Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Podsumowanie

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Streszczenie

Biofilmy bakteryjne często tworzą się na powierzchni grzybów i mogą być zaangażowane w liczne procesy interakcji bakteryjno-grzybowych, takie jak współpraca metaboliczna, konkurencja lub drapieżnictwo. Badanie biofilmów jest ważne w wielu dziedzinach biologii, w tym w naukach o środowisku, produkcji żywności i medycynie. Jednak niewiele badań koncentrowało się na takich biofilmach bakteryjnych, częściowo ze względu na trudności w ich badaniu. Większość metod jakościowych i ilościowych analiz biofilmu opisanych w literaturze jest odpowiednia tylko dla biofilmów tworzących się na powierzchniach abiotycznych lub na jednorodnych i cienkich powierzchniach biotycznych, takich jak monowarstwa komórek nabłonkowych.

Podczas gdy laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna (LSCM) jest często używana do analizy biofilmów in situ i in vivo, technologia ta staje się bardzo trudna, gdy jest stosowana do biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów, ze względu na grubość i trzy wymiary sieci strzępek. Aby przezwyciężyć to niedociągnięcie, opracowaliśmy protokół łączący mikroskopię z metodą ograniczającą gromadzenie się warstw strzępek w koloniach grzybów. Korzystając z tej metody, byliśmy w stanie zbadać rozwój biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów w wielu skalach przy użyciu zarówno LSCM, jak i skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Niniejszy raport opisuje protokół, w tym hodowle mikroorganizmów, warunki tworzenia biofilmu bakteryjnego, barwienie biofilmu oraz wizualizacje LSCM i SEM.

Wprowadzenie

Grzyby i bakterie mają wiele możliwości wzajemnych interakcji, ponieważ współżyją w większości środowisk lądowych. Ze względu na ich różnorodność i wszechobecność, interakcje te są ważne w wielu dziedzinach biologii, w tym w biotechnologii, rolnictwie, przetwórstwie spożywczym i medycynie^1,2. Interakcje molekularne wymagają pewnego stopnia bliskości, aby umożliwić wymianę między partnerami, a w niektórych przypadkach fizyczna asocjacja partnerów jest niezbędna do interakcji funkcjonalnej³. Powszechnym fizycznym powiązaniem między bakteriami a grzybami jest tworzenie się biofilmów bakteryjnych na powierzchniach grzybów⁴. Ten bezpośredni kontakt między komórkami bakteryjnymi a strzępkami grzybów umożliwia intymne interakcje, które biorą udział w różnych procesach biologicznych. Na przykład w medycynie badanie tworzenia biofilmu Pseudomonas aeruginosa na oportunistycznym patogenie grzybowym Candida albicans może dostarczyć informacji na temat związku między powstawaniem biofilmu a zjadliwością⁵. W rolnictwie badania sugerują, że ryzobakterie wspomagające wzrost roślin i bakterie kontroli biologicznej mają zwiększoną skuteczność, gdy są połączone z grzybem w mieszanym biofilmie. Na przykład Bradyrhizobium elkanii mają zwiększoną aktywność wiązania N₂, gdy są połączone z Pleurotus ostreatus w mieszanym biofilmie⁶. Wreszcie, w bioremediacji, mieszane biofilmy bakteryjno-grzybowe zostały wykorzystane do remediacji zanieczyszczonych miejsc^7,8.

LSCM jest szczególnie odpowiedni do badania biofilmów, ponieważ pozwala na trójwymiarową obserwację żywych, uwodnionych biofilmów przy minimalnym wstępnym zabiegu, zachowując w ten sposób strukturę i organizację biofilmu. Tak więc analiza biofilmu przez LSCM jest bardzo pouczająca, szczególnie w celu określenia przebiegu procesu tworzenia się biofilmu w czasie i wykrycia charakterystycznych etapów^9,10, od etapu adhezji do rozwoju dojrzałego biofilmu. Jest również specjalnie przystosowany do wizualizacji struktury i matrycy biofilmu^11,12 lub do ilościowego określenia rozmiaru biofilmu^13,14. Chociaż metoda ta jest odpowiednia do badania biofilmów na abiotycznych lub cienkich powierzchniach biotycznych, badanie biofilmu bakteryjnego na nitkowatej kolonii grzybów jest nadal bardzo trudne. Rzeczywiście, większość grzybów strzępkowych buduje w kulturze grube, złożone, trójwymiarowe sieci. Nawet jeśli grube obiekty mogą być obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej, tłumienie penetracji lasera i emisja fluorescencji często obniżają jakość końcowych obrazów na głębokości 50 μm¹⁵. Co więcej, ponieważ kolonie grzybów nie są sztywne, trudno jest poradzić sobie z mikroorganizmami bez naruszenia biofilmu. Ze względu na grubość próbek, kilka mikroskopowych analiz biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów jest zwykle wykonywanych tylko na niewielkiej części kolonii grzybów, a zatem zawiera tylko kilka strzępek^16,17,18. Wszystko to ogranicza naszą zdolność do opisania rozmieszczenia biofilmu w kolonii grzybów, a tym samym może wprowadzić błędy systematyczne do analizy w przypadku heterogenicznego rozmieszczenia biofilmu w kolonii grzybów.

Aby przezwyciężyć takie trudności, przedstawiamy metodę wzrostu i analizy biofilmu bakteryjnego na strzępkach grzybów. Metodę tę zastosowano do badania tworzenia się biofilmu w Pseudomonas fluorescens BBc6 na strzępkach ektomikoryzowego podstawczaka Laccaria bicolor S238N. Te dwa mikroorganizmy leśno-glebowe zostały wcześniej opisane jako tworzące mieszane struktury przypominające biofilm^19,20. Metodę tę można łatwo dostosować do innych nitkowatych systemów grzybowych/bakteryjnych. Przedstawiona metoda opiera się na połączeniu metody hodowli grzybów, pozwalającej na wzrost bardzo cienkich kolonii grzybów, z obrazowaniem LSCM i SEM. Pozwoliło nam to uzyskać widoki interakcji między dwoma mikroorganizmami w skali mikro- (μm) i mezo- (mm), co pozwoliło na jakościową charakterystykę biofilmu. Wykazaliśmy również, że próbki można obserwować za pomocą SEM, co pozwala na analizę strukturalną biofilmu na poziomie nanoskali (zakres nm).

Protokół

1. Przygotowanie kultur bakterii i grzybów

1. Przygotowanie kultur grzybów
   1. Przygotuj membrany celofanowe o tej samej średnicy co szalki Petriego i gotuj je w EDTA (1 g/l w wodzie dejonizowanej) przez 30 minut. Opłucz arkusze wodą dejonizowaną i dwukrotnie sterylizuj je w autoklawie.
   2. Przygotować wstępną hodowlę grzybów, zaszczepiając grzybowe zatyczki agarowe na odpowiednim podłożu agarowym pokrytym membraną celofanową poddaną wstępnej obróbce EDTA. Inkubuj go w optymalnej temperaturze wzrostu, aby uzyskać kolonie o średnicy około 1 cm.
      1. Dla L. bicolor S238N inkubować w temperaturze 25 °C przez 5 dni na podłożu agarowym Pachlewski P5, wykonanym z 0,5 g winianu diNH4, 1 g KH₂PO4, 0,5 g MgSO 4,7H₂O, 5 g Maltozy D+, 20 g glukozy D+, 1 ml 10% tiaminy-HCl, 1 ml 1/10 rozcieńczonego roztworu mikroelementów (6 g/l siarczanu żelazawego; 0,27 g/l trioksydu molibdenu; 8,45 g/l kwasu borowego; 5 g/l siarczanu manganu; 5 g/l siarczanu miedzi; 2,27 g/l siarczanu) uzupełnionego do 1 l wodą dejonizowaną; i 20 g agaru; Odczyn pH 5,5.
   3. Ze wstępnej hodowli grzybów zaszczepić nową płytkę agarową pokrytą wstępnie obrobioną membraną celofanową EDTA zawierającą niskowęglowe podłoże agarowe, aby promować promienistą ekspansję kolonii.
      1. Aby zaszczepić szalkę Petriego, delikatnie podrap skalpelem zewnętrzny obszar (w którym komórki mają ten sam stan fizjologiczny) kolonii grzybów z kultury wstępnej i przenieś strzępki na nową płytkę agarową.
      2. Inkubować w optymalnej temperaturze wzrostu, aż nowe kolonie osiągną średnicę około 1 cm. Dla L. bicolor S238N inkubować je w temperaturze 25 °C przez 5 dni na podłożu agarowym P20 (0,25 g winianu diNH4; 0,5 g KH₂PO₄; 0,25 g MgSO_4,7H2 O; 1 g glukozy D+; 0,5 ml10% tiaminy-HCl; 0,5 ml 1/10 rozcieńczonego roztworu mikroskładników pokarmowych (por. 1.1.2.1), uzupełnić do 1 l wodą dejonizowaną; i 20 g agaru; pH 5,5).
         Uwaga: Ze względu na wstępną hodowlę na celofanie, druga kultura nie będzie zawierać pożywki agarowej w centralnych zatyczkach. Zatyczki agarowe powinny zostać usunięte w celu dalszej analizy biofilmów, ponieważ korki te wprowadzają agar i składniki odżywcze, które mogą powodować odchylenia w analizie. Ten krok dotyczy tylko gatunków grzybów, które są trzymane i rozmnażane na płytkach agarowych i nie jest konieczny w przypadku grzybów rozmnażanych z zarodników lub zamrożonych zapasów.
2. Przygotowanie kultur bakteryjnych
   1. Użyj sterylnej pętli, aby zebrać od 2 do 3 pojedynczych kolonii bakteryjnych z kultury na odpowiednim podłożu agarowym i zaszczepić 25 ml płynnej pożywki Luria-Bertani (LB) (lub innej odpowiedniej pożywki, w zależności od użytego szczepu). W przypadku P. fluorescens BBc6 inkubować kulturę przez noc w temperaturze 28 °C, delikatnie wstrząsając (~150 obr./min).
      Uwaga: Preferowane jest użycie szczepu znakowanego białkiem fluorescencyjnym, takim jak GFP, ponieważ pozwala to uniknąć wykonywania podwójnego barwienia (grzyby i bakterie) przed obserwacjami mikroskopowymi. Czas, szybkość mieszania i temperatura inkubacji zależą od użytego szczepu, a celem jest uzyskanie kultury w późnym wykładniczym wzroście.

2. Przygotowanie N in vitro biofilmu bakterii na kolonii grzybów

1. Odwirować kulturę bakteryjną przy 5 000 x g przez 3 minuty i zawiesić osad w 25 ml sterylnego 0,1 M buforu fosforanu potasu (25 g/L KH₂PO₄ i 2,78 g/L K₂HPO₄, pH 5,8). Powtórz ten krok raz i dostosuj końcowe stężenie bakterii do^10-9 komórek/ml z tym samym buforem.
2. Napełnić mikropłytkę 6-dołkową 5 ml zawiesiny bakteryjnej (lub sterylnego 0,1 M buforu fosforanu potasu do kontroli ujemnej).
3. Przetnij błonę celofanową kultury grzybów sterylną żyletką, aby uzyskać kwadraty celofanu z pojedynczą kolonią grzybów na każdej membranie. Ostrożnie usunąć celofanowe kwadraty zawierające strzępki ze stałego podłoża za pomocą kleszczy i przenieść kwadrat celofanu zawierającego strzępki do studzienki mikropłytki zawierającej zawiesinę bakteryjną.
4. Delikatnie potrząśnij mikropłytką, gdy kolonie grzybów są nadal przyczepione do celofanu; następnie usuń arkusze celofanu, pozostawiając kolonie grzybów na płytce.
5. Inkubować mikropłytkę z delikatnym mieszaniem (~60 obr./min) w temperaturze dostosowanej do badanych mikroorganizmów.
   Uwaga: Czas inkubacji zależy od szybkości tworzenia się biofilmu i etapu, który ma być analizowany. W przypadku P. fluorescens BBc6/L. bicolor inkubować w temperaturze 20 °C przez 30 minut, aby uzyskać biofilmy we wczesnym stadium i do 16 godzin, aby uzyskać dojrzałe biofilmy.

3. Laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna Analiza powstawania biofilmu

1. Przygotowanie próbki
   1. W celu usunięcia bakterii planktonowych i bakterii przyczepionych elektrostatycznie do strzępek, należy opłukać grzyba, przenosząc go na nową 6-dołkową mikropłytkę wypełnioną 5 ml mocnego roztworu soli (NaCl, 17 g/l) ¹⁷ ; delikatnie wstrząsać przez 1 minutę.
   2. Przenieść grzyba na nową 6-dołkową mikropłytkę zawierającą 5 ml sterylnego 0,1 M buforu fosforanu potasu, delikatnie wstrząsnąć przez 2 minuty i przenieść grzyb do świeżego buforu fosforanu potasu.
   3. Wytnij część kolonii grzybów, która ma być zobrazowana, za pomocą skalpela, trzymając ją w buforze fosforanu potasu, tak aby uzyskany fragment zawierał około połowy kolonii grzybów.
   4. Aby zabarwić próbkę, należy przenieść ją na szalkę Petriego wypełnioną sterylną wodą zawierającą odpowiedni barwnik fluorescencyjny (w zależności od celu analizy) i inkubować ją w ciemności.
      1. Aby zobrazować sieć grzybów, użyj na przykład czerwieni kongijskiej (0,1% stężenie końcowe, 5 minut inkubacji), lektyny agglutyny z kiełków pszenicy (WGA) sprzężonej z Alexa Fluor 633 (stężenie końcowe 10 μg/ml, 10 min inkubacji) lub FUN1 (stężenie końcowe 10 μM, 10 min inkubacji).
      2. Jeśli używasz bakterii nieznakowanej fluorescencyjnie, przeciwdziałaj barwieniu komórek bakteryjnych za pomocą sondy fluorescencyjnej specyficznej dla DNA, spośród licznych dostępnych na rynku barwników DNA przenikających komórki. Na przykład użyj DAPI (stężenie końcowe 0,25 μg/ml, 10 minut inkubacji).
      3. Aby zobrazować białka macierzy, użyj białka stain²¹.
   5. Po barwieniu przepłukać próbkę, przenosząc ją do pokrywki szalki Petriego zawierającej 10 ml sterylnego 0,1 M fosforanu potasu i delikatnie wstrząsać przez 1 minutę.
   6. Zanurz szkiełko do połowy w pokrywie szalki Petriego i delikatnie doprowadź wyciętą sekcję do unoszenia się nad szkiełkiem. Następnie powoli wyjmij szkiełko z roztworu buforowego, pozwalając, aby próbka delikatnie osiadła na szkiełku.
      Uwaga: Na tym etapie bardzo ważne jest, aby postępować delikatnie, aby uniknąć zakłócenia biofilmu.
   7. Na koniec dodać do próbki 10 μl antyblakującego podłoża montażowego i przykryć je szklanym szkiełkiem nakrywkowym.
      Uwaga: Po przygotowaniu szkiełka należy przeprowadzić analizę mikroskopową tak szybko, jak to możliwe (nie dłużej niż 30 minut), aby uniknąć modyfikacji struktury biofilmu.
2. Konfokalna analiza mikroskopowa
   1. Zbadaj szkiełka pod konfokalnym mikroskopem laserowym z soczewką obiektywową 10X lub 40X sprzężoną z oprogramowaniem do obrazowania.
      Uwaga: W tym przypadku zastosowano wielowiązkowy skaningowy mikroskop konfokalny wyposażony w lasery wzbudzające 405, 488 i 561 nm, detektor GaAsp PMT oraz obiektywy 10X 0,3 NA i 40X 1,2 NA.
      1. Obrazowanie należy wykonywać przy użyciu parametrów dostosowanych do rodzaju żądanych danych i ograniczeń czasowych. Używaj długości fal wzbudzenia/emisji lasera zgodnie z zastosowaną plamą i zaleceniami producenta. Użyj kombinacji funkcji skanowania kafelków i Z-stack, aby uzyskać globalne widoki 3D kolonii grzybów i biofilmów.
         Uwaga: Obrazy na rysunku 3 zostały uzyskane przy użyciu następujących parametrów: 8 bitów/piksel, uśrednianie = 2, zatrzymanie piksela = 1,58 μs, skanowanie kafelków obrazów 5x5 ze złączaniem online (pokrycie 10%, próg = 0,7); Krok Z = 2 μm.
   2. Do wizualizacji danych 3D użyj jednego z wielu darmowych lub komercyjnych programów (oferują one wiele opcji renderowania 3D).
      1. Na przykład, aby wyświetlić dane stosu Z jako projekcje maksymalnej intensywności 2D, odejmij kanał jasnego pola, dostosuj jasność i kontrast oraz scal kanały w celu utworzenia obrazu kompozytowego. Jeśli są obecne, wyeliminuj plasterki bez sygnału na końcach stosu Z. Następnie wykonaj projekcję 2D o maksymalnej intensywności i przekonwertuj wynik na kolor RGB. Użyj funkcji "Z project" w oprogramowaniu ImageJ²², aby uzyskać prezentowane tutaj obrazy za pomocą projekcji 2D o maksymalnej intensywności.

4. Analiza mikroskopii elektronowej

1. Przygotować próbki zgodnie z opisem dla LSCM, z wyjątkiem etapu 3.1.2, po etapach płukania przenieść biofilmy do sterylnej wody zamiast buforu fosforanu potasu. Pozwala to uniknąć tworzenia się kryształów soli na etapie odwadniania, co zakłóciłoby obrazowanie SEM.
2. Przenieść biofilmy do uchwytu na próbkę i usunąć nadmiar wody; pozwolić, aby próbka pokryła się tylko niewielką ilością wody.
3. Przenieść próbkę do komory skaningowego mikroskopu elektronowego o zmiennym ciśnieniu (VP-SEM); zamrozić ją do temperatury -50 °C na stopniu chłodzącym Peltiera; i pozostawić do powolnego liofilizacji, bezpośrednio w komorze SEM, przy zmiennym ciśnieniu 100 Pa ustawionym na 15 godzin.
4. Po zakończeniu liofilizacji pobrać próbkę i przenieść ją do systemu osadzania folii w wysokiej próżni. Pokryj próbkę platyną o długości 2 nm (pomiar kwarcu) pod plazmą argonową (2,5 x ^10-2 mbar, 35 mA).
5. Obserwować pokrytą próbkę za pomocą SEM wyposażonego w pistolet do emisji polowej (FEG) przy użyciu detektora "w soczewce" o wysokiej rozdzielczości i elektronicznego wysokiego napięcia 1 kV.

Wyniki

Ogólna schematyczna procedura hodowli grzybów i przygotowania biofilmu jest podana na rysunku 1. Metoda hodowli pozwoliła nam uzyskać kolonie grzybów o grubości od 20 do 50 μm zawierające kilka warstw strzępek, co pozwoliło na analizę w mikro- i mezoskali uwodnionego żywego biofilmu przy użyciu LSCM. Zastosowanie metody pozwoliło na uzyskanie wysokiej jakości obrazów biofilmów BBc6 P. fluorescens na strzępkach L. bicolor wzdłuż tworzenia biofilmu (ryc. 2-4).

Analiza biofilmów w skali mezologicznej wykazała heterogeniczny rozkład biofilmu P. fluorescens BBc6 na strzępkach L. bicolor S238N (Rysunki 2 i 3). Analiza w skali mezoskali pozwoliła również na śledzenie tworzenia się biofilmu w czasie (ryc. 3) od wczesnych etapów, w których tylko niektóre bakterie były przyłączone do strzępek (ryc. 3a), do powstania grubego, dojrzałego biofilmu (ryc. 3b). Wysoka rozdzielczość obrazów w mezoskali pozwoliła nam na przeprowadzenie analizy w skali mikro na tych samych obrazach w celu uzyskania architektur kolonii (Rysunek 3c-d).

Analiza w mikroskali w połączeniu ze specyficznym oznakowaniem pozwoliła nam pójść o krok dalej w charakterystyce biofilmu. W tym przypadku do próbek zastosowano SYPRO Ruby²³, który oznacza większość klas białek (Rysunek 4) i pokazuje obecność białek w macierzy.

Na koniec, dalsze szczegóły struktury biofilmu uzyskano za pomocą obrazowania SEM tej samej próbki po odwodnieniu i pokryciu (Rysunek 5). Obrazowanie SEM zapewniło dostęp do poziomu nanoskali, dając tym samym dostęp do struktury matrycy.

Rycina 1: Ogólna schematyczna procedura hodowli grzybów i przygotowania biofilmu. Na rysunku przedstawiono główne etapy metody, od hodowli mikroorganizmów po analizę próbek. Więcej szczegółów znajduje się w protokole. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Repartycja biofilmu BBc6 w kolonii grzybów. Próbka została zobrazowana po 18 godzinach interakcji w 10-krotnym powiększeniu. Obraz uzyskano za pomocą projekcji 2D maksymalnej intensywności obrazów mikroskopii konfokalnej 3D. Szara siatka na rysunku przedstawia pozycje mozaiki. Strzępki L. bicolor są zabarwione kolorem Congo Red (czerwonym), a bakterie są oznaczone GFP (zielony). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Wczesne i późne etapy tworzenia biofilmu BBc6 na strzępkach L. bicolor. Obraz ten uzyskano poprzez projekcję 2D maksymalnej intensywności obrazów z mikroskopii konfokalnej 3D. Obrazowanie wykonywano w powiększeniu 40x. (a) Podział biofilmów po 2 godzinach interakcji. (b) Podział biofilmu po 14 godzinach interakcji. (c) Powiększenie białego prostokąta w (a). (d) Powiększenie białego prostokąta w (b). Strzępki grzybów są zabarwione kolorem Kongo czerwonym (czerwonym), a bakterie są oznaczone GFP (zielony). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 4: Barwienie matrycy biofilmu BBc6 na strzępkach L. bicolor. a) Biofilmy po 16 godzinach interakcji. (b) Powiększenie białego prostokąta w (a). Obrazowanie wykonano w 40-krotnym powiększeniu, a obrazy te uzyskano poprzez projekcję 2D maksymalnej intensywności obrazów mikroskopii konfokalnej 3D. Bakterie są oznaczone GFP (kolor zielony), grzyb jest barwiony Fun1 (ciemnozielony), a białka są barwione S. Ruby (czerwony). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Obrazowanie SEM biofilmów BBc6 na strzępkach L. bicolor. Obrazowanie SEM wykonano przy 2360X, EHT: 1kV. Przed obrazowaniem próbka była powoli liofilizowana w komorze SEM i pokrywana platyną. Zielone strzałki wskazują na biofilmy bakteryjne, a żółte strzałki wskazują na strzępki grzybów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Biofilmy bakteryjne są pozyskiwane w wielu środowiskach i są badane od lat pięćdziesiątych XX wieku, co doprowadziło do opracowania szeregu metod ich analizy²⁴. Klasyczne metody ilościowego oznaczania i monitorowania biofilmów obejmują testy mikromiana oraz, najpowszechniej stosowaną metodę, barwienie fioletem krystalicznym (CV). Metody te są szybkie, tanie i łatwe w obsłudze²⁵ i są szczególnie przydatne do ilościowego oznaczania całkowitej biomasy biofilmu lub do przeprowadzania testów żywotności i kwantyfikacji matrycy. Z drugiej strony, metody "omiczne" są również przydatne w badaniach biofilmu, pozwalając na ilościowe i funkcjonalne analizy biofilmów^26,27. Pomimo zalet mikropłytki i metod "omicznych", kilku istotnych cech biofilmów nie można uchwycić za pomocą tych technik, co utrudnia pełne zrozumienie tego procesu. Cechy te obejmują struktury macierzy, architekturę kolonii bakteryjnych, interakcje komórka/komórka i wzorce kolonizacji, które są kluczowymi danymi dla zrozumienia zarówno funkcjonowania biofilmów, jak i dynamiki ich powstawania. Pomimo zdolności mikroskopii do uchwycenia tych cech, analiza mikroskopowa biofilmów bakteryjnych na grzybach strzępkowych jest nadal rzadka. Wynika to głównie ze wzrostu grzybów strzępkowych, które często tworzą kolonie grubych, złożonych, trójwymiarowych sieci. Tworzenie biofilmów bakteryjnych na grzybach jest powszechne w różnych środowiskach i jest znacząco zaangażowane w różne dziedziny⁴ (np. medycynę, rolnictwo i środowisko); W związku z tym tak ważne jest opracowanie nowych metod, które ułatwią ich badanie. W tym celu połączyliśmy metodę generowania bardzo cienkich kolonii grzybów z obrazowaniem mikroskopowym biofilmów bakteryjnych. Ponadto zaproponowaliśmy zestaw narzędzi mikroskopowych do jakościowej analizy tych biofilmów. Sukces tej metody opiera się na zdolności do wytwarzania bardzo cienkich kolonii strzępek i stosowania odpowiednich barwników. Te punkty zostały omówione poniżej.

Ze względu na złożoną strukturę biofilmów, zrozumienie ich funkcji wymaga podejścia wieloskalowego^28,29. Wzorce rozmieszczenia biofilmów, architektura kolonii bakteryjnych oraz struktura i skład matrycy są analizowane w różnych skalach (tj. w skali mezologicznej i mikro). Co więcej, rozdzielczość w nanoskali umożliwia dostęp do fizycznych interakcji komórka/komórka i nanostruktury matrycy. Tym samym opracowana metoda z łatwością umożliwia wieloskalową analizę biofilmów bakteryjnych powstających na kolonii grzybów.

W większości badań analizy LSCM biofilmów są ograniczone do mikroskali, przy czym mezoskala jest zwykle wykonywana za pomocą optycznej koherentnej tomografii 30,31,32. Przedstawiona metoda umożliwia prowadzenie analiz zarówno w skali mikro, jak i mezoskalowej za pomocą LSCM. Pokazuje to użyteczność łączenia obu analiz w tym samym obszarze próbki, a nawet na tym samym obrazie przy użyciu mikroskopów konfokalnych nowej generacji o wysokiej rozdzielczości (ryc. 3). W ten sposób unika się tutaj problemów związanych ze skompilowanymi danymi zebranymi w różnych skalach za pomocą różnych metod.

Ta kombinacja analiz dała jednocześnie dostęp do repartycji biofilmu w kolonii grzybów, architektury kolonii bakteryjnej wzdłuż rozwijającego się biofilmu oraz struktury macierzy. Analiza w skali mezoskali wykazała heterogeniczny rozkład biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów (ryc. 2 i 3). Obserwacja ta nie byłaby możliwa przy użyciu protokołów, które pozwalają na obrazowanie tylko niewielkiej części kolonii grzybów, która niekoniecznie jest reprezentatywna dla całej kolonii. Tak więc, choć często zaniedbywana, analiza w skali mezoskalowej może dostarczyć cennych informacji na temat wzorców dystrybucji biofilmu.

Wreszcie, opracowana metoda może być wykorzystana do analizy próbek za pomocą różnych technik mikroskopowych, w tym skaningowej mikroskopii elektronowej. W tym przypadku SEM został wykorzystany do osiągnięcia skali nano i uzyskania bakteryjnej organizacji przestrzennej w biofilmie. Bardzo dobrze radził sobie z cienkimi koloniami grzybów, podczas gdy SEM pozwalał tylko na obrazowanie powierzchni. W przeciwieństwie do LSCM, SEM wymagał jednak odwodnienia próbki i najczęściej pokrycia metalem przewodzącym. Ten proces odwadniania może zmieniać struktury biologiczne, gdy nie jest prawidłowo przeprowadzany i może wymagać optymalizacji. W tym przypadku zastosowano odwadnianie próbki za pomocą powolnej liofilizacji³³. Niemniej jednak zastosowanie zarówno LSCM, jak i SEM do próbek pozwoli na wykonanie mikroskopii korelacyjnej w tym samym miejscu próbki.

Pomimo opisanych powyżej zalet istnieją pewne ograniczenia. Po pierwsze, może nie mieć zastosowania do wszystkich rodzajów grzybów. Rzeczywiście, ta metoda hodowli została opracowana dla grzybów rozprzestrzeniających się promieniście na powierzchni pożywek stałych. Metoda ta może nie być odpowiednia dla grzybów tworzących głównie strzępki powietrzne (np. Fusarium sp.) lub dla grzybów mikrotlenowych rozprzestrzeniających się głównie wewnątrz agaru. Problematyczne mogą być również grzyby rozkładające celofan (np. Trichoderma sp.). Po drugie, ważne jest, aby pamiętać, że strategia barwienia jest punktem krytycznym, a wybór plamy musi być dokonany ostrożnie, ponieważ plama nie może naruszać biofilmu. Na przykład zauważyliśmy, że Calcofluor White spowodował częściowe przerwanie biofilmu (dane nie pokazane), prawdopodobnie z powodu wysokiego pH tej plamy. Ponadto niektóre barwniki powodowały heterogeniczne barwienie (np. Czerwień Kongo), podczas gdy inne powodowały jednorodne barwienie (np. barwienie ścian komórkowych lektyną WGA), co dawało niejednorodną jakość obrazu. Ponadto ważne jest, aby mieć świadomość, że niektóre barwniki mogą nie być w pełni specyficzne. Na przykład WGA barwi nie tylko ściany komórkowe grzybów, ale także kwas N-acetyloneuraminowy w ścianach komórkowych bakterii Gram-dodatnich i adhezynach wytwarzanych przez bakterie Gram-dodatnie i -ujemne podczas tworzenia biofilmu^34,35. Dlatego zaleca się stosowanie fluorescencyjnych bakterii i/lub grzybów znakowanych białkami, aby uniknąć wielokrotnego barwienia. Jeśli stosuje się wiele barwników, nie mogą one zakłócać chemicznie, a ich widma emisyjne nie powinny się na siebie nakładać.

Analizy w skali mezoskalowej wymagają dużego skanowanego obszaru, a zatem LSCM może być czasochłonne (od 40 minut do 1 godziny, w zależności od grubości próbki) i utrudniać analizę dużej liczby próbek. Niemniej jednak można dokonać korekt w zależności od rodzaju wymaganych danych. Możliwe jest skrócenie czasu akwizycji i rozmiaru obrazu poprzez zmianę jakości obrazu. Na przykład wysoka rozdzielczość nie jest konieczna do analizy ogólnego podziału biofilmu.

Wreszcie, przy wyborze wyświetlania danych stosu Z jako projekcji 2D lub 3D należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia. Projekcje dwuwymiarowe są dobrym sposobem podsumowywania danych, ale informacje o głębi są tracone, a nakładające się na siebie struktury stają się ukryte. Z drugiej strony, rzuty 3D pozwalają na wizualizację z różnych punktów widzenia, ale często słabo renderują się w przypadku złożoności przestrzennej.

Podsumowując, przedstawiliśmy metodę charakterystyki biofilmów bakteryjnych na strzępkach na poziomie strukturalnym. Metodologia może być rozszerzona na inne zastosowania. Rzeczywiście, metoda ta pozwala na wykonanie funkcjonalnej lub chemicznej charakterystyki biofilmów bakteryjnych tworzących się na strzępkach grzybów. Ze względu na dużą różnorodność istniejących fluorescencyjnych systemów reporterowych, analiza LSCM może być wykorzystywana do wielu celów²⁹. Na przykład mikroskopia fluorescencyjna może być wykorzystana do monitorowania gradientu pH³⁶ lub dyfuzji cząsteczek w biofilmach³⁷. Dodatkowo metoda pozwala na analizę zbiorowisk w biofilmach wielogatunkowych. Na przykład fluorescencyjna hybrydyzacja in situ ukierunkowana na określone grupy bakterii jest szczególnie przydatna do badania specyficznego podziału bakteryjnego w wielogatunkowych biofilmach^38,39. Wreszcie, liczne barwniki fluorescencyjne mogą być użyte do scharakteryzowania składu matrycy biofilmów²¹. W tym przypadku białka były celowane za pomocą Sypro, który barwi szeroki zakres białek, w tym białka macierzy (ryc. 4), ale inne barwniki pozwalają na wizualizację innych ważnych składników macierzy, takich jak egzopolisacharydy lub zewnątrzkomórkowe DNA. Co ciekawe, wszystkie te analizy można było wykonać w skali mezologicznej przy użyciu opisanej metody. Ponieważ LSCM można wykonać na żywych próbkach, możliwe jest również uzyskanie obrazowania poklatkowego przy użyciu, na przykład, komór pokrywowych, szczególnie przydatnych w przypadku cienkich kolonii grzybów. Ta opcja jest szczególnie interesująca, ponieważ tworzenie biofilmu jest złożonym, dynamicznym procesem. Wreszcie, do celów ilościowych, zgłoszona metoda może poprawić dokładność automatycznej analizy ilościowej, umożliwiając tę kwantyfikację na obrazach w skali mezo. Może to przezwyciężyć niejednorodność biofilmu i problemy statystyczne²⁹.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych Falcon	Fisher Scientific	08-772-33	Używany w 2.2 i 3.1
Kongo Red	Fisher Scientific	C580-25	Używany w 3.1.4.1
FUN 1 Barwnik komórkowy	Thermo Fisher Scientific	F7030	Stosowany w 3.1.4.1
Aglutynina z kiełków pszenicy, Alexa Fluor 633 Sprzężony	Thermo Fisher Scientific	W21404	Stosowany w 3.1.4.1
Roztwór DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	Stosowany w 3.1.4.2
Jodek propidyny	Thermo Fisher Scientific	P3566	Stosowany w 3.1.4.3
FilmTracer SYPRO Ruby Biofilm Matrix białko Stain	Thermo Fisher Scientific	F10318	Stosowany w 3.1.4.4
Fluoromount-G Medium do montażu ślizgowego	Fisher Scientific	OB100-01	Używany w 3.1.7
LSM780 Axio Observer Z1	Zeiss		Używany w oprogramowaniu 3.2.1
ZEN 2.1 lite black	Zeiss		zastosowany w
powlekarce wysokopróżniowej 3.2.1 Leica EM ACE600	Leica		użyta w 4
GeminiSEM-FEG	Zeiss		użyta w 4