Artykuł metodologiczny

Analiza cytometryczna przepływu aktywności litycznej komórek NK w ludzkiej krwi pełnej

DOI:

10.3791/54779

⸱

17 marca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Center for Excellence in Post-Harvest Technologies, North Carolina A&T State University, North Carolina Research Campus, 2Human Performance Laboratory, Appalachian State University, North Carolina Research Campus

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca opisuje zaawansowany proces dokładnego i szybkiego określania liczby komórek NK (Natural Killer) i cytotoksyczności komórek NK w próbkach ludzkiej krwi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cytotoksyczność komórek NK jest powszechnie stosowaną miarą do określenia wpływu zewnętrznej interwencji na funkcję komórek NK. Jednak dokładność i odtwarzalność tego testu można uznać za niestabilną, albo z powodu błędów użytkownika, albo z powodu wrażliwości komórek NK na manipulację eksperymentalną. Aby wyeliminować te problemy, ustalono przepływ pracy, który redukuje je do minimum, który jest tutaj przedstawiony. Aby to zilustrować, uzyskaliśmy próbki krwi, w różnych punktach czasowych, od biegaczy (n = 4), którzy zostali poddani intensywnym ćwiczeniom. Po pierwsze, komórki NK są jednocześnie identyfikowane i izolowane poprzez znakowanie CD56 i sortowanie magnetyczne, bezpośrednio z krwi pełnej i od zaledwie jednego mililitra. Posortowane komórki NK są usuwane z wszelkich odczynników lub przeciwciał zamykających. Można je policzyć w celu ustalenia dokładnej liczby komórek NK na mililitr krwi. Po drugie, posortowane komórki NK (komórki efektorowe lub E) można zmieszać z komórkami K562 znakowanymi nadchloranem 3,3'-diotadecyloksakarbocyjaniny (DiO) w optymalnym dla testu stosunku 1:5 T:E i analizować za pomocą obrazowego cytometru przepływowego, który pozwala na wizualizację każdego zdarzenia i eliminację wszelkich fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych (takich jak dublety lub komórki efektorowe). Ten przepływ pracy można wykonać w około 4 godziny i pozwala na uzyskanie bardzo stabilnych wyników nawet podczas pracy z próbkami pobranymi przez ludzi. Jeśli to możliwe, zespoły badawcze mogą przetestować kilka interwencji eksperymentalnych na ludziach i porównać pomiary w kilku punktach czasowych bez naruszania integralności danych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki NK są niezbędnym elementem wrodzonego układu odpornościowego. Chociaż są one bardzo regulowane, mają zdolność rozpoznawania i eliminowania nieprawidłowych komórek poprzez kontakt między komórkami i bez wcześniejszej aktywacji1. W związku z tym tworzą szybką linię obrony przed infekcjami. Wykazano, że ćwiczenia, szczególnie intensywne, przejściowo osłabiają układ odpornościowy2,3,4,5. Komórki NK są szczególnie podatne na ten efekt4,6,7, skutecznie tworząc okno zwiększonej wrażliwości na choroby. W związku z tym badanie interwencji przed, w trakcie lub po intensywnym wysiłku fizycznym w celu zmniejszenia jego wpływu na funkcję komórek NK jest szczególnie interesujące dla dobrego samopoczucia sportowców po zawodach.

Jednak badanie takich interwencji komplikuje wiele czynników: 1) Komórki NK są rzadkie8, na około 1% przedziału białych krwinek; 2) Komórki NK są bardzo wrażliwe na stres i polegają na ciągłej ekspozycji na warunki fizjologiczne, aby zachować żywotność i stabilność podczas eksperymentów; oraz 3) standardowe testy mające na celu określenie cytotoksyczności komórek NK, takie jak gradienty Ficoll9 i testy uwalniania10, są niewiarygodne i niespójne. Nieodłączna zmienność próbek pobranych przez ludzi tylko potęguje te problemy. Świeże próbki ludzkie pobrane podczas interwencji są dość uregulowane i trudne do zdobycia, przynajmniej w porównaniu z próbkami zwierzęcymi lub unieśmiertelnionymi liniami komórkowymi. Zmniejsza to możliwości powtarzania eksperymentów lub dodawania uczestników do kohorty badania w celu osiągnięcia istotnych progów statystycznych. Łącznie problemy te przemawiają za potrzebą uproszczonego protokołu, który pozwala zarówno na wysoką przepustowość, jak i na wysoce wiarygodną analizę aktywności litycznej komórek NK w próbkach ludzkich.

Ustaliliśmy przepływ pracy, który skraca czas niezbędny do identyfikacji, izolacji i testowania komórek NK z ludzkiej krwi pełnej, jednocześnie minimalizując narażenie na czynniki zewnętrzne. Metoda optymalizuje wykorzystanie dwóch instrumentów, magnetycznego sortera komórek i obrazowego cytometru przepływowego, a także specyficznego dla testu, zoptymalizowanego stosunku T:E, aby umożliwić wykrywanie spadków lub wzrostów cytotoksyczności komórek NK.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Wszystkie procedury pobierania krwi zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi określonymi przez Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB).

1. Pobieranie krwi pełnej

  1. Zleć pobranie krwi certyfikowanemu flebotomiście zgodnie z wytycznymi Światowej Organizacji Zdrowia.
  2. Pobrać krew do jednej probówki o pojemności 4 ml zawierającej kwas di-potasowo-etylenodiaminotetraoctowy (K2EDTA). Odwróć probówkę do pobierania krwi zgodnie z instrukcjami producenta. Trzymaj probówkę do pobierania krwi w temperaturze pokojowej na bujaku stołowym do momentu separacji.

2. Przygotowanie komórek docelowych znakowanych DiO

  1. Hoduj komórki K562 w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco firmy Complete Iscove (IMDM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% streptomycyną penicylinową przez kilka tygodni przed testem, aby zapewnić zdrowie komórek. Dostosuj stężenie komórek do 3 x 105 komórek/ml dziennie poprzez zakończenie liczenia komórek i późniejsze przejście komórek. Wykonuj całkowitą wymianę nośnika co 2 do 3 dni.
  2. W dniu testu należy wykonać zliczanie komórek za pomocą hemocytometru 1:1.
    1. Usunąć 10 μl z kolby K562 i umieścić w probówce o pojemności 1,5 ml.
    2. Dodać 10 μl niebieskiego barwnika trypanowego do tej samej probówki o pojemności 1,5 ml, aby uzyskać współczynnik rozcieńczenia 1:1.
    3. Delikatnie przesuń probówkę, aby wymieszać komórki K562 i niebieski barwnik trypanowy.
    4. Pozostawić niebieski barwnik K562 z trypanem komórkowym do inkubacji przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
    5. Usuń 15 μl barwionych komórek K562 z probówki.
    6. Pipeta do hemocytometru w celu zliczenia komórek.
    7. Policz komórki w czterech kwadratach narożnych, a także w środkowym kwadracie, co daje w sumie pięć kwadratów.
    8. Obliczanie liczby komórek za pomocą równania:
      Całkowita liczba komórek/ml = Całkowita liczba komórek X (współczynnik rozcieńczenia/Liczba kwadratów) X 10 000/ml
  3. Zawiesić komórki docelowe K562 o końcowej gęstości 1 x 106 komórek/ml w pożywce hodowlanej IMDM wolnej od surowicy.
  4. W przypadku niebarwionych komórek docelowych K562 dodaj 10 ml komórek docelowych K562 do jednej probówki o pojemności 15 ml o gęstości 1 x 106 komórek/ml, co daje łącznie 10 x 106 komórek K562. Umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 do momentu przygotowania do użycia.
  5. W przypadku komórek docelowych K562 barwionych DiO dodaj 10 ml komórek docelowych K562 do jednej probówki o pojemności 15 ml o gęstości 1 x 106 komórek/ml, co daje łącznie 10 x 106 komórek K562.
    1. Dodać 1 μl roztworu znakującego komórki DiO na ml zawiesiny komórkowej w 15 ml probówce przeznaczonej do barwienia DiO i delikatnie odwirować. Na przykład dodaj 10 μl roztworu znakującego komórki DiO do 10 x 106 komórek K562 / ml o objętości 1 x 106 komórek / ml.
    2. Inkubować roztwór K562-DiO przez 20 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w probówce o pojemności 15 ml.
  6. Po inkubacji dodać 3 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o temperaturze pokojowej do roztworu K562-DiO zawierającego 15 ml probówki.
  7. Wirować przez 10 minut przy 135 x g w temperaturze pokojowej.
  8. Ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania osadu komórkowego za pomocą pipety o regulowanej objętości 1 000 μl.
  9. Dodaj 10 ml świeżego IMDM do probówki o pojemności 15 ml zawierającej osad komórkowy.
  10. Delikatnie zawiruj rurkę, aby ponownie zawiesić komórki.
  11. Powtórz kroki od 2.7 do 2.10 jeszcze dwa razy.
  12. Przechowuj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 do momentu, gdy będą gotowe do użycia.
    UWAGA: Komórki można przechowywać w inkubatorze do 24 godzin, ale zaleca się ich użycie tego samego dnia.

3. Przygotowanie kontroli

  1. Przenieść następujące składniki do oddzielnych i odpowiednio oznakowanych probówek o pojemności 1,5 ml:
    1. Dodaj 500 μl świeżego IMDM zawierającego zawieszone komórki K562 znakowane DiO do probówki o pojemności 1,5 ml z oznaczeniem "podwójnie dodatnim".
    2. Dodaj 500 μl świeżego IMDM zawierającego ponownie zawieszone komórki K562 znakowane DiO do probówki o pojemności 1,5 ml oznaczonej jako "tylko DiO".
    3. Dodaj 500 μl świeżego IMDM zawierającego zawieszone nieoznakowane komórki K562 do probówki o pojemności 1,5 ml oznaczonej "tylko jodek propidyny (PI)".
  2. Umieść probówki podwójnie dodatnie i tylko PI w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C na 5 minut.
  3. Po upływie 5 minut wyjmij probówki i przetrzyj 70% etanolem.
  4. Dodaj 10 l PI do probówek podwójnie dodatnich i PI tylko 1,5 ml.
  5. Umieścić wszystkie trzy kontrolne komórki docelowe K562 w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut.
  6. Po upływie 30 minut inkubacji odwirować wszystkie trzy kontrolne komórki docelowe K562 przez 2 minuty przy 163 x g.
  7. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu komórkowego.
  8. Zawiesić każdą kontrolę za pomocą 20 μl świeżej pożywki do hodowli komórkowych IMDM i pozostawić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na co najmniej 30 minut dla uzyskania optymalnego sygnału DiO.
    UWAGA: Elementy sterujące są teraz gotowe do przeprowadzenia przez obrazowy cytometr przepływowy.

4. Automatyczna separacja komórek NK

  1. Włącz separator komórek i poczekaj, aż cykl rozruchowy się zakończy.
  2. Upewnij się, że wszystkie podświetlenia butelek z płynem są zielone i że butelka na odpady jest pusta.
  3. Uzyskać stojak na probówki o temperaturze pokojowej 15 ml.
    UWAGA: Wybór jest oparty na objętościach próbek. Na przykład, aby uzyskać objętość mniejszą niż 3 ml, użyj stojaka na probówki o pojemności 15 ml, a dla objętości większej niż 3 ml użyj stojaka na probówki o pojemności 50 ml.
  4. Oznacz odpowiednio probówki z próbkami (powtórz dla każdej próbki/uczestnika): Uczestnik 1 próbka krwi pełnej; Uczestnik 1 Frakcja ujemna; Uczestnik 1 Frakcja dodatnia.
  5. Delikatnie odpipetować 1,5 ml krwi pełnej z kroku 1.2 do probówki o pojemności 15 ml "Próbka krwi pełnej".
  6. Umieść odpowiednio oznakowaną probówkę "Próbka krwi pełnej" o pojemności 15 ml z kroku 4.5 i oznaczone probówki 15 ml "Frakcja ujemna" i "Frakcja dodatnia" z kroku 4.4 w stojaku na probówki. Użyj następującej konfiguracji stojaka na próbki: Rząd (R1) A: Próbka krwi pełnej, Rząd (R2) B: Frakcja ujemna, nieznakowana, Rząd (R4) C: Frakcja dodatnia, znakowana magnetycznie.
  7. Włóż stojak separatora do próbnika MiniSampler w celu automatycznego etykietowania.
  8. Wybierz "Odczynnik" w menu i zaznacz pozycję, w której fiolka zostanie umieszczona w stojaku separatora.
  9. Wybierz "Odczytaj odczynnik", aby aktywować czytnik kodów 2D.
  10. Umieść odpowiednią fiolkę z odczynnikiem przed czytnikiem kodów 2D w odległości 0.5-2.5 cm od pokrywy czytnika kodów.
    UWAGA: Na przykład wymaganym odczynnikiem do separacji komórek NK jest CD56.
  11. Trzymaj fiolkę z odczynnikiem pod kątem przed czytnikiem kodów 2D, aby uzyskać optymalny odczyt.
  12. Umieścić fiolkę z odczynnikiem w odpowiedniej pozycji stojaka separatora.
  13. Podświetl żądane pozycje na karcie Separacja na ekranie.
  14. Z podmenu Etykietowanie przypisz program do automatycznego etykietowania.
  15. Przypisz mikrokulki odczynnika do separacji komórek CD56 do pozycji stojaka 1, 2, 3 i 4.
  16. Wybierz program separacji "posselwb".
  17. Wybierz program prania "płukanie".
  18. Wprowadzić objętość próbki 1 500 μl do podmenu "Objętość" za pomocą klawiatury numerycznej.
  19. Wybierz opcję "Enter" na klawiaturze.
  20. Wybierz "Uruchom", aby rozpocząć separację komórek.
  21. Wybierz "OK", aby potwierdzić, że dostępna jest wystarczająca ilość bufora do przetworzenia wszystkich próbek.

5. Liczba komórek NK po separacji komórek

  1. Natychmiast po oddzieleniu komórek za pomocą separatora komórek należy pobrać frakcję dodatnią. Pozostaw w temperaturze pokojowej. Ta frakcja zawiera pożądaną czystą populację komórek NK.
  2. Dla każdej pojedynczej próbki należy przeprowadzić zliczanie komórek za pomocą hemocytometru zgodnie z krokiem 2.2.
    1. Po obliczeniach zapisz liczbę komórek.

6. Przygotowanie próbki do badania cytotoksyczności

  1. Przygotuj i oznacz odpowiednio probówki o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki/uczestnika.
  2. Pipeta żąda proporcji komórek NK i komórek K562 z matrycą DiO w każdej probówce.
    UWAGA: Na przykład pożądany stosunek komórek docelowych K562 i komórek efektorowych NK wynosi 1:5.
  3. Wirować przez 5 minut przy 135 x g.
  4. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu komórkowego.
  5. Zawiesić mieszaninę komórek K562 znakowaną NK-DiO w 500 μl pożywki komórkowej NK bez interleukiny-2 (IL-2) i 2-merkaptoetanolu (2-ME) (niekompletna pożywka do hodowli komórek NK).
    UWAGA: Niekompletną pożywką do hodowli komórek NK jest Minimum Essential Medium Eagle z wodorowęglanem sodu, bez L-glutaminy, rybonukleozydów i dezoksyrybonukleozydów.
  6. Dodaj 5 μl PI do każdej probówki.
  7. Wirować przez 2 minuty przy 163 x g.
  8. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
  9. Po 2 godzinach inkubacji odwirowywać przez 2 minuty przy 163 x g.
  10. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu komórkowego.
  11. Zawiesić komórki w 25 μl niekompletnej pożywki do hodowli komórek NK.

7. Przygotowanie próbki spontanicznej ("S")

  1. Odpipetować 500 μl komórek K562 znakowanych DiO (stężenie 1 x 106 komórek/ml) do probówki o pojemności 1,5 ml.
  2. Dodaj 10 μl PI do każdej probówki.
  3. Probówka wirówkowa przez 2 minuty przy 163 x g.
  4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
  5. Po 2 godzinach inkubacji odwirowywać przez 2 minuty przy 163 x g.
  6. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu komórkowego.
  7. Ponownie zawiesić komórki w 25 μl niekompletnej pożywki do hodowli komórkowych alfa-Minimum Essential Medium (α-MEM).

8. Akwizycja danych za pomocą cytometru przepływowego do obrazowania

  1. Naciśnij zielony przycisk wewnątrz przednich drzwiczek obrazowego cytometru przepływowego, aby włączyć instrument.
  2. Włącz wszystkie komputery skojarzone z obrazowym cytometrem przepływowym.
  3. Uruchom oprogramowanie cytometru przepływowego do obrazowania.
  4. Kliknij przycisk "Uruchamianie", aby przepłukać system i przygotować linię próbkowania.
  5. Po zakończeniu "Uruchamiania" zamknij okno "Kalibracje".
  6. Przypisz kanały: w lewym górnym rogu kliknij każdy kanał, aby je przypisać.
  7. Po prawej stronie kliknij przycisk wykresu punktowego, aby utworzyć 4 wykresy rozrzutu: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 i FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01.
  8. Rozpocznij analizę próbek, najpierw używając kontroli "Podwójnie dodatniej".
    1. Kliknij "Załaduj".
    2. Umieścić probówkę o pojemności 1,5 ml z próbką "podwójnie dodatnią" z kroków 3.4 do 3.9 w ładowarce próbek.
    3. Wybierz obiektyw 40X w zakładce "Powiększenie".
    4. Włącz lasery o mocy 405 mW i 642 mW.
    5. Włącz kanał "Brightfield".
    6. Kliknij "Wybierz intensywność".
    7. Na podstawie próbki kontrolnej "Double Positive" określ żądaną intensywność lasera o mocy 405 mW, aby detektor nie był przeciążony.
      Uwaga: Na przykład optymalne natężenie dla tego eksperymentu ustalono na 11 mW.
  9. Po osiągnięciu żądanej konfiguracji uzyskaj dane.
    1. Na karcie "Pobieranie plików" wprowadź niestandardowy tekst nazwy pliku. Wybierz folder, w którym chcesz zapisać pliki danych.
    2. Wprowadź liczbę komórek do pobrania obok opcji "Zbierz". Zazwyczaj liczba ta waha się od 1 000 do 10 000.
    3. Kliknij "Pobierz."
      UWAGA: Po uzyskaniu żądanej liczby komórek plik danych jest automatycznie zapisywany w poprzednio wybranym folderze.
  10. Po zakończeniu akwizycji załaduj następną próbkę kontrolną – tylko kontrolę DiO.
    1. Kliknij "Załaduj".
    2. Umieść probówkę o pojemności 1.5 ml z próbką "Tylko DiO" w ładowarce próbek.
    3. Pozostaw wybrany obiektyw 40X w zakładce "Powiększenie".
    4. Pozostaw włączony laser o mocy 405 mW.
    5. Wyłącz laser o mocy 642 mW i kanał "Brightfield".
      UWAGA: Teraz, gdy żądana konfiguracja została osiągnięta, można uzyskać dane.
    6. Na karcie "Pobieranie plików" wprowadź niestandardowy tekst nazwy pliku i wybierz folder, w którym chcesz zapisać pliki danych. Wprowadź liczbę komórek do pobrania obok opcji "Zbierz". Zazwyczaj liczba ta wynosi 1,000.
    7. Kliknij "Pobierz."
      UWAGA: Po uzyskaniu żądanej liczby komórek plik danych jest automatycznie zapisywany w poprzednio wybranym folderze.
  11. Powtórzyć krok 8.10 dla próbki kontrolnej "tylko PI". Próbki eksperymentalne są teraz gotowe do pobrania.
  12. Z pozostałymi próbkami eksperymentalnymi, w tym z "próbkami spontanicznymi »S«" należy postępować w następujący sposób:
    1. Pozostaw wybrany obiektyw 40X w zakładce "Powiększenie".
    2. Włącz lasery o mocy 405 mW i 642 mW.
    3. Włącz kanał "Brightfield".
    4. Kliknij "Ustaw intensywność".
    5. Na karcie "Pobieranie plików" wprowadź niestandardowy tekst nazwy pliku i wybierz folder, w którym chcesz zapisać pliki danych. Wprowadź niestandardowy tekst nazwy pliku.
    6. Wprowadź liczbę komórek do pobrania obok opcji "Zbierz".
    7. Kliknij przycisk "Pobierz".
      UWAGA: Po uzyskaniu żądanej liczby komórek plik danych jest automatycznie zapisywany w poprzednio wybranym folderze.
  13. Powtórzyć krok 8.12 dla wszystkich próbek doświadczalnych.
  14. Po zebraniu wszystkich danych i plików eksperymentalnych kliknij przycisk "Zamknij", aby wysterylizować system.

9. Analiza próbki cytometru przepływowego do obrazowania

  1. Otwórz aplikację do obrazowania cytometru przepływowego.
  2. W sekcji "Plik" otwórz eksperymentalny plik . Plik RIF.
  3. Zbuduj nową matrycę przy użyciu pojedynczego koloru . RIF files (kontrola tylko DiO i kontrola tylko PI, utworzone w krokach 8.10 i 8.11), wybierając opcję "Utwórz nową matrycę" na karcie Kompensacja w oprogramowaniu cytometru przepływowego do obrazowania.
    UWAGA: Oprogramowanie poprosi o wybór plików jednokolorowych i połączy je w celu utworzenia pliku macierzy (rozszerzenie pliku .ctm), który ma zostać wybrany w celu zastosowania kompensacji kanałów.
  4. Twórz wykresy punktowe za pomocą funkcji "bloków konstrukcyjnych" oprogramowania.
    1. Utwórz wykres kropkowy (BrightFieldGradient_RMS a częstotliwość), aby zabramować skoncentrowane komórki. Wywołaj bramkę "Focus" (Rysunek 1A).
    2. Korzystając z bramki "Focus", utwórz wykres punktowy obszaru jasnego pola w stosunku do proporcji jasnego pola, aby zabramować komórki singletowe. Nazwij bramkę "Pojedyncza" (Rysunek 1B).
    3. Korzystając z bramki "pojedynczej", utwórz wykres punktowy Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Użyj tego wykresu, aby zidentyfikować i bramkować tylko komórki DiO-dodatnie (cele, żywe) i komórki podwójnie dodatnie PI-DiO (cele, martwe) (Rysunek 1C).
      UWAGA: Wszystkie wykresy opisane w krokach 9.4.1, 9.4.2 i 9.4.3 można utworzyć za pomocą funkcji "bloków konstrukcyjnych" oprogramowania.
  5. Kliknij funkcję statystyczną wykresu kropkowego, aby uzyskać dostęp do numerów komórek każdej bramy.
  6. Obliczyć odsetek martwych celów w próbce spontanicznej i próbkach doświadczalnych, stosując następujący wzór:
    % martwych celów w próbie = (#dead celów x 100)/(#live celów + #dead celów)
  7. Obliczyć cytotoksyczność, korzystając z następującego wzoru:
    % cytotoksyczności = [(Eksperymentalny martwy-Spontanicznie martwy)/(100-Spontanicznie martwy)]x100

figure-protocol-1
Rysunek 1: Reprezentatywne histogramy, wykresy punktowe i obrazy do analizy aktywności cytotoksycznej. (A) analiza komórek ogniskowych. (B) analiza pojedynczych komórek. (C) analiza barwienia komórek docelowych. Wszystkie ustalenia są dokonywane na podstawie obrazu dołączonego do każdego wydarzenia. Dostęp do tego można uzyskać w oprogramowaniu analitycznym, po prostu klikając zdarzenie na wykresach. (D) reprezentatywny obraz zdarzenia dubletowego, pokazujący apoptotyczną komórkę NK i żywy cel K562. Ch01, Jasne pole. Ch02, DiO. Kanał 05, PI. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Określanie liczby komórek NK
Wpływ intensywnego biegania na liczbę komórek NK we krwi pełnej mierzono przy użyciu protokołu ćwiczeń opisanego na rycinie 2. Próbki krwi pobierano przed wysiłkiem fizycznym, bezpośrednio po wysiłku, 1,5 godziny po wysiłku fizycznym i ostatecznie 24 i 48 godzin po wstępnym pobraniu krwi. Stężenie komórek NK na mililitr krwi pełnej mierzono dla każdego biegacza (ryc. 3A) i średnio (ryc. 3B) dla każdego pun...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda opisana w tym badaniu bezpośrednio mierzy specyficzną aktywność komórek NK danej osoby w odpowiedzi na bodźce (w tym konkretnym przypadku długotrwałe ćwiczenia). Zazwyczaj komórki NK są izolowane z krwi za pomocą gradientów gęstości lub sortowania komórek przy użyciu kombinacji markerów. Chociaż metody te są szeroko stosowane, mają wiele wad: są czasochłonne, obejmują wiele manipulacji i są w dużym stopniu zależne od użytkownika. W rezultacie na izolowane komórki NK wywierany jest nadmierny stres, co może skutkowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten projekt był wspierany przez Inicjatywę Badań nad Rolnictwem i Żywnością Competitive Grant nr 2100-68003-30395 od Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa USDA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Limfoblasty K-562ATCCCCL-243
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco firmy IscoveATCC30-2005Wysoka glukoza, z L-glutaminą, z HEPES, sterylnie filtrowane
Alfa Minimum Niezbędne podłożeATCCCRL-2407Bez rybonukleozydów i dezoksyrybonukleozydów, ale z 2 mM L-glutaminą i 1,5 g/l wodorowęglanu sodu
Roztwór błękitu trypanowego 0,4%AmrescoK940-100ML
Roztwór do barwienia jodku propridiumBD Pharmingen51-66211E
Roztwór do znakowania komórek Vybranto DiOVybrantoV-22886
autoMACS Pro SeparatorMiltenyi Biotec130-092-545
AutoMACS Bufor do bieganiaMiltenyi Biotec130-091-221
Bufor myjący autoMACSMiltenyi Biotec130-092-987
Kolumny autoMACSMiltenyi Biotec130-021-101
Mikrokulki CD56 z krwi pełnej, ludzkieMiltenyi Biotec130-090-875
ImageStream X Mark II Obrazowy cytometr przepływowyEMD Millipore
SpeedbeadsAmnis Corporation400030
0,4-0,7% Podchloryn (Sterylizator)VWRJT9416-1
Redlica Coulter ClenzBeckman Coulter8546929
70% Isopropanol (Debubbler)EMD Millipore1.3704
D-PBS (płyn osłonowy)EMD MilliporeBSS-1006-B (1X)Bez wapnia lub magnezu
OprogramowanieINSPIRE EMD MilliporeVersion Mark II, wrzesień 2013
Oprogramowanie aplikacyjne IdeasEMD Milliporewersja 6.1, lipiec 2014
klasy kulturowej r.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
  2. Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, Suppl 3 131-141 (1994).
  3. Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. Physical activity, immunity and infection. Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).
  4. Nieman, D. C. Marathon training and immune function. Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).
  5. Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. Exercise and the Regulation of Immune Functions. Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).
  6. Walsh, N. P., et al. Position statement. Part one: Immune function and exercise. Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).
  7. Timmons, B. W., Cieslak, T. Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review. Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).
  8. Westermann, J., Pabst, R. Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body. Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).
  9. Boyum, A. Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).
  10. McMillan, R., Scott, J. L. Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects. Blood. 32 (5), 738-754 (1968).
  11. Berk, L. S., et al. The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners. Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).
  12. McAnulty, L. S., et al. Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running. Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).
  13. Millard, A. L., et al. Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation. Front Immunol. 4, 125(2013).
  14. Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , Garland Science. (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cytotoksyczno kom rek NKcytometria przep ywowaseparacja kom reksortowanie magnetyczneobrazuj cy cytometr przep ywowyjodek propidynykom rki K562znakowanie CD56aktywno cytotoksyczna

Powiązane artykuły