Ekstrakcja kapsułek roślinnych do zastosowań w mikrokapsułkowaniu

Podsumowanie

Ten protokół/manuskrypt opisuje uproszczony proces produkcji kapsułek egzyny sporopolleniny (SEC) z zarodników Lycopodium clavatum oraz ładowania związków hydrofilowych do tych SEC.

Streszczenie

Mikrokapsułki pochodzące z roślinnych zarodników lub pyłku stanowią solidną platformę dla różnorodnych zastosowań mikrokapsułkowania. Kapsułki egzyny sporopolleniny (SEC) uzyskuje się, gdy zarodniki lub pyłek są przetwarzane w celu usunięcia wewnętrznej zawartości sporoplazmatycznej. Powstałe w ten sposób puste w środku mikrokapsułki wykazują wysoki stopień jednorodności mikromerytorycznej i zachowują skomplikowane cechy mikrostrukturalne związane z poszczególnymi gatunkami roślin. W niniejszym artykule przedstawiamy uproszczony proces produkcji SEC z zarodników Lycopodium clavatum oraz ładowania związków hydrofilowych do tych SEC. Obecna procedura izolacji SEC została niedawno zoptymalizowana w celu znacznego zmniejszenia wymagań dotyczących przetwarzania, które są konwencjonalnie stosowane w izolacji SEC, oraz zapewnienia produkcji nienaruszonych mikrokapsułek. Naturalne zarodniki L. clavatum są odtłuszczane acetonem, traktowane kwasem fosforowym i dokładnie myte w celu usunięcia treści sporoplazmatycznej. Wykazano, że po odtłuszczeniu acetonem pojedynczy etap przetwarzania przy użyciu 85% kwasu fosforowego usuwa całą zawartość sporoplazmatyczną. Ograniczając czas przetwarzania kwasem do 30 godzin, możliwe jest wyizolowanie czystych SEC i uniknięcie szczelinowania SEC, które, jak wykazano, występuje przy wydłużonym czasie przetwarzania. Dokładne mycie wodą, rozcieńczonymi kwasami, rozcieńczonymi zasadami i rozpuszczalnikami zapewnia odpowiednie usunięcie całego materiału sporoplazmatycznego i pozostałości chemicznych. Technika ładowania próżniowego jest wykorzystywana do ładowania modelowego białka (albuminy surowicy bydlęcej) jako reprezentatywnego związku hydrofilowego. Ładowanie próżniowe zapewnia prostą technikę ładowania różnych związków bez potrzeby stosowania ostrych rozpuszczalników lub niepożądanych chemikaliów, które są często wymagane w innych protokołach mikrokapsułkowania. Opierając się na tych protokołach izolacji i ładowania, SEC zapewniają obiecujący materiał do wykorzystania w różnorodnym zakresie zastosowań mikrokapsułkowania, takich jak terapia, żywność, kosmetyki i produkty higieny osobistej.

Wprowadzenie

Istnieje duże zainteresowanie naturalnymi kapsułkami roślinnymi otrzymywanymi z zarodników roślin i pyłków do stosowania w mikrokapsułkach. ^1-15 W naturze zarodniki i pyłki zapewniają ochronę wrażliwego materiału genetycznego przed trudnymi warunkami środowiskowymi. Podstawowa struktura zarodników roślinnych i pyłku zazwyczaj składa się z zewnętrznej warstwy otoczki (egzyny), wewnętrznej warstwy otoczki (innej) i wewnętrznego materiału cytoplazmatycznego. Egzyna składa się z chemicznie wytrzymałego biopolimeru^1,9,10,13,16 określanego jako sporopolenina, a insyna składa się głównie z materiałów celulozowych. ^16-18 Puste kapsułki można wyizolować za pomocą różnych procesów^7,9 w celu usunięcia materiału cytoplazmatycznego, białek i warstwy wewnętrznej. ^2,12,16 Te kapsułki egzyny sporopoleniny (SEC) stanowią atrakcyjną alternatywę dla syntetycznych kapsułków ze względu na ich wąski rozkład wielkości i jednolitą morfologię. ^7,9,13,19,20 Rozwój ustandaryzowanych procesów pozyskiwania SEC z różnych gatunków roślin, takich jak Lycopodium clavatum, otwiera potencjał dla szerokiego zakresu zastosowań mikrokapsułkowania w dziedzinie dostarczania leków, żywności i kosmetyków. ^6,10-13,21

Aby uzyskać SEC, badacze najpierw potraktowali zarodniki i pyłek rozpuszczalnikami organicznymi, a następnie poddali je refluksowi w roztworach alkalicznych, aby usunąć zawartość cytoplazmatyczną. ^22-25 Stwierdzono jednak, że pozostała struktura kapsułki nadal zawiera celulozową warstwę wewnętrzną. Aby temu zapobiec, naukowcy zbadali możliwość zastosowania przedłużonego procesu hydrolizy kwasowej przy użyciu kwasu solnego, gorącego kwasu siarkowego lub gorącego kwasu fosforowego przez kilka ^{dni, przy} czym kwas fosforowy stał się preferowaną metodą usuwania insyny SEC. ² Trwające od lat badania wykazały jednak, że różne zarodniki i pyłki mają różny stopień odporności na powszechnie stosowane surowe metody przetwarzania. ^26,27 Niektóre zarodniki i pyłki ulegają całkowitej degradacji i tracą całą integralność strukturalną w silnych roztworach alkalicznych lub ulegają silnemu uszkodzeniu w silnie kwaśnych roztworach. ¹⁶ Zmienność odpowiedzi SEC na warunki leczenia wynika z subtelnych różnic w strukturze chemicznej i morfologii egzyny materiału egzyny sporopoleniny między gatunkami. ²⁸ Ze względu na zmienność odporności kapsułek egzyny sporopoleniny (SEC) konieczne jest zoptymalizowanie warunków przetwarzania dla każdego gatunku zarodników i pyłku.

Zarodniki roślin z gatunku L. clavatum stały się najczęściej badanym pojedynczym źródłem SEC. Sugeruje się, że wynika to przede wszystkim z jego powszechnej dostępności, niskich kosztów, monodyspersyjności i odporności chemicznej. ^9,29 Zarodniki mogą być łatwo zbierane i zawierają zawartość sporoplazmatyczną w postaci grup organelli komórkowych i biomolekuł o wielkości 1 - 2 μm. ¹¹ Zarodniki L. clavatum były używane jako naturalny smar w ^proszku30,31, baza do ^{kosmetyków,30} oraz w ziołolecznictwie^32-36 do szerokiego zakresu zastosowań terapeutycznych. Wykazano, że SEC uzyskane z L. clavatum są bardziej odporne na przetwarzanie niż SEC z innych gatunków zarodników i pyłku. ² Wykazano, że po przetworzeniu powstałe SEC zachowują swoje skomplikowane struktury mikrogrzbietowe i wysoką jednorodność morfologiczną, zapewniając jednocześnie dużą wewnętrzną wnękę do enkapsulacji. ⁷ Badania wskazują, że SEC L. clavatum mogą być stosowane do kapsułkowania ^{leków,10,13 szczepionek,11 białek,7,14 komórek,8} olejów,5-7,9 i suplementów diety. ^5,15 Obserwowana wydajność ładowania SEC jest stosunkowo wysoka w porównaniu z konwencjonalnymi materiałami do hermetyzacji. ⁷ Istnieje również szereg doniesień o korzyściach płynących z kapsułkowania SEC, takich jak zdolność do maskowania smaków,6,10 i zapewnienie pewnego stopnia naturalnej ochrony przed utlenianiem. ¹² W istniejących badaniach najczęściej stosowana metoda ekstrakcji SEC L. clavatum opiera się na czterech głównych etapach. Pierwszym krokiem jest refluks rozpuszczalnika w acetonie przez okres do 12 godzin w temperaturze 50 °C w celu usunięcia zarodników. ¹¹ Krok drugi to refluks zasadowy w 6% wodorotlenku potasu przez okres do 12 godzin w temperaturze 120 °C w celu usunięcia materiałów cytoplazmatycznych i białkowych. ¹¹ Krok trzeci to refluks kwasowy w 85% kwasie fosforowym przez okres do 7 dni w temperaturze 180 °C w celu usunięcia materiału celulozowego. ^Krok czwarty to kompleksowy proces mycia z użyciem wody, rozpuszczalników, kwasów i zasad w celu usunięcia wszystkich pozostałych materiałów nieegzynowych i pozostałości chemicznych.

Głównym celem ekstrakcji SEC w odniesieniu do zastosowań enkapsulacyjnych jest produkcja kapsułek, które są pozbawione materiału cytoplazmatycznego, wolne od potencjalnie alergizujących białek i morfologicznie nienaruszone. ^2,37 Z punktu widzenia produkcji przemysłowej ważne jest jednak również uwzględnienie dodatkowych czynników ekonomicznych i środowiskowych, takich jak efektywność energetyczna, czas trwania produkcji, bezpieczeństwo i wynikające z tego odpady. Jeśli chodzi o efektywność energetyczną, zarówno wysokie temperatury, jak i długi czas przetwarzania wpływają na koszty produkcji, a także na ślad środowiskowy. Czas produkcji i czas realizacji są kluczowymi czynnikami wpływającymi na rentowność przetwarzania. Szczególnie niepokojące jest to, że przetwarzanie kwasu fosforowego w wysokiej temperaturze zwiększa problemy z bezpieczeństwem i prowadzi do osadzania się kamienia korozyjnego, co prowadzi do znacznego wydłużenia czasu konserwacji infrastruktury i opóźnień w czasie realizacji partii. ^38–40 Tam, gdzie to możliwe, zminimalizowanie liczby wymaganych kroków może prowadzić do znacznego zmniejszenia ilości wytwarzanych odpadów. Jednak powszechnie stosowany czteroetapowy proces ekstrakcji SEC L. clavatum po prostu wyewoluował z dziesięcioleci badań i miał niewielką rzeczywistą optymalizację procesu. Ostatnio Mundargi i wsp.41 wnieśli znaczący wkład w trwające prace w tej dziedzinie, systematycznie oceniając i optymalizując jedną z najczęściej zgłaszanych technik ekstrakcji SEC.

W pierwszej części tego badania: defetowanie zarodników demonstrowane jest przy użyciu przetwarzania acetonu w temperaturze 50 °C przez 6 godzin; procedury usuwania sporoplazmy i intine są demonstrowane przy użyciu 85% przetwarzania kwasu fosforowego w temperaturze 70 °C przez 30 godzin; intensywne mycie wodą, rozpuszczalnikami, kwasem i zasadą jest używane do demonstracji usuwania resztkowej zawartości sporoplazmatycznej; a suszenie SEC demonstrowane jest za pomocą suszenia konwekcyjnego i suszenia w piecu próżniowym. W trzeciej sekcji demonstruje się ładowanie próżniowe SEC przy użyciu próżniowego ładowania białka modelowego, albuminy surowicy bydlęcej (BSA), a następnie mycia i liofilizacji SEC obciążonego BSA. W czwartej sekcji zademonstrowano określenie skuteczności enkapsulacji BSA za pomocą wirowania, sonizacji sondy i spektrometrii UV/Vis.

Protokół

1. Ekstrakcja kapsułek egzyny sporopolininy (SEC) z zarodników L. clavatum

Uwaga: Proces ekstrakcji SEC obejmuje łatwopalny proszek (L. clavatum), gorące kwasy i łatwopalne rozpuszczalniki, dlatego niezbędne jest odpowiednie środki ochrony osobistej (gogle, maska na twarz, rękawice, fartuch laboratoryjny), zatwierdzona ocena ryzyka użytkowania i utylizacja chemikaliów przez upoważniony personel laboratoryjny.

1. Odtłuszczanie zarodników
   1. Przygotuj zestaw refluksu w dygestoriach, używając szklanego skraplacza, systemu cyrkulacji wody i łaźni wodnej (rysunek 1).
   2. Zważyć 100 g zarodników L. clavatum bez tworzenia pyłu i z dala od źródeł zapłonu.
      Uwaga: Zarodniki użyte tutaj zostały uzyskane komercyjnie (patrz Lista materiałów).
   3. Powoli przenieść zarodniki do kolby okrągłodennej z politetrafluoroetylenu (PTFE) o pojemności 1 l za pomocą mieszadła magnetycznego.
   4. Dodać 500 ml acetonu do zarodników w kolbie PTFE i delikatnie wstrząsnąć kolbą, aby utworzyć jednorodną zawiesinę.
   5. Umieścić kolbę PTFE w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C i podłączyć do chłodnicy zwrotnej.
   6. Cytować w acetonie przez 6 godzin, mieszając przy 200 obr./min, a następnie pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej.
   7. Przefiltrować zawiesinę za pomocą bibuły filtracyjnej pod próżnią i zebrać odtłuszczone zarodniki na dużych (15 cm średnicy) szklanych szalkach Petriego.
   8. Wysuszyć zarodniki w temperaturze pokojowej (wyciąg), przykrywając folią aluminiową z otworami do odparowania rozpuszczalnika.
2. Kwasoliza
   1. Przygotować 85% (v/v) kwas fosforowy z wodą dejonizowaną (DI) i przenieść odtłuszczone suche zarodniki do kolby z PTFE o pojemności 1 l.
   2. Dodać 500 ml kwasu fosforowego (85% v/v) do odtłuszczonych zarodników.
   3. Umieścić kolbę z PTFE w łaźni wodnej o temperaturze 70 °C i podłączyć do chłodnicy zwrotnej.
   4. Wykonać delikatny refluks (70 °C) w kwasie fosforowym przez 30 godzin, a następnie pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej.
   5. Rozcieńczyć zawiesinę przy użyciu 500 ml ciepłej wody demineralizowanej i zebrać SEC przez filtrację próżniową przy użyciu bibuły filtracyjnej.
   6. Przenieść SEC do szklanej zlewki o pojemności 3 l, aby wykonać serię płukań.
3. Mycie SEC
   1. Umieścić szklaną zlewkę o pojemności 3 l zawierającą SEC w dygestorium.
   2. Dodaj 800 ml gorącej (50 °C) wody DI do SEC, delikatnie mieszając przez 10 minut.
   3. Przefiltruj zawiesinę za pomocą bibuły filtracyjnej i zestawu do filtracji próżniowej.
   4. Zebrać SEC w czystej szklanej zlewce o pojemności 3 l.
   5. Powtórz kroki od 1.3.1. do 1.3.4. pięć razy.
   6. Dodać 600 ml gorącego (45 °C) acetonu do SEC, delikatnie mieszając przez 10 minut.
   7. Zebrać SEC przez filtrację w próżni i przenieść SEC do czystej zlewki szklanej o pojemności 3 l.
   8. Powtórzyć czynności 1.3.6 i 1.3.7 przy użyciu 600 ml gorącego (50 °C) 2 M kwasu solnego.
   9. Powtórzyć czynności 1.3.6 i 1.3.7, używając 600 ml gorącego (50 °C) 2 M wodorotlenku sodu.
   10. Powtórz kroki 1.3.1 i 1.3.4 osiem razy.
   11. Powtórzyć czynności 1.3.6 i 1.3.7 przy użyciu 600 ml gorącego (45 °C) acetonu.
   12. Powtórzyć czynności 1.3.6 i 1.3.7 przy użyciu 600 ml gorącego (45 °C) etanolu.
   13. Powtórzyć kroki 1.3.6 i 1.3.7, używając 800 ml gorącej (50 °C) wody demineralizowanej.
   14. Przenieś czyste SEC na sześć dużych szklanych szalek Petriego i susz w dygestoriach w temperaturze RT przez 24 godziny, aby usunąć całą zawartość wody.
   15. Suszyć SEC w piecu próżniowym w temperaturze 60 °C i próżni 1 mbar przez 10 godzin lub do uzyskania stałej masy.
   16. Zbierz wysuszone SEC i przenieś do butelki polipropylenowej.
   17. Przechowuj SEC w suchej szafce.

2. Charakterystyka SEC

1. Wykonaj analizę skaningowego mikroskopu elektronowego⁴¹ przy użyciu zarodników i SEC wytwarzanych na różnych etapach.
2. Przeprowadź analizę pierwiastkową⁴¹ przy użyciu zarodników i SEC wytwarzanych na różnych etapach. Suszyć wszystkie próbki w temperaturze 60 °C przez co najmniej 1 godzinę przed analizą pierwiastkową i obliczyć zawartość białka, stosując procentową zawartość azotu o współczynniku mnożenia 6,25. ¹¹ Uzyskać wyniki, wykonując trzy pomiary dla każdej próbki.
3. Przeprowadzanie analizy właściwości mikromerytycznych za pomocą dynamicznego analizatora cząstek obrazu. ^{Rozdział 41}
4. Skanuj nieprzetworzone, przetworzone i załadowane FITC-BSA SEC za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. ^{Rozdział 41}

3. Enkapsulacja biomakromolekuł za pomocą techniki ładowania próżniowego

1. Przygotować 1,2 ml roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 125 mg/ml przy użyciu wody demineralizowanej i przenieść do probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml.
2. Odważyć 150 mg SEC i przenieść do roztworu BSA.
3. Wiruj probówkę przez 10 minut, aby uzyskać jednorodny roztwór.
4. Przykryj rurkę bibułą filtracyjną.
5. Przenieść probówkę do kolby liofilizatora i suszyć przez 4 godziny w próżni o ciśnieniu 1 mbar.
6. Wykonaj kroki od 3.1 do 3.5 dla trzech niezależnych partii.
7. Zbierz SEC załadowane BSA i usuń aglomeraty za pomocą moździerza i tłuczka.
8. Przenieś SEC załadowane BSA do probówki o pojemności 50 ml i dodaj 2 ml wody DI, aby usunąć pozostałości BSA.
9. Zebrać SEC przez odwirowanie przy 4,704 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
10. Powtórz mycie wodą DI raz.
11. Przykryj probówkę zawierającą SEC obciążoną BSA bibułą filtracyjną.
12. Przenieś SEC do zamrażarki (-20 °C) i zamrażaj przez 1 godzinę.
13. Suszyć SEC przez 24 godziny i przechowywać w zamrażarce do czasu dalszej charakterystyki.
14. Przygotować SEC placebo bez BSA, stosując tę samą procedurę, co w krokach 3.1–3.13.
15. Przygotuj SEC załadowane zgodnie z FITC-BSA, stosując tę samą procedurę, co w krokach od 3.1 do 3.13.

4. Określanie skuteczności enkapsulacji

1. Zważyć 5 mg SEC obciążonych BSA w probówkach polipropylenowych o pojemności 2 ml.
2. Dodać 1,4 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami o pH 7,4 (PBS) i wirować przez 5 minut.
3. Sonda sonikuje zawiesinę o amplitudzie 40% przez 3 cykle po 10 sekund.
4. Przefiltrować roztwór za pomocą filtra polieterosulfonowego (PES) o wielkości 0,45 μm.
5. Wykonać tę samą procedurę, co w krokach 4.1–4.4, stosując SEC placebo.
6. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 280 nm, stosując placebo jako ślepą próbę.
7. Określić ilościowo ilość BSA kapsułkowanego za pomocą standardowej krzywej BSA (200 do 1 000 μg/ml) w PBS. ^{42 Rozdział 42}

Wyniki

Usprawniony proces ekstrakcji kapsułek Sporopollenin Exine

Ekstrakcja L. clavatum SEC została osiągnięta w trzech głównych etapach: (1) Odtłuszczanie za pomocą acetonu; (2) Kwasoliza przy użyciu kwasu fosforowego 85% (v/v); oraz (3) Intensywne mycie SEC przy użyciu rozpuszczalników. Przebieg usprawnionego procesu ekstrakcji SEC przedstawiono na rysunku 1 A - I. Krótko mówiąc, proces te...

Dyskusja

W niniejszej pracy przedstawiono systematyczną analizę ekstrakcji SEC z zarodników L. clavatum , a niniejszy raport pokazuje, że możliwe jest wyprodukowanie kapsułek wyższej jakości przy jednoczesnym osiągnięciu znacznego uproszczenia istniejącego wcześniej powszechnie stosowanego protokołu. ¹¹ W przeciwieństwie do istniejącego protokołu wymagającego wysokiej temperatury procesu (180 °C) i długiego czasu trwania procesu (7 dni)^,11 obecna optymalizacja procesu ekstrakcji SEC koncentrowała si...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lycopodium clavatum zarodniki (typ s)	Sigma	19108-500G-F
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A2153-50G
BSA sprzężona z FITC	Sigma	A9771-250MG
Kwas fosforowy (85% w/v)	Sigma	438081-2.5L
Kwas solny	Sigma	V800202
Wodorotlenek sodu	Sigma	S5881-1KG
Aceton	Sigma	V800022
Etanol	AcME
Woda dejonizowana	Woda oczyszczona Millipore
Jakościowa bibuła filtracyjna (klasa nr 1, celuloza bawełniana)
Mikrosfery polistyrenowe (50 ± 1 &mikro; m)	Thermoscientific (CA, Stany Zjednoczone)	4250A
Vectashield	Vector labs (CA, USA)	H-1000
Szkiełka samoprzylepne, D 263 M Szkło Schott, nr 1.5H (170 μ m, 25 mm x 75 mm) szkiełko niesterylne	Ibidi GmbH (Monachium, Niemcy)	10812
Lycopodium komercyjne SEC (typ L)	Polysciences, Inc. (PA, USA)	16867-1
Płyty grzewcze	IKA, Niemcy
Skaningowy mikroskop elektronowy	Jeol, Japonia	Analizator elementarny JFC-1600
	Elementar, Niemcy	VarioEL III
FlowCam: System stacjonarny	Technologie obrazowania płynów, USA	FlowCamVS
mikroskop skaningowy	Carl Zeiss, Niemcy	LSM710
Liofilizator	Labconco, USA
Spektrometr UV	Boeco, Niemcy	S220