Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza cytometryczna przepływu aktywności litycznej komórek NK w ludzkiej krwi pełnej

11.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54779

⸱

17 marca 2017

 ,  ,  ,  , 
1Center for Excellence in Post-Harvest Technologies, North Carolina A&T State University, North Carolina Research Campus, 2Human Performance Laboratory, Appalachian State University, North Carolina Research Campus

W tym artykule

Podsumowanie

Ta praca opisuje zaawansowany proces dokładnego i szybkiego określania liczby komórek NK (Natural Killer) i cytotoksyczności komórek NK w próbkach ludzkiej krwi.

Streszczenie

cytotoksyczność komórek NK jest powszechnie stosowaną miarą do określenia wpływu zewnętrznej interwencji na funkcję komórek NK. Jednak dokładność i odtwarzalność tego testu można uznać za niestabilną, albo z powodu błędów użytkownika, albo z powodu wrażliwości komórek NK na manipulację eksperymentalną. Aby wyeliminować te problemy, ustalono przepływ pracy, który redukuje je do minimum, który jest tutaj przedstawiony. Aby to zilustrować, uzyskaliśmy próbki krwi, w różnych punktach czasowych, od biegaczy (n = 4), którzy zostali poddani intensywnym ćwiczeniom. Po pierwsze, komórki NK są jednocześnie identyfikowane i izolowane poprzez znakowanie CD56 i sortowanie magnetyczne, bezpośrednio z krwi pełnej i od zaledwie jednego mililitra. Posortowane komórki NK są usuwane z wszelkich odczynników lub przeciwciał zamykających. Można je policzyć w celu ustalenia dokładnej liczby komórek NK na mililitr krwi. Po drugie, posortowane komórki NK (komórki efektorowe lub E) można zmieszać z komórkami K562 znakowanymi nadchloranem 3,3'-diotadecyloksakarbocyjaniny (DiO) w optymalnym dla testu stosunku 1:5 T:E i analizować za pomocą obrazowego cytometru przepływowego, który pozwala na wizualizację każdego zdarzenia i eliminację wszelkich fałszywie dodatnich lub fałszywie ujemnych (takich jak dublety lub komórki efektorowe). Ten przepływ pracy można wykonać w około 4 godziny i pozwala na uzyskanie bardzo stabilnych wyników nawet podczas pracy z próbkami pobranymi przez ludzi. Jeśli to możliwe, zespoły badawcze mogą przetestować kilka interwencji eksperymentalnych na ludziach i porównać pomiary w kilku punktach czasowych bez naruszania integralności danych.

Wprowadzenie

Komórki NK są niezbędnym elementem wrodzonego układu odpornościowego. Chociaż są one bardzo regulowane, mają zdolność rozpoznawania i eliminowania nieprawidłowych komórek poprzez kontakt między komórkami i bez wcześniejszej aktywacji1. W związku z tym tworzą szybką linię obrony przed infekcjami. Wykazano, że ćwiczenia, szczególnie intensywne, przejściowo osłabiają układ odpornościowy2,3,4,5. Komórki NK są szczególnie podatne na ten efekt4,6,7, skutecznie tworząc okno zwiększonej wrażliwości na choroby. W związku z tym badanie interwencji przed, w trakcie lub po intensywnym wysiłku fizycznym w celu zmniejszenia jego wpływu na funkcję komórek NK jest szczególnie interesujące dla dobrego samopoczucia sportowców po zawodach.

Jednak badanie takich interwencji komplikuje wiele czynników: 1) Komórki NK są rzadkie8, na około 1% przedziału białych krwinek; 2) Komórki NK są bardzo wrażliwe na stres i polegają na ciągłej ekspozycji na warunki fizjologiczne, aby zachować żywotność i stabilność podczas eksperymentów; oraz 3) standardowe testy mające na celu określenie cytotoksyczności komórek NK, takie jak gradienty Ficoll9 i testy uwalniania10, są niewiarygodne i niespójne. Nieodłączna zmienność próbek pobranych przez ludzi tylko potęguje te problemy. Świeże próbki ludzkie pobrane podczas interwencji są dość uregulowane i trudne do zdobycia, przynajmniej w porównaniu z próbkami zwierzęcymi lub unieśmiertelnionymi liniami komórkowymi. Zmniejsza to możliwości powtarzania eksperymentów lub dodawania uczestników do kohorty badania w celu osiągnięcia istotnych progów statystycznych. Łącznie problemy te przemawiają za potrzebą uproszczonego protokołu, który pozwala zarówno na wysoką przepustowość, jak i na wysoce wiarygodną analizę aktywności litycznej komórek NK w próbkach ludzkich.

Ustaliliśmy przepływ pracy, który skraca czas niezbędny do identyfikacji, izolacji i testowania komórek NK z ludzkiej krwi pełnej, jednocześnie minimalizując narażenie na czynniki zewnętrzne. Metoda optymalizuje wykorzystanie dwóch instrumentów, magnetycznego sortera komórek i obrazowego cytometru przepływowego, a także specyficznego dla testu, zoptymalizowanego stosunku T:E, aby umożliwić wykrywanie spadków lub wzrostów cytotoksyczności komórek NK.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury pobierania krwi zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustanowionymi przez Instytucjonalną Radę Recenzyjną (IRB) Uniwersytetu Stanowego w Appalachians (ASU).

1. Pobieranie krwi pełnej

  1. Zlecić certyfikowanemu flebotomiście pobranie krwi zgodnie z wytycznymi Światowej Organizacji Zdrowia.
  2. Pobrać krew do jednej probówki do krwi o pojemności 4 ml zawierającej dwupotasową kwas etylenodiaminotetraoctową (K2EDTA). Odwrócić probówkę zgodnie z instrukcją producenta. Przechowywać probówkę w temperaturze pokojowej na rockerze laboratoryjnym do momentu separacji.

2. Przygotowanie komórek docelowych znakowanych DiO

  1. Hodować komórki K562 w pełnej pożywce Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 1% penicyliny i streptomycyny przez kilka tygodni przed analizą, aby zapewnić dobrą kondycję komórek. Codziennie dostosowywać stężenie komórek do poziomu 3 x 105 komórek/mL poprzez wykonywanie obliczeń liczby komórek i następujące po nich pasażowanie. Dokonywać pełnej wymiany pożywki co 2 do 3 dni.
  2. W dniu analizy przeprowadzić liczenie komórek przy użyciu hemocytometru w rozcieńczeniu 1:1.
    1. Pobrać 10 µL z kolby z komórkami K562 i przenieść do probówki 1,5 mL.
    2. Dodać 10 µL barwnika trypan blue do tej samej probówki 1,5 mL, aby uzyskać czynnik rozcieńczenia 1:1.
    3. Delikatnie potrząsnąć probówką, aby wymieszać komórki K562 z barwnikiem trypan blue.
    4. Inkubować zawiesinę komórek K562 z barwnikiem trypan blue przez 1 min w temperaturze pokojowej.
    5. Pobrać z probówki 15 µL zabarwionych komórek K562.
    6. Nanieść na hemocytometr w celu policzenia komórek.
    7. Policzyć komórki w czterech narożnych polach oraz w polu środkowym, co daje łącznie pięć pól.
    8. Obliczyć liczbę komórek, korzystając z równania:
      Całkowita liczba komórek/mL = (Suma policzonych komórek) X (czynnik rozcieńczenia / liczba pól) X 10 000/mL
  3. Resuspendować docelowe komórki K562 do końcowej gęstości 1 x 106 komórek/ml w bezsurowiczej pożywce IMDM.
  4. W przypadku niezabarwionych docelowych komórek K562, dodać 10 mL komórek K562 do jednej probówki 15 mL przy gęstości 1 x 106 komórek/mL, co daje łącznie 10 x 106 komórek K562. Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 do momentu użycia.
  5. W przypadku docelowych komórek K562 barwionych DiO, dodać 10 mL komórek K562 do jednej probówki 15 mL przy gęstości 1 x 106 komórek/mL, co daje łącznie 10 x 106 komórek K562.
    1. Dodać 1 µL roztworu znakującego komórki DiO na każdy 1 mL zawiesiny komórkowej w probówce 15 ml przeznaczonej do barwienia DiO i delikatnie wymieszać na wortexie. Na przykład: dodać 10 µL roztworu znakującego DiO do 10 x 106 komórek K562/ml przy objętości 1 x 106 komórek/mL.
    2. Inkubować roztwór K562-DiO przez 20 min w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w probówce 15 ml.
  6. Po inkubacji dodać 3 ml fosforanu soli buforowej (PBS) o temperaturze pokojowej do probówki 15 ml zawierającej roztwór K562-DiO.
  7. Wirować przez 10 min przy 135 x g w temperaturze pokojowej.
  8. Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety o regulowanymj objętości do 1 000 µl, tak aby nie naruszyć granulatu komórkowego.
  9. Dodać 10 mL świeżej pożywki IMDM do probówki 15 mL zawierającej granulat komórkowy.
  10. Delikatnie wymieszać probówkę na wortexie, aby resuspendować komórki.
  11. Powtórzyć kroki od 2.7 do 2.10 jeszcze dwa razy.
  12. Przechowywać komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 do momentu użycia.
    UWAGA: Komórki można przechowywać w inkubatorze do 24 h, jednak zaleca się ich użycie w tym samym dniu.

3. Przygotowanie kontroli

  1. Przenieś następujące materiały do oddzielnych i odpowiednio opisanych probówek 1,5 ml:
    1. Dodaj 500 µL świeżego IMDM zawierającego resuspendowane komórki K562 znakowane DiO do probówki 1,5 mL opisanej jako „Double Positive”.
    2. Dodaj 500 µL świeżego IMDM zawierającego resuspendowane komórki K562 znakowane DiO do probówki 1,5 mL opisanej jako „DiO only”.
    3. Dodaj 500 µL świeżego IMDM zawierającego resuspendowane nieznakowane komórki K562 do probówki 1,5 mL opisanej jako „Propidium Iodide (PI) only”.
  2. Umieść probówki „Double Positive” oraz „PI only” w kąpieli wodnej o temperaturze 55 °C na 5 min.
  3. Po upływie 5 min wyjmij probówki i przetrzyj je 70% etanolem.
  4. Dodaj 10 L PI do probówek 1,5 mL „Double Positive” oraz „PI only”.
  5. Umieść wszystkie trzy kontrole docelowych komórek K562 w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 min.
  6. Po upływie 30 min inkubacji odwiruj wszystkie trzy kontrole docelowych komórek K562 przez 2 min przy 163 x g.
  7. Ostrożnie usuń supernatant, nie naruszając granulatu komórkowego.
  8. Resuspenduj każdą kontrolę w 20 µL świeżej pożywki do hodowli komórkowych IMDM i pozostaw w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez co najmniej 30 min, aby uzyskać optymalny sygnał DiO.
    UWAGA: Kontrole są teraz gotowe do analizy w obrazującym cytometrze przepływowym.

4. Automatyczna separacja komórek NK

  1. Włącz separator komórek i poczekaj na zakończenie cyklu startowego.
  2. Upewnij się, że podświetlenia wszystkich butelek z cieczami są zielone, a butelka na odpady jest pusta.
  3. Przygotuj statyw na probówki 15 mL w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Wybór zależy od objętości próbki. Na przykład dla objętości mniejszej niż 3 mL należy użyć statywu na probówki 15 mL, a dla objętości większej niż 3 mL – statywu na probówki 50 mL.
  4. Odpowiednio opisz probówki z próbkami (powtórz dla każdej próbki/uczestnika): Próbka krwi pełnej Uczestnika 1; Frakcja negatywna Uczestnika 1; Frakcja pozytywna Uczestnika 1.
  5. Ostrożnie pipetuj 1,5 mL krwi pełnej z kroku 1.2 do probówki 15 mL opisanej jako „Próbka krwi pełnej”.
  6. Umieść odpowiednio opisaną probówkę 15 mL z „Próbką krwi pełnej” z kroku 4.5 oraz opisane probówki 15 mL z „Frakcją negatywną” i „Frakcją pozytywną” z kroku 4.4 w statywie. Zastosuj następujący układ statywu: rządek (R1) A: Próbka krwi pełnej, rządek (R2) B: Frakcja negatywna, nieoznaczona, rządek (R4) C: Frakcja pozytywna, oznakowana magnetycznie.
  7. Wsuń statyw separatora do MiniSampler w celu automatycznego etykietowania.
  8. Wybierz opcję „Reagent” w menu i zaznacz pozycję w statywie separatora, w której zostanie umieszczona fiolka.
  9. Wybierz „Read Reagent”, aby aktywować czytnik kodów 2D.
  10. Umieść odpowiednią fiolkę z odczynnikiem przed czytnikiem kodów 2D w odległości od 0,5 do 2,5 cm od osłony czytnika.
    UWAGA: Na przykład odczynnikiem wymaganym do separacji komórek NK jest CD56.
  11. Trzymaj fiolkę z odczynnikiem pod kątem przed czytnikiem kodów 2D w celu uzyskania optymalnego odczytu.
  12. Umieść fiolkę z odczynnikiem w odpowiedniej pozycji w statywie separatora.
  13. Zaznacz pożądane pozycje w zakładce Separation na ekranie.
  14. W podmenu Labeling przypisz program automatycznego etykietowania.
  15. Przypisz odczynnik do separacji komórek CD56 MicroBeads do pozycji statywu 1, 2, 3 i 4.
  16. Wybierz program separacji „posselwb”.
  17. Wybierz program płukania „rinse”.
  18. Wpisz objętość próbki 1 500 µL w podmenu „Volume”, korzystając z klawiatury numerycznej.
  19. Wybierz opcję „Enter” na klawiaturze.
  20. Wybierz „Run”, aby rozpocząć separację komórek.
  21. Wybierz „OK”, aby potwierdzić, że dostępna jest wystarczająca ilość buforu do przetworzenia wszystkich próbek.

5. Liczenie komórek NK po separacji komórek

  1. Bezzwłocznie po separacji komórek za pomocą separatora komórek, pobierz frakcję pozytywną. Pozostaw w temperaturze pokojowej. Frakcja ta zawiera pożądaną, czystą populację komórek NK.
  2. Dla każdej poszczególnej próbki przeprowadź zliczenie komórek przy użyciu hemocytometru zgodnie z krokiem 2.2.
    1. Po obliczeniach zapisz liczbę komórek.

6. Przygotowanie próbek do testu cytotoksyczności

  1. Przygotować i odpowiednio oznakować probówki 1,5 mL dla każdej próbki/uczestnika.
  2. Do każdej probówki pipetować pożądaną proporcję komórek NK oraz komórek K562 znakowanych DiO.
    UWAGA: Na przykład pożądana proporcja komórek docelowych K562 do komórek efektorowych NK wynosi 1:5.
  3. Wirować przez 5 min przy 135 x g.
  4. Ostrożnie usunąć nadsącz, nie naruszając osadu komórkowego.
  5. Resuspender mieszaninę komórek NK i znakowanych DiO komórek K562 w 500 µL pożywki do komórek NK bez interleukiny-2 (IL-2) i 2-merkaptoetanolu (2-ME) (niepełna pożywka do hodowli komórek NK).
    UWAGA: Niepełna pożywka do hodowli komórek NK to Minimum Essential Medium Eagle z wodorowęglanem sodu, bez L-glutaminy, rybonukleozydów i deoksyrybonukleozydów.
  6. Do każdej probówki dodać 5 µL PI.
  7. Wirować przez 2 min przy 163 x g.
  8. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 h.
  9. Po 2 h inkubacji wirować przez 2 min przy 163 x g.
  10. Ostrożnie usunąć nadsącz, nie naruszając osadu komórkowego.
  11. Resuspender komórki w 25 µL niepełnej pożywki do hodowli komórek NK.

7. Przygotowanie próbki spontanicznej („S”)

  1. Do probówki 1,5 mL pipetować 500 µl komórek K562 znakowanych DiO (stężenie 1 x 106 komórek/mL).
  2. Do każdej probówki dodać 10 µL PI.
  3. Wirować probówki przez 2 min przy 163 x g.
  4. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 2 h.
  5. Po 2 h inkubacji wirować przez 2 min przy 163 x g.
  6. Ostrożnie usunąć nadsącz, nie naruszając osadu komórkowego.
  7. Resuspender komórki w 25 µl niepełnej pożywki do hodowli komórkowej alpha-Minimum Essential Medium (α-MEM).

8. Pozyskiwanie danych za pomocą obrazującego cytometru przepływowego

  1. Naciśnij zielony przycisk znajdujący się wewnątrz przednich drzwiczek cytometru przepływowego z obrazowaniem, aby włączyć urządzenie.
  2. Włącz wszystkie komputery powiązane z przepływowym cytometrem obrazującym.
  3. Uruchom oprogramowanie cytometru przepływowego z obrazowaniem.
  4. Kliknij przycisk „Startup”, aby przepłukać system i przygotować linię doprowadzającą próbkę.
  5. Po zakończeniu procedury „Startup” zamknij okno „Calibrations”.
  6. Przypisz kanały: w górnym lewym rogu klikaj kolejno w każdy kanał, aby go przypisać.
  7. Po prawej stronie kliknij przycisk wykresu rozrzutu, aby utworzyć 4 wykresy rozrzutu: Raw Max Pixel _MC_6 względem Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 względem Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 względem Area_M05 oraz FieldArea_M01 względem AspectRatio_M01.
  8. Rozpocznij analizę próbek, używając w pierwszej kolejności kontroli „podwójnie dodatniej”.
    1. Kliknij „Load”.
    2. Umieść probówkę 1,5 ml z próbką „podwójnie dodatnią” (Double Positive) z kroków 3.4–3.9 w podajniku próbek.
    3. Wybierz obiektyw 40X w zakładce „Magnification”.
    4. Włącz lasery o mocy 405 mW i 642 mW.
    5. Włącz kanał „Brightfield”.
    6. Kliknij „Wybierz intensywność”.
    7. Na podstawie próbki kontrolnej „podwójnie dodatniej” należy określić pożądaną intensywność lasera 405 mW w taki sposób, aby nie doprowadzić do przeciążenia detektora.
      Uwaga: Na przykład optymalna intensywność dla tego eksperymentu została ustawiona na 11 mW.
  9. Po uzyskaniu pożądanego ustawienia należy przystąpić do akwizycji danych.
    1. W zakładce „File Acquisition” wpisz własną nazwę pliku. Wybierz folder do zapisu pliku lub plików z danymi.
    2. Wprowadź liczbę komórek do pozyskania obok pola „Collect”. Zazwyczaj liczba ta mieści się w przedziale od 1 000 do 10 000.
    3. Kliknij „Acquire”.
      UWAGA: Po uzyskaniu pożądanej liczby komórek plik danych jest automatycznie zapisywany w wcześniej wybranym folderze.
  10. Po zakończeniu akwizycji należy załadować kolejną próbkę kontrolną – kontrolę z samym DiO.
    1. Kliknij „Load”.
    2. Umieść probówkę 1,5 ml z próbką „tylko DiO” w podajniku próbek.
    3. Pozostaw wybrany obiektyw 40X w zakładce „Magnification”.
    4. Pozostaw włączony laser o mocy 405 mW.
    5. Wyłącz laser 642 mW oraz kanał „Brightfield”.
      UWAGA: Po uzyskaniu pożądanej konfiguracji można przystąpić do akwizycji danych.
    6. W karcie „File Acquisition” (Pozyskiwanie plików) wprowadź nazwę pliku w polu tekstowym i wybierz folder do zapisania plików z danymi. Obok pola „Collect” (Zbieraj) wprowadź liczbę komórek do pozyskania. Zazwyczaj liczba ta wynosi 1000.
    7. Kliknij „Acquire”.
      UWAGA: Po uzyskaniu pożądanej liczby komórek plik z danymi zostanie automatycznie zapisany w wcześniej wybranym folderze.
  11. Powtórz krok 8.10 dla próbki kontrolnej „tylko PI”. Próbki doświadczalne są teraz gotowe do zebrania.
  12. Pozostałe próbki eksperymentalne, w tym „próbki spontaniczne 'S'”, należy traktować w następujący sposób:
    1. Pozostaw wybrany obiektyw 40X w zakładce „Magnification”.
    2. Włącz lasery 405 mW i 642 mW.
    3. Włącz kanał „Brightfield”.
    4. Kliknij „Set Intensity”.
    5. W karcie „File Acquisition” wpisz nazwę pliku i wybierz folder do zapisu plików z danymi. Wpisz nazwę pliku.
    6. Wpisz liczbę komórek do pozyskania obok pola „Collect”.
    7. Kliknij przycisk „Acquire”.
      UWAGA: Po uzyskaniu pożądanej liczby komórek plik danych jest automatycznie zapisywany w wcześniej wybranym folderze.
  13. Powtórz krok 8.12 dla wszystkich próbek badawczych.
  14. Po zebraniu wszystkich danych i plików eksperymentalnych należy kliknąć przycisk „Shutdown”, aby przeprowadzić sterylizację systemu.

9. Analiza próbek w cytometrze przepływowym z obrazowaniem

  1. Otwórz aplikację oprogramowania do analizy obrazowania przepływowego.
  2. W menu „File” otwórz eksperymentalny plik .RIF.
  3. Utwórz nową macierz, korzystając z plików .RIF dla pojedynczych kolorów (kontrola tylko DiO oraz kontrola tylko PI, utworzone w krokach 8.10 i 8.11), wybierając opcję „Create a New Matrix” w zakładce Compensation w oprogramowaniu obrazującego cytometru przepływowego.
    UWAGA: Oprogramowanie poprosi o wybranie plików dla pojedynczych kolorów i połączy je w celu utworzenia pliku macierzy (rozszerzenie .ctm), który należy wybrać, aby zastosować kompensację kanałów.
  4. Utwórz wykresy kropkowe (dot plots), korzystając z funkcji „building blocks” oprogramowania.
    1. Utwórz wykres kropkowy (BrightFieldGradient_RMS vs frequency), aby wyznaczyć bramkę dla komórek w ostrości. Nazwij bramkę „Focus” (Rycina 1A).
    2. Korzystając z bramki „Focus”, utwórz wykres kropkowy Bright Field Area vs Bright Field Aspect Ratio, aby wyznaczyć bramkę dla komórek pojedynczych (singletów). Nazwij bramkę „Single” (Rycina 1B).
    3. Korzystając z bramki „Single”, utwórz wykres kropkowy Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Użyj tego wykresu, aby zidentyfikować i wyznaczyć bramki dla komórek tylko DiO-dodatnich (cele, żywe) oraz komórek podwójnie dodatnich PI-DiO (cele, martwe) (Rycina 1C).
      UWAGA: Wszystkie wykresy opisane w krokach 9.4.1, 9.4.2 i 9.4.3 można utworzyć za pomocą funkcji „building blocks” oprogramowania.
  5. Kliknij funkcję statystyk wykresu kropkowego, aby uzyskać dostęp do liczby komórek w każdej bramce.
  6. Oblicz procent martwych celów w próbce spontanicznej i próbkach eksperymentalnych, korzystając z następującego wzoru:
    % martwych celów w próbce = (# martwych celów x 100)/(# żywych celów + # martwych celów)
  7. Oblicz cytotoksyczność, korzystając z następującego wzoru:
    % cytotoksyczność = [(Experimental dead-Spontaneous dead)/(100-Spontaneous dead)]x100

Analiza danych cytometrii przepływowej; wykresy kropkowe i obrazowanie fluorescencyjne w celu analizy żywotności komórek i ognisk.
Rycina 1: Reprezentatywne histogramy, wykresy kropkowe i obrazy dla analizy aktywności cytotoksycznej. (A) analiza ognisk komórkowych. (B) analiza pojedynczych komórek. (C) analiza barwienia komórek docelowych. Wszystkie oznaczenia są wykonywane przy użyciu obrazu przypisanego do każdego zdarzenia. Można do niego uzyskać dostęp w oprogramowaniu do analizy, po prostu klikając zdarzenie na wykresach. (D) reprezentatywny obraz zdarzenia dubletu, pokazujący apoptotyczną komórkę NK i żywą komórkę docelową K562. Ch01, pole jasne. Ch02, DiO. Ch05, PI. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Oznaczenie liczby komórek NK
Wpływ intensywnego biegania na liczbę komórek NK w krwi pełnej zmierzono, stosując protokół ćwiczeń opisany na Rysunku 2. Próbki krwi pobrano przed ćwiczeniami, bezpośrednio po ćwiczeniach, 1,5 h po ćwiczeniach, a na koniec 24 i 48 h po pierwszym pobraniu krwi. Dla każdego biegacza (Rysunek 3A) oraz średnio (Rysunek 3B) zmierzono stężenie komórek NK na mililitr krwi pełnej dla każdego punktu czasowego.

...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metoda opisana w tym badaniu bezpośrednio mierzy specyficzną aktywność komórek NK danej osoby w odpowiedzi na bodźce (w tym konkretnym przypadku długotrwałe ćwiczenia). Zazwyczaj komórki NK są izolowane z krwi za pomocą gradientów gęstości lub sortowania komórek przy użyciu kombinacji markerów. Chociaż metody te są szeroko stosowane, mają wiele wad: są czasochłonne, obejmują wiele manipulacji i są w dużym stopniu zależne od użytkownika. W rezultacie na izolowane komórki NK wywierany jest nadmierny stres, co może skutkowa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten projekt był wspierany przez Inicjatywę Badań nad Rolnictwem i Żywnością Competitive Grant nr 2100-68003-30395 od Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa USDA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Limfoblasty K-562ATCCCCL-243
Zmodyfikowane podłoże Dulbecco firmy IscoveATCC30-2005Wysoka glukoza, z L-glutaminą, z HEPES, sterylnie filtrowane
Alfa Minimum Niezbędne podłożeATCCCRL-2407Bez rybonukleozydów i dezoksyrybonukleozydów, ale z 2 mM L-glutaminą i 1,5 g/l wodorowęglanu sodu
Roztwór błękitu trypanowego 0,4%AmrescoK940-100ML
Roztwór do barwienia jodku propridiumBD Pharmingen51-66211E
Roztwór do znakowania komórek Vybranto DiOVybrantoV-22886
autoMACS Pro SeparatorMiltenyi Biotec130-092-545
AutoMACS Bufor do bieganiaMiltenyi Biotec130-091-221
Bufor myjący autoMACSMiltenyi Biotec130-092-987
Kolumny autoMACSMiltenyi Biotec130-021-101
Mikrokulki CD56 z krwi pełnej, ludzkieMiltenyi Biotec130-090-875
ImageStream X Mark II Obrazowy cytometr przepływowyEMD Millipore
SpeedbeadsAmnis Corporation400030
0,4-0,7% Podchloryn (Sterylizator)VWRJT9416-1
Redlica Coulter ClenzBeckman Coulter8546929
70% Isopropanol (Debubbler)EMD Millipore1.3704
D-PBS (płyn osłonowy)EMD MilliporeBSS-1006-B (1X)Bez wapnia lub magnezu
OprogramowanieINSPIRE EMD MilliporeVersion Mark II, wrzesień 2013
Oprogramowanie aplikacyjne IdeasEMD Milliporewersja 6.1, lipiec 2014
klasy kulturowej r.

Bibliografia

  1. Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
  2. Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, Suppl 3 131-141 (1994).
  3. Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. Physical activity, immunity and infection. Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).
  4. Nieman, D. C. Marathon training and immune function. Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).
  5. Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. Exercise and the Regulation of Immune Functions. Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).
  6. Walsh, N. P., et al. Position statement. Part one: Immune function and exercise. Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).
  7. Timmons, B. W., Cieslak, T. Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review. Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).
  8. Westermann, J., Pabst, R. Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body. Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).
  9. Boyum, A. Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).
  10. McMillan, R., Scott, J. L. Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects. Blood. 32 (5), 738-754 (1968).
  11. Berk, L. S., et al. The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners. Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).
  12. McAnulty, L. S., et al. Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running. Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).
  13. Millard, A. L., et al. Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation. Front Immunol. 4, 125(2013).
  14. Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , Garland Science. (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Cytotoksyczno kom rek NKcytometria przep ywowaseparacja kom reksortowanie magnetyczneobrazuj cy cytometr przep ywowyjodek propidynykom rki K562znakowanie CD56aktywno cytotoksyczna
Analiza cytometryczna przepływu aktywności litycznej komórek NK w ludzkiej krwi pełnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.