Artykuł metodologiczny

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

20.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54771

⸱

25 stycznia 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Interactions Arbres – Microorganismes, UMR1136, INRA Université de Lorraine, 2Ecologie et Ecophysiologie Forestières - PTEF, UMR 1137, INRA Université de Lorraine, 3Biosciences Division, Oak Ridge National Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Streszczenie

Biofilmy bakteryjne często tworzą się na powierzchni grzybów i mogą być zaangażowane w liczne procesy interakcji bakteryjno-grzybowych, takie jak współpraca metaboliczna, konkurencja lub drapieżnictwo. Badanie biofilmów jest ważne w wielu dziedzinach biologii, w tym w naukach o środowisku, produkcji żywności i medycynie. Jednak niewiele badań koncentrowało się na takich biofilmach bakteryjnych, częściowo ze względu na trudności w ich badaniu. Większość metod jakościowych i ilościowych analiz biofilmu opisanych w literaturze jest odpowiednia tylko dla biofilmów tworzących się na powierzchniach abiotycznych lub na jednorodnych i cienkich powierzchniach biotycznych, takich jak monowarstwa komórek nabłonkowych.

Podczas gdy laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna (LSCM) jest często używana do analizy biofilmów in situ i in vivo, technologia ta staje się bardzo trudna, gdy jest stosowana do biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów, ze względu na grubość i trzy wymiary sieci strzępek. Aby przezwyciężyć to niedociągnięcie, opracowaliśmy protokół łączący mikroskopię z metodą ograniczającą gromadzenie się warstw strzępek w koloniach grzybów. Korzystając z tej metody, byliśmy w stanie zbadać rozwój biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów w wielu skalach przy użyciu zarówno LSCM, jak i skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Niniejszy raport opisuje protokół, w tym hodowle mikroorganizmów, warunki tworzenia biofilmu bakteryjnego, barwienie biofilmu oraz wizualizacje LSCM i SEM.

Wprowadzenie

Grzyby i bakterie mają wiele możliwości wzajemnych interakcji, ponieważ współżyją w większości środowisk lądowych. Ze względu na ich różnorodność i wszechobecność, interakcje te są ważne w wielu dziedzinach biologii, w tym w biotechnologii, rolnictwie, przetwórstwie spożywczym i medycynie1,2. Interakcje molekularne wymagają pewnego stopnia bliskości, aby umożliwić wymianę między partnerami, a w niektórych przypadkach fizyczna asocjacja partnerów jest niezbędna do interakcji funkcjonalnej3. Powszechnym fizycznym powiązaniem między bakteriami a grzybami jest tworzenie się biofilmów bakteryjnych na powierzchniach grzybów4. Ten bezpośredni kontakt między komórkami bakteryjnymi a strzępkami grzybów umożliwia intymne interakcje, które biorą udział w różnych procesach biologicznych. Na przykład w medycynie badanie tworzenia biofilmu Pseudomonas aeruginosa na oportunistycznym patogenie grzybowym Candida albicans może dostarczyć informacji na temat związku między powstawaniem biofilmu a zjadliwością5. W rolnictwie badania sugerują, że ryzobakterie wspomagające wzrost roślin i bakterie kontroli biologicznej mają zwiększoną skuteczność, gdy są połączone z grzybem w mieszanym biofilmie. Na przykład Bradyrhizobium elkanii mają zwiększoną aktywność wiązania N2, gdy są połączone z Pleurotus ostreatus w mieszanym biofilmie6. Wreszcie, w bioremediacji, mieszane biofilmy bakteryjno-grzybowe zostały wykorzystane do remediacji zanieczyszczonych miejsc7,8.

LSCM jest szczególnie odpowiedni do badania biofilmów, ponieważ pozwala na trójwymiarową obserwację żywych, uwodnionych biofilmów przy minimalnym wstępnym zabiegu, zachowując w ten sposób strukturę i organizację biofilmu. Tak więc analiza biofilmu przez LSCM jest bardzo pouczająca, szczególnie w celu określenia przebiegu procesu tworzenia się biofilmu w czasie i wykrycia charakterystycznych etapów9,10, od etapu adhezji do rozwoju dojrzałego biofilmu. Jest również specjalnie przystosowany do wizualizacji struktury i matrycy biofilmu11,12 lub do ilościowego określenia rozmiaru biofilmu13,14. Chociaż metoda ta jest odpowiednia do badania biofilmów na abiotycznych lub cienkich powierzchniach biotycznych, badanie biofilmu bakteryjnego na nitkowatej kolonii grzybów jest nadal bardzo trudne. Rzeczywiście, większość grzybów strzępkowych buduje w kulturze grube, złożone, trójwymiarowe sieci. Nawet jeśli grube obiekty mogą być obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej, tłumienie penetracji lasera i emisja fluorescencji często obniżają jakość końcowych obrazów na głębokości 50 μm15. Co więcej, ponieważ kolonie grzybów nie są sztywne, trudno jest poradzić sobie z mikroorganizmami bez naruszenia biofilmu. Ze względu na grubość próbek, kilka mikroskopowych analiz biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów jest zwykle wykonywanych tylko na niewielkiej części kolonii grzybów, a zatem zawiera tylko kilka strzępek16,17,18. Wszystko to ogranicza naszą zdolność do opisania rozmieszczenia biofilmu w kolonii grzybów, a tym samym może wprowadzić błędy systematyczne do analizy w przypadku heterogenicznego rozmieszczenia biofilmu w kolonii grzybów.

Aby przezwyciężyć takie trudności, przedstawiamy metodę wzrostu i analizy biofilmu bakteryjnego na strzępkach grzybów. Metodę tę zastosowano do badania tworzenia się biofilmu w Pseudomonas fluorescens BBc6 na strzępkach ektomikoryzowego podstawczaka Laccaria bicolor S238N. Te dwa mikroorganizmy leśno-glebowe zostały wcześniej opisane jako tworzące mieszane struktury przypominające biofilm19,20. Metodę tę można łatwo dostosować do innych nitkowatych systemów grzybowych/bakteryjnych. Przedstawiona metoda opiera się na połączeniu metody hodowli grzybów, pozwalającej na wzrost bardzo cienkich kolonii grzybów, z obrazowaniem LSCM i SEM. Pozwoliło nam to uzyskać widoki interakcji między dwoma mikroorganizmami w skali mikro- (μm) i mezo- (mm), co pozwoliło na jakościową charakterystykę biofilmu. Wykazaliśmy również, że próbki można obserwować za pomocą SEM, co pozwala na analizę strukturalną biofilmu na poziomie nanoskali (zakres nm).

Protokół

1. Przygotowanie kultur bakterii i grzybów

  1. Przygotowanie kultur grzybów
    1. Przygotuj membrany celofanowe o tej samej średnicy co szalki Petriego i gotuj je w EDTA (1 g/l w wodzie dejonizowanej) przez 30 minut. Opłucz arkusze wodą dejonizowaną i dwukrotnie sterylizuj je w autoklawie.
    2. Przygotować wstępną hodowlę grzybów, zaszczepiając grzybowe zatyczki agarowe na odpowiednim podłożu agarowym pokrytym membraną celofanową poddaną wstępnej obróbce EDTA. Inkubuj go w optymalnej temperaturze wzrostu, aby uzyskać kolonie o średnicy około 1 cm.
      1. Dla L. bicolor S238N inkubować w temperaturze 25 °C przez 5 dni na podłożu agarowym Pachlewski P5, wykonanym z 0,5 g winianu diNH4, 1 g KH2PO4, 0,5 g MgSO 4,7H2O, 5 g Maltozy D+, 20 g glukozy D+, 1 ml 10% tiaminy-HCl, 1 ml 1/10 rozcieńczonego roztworu mikroelementów (6 g/l siarczanu żelazawego; 0,27 g/l trioksydu molibdenu; 8,45 g/l kwasu borowego; 5 g/l siarczanu manganu; 5 g/l siarczanu miedzi; 2,27 g/l siarczanu) uzupełnionego do 1 l wodą dejonizowaną; i 20 g agaru; Odczyn pH 5,5.
    3. Ze wstępnej hodowli grzybów zaszczepić nową płytkę agarową pokrytą wstępnie obrobioną membraną celofanową EDTA zawierającą niskowęglowe podłoże agarowe, aby promować promienistą ekspansję kolonii.
      1. Aby zaszczepić szalkę Petriego, delikatnie podrap skalpelem zewnętrzny obszar (w którym komórki mają ten sam stan fizjologiczny) kolonii grzybów z kultury wstępnej i przenieś strzępki na nową płytkę agarową.
      2. Inkubować w optymalnej temperaturze wzrostu, aż nowe kolonie osiągną średnicę około 1 cm. Dla L. bicolor S238N inkubować je w temperaturze 25 °C przez 5 dni na podłożu agarowym P20 (0,25 g winianu diNH4; 0,5 g KH2PO4; 0,25 g MgSO4,7H2 O; 1 g glukozy D+; 0,5 ml10% tiaminy-HCl; 0,5 ml 1/10 rozcieńczonego roztworu mikroskładników pokarmowych (por. 1.1.2.1), uzupełnić do 1 l wodą dejonizowaną; i 20 g agaru; pH 5,5).
        Uwaga: Ze względu na wstępną hodowlę na celofanie, druga kultura nie będzie zawierać pożywki agarowej w centralnych zatyczkach. Zatyczki agarowe powinny zostać usunięte w celu dalszej analizy biofilmów, ponieważ korki te wprowadzają agar i składniki odżywcze, które mogą powodować odchylenia w analizie. Ten krok dotyczy tylko gatunków grzybów, które są trzymane i rozmnażane na płytkach agarowych i nie jest konieczny w przypadku grzybów rozmnażanych z zarodników lub zamrożonych zapasów.
  2. Przygotowanie kultur bakteryjnych
    1. Użyj sterylnej pętli, aby zebrać od 2 do 3 pojedynczych kolonii bakteryjnych z kultury na odpowiednim podłożu agarowym i zaszczepić 25 ml płynnej pożywki Luria-Bertani (LB) (lub innej odpowiedniej pożywki, w zależności od użytego szczepu). W przypadku P. fluorescens BBc6 inkubować kulturę przez noc w temperaturze 28 °C, delikatnie wstrząsając (~150 obr./min).
      Uwaga: Preferowane jest użycie szczepu znakowanego białkiem fluorescencyjnym, takim jak GFP, ponieważ pozwala to uniknąć wykonywania podwójnego barwienia (grzyby i bakterie) przed obserwacjami mikroskopowymi. Czas, szybkość mieszania i temperatura inkubacji zależą od użytego szczepu, a celem jest uzyskanie kultury w późnym wykładniczym wzroście.

2. Przygotowanie N in vitro biofilmu bakterii na kolonii grzybów

  1. Odwirować kulturę bakteryjną przy 5 000 x g przez 3 minuty i zawiesić osad w 25 ml sterylnego 0,1 M buforu fosforanu potasu (25 g/L KH2PO4 i 2,78 g/L K2HPO4, pH 5,8). Powtórz ten krok raz i dostosuj końcowe stężenie bakterii do10-9 komórek/ml z tym samym buforem.
  2. Napełnić mikropłytkę 6-dołkową 5 ml zawiesiny bakteryjnej (lub sterylnego 0,1 M buforu fosforanu potasu do kontroli ujemnej).
  3. Przetnij błonę celofanową kultury grzybów sterylną żyletką, aby uzyskać kwadraty celofanu z pojedynczą kolonią grzybów na każdej membranie. Ostrożnie usunąć celofanowe kwadraty zawierające strzępki ze stałego podłoża za pomocą kleszczy i przenieść kwadrat celofanu zawierającego strzępki do studzienki mikropłytki zawierającej zawiesinę bakteryjną.
  4. Delikatnie potrząśnij mikropłytką, gdy kolonie grzybów są nadal przyczepione do celofanu; następnie usuń arkusze celofanu, pozostawiając kolonie grzybów na płytce.
  5. Inkubować mikropłytkę z delikatnym mieszaniem (~60 obr./min) w temperaturze dostosowanej do badanych mikroorganizmów.
    Uwaga: Czas inkubacji zależy od szybkości tworzenia się biofilmu i etapu, który ma być analizowany. W przypadku P. fluorescens BBc6/L. bicolor inkubować w temperaturze 20 °C przez 30 minut, aby uzyskać biofilmy we wczesnym stadium i do 16 godzin, aby uzyskać dojrzałe biofilmy.

3. Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna Analiza powstawania biofilmu

  1. Przygotowanie próbki
    1. W celu usunięcia bakterii planktonowych i bakterii przyczepionych elektrostatycznie do strzępek, należy opłukać grzyba, przenosząc go na nową 6-dołkową mikropłytkę wypełnioną 5 ml mocnego roztworu soli (NaCl, 17 g/l) 17 ; delikatnie wstrząsać przez 1 minutę.
    2. Przenieść grzyba na nową 6-dołkową mikropłytkę zawierającą 5 ml sterylnego 0,1 M buforu fosforanu potasu, delikatnie wstrząsnąć przez 2 minuty i przenieść grzyb do świeżego buforu fosforanu potasu.
    3. Wytnij część kolonii grzybów, która ma być zobrazowana, za pomocą skalpela, trzymając ją w buforze fosforanu potasu, tak aby uzyskany fragment zawierał około połowy kolonii grzybów.
    4. Aby zabarwić próbkę, należy przenieść ją na szalkę Petriego wypełnioną sterylną wodą zawierającą odpowiedni barwnik fluorescencyjny (w zależności od celu analizy) i inkubować ją w ciemności.
      1. Aby zobrazować sieć grzybów, użyj na przykład czerwieni kongijskiej (0,1% stężenie końcowe, 5 minut inkubacji), lektyny agglutyny z kiełków pszenicy (WGA) sprzężonej z Alexa Fluor 633 (stężenie końcowe 10 μg/ml, 10 min inkubacji) lub FUN1 (stężenie końcowe 10 μM, 10 min inkubacji).
      2. Jeśli używasz bakterii nieznakowanej fluorescencyjnie, przeciwdziałaj barwieniu komórek bakteryjnych za pomocą sondy fluorescencyjnej specyficznej dla DNA, spośród licznych dostępnych na rynku barwników DNA przenikających komórki. Na przykład użyj DAPI (stężenie końcowe 0,25 μg/ml, 10 minut inkubacji).
      3. Aby zobrazować białka macierzy, użyj białka stain21.
    5. Po barwieniu przepłukać próbkę, przenosząc ją do pokrywki szalki Petriego zawierającej 10 ml sterylnego 0,1 M fosforanu potasu i delikatnie wstrząsać przez 1 minutę.
    6. Zanurz szkiełko do połowy w pokrywie szalki Petriego i delikatnie doprowadź wyciętą sekcję do unoszenia się nad szkiełkiem. Następnie powoli wyjmij szkiełko z roztworu buforowego, pozwalając, aby próbka delikatnie osiadła na szkiełku.
      Uwaga: Na tym etapie bardzo ważne jest, aby postępować delikatnie, aby uniknąć zakłócenia biofilmu.
    7. Na koniec dodać do próbki 10 μl antyblakującego podłoża montażowego i przykryć je szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
      Uwaga: Po przygotowaniu szkiełka należy przeprowadzić analizę mikroskopową tak szybko, jak to możliwe (nie dłużej niż 30 minut), aby uniknąć modyfikacji struktury biofilmu.
  2. Konfokalna analiza mikroskopowa
    1. Zbadaj szkiełka pod konfokalnym mikroskopem laserowym z soczewką obiektywową 10X lub 40X sprzężoną z oprogramowaniem do obrazowania.
      Uwaga: W tym przypadku zastosowano wielowiązkowy skaningowy mikroskop konfokalny wyposażony w lasery wzbudzające 405, 488 i 561 nm, detektor GaAsp PMT oraz obiektywy 10X 0,3 NA i 40X 1,2 NA.
      1. Obrazowanie należy wykonywać przy użyciu parametrów dostosowanych do rodzaju żądanych danych i ograniczeń czasowych. Używaj długości fal wzbudzenia/emisji lasera zgodnie z zastosowaną plamą i zaleceniami producenta. Użyj kombinacji funkcji skanowania kafelków i Z-stack, aby uzyskać globalne widoki 3D kolonii grzybów i biofilmów.
        Uwaga: Obrazy na rysunku 3 zostały uzyskane przy użyciu następujących parametrów: 8 bitów/piksel, uśrednianie = 2, zatrzymanie piksela = 1,58 μs, skanowanie kafelków obrazów 5x5 ze złączaniem online (pokrycie 10%, próg = 0,7); Krok Z = 2 μm.
    2. Do wizualizacji danych 3D użyj jednego z wielu darmowych lub komercyjnych programów (oferują one wiele opcji renderowania 3D).
      1. Na przykład, aby wyświetlić dane stosu Z jako projekcje maksymalnej intensywności 2D, odejmij kanał jasnego pola, dostosuj jasność i kontrast oraz scal kanały w celu utworzenia obrazu kompozytowego. Jeśli są obecne, wyeliminuj plasterki bez sygnału na końcach stosu Z. Następnie wykonaj projekcję 2D o maksymalnej intensywności i przekonwertuj wynik na kolor RGB. Użyj funkcji "Z project" w oprogramowaniu ImageJ22, aby uzyskać prezentowane tutaj obrazy za pomocą projekcji 2D o maksymalnej intensywności.

4. Analiza mikroskopii elektronowej

  1. Przygotować próbki zgodnie z opisem dla LSCM, z wyjątkiem etapu 3.1.2, po etapach płukania przenieść biofilmy do sterylnej wody zamiast buforu fosforanu potasu. Pozwala to uniknąć tworzenia się kryształów soli na etapie odwadniania, co zakłóciłoby obrazowanie SEM.
  2. Przenieść biofilmy do uchwytu na próbkę i usunąć nadmiar wody; pozwolić, aby próbka pokryła się tylko niewielką ilością wody.
  3. Przenieść próbkę do komory skaningowego mikroskopu elektronowego o zmiennym ciśnieniu (VP-SEM); zamrozić ją do temperatury -50 °C na stopniu chłodzącym Peltiera; i pozostawić do powolnego liofilizacji, bezpośrednio w komorze SEM, przy zmiennym ciśnieniu 100 Pa ustawionym na 15 godzin.
  4. Po zakończeniu liofilizacji pobrać próbkę i przenieść ją do systemu osadzania folii w wysokiej próżni. Pokryj próbkę platyną o długości 2 nm (pomiar kwarcu) pod plazmą argonową (2,5 x 10-2 mbar, 35 mA).
  5. Obserwować pokrytą próbkę za pomocą SEM wyposażonego w pistolet do emisji polowej (FEG) przy użyciu detektora "w soczewce" o wysokiej rozdzielczości i elektronicznego wysokiego napięcia 1 kV.

Wyniki

Ogólny schemat procedury hodowli grzybów i przygotowania biofilmu przedstawiono na Rysunku 1. Zastosowana metoda hodowli pozwoliła na uzyskanie kolonii grzybów o grubości od 20 do 50 µm, składających się z kilku warstw strzępek, co umożliwiło analizę uwodnionego, żywego biofilmu w skali mikro i mezo z wykorzystaniem LSCM. Zastosowanie tej metody pozwoliło na pozyskanie wysokiej jakości obrazów biofilmów P. fluorescens BBc6 na strzępkach L. bicolor w trakcie formowania się biofilmu (Rysunki 2-4).

Analiza w skali mezo wykazała heterogeniczną dystrybucję biofilmu P. fluorescens BBc6 na strzępkach L. bicolor S238N (ryciny 2 i 3). Analiza w skali mezo pozwoliła również na śledzenie procesu tworzenia biofilmu w czasie (rycina 3), od wczesnych etapów, w których tylko niektóre bakterie były przytwierdzone do strzępek (rycina 3a), aż po powstanie grubego, dojrzałego biofilmu (rycina 3b). Wysoka rozdzielczość obrazów w skali mezo umożliwiła przeprowadzenie analizy w skali mikro na tych samych obrazach w celu uzyskania architektury kolonii (rycina 3c-d).

Analiza w mikroskali w połączeniu ze specyficznym znakowaniem pozwoliła nam pójść o krok dalej w charakterystyce biofilmu. W tym celu do próbek zastosowano SYPRO Ruby23, który znakuje większość klas białek (Rysunek 4), co wykazało obecność białek w macierzy.

Ostatecznie, dodatkowe szczegóły struktury biofilmu uzyskano za pomocą obrazowania SEM tej samej próbki po odwodnieniu i napyleniu (Rycina 5). Obrazowanie SEM umożliwiło analizę na poziomie nanometrycznym, dając tym samym wgląd w strukturę macierzy.

Schemat oddziaływania bakterii i grzybów; obejmuje przenoszenie na celofan z EDTA, inkubację oraz analizę mikroskopową.
Rycina 1: Ogólny schemat procedury hodowli grzybów i przygotowania biofilmu. Rycina ta przedstawia główne etapy metody, od hodowli mikroorganizmów po analizy próbek. Więcej szczegółów znajduje się w protokole. Aby wyświetlić rycinię w większym rozmiarze, kliknij tutaj.

Obraz mikroskopii fluorescencyjnej cytoszkieletu neuronu, przedstawiający filamenty aktynowe w kolorze czerwonym, struktura komórki.
Rycina 2: Rozkład biofilmu BBc6 na kolonii grzyba. Próbkę obrazowano po 18 hr interakcji przy powiększeniu 10X. Obraz uzyskano poprzez 2D projekcję maksymalnej intensywności obrazów z mikroskopii konfokalnej 3D. Szara siatka na rysunku przedstawia pozycje mozaiki. Strzępki L. bicolor są barwione czerwienią kongowym (kolor czerwony), a bakterie są znakowane GFP (kolor zielony). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna, czerwone/zielone włókna, analiza tkanki nerwowej, obraz mikroskopowy, szczegóły komórkowe.
Rycina 3: Wczesne i późne stadia tworzenia biofilmu BBc6 na strzępkach L. bicolor. Obraz ten uzyskano poprzez 2D projekcję maksymalnej intensywności z obrazów mikroskopii konfokalnej 3D. Obrazowanie przeprowadzono przy powiększeniu 40X. (a) Rozkład biofilmu po 2 h interakcji. (b) Rozkład biofilmu po 14 h interakcji. (c) Powiększenie białego prostokąta z (a). (d) Powiększenie białego prostokąta z (b). Strzępki grzybni są barwione czerwienią kongową (czerwony), a bakterie są znakowane GFP (zielony). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna komórek nerwowych, kanały czerwony i zielony, uwidaczniająca struktury neuronalne.
Rysunek 4: Barwienie macierzy biofilmu BBc6 na L. bicolor strzępki. (a) Biofilmy po 16 h interakcji. (b) Powiększenie białego prostokąta z (a). Obrazowanie wykonano przy 40-krotnym powiększeniu, a obrazy te uzyskano poprzez dwuwymiarową projekcję maksymalnej intensywności (MIP) z trójwymiarowych obrazów mikroskopii konfokalnej. Bakterie są znakowane białkiem GFP (zielony), grzyb jest barwiony barwnikiem Fun1 (ciemnozielony), a białka są barwione barwnikiem S. Ruby (czerwony). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.

Mikrograf elektronowy struktury biofilmu; analiza mikroskopowych szczegółów powierzchni; pasek skali 20 µm.
Rycina 5: Obrazowanie SEM biofilmów BBc6 na strzępkach L. bicolor. Obrazowanie SEM wykonano przy powiększeniu 2360X, EHT: 1kV. Przed obrazowaniem próbkę powoli liofilizowano w komorze SEM i napylano platyną. Zielone strzałki wskazują biofilmy bakteryjne, a żółte strzałki wskazują strzępki grzybów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Biofilmy bakteryjne są pozyskiwane w wielu środowiskach i są badane od lat pięćdziesiątych XX wieku, co doprowadziło do opracowania szeregu metod ich analizy24. Klasyczne metody ilościowego oznaczania i monitorowania biofilmów obejmują testy mikromiana oraz, najpowszechniej stosowaną metodę, barwienie fioletem krystalicznym (CV). Metody te są szybkie, tanie i łatwe w obsłudze25 i są szczególnie przydatne do ilościowego oznaczania całkowitej biomasy biofilmu lub do przeprowadzania testów żywotności i kwantyfikacji matrycy. Z drugiej strony, metody "omiczne" są również przydatne w badaniach biofilmu, pozwalając na ilościowe i funkcjonalne analizy biofilmów26,27. Pomimo zalet mikropłytki i metod "omicznych", kilku istotnych cech biofilmów nie można uchwycić za pomocą tych technik, co utrudnia pełne zrozumienie tego procesu. Cechy te obejmują struktury macierzy, architekturę kolonii bakteryjnych, interakcje komórka/komórka i wzorce kolonizacji, które są kluczowymi danymi dla zrozumienia zarówno funkcjonowania biofilmów, jak i dynamiki ich powstawania. Pomimo zdolności mikroskopii do uchwycenia tych cech, analiza mikroskopowa biofilmów bakteryjnych na grzybach strzępkowych jest nadal rzadka. Wynika to głównie ze wzrostu grzybów strzępkowych, które często tworzą kolonie grubych, złożonych, trójwymiarowych sieci. Tworzenie biofilmów bakteryjnych na grzybach jest powszechne w różnych środowiskach i jest znacząco zaangażowane w różne dziedziny4 (np. medycynę, rolnictwo i środowisko); W związku z tym tak ważne jest opracowanie nowych metod, które ułatwią ich badanie. W tym celu połączyliśmy metodę generowania bardzo cienkich kolonii grzybów z obrazowaniem mikroskopowym biofilmów bakteryjnych. Ponadto zaproponowaliśmy zestaw narzędzi mikroskopowych do jakościowej analizy tych biofilmów. Sukces tej metody opiera się na zdolności do wytwarzania bardzo cienkich kolonii strzępek i stosowania odpowiednich barwników. Te punkty zostały omówione poniżej.

Ze względu na złożoną strukturę biofilmów, zrozumienie ich funkcji wymaga podejścia wieloskalowego28,29. Wzorce rozmieszczenia biofilmów, architektura kolonii bakteryjnych oraz struktura i skład matrycy są analizowane w różnych skalach (tj. w skali mezologicznej i mikro). Co więcej, rozdzielczość w nanoskali umożliwia dostęp do fizycznych interakcji komórka/komórka i nanostruktury matrycy. Tym samym opracowana metoda z łatwością umożliwia wieloskalową analizę biofilmów bakteryjnych powstających na kolonii grzybów.

W większości badań analizy LSCM biofilmów są ograniczone do mikroskali, przy czym mezoskala jest zwykle wykonywana za pomocą optycznej koherentnej tomografii 30,31,32. Przedstawiona metoda umożliwia prowadzenie analiz zarówno w skali mikro, jak i mezoskalowej za pomocą LSCM. Pokazuje to użyteczność łączenia obu analiz w tym samym obszarze próbki, a nawet na tym samym obrazie przy użyciu mikroskopów konfokalnych nowej generacji o wysokiej rozdzielczości (ryc. 3). W ten sposób unika się tutaj problemów związanych ze skompilowanymi danymi zebranymi w różnych skalach za pomocą różnych metod.

Ta kombinacja analiz dała jednocześnie dostęp do repartycji biofilmu w kolonii grzybów, architektury kolonii bakteryjnej wzdłuż rozwijającego się biofilmu oraz struktury macierzy. Analiza w skali mezoskali wykazała heterogeniczny rozkład biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów (ryc. 2 i 3). Obserwacja ta nie byłaby możliwa przy użyciu protokołów, które pozwalają na obrazowanie tylko niewielkiej części kolonii grzybów, która niekoniecznie jest reprezentatywna dla całej kolonii. Tak więc, choć często zaniedbywana, analiza w skali mezoskalowej może dostarczyć cennych informacji na temat wzorców dystrybucji biofilmu.

Wreszcie, opracowana metoda może być wykorzystana do analizy próbek za pomocą różnych technik mikroskopowych, w tym skaningowej mikroskopii elektronowej. W tym przypadku SEM został wykorzystany do osiągnięcia skali nano i uzyskania bakteryjnej organizacji przestrzennej w biofilmie. Bardzo dobrze radził sobie z cienkimi koloniami grzybów, podczas gdy SEM pozwalał tylko na obrazowanie powierzchni. W przeciwieństwie do LSCM, SEM wymagał jednak odwodnienia próbki i najczęściej pokrycia metalem przewodzącym. Ten proces odwadniania może zmieniać struktury biologiczne, gdy nie jest prawidłowo przeprowadzany i może wymagać optymalizacji. W tym przypadku zastosowano odwadnianie próbki za pomocą powolnej liofilizacji33. Niemniej jednak zastosowanie zarówno LSCM, jak i SEM do próbek pozwoli na wykonanie mikroskopii korelacyjnej w tym samym miejscu próbki.

Pomimo opisanych powyżej zalet istnieją pewne ograniczenia. Po pierwsze, może nie mieć zastosowania do wszystkich rodzajów grzybów. Rzeczywiście, ta metoda hodowli została opracowana dla grzybów rozprzestrzeniających się promieniście na powierzchni pożywek stałych. Metoda ta może nie być odpowiednia dla grzybów tworzących głównie strzępki powietrzne (np. Fusarium sp.) lub dla grzybów mikrotlenowych rozprzestrzeniających się głównie wewnątrz agaru. Problematyczne mogą być również grzyby rozkładające celofan (np. Trichoderma sp.). Po drugie, ważne jest, aby pamiętać, że strategia barwienia jest punktem krytycznym, a wybór plamy musi być dokonany ostrożnie, ponieważ plama nie może naruszać biofilmu. Na przykład zauważyliśmy, że Calcofluor White spowodował częściowe przerwanie biofilmu (dane nie pokazane), prawdopodobnie z powodu wysokiego pH tej plamy. Ponadto niektóre barwniki powodowały heterogeniczne barwienie (np. Czerwień Kongo), podczas gdy inne powodowały jednorodne barwienie (np. barwienie ścian komórkowych lektyną WGA), co dawało niejednorodną jakość obrazu. Ponadto ważne jest, aby mieć świadomość, że niektóre barwniki mogą nie być w pełni specyficzne. Na przykład WGA barwi nie tylko ściany komórkowe grzybów, ale także kwas N-acetyloneuraminowy w ścianach komórkowych bakterii Gram-dodatnich i adhezynach wytwarzanych przez bakterie Gram-dodatnie i -ujemne podczas tworzenia biofilmu34,35. Dlatego zaleca się stosowanie fluorescencyjnych bakterii i/lub grzybów znakowanych białkami, aby uniknąć wielokrotnego barwienia. Jeśli stosuje się wiele barwników, nie mogą one zakłócać chemicznie, a ich widma emisyjne nie powinny się na siebie nakładać.

Analizy w skali mezoskalowej wymagają dużego skanowanego obszaru, a zatem LSCM może być czasochłonne (od 40 minut do 1 godziny, w zależności od grubości próbki) i utrudniać analizę dużej liczby próbek. Niemniej jednak można dokonać korekt w zależności od rodzaju wymaganych danych. Możliwe jest skrócenie czasu akwizycji i rozmiaru obrazu poprzez zmianę jakości obrazu. Na przykład wysoka rozdzielczość nie jest konieczna do analizy ogólnego podziału biofilmu.

Wreszcie, przy wyborze wyświetlania danych stosu Z jako projekcji 2D lub 3D należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia. Projekcje dwuwymiarowe są dobrym sposobem podsumowywania danych, ale informacje o głębi są tracone, a nakładające się na siebie struktury stają się ukryte. Z drugiej strony, rzuty 3D pozwalają na wizualizację z różnych punktów widzenia, ale często słabo renderują się w przypadku złożoności przestrzennej.

Podsumowując, przedstawiliśmy metodę charakterystyki biofilmów bakteryjnych na strzępkach na poziomie strukturalnym. Metodologia może być rozszerzona na inne zastosowania. Rzeczywiście, metoda ta pozwala na wykonanie funkcjonalnej lub chemicznej charakterystyki biofilmów bakteryjnych tworzących się na strzępkach grzybów. Ze względu na dużą różnorodność istniejących fluorescencyjnych systemów reporterowych, analiza LSCM może być wykorzystywana do wielu celów29. Na przykład mikroskopia fluorescencyjna może być wykorzystana do monitorowania gradientu pH36 lub dyfuzji cząsteczek w biofilmach37. Dodatkowo metoda pozwala na analizę zbiorowisk w biofilmach wielogatunkowych. Na przykład fluorescencyjna hybrydyzacja in situ ukierunkowana na określone grupy bakterii jest szczególnie przydatna do badania specyficznego podziału bakteryjnego w wielogatunkowych biofilmach38,39. Wreszcie, liczne barwniki fluorescencyjne mogą być użyte do scharakteryzowania składu matrycy biofilmów21. W tym przypadku białka były celowane za pomocą Sypro, który barwi szeroki zakres białek, w tym białka macierzy (ryc. 4), ale inne barwniki pozwalają na wizualizację innych ważnych składników macierzy, takich jak egzopolisacharydy lub zewnątrzkomórkowe DNA. Co ciekawe, wszystkie te analizy można było wykonać w skali mezologicznej przy użyciu opisanej metody. Ponieważ LSCM można wykonać na żywych próbkach, możliwe jest również uzyskanie obrazowania poklatkowego przy użyciu, na przykład, komór pokrywowych, szczególnie przydatnych w przypadku cienkich kolonii grzybów. Ta opcja jest szczególnie interesująca, ponieważ tworzenie biofilmu jest złożonym, dynamicznym procesem. Wreszcie, do celów ilościowych, zgłoszona metoda może poprawić dokładność automatycznej analizy ilościowej, umożliwiając tę kwantyfikację na obrazach w skali mezo. Może to przezwyciężyć niejednorodność biofilmu i problemy statystyczne29.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Francuską Narodową Agencję Badawczą poprzez Laboratorium Doskonałości ARBRE (ANR-11-LABX-0002-01), Obszar Naukowy Interfejsów Roślin-Mikrob w Programie Nauk Genomicznych oraz Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych w Biurze Nauki DOE. Oak Ridge National Laboratory jest zarządzane przez UT-Battelle, LLC, dla Departamentu Energii Stanów Zjednoczonych na podstawie umowy DE-AC05-00OR22725.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych FalconFisher Scientific08-772-33Używany w 2.2 i 3.1
Kongo RedFisher ScientificC580-25Używany w 3.1.4.1
FUN 1 Barwnik komórkowyThermo Fisher ScientificF7030Stosowany w 3.1.4.1
Aglutynina z kiełków pszenicy, Alexa Fluor 633 SprzężonyThermo Fisher ScientificW21404Stosowany w 3.1.4.1
Roztwór DAPIThermo Fisher Scientific62248Stosowany w 3.1.4.2
Jodek propidynyThermo Fisher ScientificP3566Stosowany w 3.1.4.3
FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix białko StainThermo Fisher ScientificF10318Stosowany w 3.1.4.4
Fluoromount-G Medium do montażu ślizgowegoFisher ScientificOB100-01Używany w 3.1.7
LSM780 Axio Observer Z1ZeissUżywany w oprogramowaniu 3.2.1
ZEN 2.1 lite black Zeisszastosowany w
powlekarce wysokopróżniowej 3.2.1 Leica EM ACE600Leicaużyta w 4
GeminiSEM-FEGZeissużyta w 4

Bibliografia

  1. Frey-Klett, P., Burlinson, P., Deveau, A., Barret, M., Tarkka, M., Sarniguet, A. Bacterial-Fungal Interactions: Hyphens between Agricultural, Clinical, Environmental, and Food Microbiologists. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 75 (4), 583-609 (2011).
  2. Scherlach, K., Graupner, K., Hertweck, C. Molecular bacteria-fungi interactions: effects on environment, food, and medicine. Annu. Rev. Microbiol. 67, 375-397 (2013).
  3. Schroeckh, V., Scherlach, K., et al. Intimate bacterial-fungal interaction triggers biosynthesis of archetypal polyketides in Aspergillus nidulans. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (34), 14558-14563 (2009).
  4. Hogan, D. A., Wargo, M. J., Beck, N. Bacterial Biofilms on Fungal Surfaces. Biofilm mode of life: mechanisms and adaptations. 13, 235-245 (2007).
  5. Hogan, D. A., Kolter, R. Pseudomonas - Candida interactions: an ecological role for virulence factors. Science. 296 (5576), 2229-2232 (2002).
  6. Jayasinghearachchi, H. S., Seneviratne, G. Can mushrooms fix atmospheric nitrogen? J. Biosci. 29 (3), 293-296 (2004).
  7. Seneviratne, G., Zavahir, J. S., Weerasekara, W. M. M. S., Bandara, M. L. M. A. Fungal-bacterial biofilms their development for novel biotechnological applications. World J Microbiol Biotechnol. , 739-743 (2008).
  8. Herath, H. M. L. I., Upamali, A., Vithanage, M., Seneviratne, G. Developed fungal - bacterial biofilms as a novel tool for bioremoval of hexavelant chromium from wastewater. Chem. Ecol. 00 (0), 1-10 (2014).
  9. Macedo, A. J., Kuhlicke, U., Neu, T. R., Timmis, K. N., Abraham, W. R. Three stages of a biofilm community developing at the liquid-liquid interface between polychlorinated biphenyls and water. Appl. Environ. Microbiol. 71 (11), 7301-7309 (2005).
  10. Da Silva, W. J., Seneviratne, J., Samaranayake, L. P., Del Bel Cury, A. A. Bioactivity and architecture of Candida albicans biofilms developed on poly(methyl methacrylate) resin surface. J. Biomed. Mater. Res. - Part B Appl. Biomater. 94 (1), 149-156 (2010).
  11. Flemming, H., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Publ. Gr. 8 (9), 623-633 (2010).
  12. Cerca, N., Gomes, F., Pereira, S., Teixeira, P., Oliveira, R. Confocal laser scanning microscopy analysis of S. epidermidis biofilms exposed to farnesol, vancomycin and rifampicin. BMC Res. Notes. 5, 244(2012).
  13. Lepanto, P., Lecumberry, F., Rossello, J., Kierbel, A. A confocal microscopy image analysis method to measure adhesion and internalization of Pseudomonas aeruginosa multicellular structures into epithelial cells. Mol. Cell. Probes. 28 (1), 1-5 (2014).
  14. Mueller, L. N., de Brouwer, J. F. C., Almeida, J. S., Stal, L. J., Xavier, J. B. Analysis of a marine phototrophic biofilm by confocal laser scanning microscopy using the new image quantification software PHLIP. BMC Ecol. 6, (2006).
  15. Murray, J. M. Methods for imaging thick specimens: Confocal microscopy, deconvolution, and structured illumination. Cold Spring Harb. Protoc. 6 (12), 1399-1437 (2011).
  16. Toljander, J. F., Artursson, V., Paul, L. R., Jansson, J. K., Finlay, R. D. Attachment of different soil bacteria to arbuscular mycorrhizal fungal extraradical hyphae is determined by hyphal vitality and fungal species. FEMS Microbiol. Ecol. 254, 34-40 (2006).
  17. Brandl, M. T., Carter, M. Q., Parker, C. T., Chapman, M. R., Huynh, S. Salmonella Biofilm Formation on Aspergillus niger Involves Cellulose - Chitin Interactions. PLoS One. 6 (10), (2011).
  18. Balbontín, R., Vlamakis, H. Mutualistic interaction between Salmonella enterica and Aspergillus niger and its effects on Zea mays colonization. Microb. Biotechnol. Publ. , (2014).
  19. Frey-Klett, P., Garbaye, J., Tarkka, M. The mycorrhiza helper bacteria revisited. New Phytol. 176 (1), 22-36 (2007).
  20. Deveau, A., Brulé, C., et al. Role of fungal trehalose and bacterial thiamine in the improved survival and growth of the ectomycorrhizal fungus Laccaria bicolor S238N and the helper bacterium Pseudomonas fluorescens BBc6R8. Environ. Microbiol. Rep. 2 (4), 560-568 (2010).
  21. Neu, T. R., Lawrence, J. R. Advanced Techniques for In Situ Analysis of the Biofilm Matrix (Structure, Composition, Dynamics) by Means of Laser Scanning Microscopy. Methods Mol. Biol. 1147, 43-64 (2014).
  22. Rasband, W. S. imagej. , Available from: http://imagej.nih.gov/ij (2016).
  23. Berggren, K. N., Schulenberg, B., et al. An improved formulation of SYPRO Ruby protein gel stain: Comparison with the original formulation and with a ruthenium II tris (bathophenanthroline disulfonate) formulation. Proteomics. 2 (5), 486-498 (2002).
  24. Pantanella, F., Valenti, P., Natalizi, T., Passeri, D., Berlutti, F. Analytical techniques to study microbial biofilm on abiotic surfaces: pros and cons of the main techniques currently in use. Ann. di Ig. 25 (1), 31-42 (2013).
  25. Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), (2011).
  26. Azevedo, N. F., Lopes, S. P., Keevil, C. W., Pereira, M. O., Vieira, M. J. Time to "go large" on biofilm research: Advantages of an omics approach. Biotechnol. Lett. 31 (4), 477-485 (2009).
  27. Koerdt, A., Orell, A., et al. Macromolecular fingerprinting of Sulfolobus species in biofilm: A transcriptomic and proteomic approach combined with spectroscopic analysis. J. Proteome Res. 10 (9), 4105-4119 (2011).
  28. Morgenroth, E., Milferstedt, K. Biofilm engineering: Linking biofilm development at different length and time scales. Rev. Environ. Sci. Biotechnol. 8 (3), 203-208 (2009).
  29. Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).
  30. Xi, C., Marks, D., Schlachter, S., Luo, W., Boppart, S. A. High-resolution three-dimensional imaging of biofilm development using optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 11 (3), 34001(2006).
  31. Janjaroen, D., Ling, F., et al. Roles of ionic strength and biofilm roughness on adhesion kinetics of Escherichia coli onto groundwater biofilm grown on PVC surfaces. Water Res. 47 (7), 2531-2542 (2013).
  32. Derlon, N., Koch, N., et al. Activity of metazoa governs biofilm structure formation and enhances permeate flux during Gravity-Driven Membrane (GDM) filtration. Water Res. 47 (6), 2085-2095 (2013).
  33. Karcz, J., Bernas, T., Nowak, A., Talik, E., Woznica, A. Application of lyophilization to prepare the nitrifying bacterial biofilm for imaging with scanning electron microscopy. Scanning. 34 (1), 26-36 (2012).
  34. Burton, E., Yakandawala, N., LoVetri, K., Madhyastha, M. S. A microplate spectrofluorometric assay for bacterial biofilms. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 34 (1), 1-4 (2007).
  35. Berne, C., Ducret, A., Hardy, G. G., Brun, Y. V. Adhesins Involved in Attachment to Abiotic Surfaces by Gram-Negative Bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (4), 1-45 (2015).
  36. Schlafer, S., Garcia, J. E., Greve, M., Raarup, M. K., Nyvad, B., Dige, I. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Appl. Environ. Microbiol. 81 (4), 1267-1273 (2015).
  37. Daddi Oubekka, S., Briandet, R., Fontaine-Aupart, M. P., Steenkeste, K. Correlative time-resolved fluorescence microscopy to assess antibiotic diffusion-reaction in biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 56 (6), 3349-3358 (2012).
  38. Almeida, C., Azevedo, N. F., Santos, S., Keevil, C. W., Vieira, M. J. Discriminating multi-species populations in biofilms with peptide nucleic acid fluorescence in situ hybridization (PNA FISH). PLoS One. 6 (3), (2011).
  39. Malic, S., Hill, K. E., Hayes, A., Percival, S. L., Thomas, D. W., Williams, D. W. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155 (8), 2603-2611 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Strz pki grzyb wmikroskopia konfokalnaskaningowa mikroskopia elektronowatworzenie biofilmubarwienie biofilmuprotok mikroskopowywizualizacja biofilmu
Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.