Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowa mikroskopia superrozdzielcza włókien F-aktyny za pomocą interferometrycznej mikroskopii lokalizacji aktywowanej światłem (iPALM)

DOI:

10.3791/54774

⸱

1 grudnia 2016

 , 
1Department of Biology, South University of Science and Technology of China, Shenzhen, 2Mechanobiology Institute, Singapore, 3Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół zastosowania interferometrycznej mikroskopii lokalizacji fotoaktywowanej (iPALM), 3-wymiarowej metody mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek w super rozdzielczości, do obrazowania cytoszkieletu aktynowego w przylegających komórkach ssaków. Takie podejście umożliwia opartą na świetle wizualizację cech strukturalnych w nanoskali, które w przeciwnym razie pozostałyby nierozwiązane przez konwencjonalną mikroskopię optyczną z ograniczoną dyfrakcją.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia fluorescencyjna umożliwia bezpośrednią wizualizację określonych biomolekuł w komórkach. Jednak w przypadku konwencjonalnej mikroskopii fluorescencyjnej rozdzielczość przestrzenna jest ograniczona przez dyfrakcję do ~ 200 nm w płaszczyźnie obrazu i > 500 nm wzdłuż osi optycznej. W rezultacie, mikroskopia fluorescencyjna przez długi czas była poważnie ograniczona w obserwacji cech ultrastrukturalnych w komórkach. Niedawny rozwój metod mikroskopii superrozdzielczej przezwyciężył to ograniczenie. W szczególności pojawienie się fotoprzełączalnych fluoroforów umożliwia mikroskopię superrozdzielczą opartą na lokalizacji, która zapewnia moc rozdzielczą zbliżającą się do skali długości molekularnej. W tym miejscu opisano zastosowanie metody trójwymiarowej mikroskopii superrozdzielczej opartej na mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek i interferometrii wielofazowej, zwanej interferometryczną mikroskopią lokalizacji aktywowanej światłem (iPALM). Metoda ta zapewnia rozdzielczość niemal izotropową rzędu 20 nm we wszystkich trzech wymiarach. Protokoły wizualizacji nitkowatego cytoszkieletu aktynowego, w tym przygotowanie próbki i działanie instrumentu iPALM, są opisane tutaj. Protokoły te są również łatwe do dostosowania i pouczające w badaniu innych cech ultrastrukturalnych w komórkach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wizualizacja złożonych struktur komórkowych od dawna stanowi integralną część biologicznych spostrzeżeń i odkryć. Chociaż mikroskopia fluorescencyjna może obrazować komórki o wysokiej specyficzności molekularnej, jej zdolność rozdzielcza jest ograniczona przez dyfrakcję do ~ 200 nm w płaszczyźnie obrazu (x,y lub wymiar boczny) i > 500 nm wzdłuż osi optycznej (z lub wymiar osiowy)1,2. W związku z tym obserwacja cech ultrastrukturalnych historycznie ograniczała się do mikroskopii elektronowej (EM). Na szczęście niedawny rozwój mikroskopii superrozdzielczej pozwolił obejść tę granicę, umożliwiając rozdzielczość przestrzenną w zakresie 10 - 100 nm1-6. W szczególności podejścia super rozdzielczości oparte na lokalizacji pojedynczej cząsteczki, znane pod akronimami takimi jak PALM (PhotoActivated Localization Microscopy)4, FPALM (Fluorescence PhotoActivated Localization Microscopy)5 (d)STORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)6,7, PAINT (Point Accumulation for Imaging Nanoscale Topography)8, GSDIM (Ground State Depletion Microscopy, a następnie indywidualny powrót molekularny)9lub SMACM (Single-Molecule Active-Control Microscopy)10, a także ich trójwymiarowe (3D) implementacje, takie jak interferometryczna PALM (iPALM)11 lub 3D-STORM12, były cenne w ujawnianiu nowych informacji na temat organizacji wielu struktur biologicznych w nanoskali, w tym aksonów i synaps neuronalnych13, zrostów ogniskowych14,15, połączeń komórka-komórka16, porów jądrowych17 i centrosomów18-20, żeby wymienić tylko kilka.

Kolejną ultrastrukturalną cechą komórek, dla której potencjalnie przydatna jest mikroskopia superrozdzielcza, jest cytoszkielet aktynowy. Złożona siatka nitkowatej (f)-aktyny w korze komórkowej odgrywa zasadniczą rolę w kontroli kształtu komórki i właściwości mechanicznych21. Organizacja f-aktyny jest aktywnie i dynamicznie regulowana przez liczne białka regulatorowe, które silnie wpływają na polimeryzację, sieciowanie, obrót, stabilność i topologię sieci22. Jednakże, chociaż charakterystyka architektury siatki f-aktyny jest ważna dla mechanistycznego wglądu w różnorodny zakres procesów komórkowych, mały rozmiar (~ 8 nm) włókien f-aktyny utrudnia ich obserwację za pomocą konwencjonalnej mikroskopii świetlnej ograniczonej dyfrakcją; w związku z tym wizualizacja subtelnej struktury aktyny była dotychczas wykonywana wyłącznie przez EM. W tym miejscu opisujemy protokoły wizualizacji cytoszkieletu f-aktyny w przylegających komórkach ssaków, wykorzystując technikę mikroskopii super rozdzielczej iPALM, aby wykorzystać jej bardzo wysoką precyzję w 3D11,23. Chociaż instrument iPALM jest wysoce specjalistyczny, instrukcja konfiguracji takiego instrumentu została opisananiedawno23, podczas gdy dostęp do mikroskopu iPALM znajdującego się w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa został również udostępniony społeczności naukowej przy minimalnych kosztach. Ponadto opisane w niniejszym dokumencie metody przygotowania próbek mają bezpośrednie zastosowanie do alternatywnych podejść do super rozdzielczości 3D, takich jak te oparte na astygmatycznym rozogniskowaniu funkcji rozproszenia punktowego (PSF)12 lub detekcji dwupłaszczyznowej24, które są szerzej dostępne.

Zauważamy, że niezbędnym składnikiem do mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji pojedynczych cząsteczek jest fotoprzełączalny fluorofor25, który pozwala spełnić trzy krytyczne wymagania dla mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji pojedynczej cząsteczki: i) wysoka jasność i kontrast pojedynczej cząsteczki w stosunku do sygnałów tła; ii) rzadki rozkład pojedynczych cząsteczek w danym kadrze obrazu; oraz (iii) wysoka gęstość przestrzenna etykietowania wystarczająca do uchwycenia profilu podstawowej struktury (znana również jako kryterium doboru próby Nyquista-Shannona)26. W związku z tym, aby uzyskać zadowalające wyniki, należy położyć równy nacisk zarówno na właściwe przygotowanie próbek w celu optymalizacji fotoprzełączania fluoroforów i zachowanie leżącej u ich podstaw ultrastruktury, jak i na aspekty instrumentacji i akwizycji eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki do obrazowania

  1. Ponieważ sygnały fluorescencji tła zakłócają fluorescencję z etykiet fluoroforowych, należy wyczyścić szkła nakrywkowe, najpierw płucząc je w wodzie dejonizowanej (ddH2O), a następnie susząc je na powietrzu za pomocą sprężonego powietrza. Następnie wytrawianie plazmowe w myjce plazmowej przez 15 sekund lub dłużej, jeśli to konieczne.
  2. Aby umożliwić korekcję dryftu i kalibrację iPALM, użyj okrągłych (o średnicy 22 mm) okrągłych (o średnicy 22 mm) wstępnie oczyszczonych szkieł nakrywkowych osadzonych w fluorescencyjnych nanocząstkach jako znaczników odniesienia, które służą jako wysoce fotostabilne referencje dla niezawodnej kalibracji i korekcji dryfu. Ze względu na długi czas akwizycji wymagany do zgromadzenia wystarczającej gęstości fluoroforu (> 15 - 30 minut), dryft próbki jest nieunikniony.
  3. Umieść każde fiducialowane szkło nakrywkowe na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. Sterylizuj je promieniowaniem ultrafioletowym (UV) w okapie z przepływem laminarnym przez 15 minut.
  4. W sterylnym kapturze z przepływem laminarnym przygotować roztwór fibronektyny do pokrycia szkłem nakrywkowym, rozcieńczając 1 mg/ml roztworu podstawowego fibronektyny w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco do końcowego stężenia 2 - 10 μg/ml. Przepłukać każdą szklankę nakrywkową trzykrotnie DPBS i inkubować z 2 ml roztworu fibronektyny przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie odessać roztwór fibronektyny i spłukać raz DPBS.
  5. Krótko przepłukać komórki za pomocą DPBS. Inkubować z 1-2 ml trypsyny przez kilka minut w temperaturze 37 °C, aż komórki się oderwą i schłodzić ~ 10 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych zawierającej surowicę. Na przykład w przypadku ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) należy użyć pożywki do hodowli śródbłonka dużych naczyń wypełnionych czynnikami śródbłonka dużych naczyń oraz penicyliną lub streptomycyną.
    1. Ponownie umieść komórki na szkle pokrytym fibronektyną (w przypadku rzadkiej gęstości płytka < 50 000 komórek na szkło nakrywkowe) i utrzymuj hodowlę w inkubatorze ustawionym na 95% wilgotności, 5% CO2 i 37 °C.
  6. W celu prawidłowego zachowania drobnych struktur cytoszkieletu f-aktyny należy stosować roztwory buforowe na bazie odczynników buforowychGooda 27.
    1. Na przykład, przygotować bufor PHEM jako 2x roztwór podstawowy (120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA, 4 mM MgCl2, pH 7,0 z KOH) przez rozpuszczenie 6,5 g HEPES, 3,8 g EGTA i 190 mg MgCl2 w ~ 300 ml ddH2O, z pH dostosowanym do 7,0 przez kroplowe dodawanie stężonego roztworu KOH; następnie, dodać ddH2O, aby doprowadzić objętość do 500 ml. Wysterylizuj bufor za pomocą filtra 0,22 μm, przechowuj go w temperaturze 4 °C i rozcieńcz w stosunku 1:1 z ddH2O przed użyciem.
  7. Aby uzyskać najlepsze wyniki przy znakowaniu f-aktyny o dużej gęstości, należy użyć falloidyny sprzężonej z organicznymi fluoroforami, takimi jak Alexa Fluor 647. W żądanym punkcie czasowym po ponownym poszczepieniu komórek utrwal komórki w następujący sposób:
    1. Odessać pożywkę z każdej studzienki zawierającej próbkę komórkową. Delikatnie, ale szybko dozować 2 ml ciepłych (37 °C) utrwalaczy ekstrakcyjnych zawierających 0,25% aldehydu glutarowego w buforze PHEM z 0,25% Triton X-100. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 - 2 minuty. Do kolejnych etapów należy użyć 2 ml buforu utrwalającego lub hartującego na szkło nakrywkowe, chyba że wskazano inaczej.
    2. Zastąp utrwalacz ekstrakcyjny 2,5% utrwalaczem aldehydu glutarowego w buforze PHEM i pozwól próbkom inkubować przez 10 - 12 minut. Ten i kolejne kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej.
    3. Odessać utrwalacze i delikatnie zastąpić je buforem PHEM. Przechyl i delikatnie zamieszaj, a następnie ponownie umyj PHEM. Powtórz dwa razy.
    4. Aby wygasić autofluorescencję z aldehydu glutarowego, który może przytłoczyć sygnały z pożądanych fluoroforów, należy inkubować próbki ze świeżo przygotowanym buforem hartowniczym zawierającym NaBH4 o stężeniu masowym 0,1% w PHEM. Obserwowane będą obfite bąbelki. Od czasu do czasu delikatnie postukaj w naczynie na próbkę, aby usunąć pęcherzyki. Pozwól mu inkubować przez 5 - 10 minut.
    5. Odessać bufor hartowniczy i delikatnie zastąpić go buforem PHEM. Spłucz kilka razy, aby usunąć bąbelki. Odpipetować pipetą 2 ml buforu PHEM i pozostawić do inkubacji w ciemności przez 5 minut. Powtórz dwa razy i pozwól próbce spocząć w buforze PHEM po zakończeniu.
    6. Przygotuj komorę wilgotnościową do inkubacji falloidyny za pomocą dużej plastikowej szalki Petriego wyściełanej kawałkiem ręcznika papierowego obficie zwilżonego 5 - 10 ml ddH2O. Umieść duży arkusz czystego Parafilmu na mokrym ręczniku papierowym.
    7. Ze względu na stosunkowo wysoki koszt znakowanej falloidyny, do każdego etykietowania należy użyć niewielkiej objętości. W przypadku etykietowania o wysokiej gęstości zacznij od stężenia 0,3 μM. Przygotuj ~ 60 μl na szkło nakrywkowe za pomocą falloidyny-Alexa Fluor 647 w buforze PHEM.
    8. Odpipetować 55 - 60 μl roztworu falloidyny na arkusz Parafilm w komorze wilgotnościowej. Za pomocą cienkich kleszczyków delikatnie usuń szklaną nakrywkę próbki. Uważaj, aby zwrócić uwagę na właściwą twarz zawierającą komórkę.
    9. Szybko i delikatnie stuknąć nadmiar buforu, dotykając krawędzi szkła nakrywkowego złożonym kawałkiem delikatnego papieru chłonnego, a następnie umieścić stronę z komórką szkła nakrywkowego skierowaną w dół na kroplę roztworu falloidyny na Parafilm. Upewnij się, że nie ma pęcherzyków uwięzionych przez szkło nakrywkowe.
    10. Umieść pokrywę na komorze wilgotnościowej. Owinąć komorę folią aluminiową w celu ochrony przed światłem otoczenia i pozostawić próbkę do inkubacji przez noc w temperaturze 4 °C. Próbka może być przechowywana w tym stanie przez kilka dni. Upewnij się, że komora wilgotnościowa pozostaje wilgotna, jeśli planowane jest długie przechowywanie.
  8. Przed obrazowaniem delikatnie umieścić szklaną stronę z komórką do góry na nowej 6-dołkowej płytce zawierającej 2 ml buforu PHEM na dołek.
  9. Przygotować obrazujące na bazie tiolu z pochłonięciem tlenu, używając następujących roztworów podstawowych: 1 M glukozy, 1 M cysteaminy i 100 razy mieszaniny oksydazy glukozowej / enzymu katalazy (4 mg katalazy i 10 mg oksydazy glukozowej w 100 μl buforu PHEM, dobrze wymieszane przez wirowanie)28. Bezpośrednio przed obrazowaniem wymieszaj 75 μl 1 M roztworu glukozy, 30 μl 1 M roztworu cysteaminy i 3 μl 100x mieszaniny enzymów podstawowych. Dostosować objętość do 300 μl za pomocą buforu PHEM i użyć natychmiast po wymieszaniu do zamontowania próbki.
  10. W przypadku iPALM przygotuj próbkę obrazowania przy użyciu wstępnie oczyszczonego szkła nakrywkowego #1.5 (średnica 22 mm).
    1. Alternatywnie użyj szklanego szkiełka (3" x 1") z dwustronną samoprzylepną przekładką, aby pomóc w montażu, jeśli zamiast tego ma być używany 3D-STORM12 oparty na astygmatyzmie.
    2. Aby zebrać próbkę do obrazowania, użyj cienkich kleszczyków, aby delikatnie usunąć szklaną pokrywę próbki z dołka buforowego. Następnie szybko i delikatnie stuknij nadmiar bufora, dotykając krawędzi szkła nakrywkowego złożonym papierem chłonnym.
    3. Umieść szklaną stronę z komorą skierowaną do góry na kawałku czystego papieru do soczewek. Przepłukać próbkę, umieszczając na niej 30–50 μl buforu do obrazowania, a następnie usunąć nadmiar buforu, przechylając i stukając złożonym papierem chłonnym.
    4. Powtórzyć etap płukania kilka razy, a następnie umieścić 30 - 50 μl buforu do obrazowania na próbce. Osusz krawędź szkła nakrywkowego i umieść wiele bardzo małych kropek szybkoutwardzalnej żywicy epoksydowej na wysuszonym obszarze.
    5. Powoli opuść kolejną wstępnie oczyszczoną szklankę nakrywkową #1.5 (zwykłą, okrągłą szklaną pokrywę o średnicy 18 mm) na środek szklanej pokrywy zawierającej ogniwo o średnicy 22 mm. Pozwól, aby bufor obrazowania zwilżył obie nakrywki przez działanie kapilarne. Małe kropki szybkoutwardzalnej żywicy epoksydowej powinny przylegać do obu szkieł nakrywkowych.
    6. Delikatnie dociśnij zmontowaną próbkę za pomocą złożonego papieru chłonnego, aby równomiernie rozłożyć nacisk. Użyć wystarczającego ciśnienia, aby komórka próbki była cienka i równa (< 15 μm), ale nie na tyle, aby zmiażdżyć komórki. Zmierz odpowiednią grubość, obserwując wzór pierścieni Newtona. Pamiętaj również, aby wykonać ten krok delikatnie, aby zminimalizować pęcherzyki powietrza. W razie potrzeby poćwicz wcześniej kilka razy z pustymi okularami nakrywkowymi.
  11. Uszczelnić próbkę stopioną wazeliną, lanoliną i parafiną (VALAP, materiał podstawowy przygotowany z po 100 g wazeliny, lanoliny i parafiny, stopionych razem)29, przepłukać szczelnie zapieczętowaną próbkęddH2O i wysuszyć suszarką sprężonym powietrzem. Próbka jest teraz gotowa do zamontowania na mikroskopie w celu obrazowania.

2. Rozmieszczenie próbki i wyrównanie iPALM

  1. Przesuń sprężynową górną soczewkę obiektywu do góry, aby umożliwić wyjęcie uchwytu na próbkę. Umieść zapieczętowaną próbkę przygotowaną w kroku 1.10 na uchwycie próbki i zabezpiecz kilkoma małymi magnesami z metali ziem rzadkich. Nałóż olejek immersyjny po obu stronach próbki obrazowej. Umieść uchwyt próbki z powrotem w torze optycznym i delikatnie opuść górną soczewkę obiektywu.
  2. Włącz lasery wzbudzające. Włącz kamerę EMCCD (Electron Multipling Charge-Coupled Device) w trybie przesyłania klatek.
    1. Obrócić odpowiednie filtry emisji. Aktywuj migawkę mechaniczną, aby zablokować ścieżkę górnej belki (Rysunek 1A) i otworzyć ścieżkę dolnej belki. Ustaw ostrość na dolnej soczewce obiektywu poprzez przesuwanie w małych krokach za pomocą siłownika piezoelektrycznego.
    2. Gdy odniesienie jest już ostre, otwórz górną ścieżkę wiązki, blokując jednocześnie ścieżkę dolnej wiązki i ustaw ostrość górnej soczewki obiektywu w podobny sposób. Monitoruj szerokość powiernika na wyświetlaczu komputera, aby uzyskać optymalną ostrość.
  3. Aby zapewnić prawidłowe centrowanie, otwórz zarówno górną, jak i dolną ścieżkę belki. Ręcznie wyreguluj górną soczewkę obiektywu, podczas gdy dolny obiektyw jest utrzymywany na stałym poziomie za pomocą pary mikro-drobnych ustalających, aż obrazy odniesienia nałożą się na siebie tak blisko, jak to możliwe, najlepiej w obrębie jednego piksela.
    1. Następnie wykonaj precyzyjne korekty, tak aby obrazy odniesienia w kroku 2.3 nakładały się na siebie w obrębie jednej dziesiątej piksela EMCCD. Wyreguluj górne 2-osiowe lustra piezograficzne za pomocą oprogramowania sterującego, utrzymując obie soczewki obiektywu i dolne lustra odbijające na stałym poziomie. Porównaj środki powierników górnego i dolnego widoku obiektywu za pomocą wyświetlacza komputera, aby pokierować procesem.

3. Kalibracja konfiguracji iPALM

UWAGA: Ponieważ emisja fluorescencji jest niespójna, aby zakłócenia mogły być obserwowane w iPALM, długości ścieżek przez górny i dolny obiektyw muszą być blisko siebie, z dokładnością do kilku mikronów. Można to osiągnąć w następujący sposób:

  1. Przy włączonych laserach, kamerach stale przesyłających strumieniowo, a zarówno górna, jak i dolna ścieżka wiązki są otwarte, oscylują uchwyt próbki z-piezo za pomocą sinusoidalnego przebiegu napięcia generowanego przez oprogramowanie sterujące dla ciągłych oscylacji osi z o wielkości 400 nm.
  2. Wykorzystując fakt, że gdy nie jest optymalnie wyrównana, intensywność odniesienia zmienia się nieznacznie wraz z oscylacją, ręcznie przesuwaj zmotoryzowany zespół rozdzielacza wiązki w górę lub w dół, aż intensywność reflukcji zacznie oscylować z powodu pożądanego efektu interferencji pojedynczego fotonu. Oznacza to ścisłe dopasowanie długości ścieżek optycznych. W optymalnych przypadkach można osiągnąć stosunek szczytu do doliny wynoszący > 10 (rysunek 1D).
  3. Aby upewnić się, że zarówno amplituda, jak i faza na każdej powierzchni są tak jednolite, jak to możliwe w całym polu, wyreguluj dolne lustro zespołu rozdzielacza wiązki małymi krokami, aby precyzyjnie dostroić szczelinę i kąty nachylenia. Wykonaj dokładne wyrównanie rozdzielacza wiązki, przesuwając próbkę w krokach co 8 nm w ciągu 800 nm.
    1. Monitoruj intensywność odniesienia między kamerami #1 - 3. Dostosuj wysokość, położenie i nachylenie dolnego lustra w zespole rozdzielacza wiązki małymi krokami, tak aby faza oscylacji kamery #1 względem kamery #2 była zmaksymalizowana, najlepiej pod kątem 120° (Rysunek 1B-D).
    2. Po zakończeniu wstępnego wyrównania przetłumacz próbkę na skanowanie w poszukiwaniu odpowiedniego pola widzenia, które zawiera zarówno komórki do obrazu, jak i wiele powierników w pobliżu. Umieść obudowę wokół systemu, aby zablokować rozproszone światło i zakłócenia otoczenia. Po znalezieniu obszaru obrazowania ponownie wykonaj procedurę opisaną w kroku 3.4 i zapisz krzywą kalibracyjną do wykorzystania w kolejnych ekstrakcjach współrzędnych z za pomocą polecenia "Uzyskaj skany kalibracyjne w porównaniu z pozycją piezoelektryczną próbki" w głównym interfejsie.

4. Akwizycja danych

  1. Po znalezieniu żądanego obszaru i uzyskaniu krzywej kalibracyjnej wprowadź odpowiednie nazwy plików do oprogramowania. Otwórz zarówno górną, jak i dolną ścieżkę belki. Zwiększ moc wzbudzenia lasera 642 nm do maksimum. W przypadku Alexa Fluor 647 może być konieczny początkowy okres wyłączania fluoroforu (Rysunek 2A).
    1. Naświetlić stałym wzbudzeniem 642 nm przez 5 minut lub dłużej, jeśli to konieczne, aż do zaobserwowania mrugania pojedynczej cząsteczki (rysunek 2B). Oprogramowanie umożliwia automatyczne zwiększanie aktywacji zdjęcia 405 nm w trakcie akwizycji. Aby elementy nitkowate były wyraźnie widoczne, zwykle wymagana jest duża liczba klatek akwizycji (> 50 000 klatek). Gdy wszystko będzie gotowe, rozpocznij akwizycję zestawów obrazów RAW za pomocą polecenia "Rozpocznij akwizycję iPALM" w głównym interfejsie.
  2. Podczas akwizycji dostosuj poziom fotoaktywacji, dostosowując intensywność lasera 405 nm, aby utrzymać odpowiednią gęstość mrugania w razie potrzeby (patrz przykłady na rysunku 2B).
    nuta: Po zakończeniu akwizycji oprogramowanie automatycznie przekonwertuje pliki obrazów do odpowiedniego formatu binarnego. Repozytorium danych na serwerze obliczeniowym jest zamontowane jako dysk sieciowy, co pozwala na bezpośrednie kopiowanie tam danych w celu dalszego przetwarzania.

5. Przetwarzanie i analiza danych

  1. Przeprowadź analizę lokalizacji za pomocą specjalnie opracowanego oprogramowania, aby wyodrębnić najlepiej dopasowane parametry dla wszystkich pojedynczych cząsteczek, a także dla powierników11,15,23. W ten sposób uzyskuje się nie tylko współrzędną x,y, ale także intensywność, która jest używana do analizy krzywej kalibracyjnej.
    1. Zaimportuj surowe dane kalibracyjne uzyskane w kroku 3.5 za pomocą polecenia "Wyodrębnij piki z wieloma etykietami" w menu "Plik", aby przeprowadzić lokalizację pojedynczej cząsteczki. Po wstępnej analizie lokalizacji, współrzędne uzyskane z kamer #1 - 3 są obecne odpowiednio w kanałach czerwonym, zielonym i niebieskim i mogą być zapisane do dalszej analizy za pomocą polecenia "Zapisz przetworzone jako IDL (.sav)" w menu "Plik".
  2. Aby wprowadzić dane z kamer #1 - 3 do rejestracji za pomocą fluorescencyjnych powierników osadzonych na szkiełkach nakrywkowych, wybierz kilka jasnych powierników, aby zapewnić pokrycie centralnego obrazu (np. Rysunek 1B) za pomocą polecenia "Punkty odniesienia kotwicy" w menu "Transformacje obrazu". Użyj potrójnych zestawów współrzędnych lokalizacyjnych z kamer #1 - 3 uzyskanych z jasnych powierników w kroku 5.1, aby obliczyć macierz rotacji i skalowania, która spowoduje, że kamery #1 i #3 zostaną zarejestrowane z kamerą #2. Przy wystarczająco dużej liczbie powierników można wykonać wypaczanie wielomianów wyższego rzędu w celu lepszego dopasowania.
  3. Po obliczeniu macierzy transformacji przekształć razem surowe dane kamer #1 - 3, aby uzyskać zsumowane dane surowe. Wykonaj kolejną rundę analizy lokalizacji, aby uzyskać bardziej precyzyjną współrzędną x,y i określić względny udział każdego kanału kamery w zsumowanych danych surowych; użyj polecenia "Przekształć Raw, Zapisz i Zapisz sumę (.dat)" w menu "Transformacje obrazu". Ten współczynnik intensywności zawiera informacje o współrzędnej z.
  4. Wybierz jasny punkt odniesienia i wykonaj kalibrację Z za pomocą funkcji "Test Wind Point 3D" w wyskakującym oknie dialogowym, klikając "Operacje współrzędnych Z" w menu "Funkcje specjalne". Spowoduje to dopasowanie funkcji 3-sinusoidalnych do intensywności 3 kanałów kamery w celu wyznaczenia krzywej kalibracji. Plik kalibracyjny jest następnie zapisywany w celu dalszego wykorzystania w głównych zestawach danych.
  5. Aby przetestować jakość krzywej kalibracyjnej, należy przeprowadzić ekstrakcję współrzędnych z, jak opisano wcześniej23. W przypadku dobrze zachowujących się powierników w dobrze skalibrowanym systemie współrzędna z powinna być skalowana liniowo, ponieważ zestawy danych kalibracyjnych są pobierane z liniowym przemiataniem w pozycji z. Co więcej, pozycje Z wszystkich powierników powinny skalować się z podobnym nachyleniem.
  6. Po uzyskaniu zadowalającej kalibracji należy przeprowadzić analizę lokalizacji i transformacji dla zbiorów danych obrazów surowych uzyskanych w kroku 4, postępując zgodnie z tą samą procedurą opisaną w krokach 5.1-5.3. Po zakończeniu załaduj plik kalibracyjny z kroku 5.4 i wykonaj ekstrakcję współrzędnych Z za pomocą funkcji "Wybierz plik WND" i "Wyodrębnij współrzędną Z" w wyskakującym oknie dialogowym, klikając "Operacje współrzędnych Z" w menu "Funkcje specjalne".
    nuta: Ponieważ czas akwizycji wynosi > 15 minut, należy spodziewać się dryfu mechanicznego.
  7. Aby wykonać korekcję dryfu w x,y, wybierz jasny refficjal ze współrzędnych lokalizacji. Ten powiernik powinien być obecny we wszystkich ramkach. Następnie użyj dryfu współrzędnych x,y powiernika, aby wyrównać wszystkie inne współrzędne w tej samej ramce z powrotem do rejestracji (Rysunek 3A-B) za pomocą funkcji "Test/Write Guide Star" w menu "Transformacje obrazu". Rejestrację współrzędnej Z można przeprowadzić podobnie, uzyskując dostęp do funkcji "Gwiazda przewodnika testowego" i "Napisz gwiazdę przewodnika" w wyskakującym oknie dialogowym, klikając "Operacje współrzędnej Z" w menu "Funkcje specjalne".
  8. Ponieważ próbka może wykazywać niewielkie nachylenie, należy przeprowadzić korekcję nachylenia, podając współrzędne x,y,z 3 punktów odniesienia definiujących płaszczyznę, która powinna być ustawiona poziomo, za pomocą funkcji "Usuń pochylenie XYZ" w wyskakującym oknie dialogowym, klikając "Operacje współrzędnych Z" w menu "Funkcje specjalne".
  9. Po wprowadzeniu poprawek dryfu i pochylenia zapisz współrzędne lokalizacji. Zrekonstruuj obraz w super rozdzielczości do dalszej analizy (Rysunek 4A-D) za pomocą polecenia "Render" w głównym interfejsie. Kolor może być używany do wskazania współrzędnej z. Alternatywnie można również renderować widok z boku wybranego obszaru. Współrzędne lokalizacji można wyeksportować jako pliki tekstowe w celu dalszej analizy ilościowej lub zrekonstruowany obraz można zapisać jako plik .tif.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytycznymi wymaganiami dla iPALM są wyrównanie, rejestracja i kalibracja systemów optycznych. Są one niezbędne, aby zapewnić odpowiednią interferencję w 3-kierunkowym rozdzielaczu wiązki wymaganą do ekstrakcji współrzędnych z. Aby umożliwić ciągłe monitorowanie, niezbędne są stałe punktowe źródła fluorescencji. Można to osiągnąć za pomocą fluorescencyjnych Au lub bimetalicznych nanocząstek23, których fotoluminescencja powstaje w wyniku zlokalizowanego powierzchniowego rezonans...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Układ optyczny iPALM oparty jest na konstrukcji obiektywu 4-π z podwójnym przeciwieństwem, jak pokazano na rysunku 1A. Układ jest zbudowany zarówno z niestandardowych części optomechanicznych, jak i komercyjnych, jak opisano wcześniej23 i wymieniono w tabeli 1. Oprócz naszej konfiguracji, Howard Hughes Medical Institute (HHMI) jest gospodarzem systemu, który jest dostępny dla społeczności naukowej w Centrum Zaawansowanego Obrazowania w Kampusie Badawczym Janel...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

YW i PK dziękują za wsparcie finansowe od Singapore National Research Foundation, przyznane PK (NRF-NRFF-2011-04 i NRF2012NRF-CRP001-084). Dziękujemy również otwartemu laboratorium MBI i ośrodkom mikroskopowym za wsparcie w zakresie infrastruktury.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
stół optycznyNewport, CARS4000iPALM, zainstalowany na 4 Newport Stabilizatory wibroizolatory
wibroizolator do stołu optycznegoNewport, CAS-2000
laser-642Newport, CA1185055moc wyjściowa = 100 mw
laser-561Newport, CA1168931moc wyjściowa = 200 mw
laser-488Newport, CA1137970moc wyjściowa = 200 mw
laser-405Newport, CA1142279moc wyjściowa = 100 mw
szerokopasmowe lustra dielektryczneThorlabs, NJBB1-E02sumator laserowy
dichroiczny rozdzielacz wiązkiSemrock, NYLM01-427-25
akustyczno-optyczny filtr przestrajalnyAA Opto-elektroniczny, FrancjaAOTFnC-VIS-TN
Liniowy polaryzatorNewport, CA05LP-VIS-B
płyta bazowalokalny warsztatdostosowane
lustro obrotowe (22,5°)Reynard Corpporation, CAdostosowane22,5 i stopniowe zmotoryzowane
mocowania optyczneNew Focus, CA8816
zmotoryzowany stolik translacyjny XYZThorlabs, NJMT3 / M-Z6uchwyt na próbkę
kontroler serwomotoru T-Cube DC Thorlabs, NJTDC001
Piezoelektryczny przesuwnik fazowyPhysik Instrumente, NiemcyS-303.CD
obiektywNikon, JaponiaMRD01691obiektyw. Stopień translacji oleju Apo TIRF 60X/1.49
New Focus, CA9062-COM-M
Siłownik silnika PicoNew Focus, CA8301
obrotowy elektromagnes / migawkaDACO Instruments, CT5423-458
3-kierunkowy rozdzielacz wiązkiRocky Mountain Instruments,CO dostosowanyrozdzielacz wiązki
Skaner piezoelektryczny Z / Tip / TiltPhysik Instrumente, NiemcyS-316.10
zmotoryzowany pięcioosiowy wyrównywacz przechyłuNew Focus, CA8081
Kontroler ethernet PicmotorNew Focus, CA8752
Kontrolery piezoelektryczne/wzmacniacz/cyfrowy moduł operacyjnyPhysik Instrumente, NiemcyE-509/E-503/E-517
Filtry
Semrock, NY FF01-523/20filtr pasmowo-przepustowySemrock, NYFF01-588/21
filtr pasmowo-przepustowySemrock, NYFF01-607/30
Semrock, NYFF01-676/37
Semrock, NYNF01-405/488/561/635
zmotoryzowane koło filtrów ze sterownikiemThorlabs, NJFW103H
EMCCDAndor, Wielka BrytaniaDU-897U-CSO-#BV3 zestawy
Komputery stacjonarne do sterowania kamerami i synchronizacjiDellPrecision T3500PC, 4 zestawy
szkiełek nakrywkowych z referencyjnymHestzig600-100AuF. Dostępne znaki odniesienia o różnej gęstości i widmach
fibronektynaMilipore, MTFC010
paraformaldehydElektron Nauki mikroskopowe,15710. 16%
aldehyd glutarowyMikroskopia elektronowa Sciences, PA1622025%
triton X-100Sigma aldrich, MOT8787
HUVEC cellsLife Technologies, CAC-015-10C
Medium 200Life Technologies, CAM-200-500
Czynnikiśródbłonka dużych naczyńLife Technologies, CAA14608-01
Sól fizjologiczna14190367
Pennicylina/Streptomycyna15140122
Trypsyna/EDTALife Technologies, CA25200056
PIPESSigma aldrich, MOP1851PHEM
HEPES1. baza, MalezjaBIO-1825
EGTASigma aldrich, MOE3889
MgCl2Millipore, MT5985
Alexa Fluor 647 PhalloidinInvitrogen, CAA22287barwienie
borowodorku sodu (NaBH4)Sigma aldrich, MO480886wygaszanie glukozy
1. zasada, MalezjaBIO-1101bufor obrazowania
oksydaza glukozowaSigma aldrich, MOG2133
katalazaSigma aldrich, MOC9322
cysteaminaSigma aldrich, MO30070
Epoksydowethorlaby, NJG14250
wazelinaSigma aldrich, MO16415próbka uszczelniająca
lanolinęSigma aldrich, MOL7387
wosk parafinowySigma aldrich, MO327204
Olejek immersyjnyMikroskopia elektronowa Sciences, obrazowanie PA16915-04. Wózek typu HF
Filtr pasmowo-przepustowy Filtr pasmowo-przepustowy Filtr wycinający , przygotowanie próbki VA utrwalenie PA buforowana fosforanem Dulbecco

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Localization-based super-resolution imaging of cellular structures. Methods Mol Biol. 1046, 59-84 (2013).
  2. Bertocchi, C., Goh, W. I., Zhang, Z., Kanchanawong, P. Nanoscale imaging by super resolution fluorescence microscopy and its emerging applications in biomedical research. Crit Rev Biomed Eng. 41, 281-308 (2013).
  3. Kanchanawong, P., Waterman, C. M. Advances in light-based imaging of three-dimensional cellular ultrastructure. Curr Opin Cell Biol. 24, 125-133 (2012).
  4. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  5. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91, 4258-4272 (2006).
  6. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
  7. Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Edit. 47, 6172-6176 (2008).
  8. Sharonov, A., Hochstrasser, R. M. Wide-field subdiffraction imaging by accumulated binding of diffusing probes. P Natl Acad Sci USA. 103, 18911-18916 (2006).
  9. Fölling, J., Bossi, M., Bock, H., Medda, R., Wurm, C. A., Hein, B., Jakobs, S., Eggeling, C., Hell, S. W. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5, 943-945 (2008).
  10. Biteen, J., et al. Single-moldecule active-control microscopy (SMACM) with photo-reactivable EYFP for imaging biophysical processes in live cells. Nat Methods. 5, 947-949 (2008).
  11. Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci USA. 106, 3125-3130 (2009).
  12. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).
  13. Dani, A., Huang, B., Bergan, J., Dulac, C., Zhuang, X. Super resolution imaging of chemical synapses in the brain. Neuron. 68, 843-856 (2010).
  14. Liu, J., et al. Talin determines the nanoscale architecture of focal adhesions. P Natl Acad Sci USA. 112 (35), E4864-E4873 (2015).
  15. Kanchanawong, P., et al. Nanoscale architecture of integrin-based cell adhesions. Nature. 468, 580-584 (2010).
  16. Wu, Y., Kanchanawong, P., Zaidel-Bar, R. Actin-delimited adhesion-independent clustering of e-cadherin forms the nanoscale building blocks of adherens junctions. Dev Cell. 32 (2), 139-154 (2015).
  17. Szymborska, A., et al. Nuclear Pore Scaffold Structure Analyzed by Super-Resolution Microscopy and Particle Averaging. Science. 341, 655-658 (2013).
  18. Lawo, S., Hasegan, M., Gupta, G. D., Pelletier, L. Subdiffraction imaging of centrosomes reveals higher-order organizational features of pericentriolar material. Nat Cell Biol. 14, 1148-1158 (2012).
  19. Mennella, V., Agard, D. A., Huang, B., Pelletier, L. Amorphous no more: subdiffraction view of the pericentriolar material architecture. Trends Cell Biol. 24, 188-197 (2014).
  20. Mennella, V., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence microscopy reveals a domain of the centrosome critical for pericentriolar material organization. Nat Cell Biology. 14, 1159-1168 (2012).
  21. Fletcher, D. A., Mullins, R. D. Cell mechanics and the cytoskeleton. Nature. 463, 485-492 (2010).
  22. Salbreux, G., Charras, G., Paluch, E. Actin cortex mechanics and cellular morphogenesis. Trends Cell Biol. 22, 536-545 (2012).
  23. Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2014).
  24. Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nat Methods. 5, 527-529 (2008).
  25. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging. Trends Cell Biol. 19, 555-565 (2009).
  26. Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc. IRE. 37, 10-21 (1949).
  27. Good, N. E., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry. 5, 467-477 (1966).
  28. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophys J. 94, 1826-1835 (2008).
  29. Shin, W. D., et al. Live Cell Imaging: A Laboratory Manual. Goldman, R. D., Swedlow, J. R., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2010).
  30. Aquino, D., et al. Two-color nanoscopy of three-dimensional volumes by 4Pi detection of stochastically switched fluorophores. Nat Methods. 8, 353-359 (2011).
  31. Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8, 1027-1036 (2011).
  32. Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466, 647-651 (2010).
  33. Baddeley, D., Cannell, M. B., Soeller, C. Visualization of Localization Microscopy Data. Microsc Microanal. 16, 64-72 (2010).
  34. El Beheiry, M., Dahan, M. ViSP: representing single-particle localizations in three dimensions. Nat Methods. 10, 689-690 (2013).
  35. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9, 152-158 (2012).
  36. Shroff, H., Galbraith, C. G., Galbraith, J. A., Betzig, E. Live-cell photoactivated localization microscopy of nanoscale adhesion dynamics. Nat Methods. 5, 417-423 (2008).
  37. Yamashiro, S., et al. New single-molecule speckle microscopy reveals modification of the retrograde actin flow by focal adhesions at nanometer scales. Mol Biol Cell. 25, 1010-1024 (2014).
  38. Shroff, H., et al. Dual-color super resolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes. P Natl Acad Sci USA. 104, 20308-20313 (2007).
  39. Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346, (2014).
  40. Brown, T. A., et al. Super resolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction. Mol Cell Biol. 31, 4994-5010 (2011).
  41. Huang, F., et al. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
  42. Daostorm, S. DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy. Nat methods. 8, 279(2011).
  43. Zhu, L., Zhang, W., Elnatan, D., Huang, B. Faster STORM using compressed sensing. Nat Methods. 9, 721-723 (2012).
  44. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343, 653-656 (2014).
  45. Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nat Methods. 9, 1181-1184 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia iPALMcytoszkielet aktynowylokalizacja pojedynczych cz steczekinterferometria wielofazowamikroskopia fluorescencyjnakamery EMCCDwzbudzanie laseroweprzygotowanie pr bekrekonstrukcja obrazu

Powiązane artykuły