słabymi wynikami ciąży1,4. ZIKV należy do zestawu flawiwirusów istotnych z medycznego punktu widzenia, które mogą powodować wady neurologiczne, takich jak wirusy dengi, Zachodniego Nilu i zapalenia mózgu St. Louis. Głównym sposobem przenoszenia wirusa jest przenoszenie komarów Aedes aegypti, a ponadto odnotowano również przenoszenie drogą płciową5,6. ZIKV stał się poważnym globalnym problemem zdrowotnym ze względu na rozszerzające się rozmieszczenie geograficzne wektora komara i jego silną korelację z wadami wrodzonymi. ZIKV został po raz pierwszy wyizolowany w 1947 roku od rezusa wartowniczego w lesie Zika w Ugandzie, a pierwszy przypadek u człowieka odnotowano w 1952roku. Osoby, które zostaną zakażone wirusem ZIKV, mają łagodne objawy, takie jak gorączka, wysypka, ból głowy, zapalenie spojówek i bóle mięśni/stawów. Zakażone kobiety w ciąży mogą przenosić ZIKV na rozwijający się płód1. Zakażenie ZIKV powiązano również z zespołem Guillaina-Barrego, autoimmunologiczną demielinizacją nerwów obwodowych9

.

Genom wirusa Zika składa się z jednoniciowej cząsteczki RNA o dodatnim znaczeniu, która ma około 10,8 kilozasad długości. Struktura genomu jest zorganizowana jako 5'NCR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR, z regionami niekodującymi (NCR) flankującymi region kodujący białko6. Pojedynczemu poliproteinie (3,419 aa) ulega translacji, która jest rozszczepiana ko- i potranslacyjnie na 10 mniejszych peptydów. Zarówno struktury pętli macierzystej RNA 5'NCR, jak i 3'NCR odgrywają kluczową rolę w rozpoczęciu translacji i replikacji genomu wirusa. Składniki strukturalne genomu składają się z białek kapsydu, błony i otoczki. Białka niestrukturalne mają kluczowe znaczenie dla replikacji genomu.

Obecnie szczepy wirusa Zika są pogrupowane w trzy główne genotypy: zachodnioafrykańskie, wschodnioafrykańskie i azjatyckie6,10-13. Sugeruje się, że linia wschodnioafrykańska rozprzestrzeniła się na Afrykę Zachodnią i Azję, gdzie późniejewoluowała12. Genotyp azjatycki jest odpowiedzialny za obecne ogniska epidemii w obu Amerykach. Wirus Zika może być hodowany zarówno w komórkach komarów, jak i ssaków. Pierwotne fibroblasty skóry, niedojrzałe komórki dendrytyczne, korowe nerwowe komórki progenitorowe i komórki Vero są podatne na zakażenie wirusem Zika10,14,15. Wykazano, że zarówno interferony typu I, jak i typu II ograniczają wzrost ZIKV w fibroblastach skóry15. Celem tego badania jest zapewnienie szczegółowego protokołu produkcji i oznaczania azjatyckiego genotypu wirusa ZIKA PRVABC59 w systemie hodowli komórek ssaków oraz wykazanie użyteczności tego systemu hodowli zakaźnej jako platformy rozwoju leków. Zasób ten może przynieść ogromne korzyści społeczności badawczej zajmującej się wirusem Zika i neurologią, aby dokładniej wyjaśnić mechanizmy patogenezy wirusa i ewolucji zjadliwości wirusów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Schematyczny opis przebiegu prac przedstawiono na Rysunku 1.

1. Komórki

  1. Do produkcji wirusa Zika oraz analizy cyklu replikacji wirusowej należy wykorzystać komórki Vero.
  2. Przygotować pełną pożywkę wzrostową zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM L-glutaminy, penicylinę (100 units/ml), streptomycynę (100 units/ml) oraz 10 mM HEPES.
  3. Komórki Vero hodować w określonej pełnej pożywce wzrostowej w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.

2. Produkcja wirusa Zika

  1. Zbierz komórki Vero przy 80% gęstości komórek, używając 0,25% trypsyny w kolbie T-75, a następnie policz komórki.
    1. Odsuń pożywkę z kolby hodowlanej T-75 i wypłucz komórki 2 ml soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).
    2. Dodaj 2 ml 0,25% trypsyny i inkubuj kolbę w temperaturze 37 °C przez 5 min.
    3. Dodaj 8 ml pożywki wzrostowej zawierającej surowicę, aby dezaktywować trypsynę. Pipetuj wielokrotnie w górę i w dół, aby zawiesić komórki, a następnie przenieś je do probówki 15 ml.
    4. Pobierz 10 µl zawiesiny komórkowej i zmieszaj z równą ilością 0,4% błękitu trypanu. Nałóż przygotowaną mieszaninę na szkiełko komory licznikowej i określ liczbę żywych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.
  2. Zasiać łącznie 7 milionów komórek w objętości 30 ml do kolby T-160.
  3. Następnego dnia przygotuj odpowiednią wielokrotność infekcji (0,01 do 0,1 MOI) inokulum wirusa Zika w 10 ml bezsurowiczej pożywki hodowlanej na każdą kolbę.
  4. Usuń zużytą pożywkę z kolby T-160, a następnie dodaj świeżo przygotowane inokulum wirusowe (10 ml).
  5. Inkubuj zaszczepione kolby w 37 °C przy 5% CO2 przez 4-6 h. Rozprowadź inokulum, delikatnie przechylając kolby na boki co godzinę.
  6. Po zakończeniu inkubacji zastąp inokulum ciepłą pożywką wzrostową uzupełnioną surowicą (30 ml) dla każdej kolby. Następnie kontynuuj hodowlę wirusa przez kolejne 96 h.
  7. Zweryfikuj przebieg infekcji, obserwując pojawienie się placków wirusowych na monowarstwie komórek za pomocą mikroskopu fazokontrastowego i wykonaj zdjęcia (Rysunek 2) w razie potrzeby przy powiększeniach 40X i 200X.

Proces różnicowania komórek przy powiększeniu 40X i 200X, obraz mikroskopowy, badania nad biologią komórki.
Rysunek 2: Plaque utworzone przez wirusa Zika na monowarstwie komórek Vero.Obrazy w jasnym polu przy różnych powiększeniach pokazują plaque wirusa Zika w 48 hpi. Zwróć uwagę na obecność zaokrąglonych ognisk komórkowych na monowarstwie. (Pasek skali = 50 µm) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Zebrać nadsączniki z hodowli komórkowej w punkcie czasowym 96 hr i odwirować nadsącz przy 300 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C w celu usunięcia szczątków komórkowych.
  2. Ostrożnie zebrać nadsącz, nie naruszając osadu ze szczątków, i przenieść go do probówek o pojemności 15 ml. W celu zagęszczenia cząstek wirusowych można przeprowadzić ultrawirowanie przy 24 000 x g (opcjonalnie).
  3. Przechowywać nadsączniki z hodowli wirusowej w wielu alikwotach w temperaturze -80 °C.

3. Pomiar miana wirusa Zika za pomocą testu plackowego

  1. Wysiać naiwne komórki Vero w zagęszczeniu 1 x 105 liczba komórek na studzienkę w objętości 2 ml przy użyciu płytki 12-dołkowej.
  2. Następnego dnia, z wykorzystaniem medium bezsurowiczego, przygotować 10-krotne rozcieńczenia seryjne supernatantów kultur wirusowych pobranych z kolby T-160. Usunąć zużyte medium z każdej studzienki i dodać 400 µl przygotowanego inokulum na komórki Vero w trzech powtórzeniach.
  3. Inkubuj zaszczepione kolby w temperaturze 37°C °C z dodatkiem 5% CO2 przez 4–6 h. Rozprowadzić inokulum, delikatnie przechylając płytkę na boki co godzinę.
  4. Po zakończeniu inkubacji zastąpić inokulum podłożem uzupełnionym o surowicę (2 ml na dołek).
  5. W 48. godzinie po inokulacji należy policzyć ogniska wirusowe za pomocą mikroskopu kontrastowego. Oblicz miano wirusa jako liczba jednostek tworzących plaki (PFU) na ml. Patrz Rysunek 3 do testu plackowego.
  6. Utrwal i zabarw komórki w 4% roztworze formaldehydu i 0,1% roztworze fioletu krystalicznego, przygotowanych w 20% etanolu, aby uzyskać wyraźną wizualizację plamek.

4. Test replikacji genomu wirusa Zika

  1. Wysiać naiwne komórki Vero w zagęszczeniu 1 x 105 komórek na studzienkę w objętości 2 ml, korzystając z płytki 12-dołkowej. Następnego dnia przygotować w trzech powtórzeniach inokula wirusowe o niskim i wysokim mianie (MOI 0,01 i 0,1; 400 µl/studzienkę), wykorzystując pożywkę bezsurowiczą. W przypadku infekcji pozorowanej (mock) zastosować wyłącznie pożywkę bezsurowiczą (400 µl/studzienkę).
  2. Powtórzyć kroki od 3.2 do 3.4.
  3. W punktach czasowych 48 i 96 h zebrać próbki do analizy RNA oraz immunocytochemii (ICC).
    1. W celu zbioru próbek RNA usunąć pożywkę, a następnie dodać 400 µl roztworu lizującego bezpośrednio do każdej studzienki i zebrać lizaty.
    2. W przypadku ICC usunąć pożywkę, a następnie utrwalić komórki, dodając 1 ml metanolu do każdej studzienki i inkubując płytkę w temperaturze 4 °C przez 30 min.
    3. Z lizatu komórkowego wyizolować całkowite RNA przy użyciu zestawu do izolacji RNA zgodnie z instrukcją producenta. Ilość RNA oznaczyć za pomocą spektrofotometru.
  4. Przeprowadzić dwuetapową ilościową PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR), aby określić zawartość genomu ZIKV w zebranym RNA.
    1. W celu przeprowadzenia odwrotnej transkrypcji RNA przygotować najpierw mieszaninę reakcyjną o objętości 13 µl, składającą się z 5 µg wyizolowanego RNA, 1 µl dNTP (10 mM) oraz 1 µl przypadkowych heksamerów (250 ng) w probówce 0,2 ml. Inkubować probówkę w temperaturze 65 °C przez 5 min, a następnie umieścić na lodzie przez jedną minutę. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodać 1 µl odwrotnej transkryptazy, 4 µl 5x buforu do syntezy nici, 1 µl 0,1 M ditiotreitolu oraz 1 µl inhibitora RNazy. Inkubować probówkę przez dodatkowe 5 min w temperaturze 25 °C, a następnie przez 60 min w temperaturze 50 °C i inaktywować reakcję poprzez podgrzanie do 70 °C przez 15 min.
    2. Przeprowadzić qPCR, wykorzystując 1 µl otrzymanego cDNA z 12,5 µl 2x green dye super mix zawierającego polimerazę DNA oraz 1 µl 10 mM poszczególnych starterów specyficznych dla wirusa Zika [startery pan-genotypowe wirusa Zika (For: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3'), startery dla szczepu PRVABC59 genotypu azjatyckiego wirusa Zika (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3')], wirusa zapalenia wątroby C (JFH RTQ F: 5'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3') lub komórkowego genu referencyjnego GAPDH (For: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3'; Rev: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') w końcowej objętości reakcji 25 µl.
    3. Przeprowadzić PCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z warunkami: 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 30 s (40 cykli).
    4. Wykorzystać poziom ekspresji GAPDH na podstawie wartości progu cyklu (Ct) do normalizacji pomiaru genomu wirusa Zika. Obliczyć wartość delta Ct (ΔCt) genomu Zika w stosunku do GAPDH i wyznaczyć wartość 2ΔCt. Następnie obliczyć zmianę krotności (fold change), wyznaczając stosunek znormalizowanej zawartości genomu Zika pomiędzy komórkami zainfekowanymi a niezakazionymi w określonych punktach czasowych. Wyniki replikacji genomu ZIKV przedstawiono na Rysunku 4.
  5. Przeprowadzić ICC z wykorzystaniem utrwalonych metanolem komórek.
    1. Umyć utrwalone komórki trzy razy w 1x PBS i zablokować buforem blokującym do ICC (3% surowicy koziej, 3% BSA, 0,1% Triton-x 100 w PBS).
    2. Zastosować mysie monoklonalne przeciwciało anty-dsRNA J2 (1 µg/ml) w rozcieńczeniu 1:100 w buforze blokującym i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    3. Umyć komórki w 1x PBS i dodać wtórne przeciwciało kozie anty-mysie IgG-594 (1 µg/ml) w rozcieńczeniu 1:1 000 w buforze blokującym i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
    4. Umyć komórki w 1x PBS i zabarwić jądra komórkowe barwnikiem Hoechst, a następnie obserwować komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 100X (Rysunek 4).

5. Przesiewowa analiza biblioteki cytokin przeciwko infekcji wirusem Zika

  1. Wysiać naiwne komórki Vero w gęstości 1 x 105 komórek na dołek, używając płytki 12-dołkowej. Po przytwierdzeniu się komórek (6 h po wysianiu), dodać każdą cytokinę w określonych stężeniach w duplikacie biologicznym (objętość 2 ml/dołek). Uwzględnić kontrolę z samym nośnikiem (PBS).
  2. W 12. godzinie po traktowaniu przeprowadzić infekcję wirusem Zika (MOI 0,1 w 400 µl na dołek). Uwzględnić dołki kontrolne negatywne bez infekcji (mock).
  3. W 4. godzinie po infekcji zastąpić inokulum wirusowe pożywką z cytokinami (2 ml). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez kolejne 44 h.
  4. W 48. godzinie po infekcji policzyć plaki wirusowe przy użyciu mikroskopu fazowo-kontrastowego i wykonać reprezentatywne zdjęcia zainfekowanych komórek przy powiększeniu 40X (Rysunek 5).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu wykorzystano szczep wirusa Zika (PRVABC59; numer akcesyjny GenBank KU501215) o genotypie azjatyckim12. Do badania infekcji wirusem Zika de novo użyto komórek Vero przy 80% konfluencji. Do produkcji wirusa i późniejszej charakterystyki wirologicznej zastosowano wirusa Zika z wczesnego pasażu (P3). Płytki wirusowe zaobserwowano w drugim dniu infekcji. Potomstwo wirusa Zika uwalniane z początkowo zainfekowanej komórki może rozprzestrzeniać się na sąsi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiono uproszczony protokół hodowli wirusa Zika in vitro . Przedstawiono kluczowe etapy, w tym identyfikację optymalnych punktów końcowych dla ekspansji hodowli wirusa, pomiar miana i ilościowe określenie replikacji genomu. Wirus Zika jest ludzkim patogenem, dlatego podczas obchodzenia się z czynnikami zakaźnymi należy ściśle przestrzegać procedur bezpieczeństwa biologicznego. Linia komórkowa nerki małpy, Vero, została wykorzystana do zademonstrowania różnych testów wirusologicznych. Kinetyk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować dr Aaronowi Braultowi i dr Brandy Russell z Centrum Kontroli i Prewencji Chorób (CDC), USA za dostarczenie PRVABC59 szczepu wirusa Zika. Dziękujemy Nicholasowi Tenowi z Uniwersytetu Yale za redakcję tego manuskryptu. Praca ta była wspierana przez Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award dla V.A.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM)Sigma Life ScienceD5796
HEPESLife Technologies15630080
GlutamaxLife Technologies35050061
2,5% trypsyna, 10x [-] Czerwień fenolowa   Corning25-054-C1
Trypan Blue Stain 0,4%Life TechnologiesT10282
Hrabina – Automatyczny licznik komórekThermoFisher ScientificC10227
Countess-cell counting  szkiełka komoroweThermoFisher ScientificC10283
Rneasy Mini KitQiagen74104
Nanodrop 2000mysieNanodrop 2000
J2 Angielski & Doradztwo Naukowe Kft.
Koza anty-królicza IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11020
INDEKS GÓRNY III RT Life Technologies18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROXLife Technologies11744500
QuantStudio12K Flex System do PCR w czasie rzeczywistymThermo Fischer4471088
bez RNazPromegaM6101
 ATCCCCL-81
Szczep wirusa Zika PRVABC59Centra Kontroli i Prewencji Chorób (CDC)
IL-6Peprotech200-06                         
IL-1 alfa             Peprotech200-01A                   
TNF-alfaPeprotech300-01A                   
Interferon alfa A   R & D Systems11100-1
Interferon betaPeprotech300-02BC
Interferon gammaWirówka Peprotech300-02
5415RWirówka Eppendorf5415R
5810REppendorf5810R
Mikroskop immunofluorescencyjny Nikon Eclipse Ti z Nikon Intenselight C-HGFINikon Visit Nikon na zamówienie
przeciwciało monoklonalne anty-dsRNA Thermo Scientific 10010200 Linia komórkowa Vero

Bibliografia

  1. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
  2. Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
  3. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
  4. Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), Brazil. 59-62 (2015).
  5. Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).
  6. Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).
  7. Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).
  8. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome--case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).
  10. Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).
  11. Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).
  12. Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).
  13. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).
  14. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).
  15. Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).
  16. Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311(2013).
  17. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
  18. Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).
  19. Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oznaczanie miana wirusatworzenie plakreplikacja genomuleczenie interferonemprzesiew cytokinkom rki VeroimmunocytochemiaRT qPCR

Powiązane artykuły