Informacje strukturalne z eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET przy użyciu systemu szybkiego nanopozycjonowania

Summary

Przedstawiamy konfigurację i eksperymentalną procedurę uzyskiwania danych smFRET z dużych sieci donor-akceptor za pomocą mikroskopu TIRF. Analiza tych pomiarów krok po kroku za pomocą oprogramowania do wnioskowania bayesowskiego Fast-NPS pozwala uzyskać informacje strukturalne o wysokiej rozdzielczości dzięki zastosowaniu dostosowanych modeli barwników.

Abstract

Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) może być używany do uzyskiwania informacji strukturalnych o kompleksach biomolekularnych w czasie rzeczywistym. W ten sposób stosuje się wielokrotne pomiary smFRET w celu zlokalizowania nieznanej pozycji barwnika w kompleksie białkowym za pomocą trilateracji. W celu uzyskania informacji ilościowych, Nano-Positioning System (NPS) wykorzystuje probabilistyczną analizę danych do łączenia informacji strukturalnych z krystalografii rentgenowskiej z danymi fluorescencji pojedynczych cząsteczek w celu obliczenia nie tylko najbardziej prawdopodobnej pozycji, ale także pełnego trójwymiarowego rozkładu prawdopodobieństwa, zwanego a posterior, co wskazuje na niepewność eksperymentalną. Koncepcja ta została uogólniona na potrzeby analizy sieci smFRET zawierających liczne cząsteczki barwnika. Najnowsza wersja NPS, Fast-NPS, zawiera nowy algorytm wykorzystujący estymację parametrów bayesowskich w oparciu o próbkowanie Monte Carlo łańcucha Markowa i równoległe temperowanie, który pozwala na analizę dużych sieci smFRET w stosunkowo krótkim czasie. Co więcej, Fast-NPS umożliwia obliczenie tylnego odcinka poprzez wybór jednego z pięciu różnych modeli dla każdego barwnika, które uwzględniają różne zachowania przestrzenne i orientacyjne wykazywane przez cząsteczki barwnika ze względu na ich lokalne środowisko.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół uzyskiwania danych smFRET i stosowania Fast-NPS. Udostępniamy szczegółowe instrukcje dotyczące akwizycji trzech parametrów wejściowych Fast-NPS: wartości smFRET, a także wydajności kwantowej i anizotropii cząsteczek barwnika. Ostatnio NPS został wykorzystany do wyjaśnienia architektury archeonowego otwartego kompleksu promotorowego. Dane te służą do zademonstrowania wpływu pięciu różnych modeli barwnika na rozkład a posteriori.

Introduction

Określenie struktury biomolekuły jest kluczowym warunkiem wstępnym do zrozumienia jej funkcji. Dwie dobrze znane metody określania struktury to mikroskopia krioelektronowa i krystalografia rentgenowska^1,2. Obecnie obie metody dostarczają informacji strukturalnych o wysokiej rozdzielczości z rozdzielczością aż do poziomu angstremów. Te dwie metody są szeroko stosowane do wyjaśnienia struktury dużych biomolekuł, takich jak kompleksy białkowe. Chociaż istniejące metody były stale ulepszane w ciągu ostatnich dziesięcioleci, złożoność struktur biologicznych nadal stanowi poważne wyzwanie dla biologii strukturalnej, w szczególności gdy badane są duże, dynamiczne i przejściowe kompleksy³.

W celu zbadania dynamiki kompleksów makromolekularnych, a w szczególności relacji struktura-funkcja, metodologie jednocząsteczkowe dostarczyły użytecznych informacji⁴. Opracowano kilka nowych strategii zapewniających ortogonalne podejście do pozyskiwania informacji strukturalnych i dynamicznych. Przykładami są szybka AFM⁵, mechanical manipulation⁶, mikroskopia lokalizacji fluorescencji⁷, a także jednocząsteczkowy transfer energii rezonansowej Förster (smFRET)^8,9. Od dość wczesnego czasu FRET był określany mianem linijki molekularnej, ze względu na zależność odległości od skali długości biomakrocząsteczek¹⁰.

Jednym ze szczególnie interesujących zastosowań smFRET jest wykorzystanie informacji o odległości uzyskanych z pomiarów smFRET do wnioskowania o informacjach strukturalnych^{11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23}. Ze względu na wysoką rozdzielczość czasową smFRET, położenie ruchomych części struktury białkowej może być zlokalizowane. Jednakże, aby wydobyć informacje ilościowe z danych smFRET, ważne parametry korekcyjne dotyczące cząsteczek barwnika muszą zostać określone podczas pomiaru²⁴. Dzięki tym współczynnikom korekcyjnym sprawność _{FRET E FRET} można obliczyć za pomocą wzoru

,

gdzie I_{, A} i I_D są intensywnościami fluorescencji odpowiednio cząsteczki donora i akceptora (patrz rysunek 2). Współczynnik β uwzględnia przesłuch, czyli wyciek emisji donorowej do kanału akceptora i jest obliczany przez

gdzie I'_A i I'_D to intensywności fluorescencji cząsteczki donora i akceptora po fotowybielaniu cząsteczki akceptora.

Czynnik γ koryguje różnicę we względnej skuteczności wykrywania w dwóch kanałach, jak również różnice w wydajności kwantowej fluorescencji barwnika donorowego i akceptorowego. Oblicza się go na podstawie każdego pojedynczego śladu czasowego za pomocą

Zauważ, że ten opis pomija bezpośrednie wzbudzenie cząsteczki akceptora, które czasami staje się ważne i również musiałoby zostać poprawione. Do wyznaczenia tych współczynników korekcyjnych przydatne jest pobudzenie zarówno dawcy, jak i akceptora w naprzemiennym schemacie²⁵ w celu rozróżnienia między zmianami fotofizycznymi a dynamiką strukturalną.

Aby nie tylko uzyskać ilościowe efektywność smFRET, ale także ilościowe informacje strukturalne, w 2008 roku wprowadzono Nano-Positioning System (NPS)²⁶. Nazwa została wybrana ze względu na podobieństwa do satelitarnego Globalnego Systemu Pozycjonowania (GPS). NPS jest techniką hybrydową łączącą dane smFRET i krystalografii rentgenowskiej w celu lokalizacji nieznanych pozycji barwników w kompleksach biomakromolekularnych. Struktura krystaliczna służy jako układ odniesienia, a wyniki smFRET są wykorzystywane do uzyskania informacji o odległości między nieznaną pozycją fluoroforu (antena) a pozycją znaną ze struktury krystalicznej (satelita). W kolejnych eksperymentach mierzone są odległości między anteną a kilkoma satelitami, a pozycja anteny jest określana za pomocą statystycznie rygorystycznego schematu analizy opartego na estymacji parametrów bayesowskich. W rezultacie obliczana jest nie tylko najbardziej prawdopodobna pozycja anteny, ale także jej pełny rozkład niepewności 3D, tzw. tylny, wizualizowany za pomocą wiarygodnych objętości. Ponadto NPS został rozszerzony, aby umożliwić analizę kompletnych sieci smFRET²⁷.

NPS został wykorzystany do rozwiązania wielu ważnych kwestii dotyczących transkrypcji eukariotycznej, a mianowicie przebiegu DNA w górę, DNA bez matrycy i powstającego mRNA w kompleksie elongacyjnym polimerazy II RNA^12,28, demonstrując również wpływ czynników inicjujących transkrypcję²⁶ oraz dynamiczną architekturę kompleksu otwartego promotora²⁹. Ponadto NPS wykorzystano do wyjaśnienia struktury archeonowej polimerazy RNA otwartego kompleksu³⁰, a w szczególności pozycji czynnika inicjującego transkrypcję TFE, który wiąże się konkurencyjnie z tym samym miejscem, co czynnik wydłużający transkrypcję Spt4/5³¹.

Od tego czasu opublikowano wiele podejść strukturalnych opartych na smFRET^15,18,21,23. Porównując różne metody strukturalne oparte na smFRET, staje się jasne, że pozorna precyzja metody jest w dużym stopniu zależna od konkretnego wyboru modeli barwników. Należy zauważyć, że cząsteczki barwnika mogą wykazywać różne zachowania przestrzenne i orientacyjne w zależności od ich lokalnego środowiska.

W tym celu wprowadzono Fast-NPS³². Fast-NPS wykorzystuje zaawansowany algorytm próbkowania, który drastycznie skraca czas obliczeń. Co więcej, Fast-NPS pozwala na przeprowadzenie analizy strukturalnej i dla każdej cząsteczki barwnika użytkownik może wybrać z zestawu pięciu różnych modeli barwników, które zostaną opisane w dalszej części. Najbardziej konserwatywny model, zwany klasycznym, zakłada, że barwnik zajmuje tylko jedną, ale nieznaną pozycję. W tej pozycji fluorofor może swobodnie obracać się w stożku, którego rozmiar jest określany na podstawie odpowiedniej (zależnej od czasu) anizotropii fluorescencji. Orientacja stożka nie jest znana, co prowadzi do dużych niepewności przy przeliczaniu zmierzonych sprawności smFRET na odległości. Pod tym względem model jest konserwatywny, ponieważ doprowadzi do najmniejszej precyzji w porównaniu z innymi modelami barwników. Tylko w przypadku bardzo krótkich odległości założenia przyjęte przez klasyczny model powinny prowadzić do zauważalnie błędnego wyznaczenia pozycji. W przypadku typowych wartości smFRET prawidłowa pozycja jest zawsze zamknięta w stosunkowo dużej wiarygodnej objętości.

Jednakże, ponieważ pożądana jest wyższa precyzja, ważne jest opracowanie i przetestowanie alternatywnych modeli barwników, które mogłyby pomóc w poprawie precyzji. Jeśli barwnik obraca się znacznie szybciej niż jego naturalny czas życia fluorescencji, można zastosować tak zwany model iso. W tym przypadku współczynnik orientacji κ² (potrzebny do obliczenia charakterystycznego izotropowego promienia Förstera) jest ustawiony na 2/3. W rezultacie, obliczone wiarygodne objętości są prawie dwa rzędy wielkości mniejsze w porównaniu z tymi w klasycznym modelu³². W przypadku, gdy fluorofor znajduje się w środowisku, które umożliwia nie tylko szybką reorientację, ale dodatkowo szybki ruch po całej jego dostępnej objętości, należy zastosować model meanpos-iso. W tym modelu barwnik faktycznie zajmuje tylko jedną średnią pozycję, w której uśrednianie przestrzenne jest uwzględniane przez wielomianową konwersję odległości¹⁵. Model ten ma zastosowanie, jeśli na przykład (zwykle hydrofobowy) barwnik jest przyłączony do regionu hydrofilowego, np. DNA. Zastosowanie modelu meanpos-iso prowadzi do dalszego zmniejszenia wielkości wiarygodnych objętości około dwukrotnie. Jednak barwnik połączony z białkiem może wiązać się odwracalnie z kilkoma hydrofobowymi plamami w swojej sterycznie dostępnej objętości (AV). Fluorofor, który natychmiast przełącza się między tymi obszarami, ale w obrębie jednego obszaru podlega swobodnej rotacji i szybkiemu ruchowi zlokalizowanemu, najlepiej opisuje model var-meanpos-iso. W podobnej sytuacji, w której barwnik nie może się swobodnie obracać, stosuje się model var-meanpos. Więcej szczegółów na temat tych modeli można znaleźć w naszej najnowszej publikacji³².

Te modele dostarczają obszernego repertuaru, aby uwzględnić różne środowiska, z którymi barwnik może się spotkać, a ich mądre zastosowanie optymalizuje jego precyzję lokalizacji. W Fast-NPS każda cząsteczka barwnika przyłączona do określonej pozycji może być przypisana do indywidualnego modelu, tak więc partnerzy FRET mogą mieć różne modele. Umożliwia to nieograniczone i bliskie naturze modelowanie. Ważne jest jednak, aby przeprowadzić rygorystyczne testy statystyczne, aby upewnić się, że wynik uzyskany przez końcową kombinację modeli jest nadal zgodny z danymi eksperymentalnymi. Testy te są zawarte w oprogramowaniu Fast-NPS.

Aby zastosować Fast-NPS do danych eksperymentalnych, wymagany jest pomiar (tylko) trzech parametrów wejściowych. Po pierwsze, należy wyznaczyć izotropowe promienie Förstera specyficzne dla pary barwników (). W związku z tym należy zmierzyć wydajność kwantową (QY) barwnika donorowego, widma emisji fluorescencji donorowej i widma absorpcji akceptora. Pomiary te można wykonywać masowo, przy użyciu standardowego spektrometru i standardowego spektrometru fluorescencyjnego. Dla każdej pary R₀ jest następnie obliczane za pomocą darmowego programu PhotochemCAD i może być używane w analizie NPS. Ponadto anizotropie fluorescencji (czasowo-rozdzielcze) cząsteczek barwnika należy uzyskać za pomocą spektrometru fluorescencji czułego na polaryzację (i czas). Jednak najważniejszymi parametrami wejściowymi dla Fast-NPS są sprawność smFRET mierzona na mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki, takiej jak mikroskop fluorescencyjny z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM).

Tutaj prezentujemy krok po kroku protokół do uzyskiwania danych smFRET i stosowania Fast-NPS (Rysunek 1).

Protocol

1. Wymagania wstępne i sprzęt laboratoryjny

UWAGA: Montaż komory pomiarowej jest pokazany na rysunku 3. Warstwowa konstrukcja komory pomiarowej składa się z trzech głównych elementów: szkiełka ze szkła kwarcowego (stopionej krzemionki), folii uszczelniającej i szkiełka nakrywkowego, które uszczelnia komorę przepływową. Komora pomiarowa jest zamontowana na niestandardowym uchwycie na próbkę. Wymiary komory na próbkę i metalowego uchwytu są dostosowane tak, aby pasowały do standardowego szkiełka mikroskopowego ze szkła kwarcowego (76 mm x 26 mm).

1. Wytnij szkiełka ze szkła kwarcowego za pomocą wiertła diamentowego (0.75 mm) w miejscach wskazanych na rysunku 4. Konstrukcja szkiełek ze szkła kwarcowego jest asymetryczna, aby rozróżnić dwie strony każdej prowadnicy.
   UWAGA: Szkiełka kwarcowe mogą być ponownie użyte po pomiarze, aż powierzchnia zostanie porysowana.
2. Aby zamontować komory, użyj niestandardowych metalowych uchwytów na próbki, jak pokazano na rysunku 5. Uchwyty na próbki zawierają dwa gwinty (M4) w celu podłączenia rurki dolotowej i wylotowej do komory przepływowej. Ponadto użyj gwintów (M3), aby zamontować komorę na próbkę na metalowym uchwycie, a także gwintów (M3), aby przymocować uchwyt pryzmatu do dolnej połowy metalowego uchwytu.
3. Pomiary smFRET należy wykonać na mikroskopie fluorescencyjnym z całkowitym wewnętrznym odbiciem typu pryzmatycznego (TIRFM) (rysunek 6).
   UWAGA: TIRFM wyposażony jest w trzy lasery: zielony (532 nm, laser Nd:YAG) i czerwony (643 nm, laser diodowy) do wzbudzania cząsteczek donora i akceptora barwnika, a także niebieski laser (491 nm, laser na ciele stałym pompowany diodą) do wybielania fluorescencyjnych zanieczyszczeń tła na komorze próbki przed pomiarem smFRET. Trzy wiązki laserowe są połączone przestrzennie i można je wybrać za pomocą przestrajalnego filtra akustyczno-optycznego (AOTF). Światło fluorescencyjne jest zbierane przez obiektyw o dużej aperturze, dzielone na kanał donorowy i akceptorowy za pomocą zwierciadła dichroicznego i rzutowane na dwie kamery EM-CCD. Komora na próbkę jest przymocowana do stolika mikrometrycznego, umożliwiającego ruch w kierunku x i y za pomocą dwóch silników krokowych. Trzeci silnik piezoelektryczny jest używany wraz z laserem na podczerwień i detektorem czułym na położenie w celu zbudowania systemu automatycznego ustawiania ostrości, aby zapewnić optymalną ostrość przez cały eksperyment.
   1. Stosować zmienne wzbudzenie laserowe (ALEX), gdy obserwowana jest dynamika trajektorii czasowych FRET²⁵. Taka dynamika może być spowodowana albo zmianami konformacyjnymi w cząsteczkach, albo fluktuacjami jasności akceptora i mruganiem akceptora.
      UWAGA: ALEX pozwala na rozróżnienie między tymi dwiema możliwymi przyczynami i zapobiega błędnej interpretacji dynamicznych trajektorii FRET. Jednak dla uproszczenia, część protokołu jest ograniczona do analizy filmów nakręconych bez ALEX.
      Uwaga: Lasery klasy 3B są używane w układzie fluorescencji pojedynczej cząsteczki. Upewnij się, że przed uruchomieniem systemu podjęto odpowiednie środki ostrożności dotyczące lasera, zgodnie z lokalnymi przepisami rządowymi.
4. Wykonać pomiar absorpcji używany do określenia wydajności kwantowej na spektrometrze UV-VIS (patrz Materiały i metody).
5. Wykonać pomiar widma emisyjnego fluorescencji donorowej, widma absorpcji akceptora i anizotropii fluorescencji na spektrometrze fluorescencyjnym (patrz Materiały i metody).
6. Przygotuj komory na próbki zgodnie z opublikowanymi procedurami³³. Alternatywnie można użyć procedury opisanej w [³⁴].
7. Oznaczyć badane próbki parą cząsteczek barwnika donor-akceptor odpowiednią dla smFRET i upewnić się, że na powierzchni komory próbki znajduje się ugrupowanie biotyny do unieruchomienia.
   UWAGA: Aby zlokalizować nieznane położenie barwnika anteny za pomocą oprogramowania Fast-NPS, potrzebne są różne konstrukty próbek. Każdy konstrukt musi mieć jedną etykietę w nieznanym miejscu barwnika anteny i jedną etykietę w pozycji satelitarnej znanej ze struktury krystalicznej. Aby uzyskać dokładne wyniki, wymagane są co najmniej trzy różne konstrukcje z barwnikami przymocowanymi do pozycji anteny i trzy różne pozycje satelitarne. Pomiary między antenami, jak również między satelitami, są również przydatne w celu poprawy dokładności, jednak wymaga to wymiany cząsteczek barwnika, które muszą być prawidłowo wprowadzone do analizy.

2. Montaż komór przepływowych w niestandardowym uchwycie

1. Przeciągnij rurkę silikonową (0.8 mm ID, 2.4 mm OD) w z wydrążonymi (M4) i przytnij rurkę na obu końcach prosto, pozostawiając zwis 1 cm po obu stronach za pomocą ostrej żyletki. Wyreguluj zwis rurki na około 2 mm po jednej stronie z zakładką.
2. Zamontuj komorę przepływową w uchwycie próbki w taki sposób, aby otwory w szkiełku kwarcowym pasowały do gwintów w uchwycie próbki. Delikatnie dokręć wlotowe i wylotowe, aby upewnić się, że wlot i wylot komory próbki są nadal przepuszczalne. Delikatnie dokręć cztery uchwytu szkła akrylowego, aby ustalić położenie komory przepływowej.
3. Pokrój rurkę silikonową (0,58 mm średnicy, 0,96 mm średnicy) na kawałki o długości 20 cm. Włóż jeden z elementów do wlotowej i wylotowej komory pomiarowej. Zamknij rurkę doprowadzającą i wylotową za pomocą clamp.
   UWAGA: Zmontowane komory na próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej do dwóch tygodni.

3. Pomiar smFRET na mikroskopie TIRF

1. Za pomocą strzykawki przemyć komorę na próbkę 500 μl PBS. Przez cały czas należy zapobiegać przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do komory próbki, tworząc kropelkę na końcu rurki wlotowej przed zmianą na inny roztwór buforowy.
2. Przepłukać komorę próbki roztworem 100 μl neutrawarydyny (0,5 mg/ml w PBS) i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
3. Przepłukać roztwór neutrawidyny 500 μl PBS.
4. Przykręć metalowy uchwyt pryzmatu do komory próbki.
5. Zamontuj komorę na próbkę do stolika mikrometrycznego mikroskopu TIRF. Upewnij się, że komora na próbkę jest zamontowana poziomo tak prosto, jak to możliwe przed obiektywem, aby uniknąć rozmycia podczas procesu skanowania.
6. Uruchom oprogramowanie sterujące kamerami EM-CCD oraz oprogramowanie do sterowania silnikami piezoelektrycznymi sceny.
7. Dostosuj ostrość obiektywu mikroskopu, patrząc na odbicia lasera IR.
8. Umieść pryzmat (PS991, n = 1.52) na metalowym uchwycie pryzmatu. Dostosuj boczne położenie pryzmatu, aby upewnić się, że wiązki laserowe uderzają w pryzmat, a następnie użyj kleju i inkubuj w świetle UV przez 5 minut.
   UWAGA: Zamontowany pryzmat może być ponownie użyty poprzez czyszczenie.
9. W oprogramowaniu sterującym kamerą kliknij "Setup Acquisition" i zdefiniuj następujące parametry akwizycji: czas integracji 100 ms, 401 klatek/film (zielona kamera), 400 klatek/film (czerwona kamera), wzmocnienie mnożnika elektronów 225, wzmocnienie przedwzmacniacza 5x i częstotliwość odczytu 3 MHz przy 14 bitach.
10. Utwórz folder na lokalnym dysku twardym do pomiaru. Wybierz żądaną nazwę dla plików pomiarowych, np. Rok-Miesiąc-Dzień. W ustawieniach oprogramowania przejdź do ridera "Auto-Save", włącz "Auto save" i wybierz format pliku *.sif do akwizycji filmu. Wybierz folder na dysku twardym. Użyj nazwy folderu jako stem pliku.
11. Włącz funkcję "AutoIncrement" (ustaw wartość początkową na 1). Włącz dołączanie operatora do nazwy pliku. Użyj "DON" i "ACC" odpowiednio dla kanału dawcy i akceptora. Wybierz "_" jako separator.
12. W oprogramowaniu do sterowania kamerą kliknij "Wideo", aby rozpocząć obraz na żywo z kamery i fluorescencji tła wybielacza, skanując komorę próbki przy użyciu maksymalnej intensywności lasera wszystkich trzech laserów (łącznie ≈3 000 W/^cm2 przez 10 s na pole view).
13. Wyłącz niebieski laser. Zmniejsz intensywność zielonego lasera do około 200 W/^cm2 i do około 40 mW/^cm2 dla czerwonego lasera, jeśli stosowane jest przemienne wzbudzenie laserowe (ALEX).
14. Rozcieńczyć biotynylowaną próbkę fluorescencyjną do stężenia 50-100 pM. Załadować 100 μl roztworu. Próbka jest unieruchomiana na powierzchni komory po związaniu.
    UWAGA: Uważaj, aby nie przeciążać komory. Sąsiednie cząsteczki muszą być od siebie oddzielone.
15. W razie potrzeby załadować do komory dodatkowe 100 μl próbki o 2x większym stężeniu.
16. Uszczelnij rurkę wlotową i wylotową komory pomiarowej za pomocą clamps po zakończeniu ładowania.
17. Wyłącz wszystkie lasery i użyj silników piezoelektrycznych, aby przesunąć komorę przepływową o dwa pola widzenia dalej.
18. W oprogramowaniu do sterowania kamerą kliknij "Take signal" (Weź sygnał), aby rozpocząć nagrywanie filmu i jednocześnie włączyć laser. Upewnij się, że ponad 80% cząsteczek zostanie wybielonych do końca filmu, dostosowując moc lasera.
19. Powtórzyć kroki 3.17 i 3.18 dla całego obszaru komory na próbkę wstępnie wybieloną.

4. Przejęcie Mapy Transformacji ("mapa koralików")

1. Przygotować komorę przepływową zgodnie z opisem w sekcjach 1.1, 1.2 i 2.
2. Użyj fluorescencyjnych kulek wielospektralnych pokrytych awidyną, które pokazują emisję fluorescencji w kanale donorowym i akceptorowym. Wirować bulion przez 1 minutę, następnie rozcieńczyć 50 μL bulionu w 50 μL ddH₂O. Wirować ponownie przez 1 minutę, sonikować 1-2 min, a następnie wirować przez kolejne 10 s.
3. Wykonaj czynności opisane dla pomiarów smFRET (rozdział 3.5-3.10).
4. Załadować 100 μl (objętość 1 komory) rozcieńczonych w stosunku 1:2 kulek fluorescencyjnych do komory przepływowej. Odczekaj 10 minut, aż koraliki fluorescencyjne zwiążą się z powierzchnią.
5. Użyj parametrów akwizycji w 3.9, ale zmień długość filmu na 26 (zielona kamera) i 25 (czerwona kamera), a wzmocnienie mnożnika elektronów na 10.
6. Ustaw intensywność zielonego lasera na wartość 20 W/cm².
7. Nagraj jeden film w polu widzenia z około 50-100 koralikami.

5. Przetwarzanie i analiza danych smFRET

1. Do analizy mapy ściegów (patrz Materiały i metody) oraz pozyskanych filmów należy użyć specjalnie napisanego oprogramowania SM FRET (patrz Materiały i metody). Uruchom program viewPlot1.m.
2. Kliknij na Analiza|Analiza wsadowa, odznacz opcję "ALEX", jeśli nie została użyta. Aby uzyskać najlepszą wydajność, wybierz próg dla znalezienia szczytu "wysoki". Naciśnij "OK".
3. Wybierz "NIE", gdy pojawi się pytanie, czy mapa koralików została już przeanalizowana. Przeglądaj folder zawierający pobraną mapę koralików i wybierz plik *.sif (klikając go dwukrotnie). W następnym oknie dialogowym naciśnij "OK".
   UWAGA: Jeśli mapa ściegu była już analizowana w poprzednim pomiarze, wybierz tutaj "TAK" i wybierz zapisaną mapę ściegów, przechodząc do odpowiedniego folderu i klikając dwukrotnie plik *.map mapy ściegów. Przejdź do kroku 5.8.
4. Wybierz dwa pojedyncze koraliki umieszczone w przeciwległych rogach pola widzenia. Intensywność pikseli jest oznaczona kolorami od ciemnoniebieskiego (niska intensywność) do ciemnoczerwonego (wysoka intensywność).
5. Kliknij środek pierwszego koralika. Jeśli środek cząsteczki może być wyraźnie zlokalizowany za pomocą kodowania kolorami, wybierz "TAK" lub kliknij "NIE" i wybierz inną parę cząsteczek.
6. Ustaw celownik na pikselu pokazującym maksymalną intensywność i naciśnij "KEEP". Powtórz proces z drugim kanałem.
7. Kliknij cząsteczkę w przeciwległym rogu i powtórz kroki 5.5 i 5.6.
   UWAGA: Względne przesunięcie pikseli obu kanałów jest wyświetlane w oknie poleceń, a mapa transformacji jest automatycznie zapisywana jako plik *.map do folderu zawierającego plik beadmap *.sif.
8. Aby załadować filmy dawcy i akceptora (*.sif) do "analizy wsadowej", przejdź do folderu, wybierz wszystkie filmy, które mają być analizowane i kliknij "OK". W następnym oknie dialogowym naciśnij "OK".
   UWAGA: Analiza wsadowa jest zakończona, gdy ostatni pas wyświetlany w oknie poleceń zaczyna się od "Zakończono analizowanie...". Wykryte cząsteczki są wyświetlane w nowym oknie, które wskazuje również względne przesunięcie donora i kanału akceptorowego wyznaczone na podstawie mapy transformacji.
9. Aby załadować wsadowe pliki filmowe, kliknij Plik|Ładunek. Odznacz opcję "ALEX", jeśli nie była używana. Ustaw smoothwidth na 10 i kliknij "OK". Wybierz folder zawierający pliki *.ttr i kliknij "zaznacz wszystko" i "OK" w następnym menu kontekstowym.
10. Jeśli wyświetlany ślad zawiera charakterystyczne fazy smFRET (rysunek 2), naciśnij przycisk przełączania "Nie wybrano" i najpierw wybierz punkt czasowy początku zdarzenia FRET, przesuwając linię kursorem myszy i klikając lewym przyciskiem myszy. Następnie wybierz punkt czasowy bielenia cząsteczki akceptora, a na końcu punkt czasowy bielenia cząsteczki donora.
11. W następnym oknie wydajność FRET jest wykreślona na niebiesko. Aby wybrać ślad, naciśnij przycisk "Tak", w przeciwnym razie wybierz "Nie". Aby ponownie uzyskać dostęp do śledzenia czasu, kliknij przycisk "Poprzedni".
12. Powtarzaj procedurę aż do ostatniej cząsteczki filmu.
13. Po przeanalizowaniu ostatniej cząsteczki w filmie zapisz wybrane ślady, klikając na "Plik|Zapisz". Zapisz wybrane ślady w tym samym folderze, w którym znajdują się pliki *.sif.
14. Powtórz kroki 5.10-5.13 dla wszystkich pobranych filmów.
15. Uruchom program combine_fret_results.m. Wybierz folder zawierający pliki *.res i wszystkie pliki *. FRETonly_trace plików. Zapisz molekularne pliki FRET i FRET dla ramek odpowiednio jako MW.dat i FRW.dat.
    UWAGA: Pliki *.dat są zapisywane jako pliki ASCII. Plik FRW.dat zawiera sześć kolumn i jeden wiersz dla każdej ramki FRET. Szósta kolumna zawiera skorygowaną wydajność fretu dla każdej ramki. Plik MW.dat zawiera 21 kolumn i jeden wiersz na wybraną cząsteczkę FRET. Trzecia kolumna zawiera molekularną wydajność FRET.

6. Wyświetlanie danych smFRET w histogramach

UWAGA: Aby wyodrębnić średnią wydajność smFRET wszystkich zarejestrowanych danych smFRET, dane dotyczące ramki lub cząsteczki są wykreślane na histogramach i analizowane za pomocą dopasowań Gaussa do (wielu) pików. W dalszej części protokół korzysta z komercyjnego oprogramowania do analizy danych (patrz Lista materiałów). Jednak zamiast tego można użyć dowolnego innego dostępnego oprogramowania.

1. Otwórz oprogramowanie do analizy danych (patrz Lista materiałów). Kliknij na Plik|Import|wiele ASCII. Wybierz folder zawierający plik FRW.dat. Wybierz plik i naciśnij "OK". Zaakceptuj opcję wprowadzania za pomocą "OK" bez zmian.
2. Wybierz trzecią kolumnę C(Y) zawierającą skorygowane sprawności FRET, kliknij prawym przyciskiem myszy kolumnę i wybierz Wykres|Statystyki|Histogram. W oknie histogramu kliknij dwukrotnie na kolumny i odznacz "automatyczne binowanie" i wybierz żądany rozmiar kosza, np. 0,05. Wybierz również wartości początkowe i końcowe, np. -0,025 i 1,025.
3. Wybierz kolumny histogramu, klikając je lewym przyciskiem myszy. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "przejdź do arkusza kosza". Wybierz kolumnę "Liczy", klikając ją lewym przyciskiem myszy, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Działka|Kolumna/Pasek/Koło|Kolumna.
4. Na wykresie słupkowym kolumny przejdź do Analiza|Dopasowanie|Dopasowanie krzywej nieliniowej|Otwórz okno dialogowe. Wybierz "Gaussian" w sekcji Funkcja, a następnie przejdź do jeźdźca "Parametr". Usuń zaznaczenie opcji automatycznej inicjalizacji parametrów. Ustal wartość przesunięcia (y0) na 0. Kliknij "Dopasuj".
   UWAGA: Funkcja dopasowania oraz szczegóły dopasowania są teraz wyświetlane na wykresie kolumny. Wartość "xc" określa środek funkcji dopasowania, tj. średnią wydajność FRET, która służy jako parametr wejściowy dla oprogramowania NPS.

7. Pomiar wydajności kwantowej

1. Wykonać ilościowe wyznaczanie wydajności za pomocą metody względnej podobnej do procedury opisanej przez Würth i wsp.³⁵, używając jako standardu rodaminy 101 rozpuszczonej w etanolu (QY = 91,5%).
2. Rejestrować widma absorpcyjne za pomocą spektrometru UV-VIS, wykorzystując objętość 80 μl w kuwecie absorpcyjnej o długości drogi 1 cm. Absorbancja na długości fali, która będzie używana do wzbudzenia fluorescencji, musi wynosić ≤ 0,05.
3. Rejestrować widma emisyjne na spektrometrze skalibrowanym w lampie, pracującym w trybie zliczania fotonów. Pomiary należy wykonać za pomocą polaryzatorów Glan-Thompson na ścieżce wzbudzenia (0°) i emisji (54,7°) (warunki kąta magicznego) przy użyciu szerokości pasma widmowego około 5 nm i 2,5 nm odpowiednio dla monochromatora wzbudzenia i emisji. Mierzyć próbki po przeniesieniu ich do kuwety fluorescencyjnej o długości drogi 3 mm, zwracając uwagę, aby szybkość zliczania nie przekraczała 10^{6 s-1}.
   1. Obliczać uzysk kwantowy zgodnie z

gdzie n i n_Std to odpowiednio współczynniki załamania światła rozpuszczalnika próbki i wzorca. f(λ) i f_Std (λ) to intensywności fluorescencji próbki i wzorca na długości fali λ. A(λ_ex) i A^std (λ_ex) są absorbancją próbki i odniesieniem na długości fali wzbudzenia, a Φ_std jest wydajnością kwantową wzorca.

8. Obliczanie izotropowego promienia Förstera

1. Oblicz izotropowy promień Förstera () od widma emisyjnego cząsteczki donorowej, widma absorpcji cząsteczki akceptora, wydajności kwantowej donora i współczynnika załamania światła. Użyj darmowego programu PhotochemCAD do obliczenia . Jednak zamiast tego można użyć dowolnego innego dostępnego oprogramowania³⁶.

9. Pomiar anizotropii

1. Określ anizotropie fluorescencji w stanie ustalonym na podstawie zapisów widm fluorescencji z różnymi ustawieniami polaryzatora wzbudzenia/emisji (V/V, V/H, H/V, H/H)³⁶.
2. Oblicz współczynnik G, który koryguje artefakty polaryzacji instrumentu, dla każdej długości fali ze współczynnika

i użyj go do obliczenia wartości anizotropii dla każdej długości fali:

gdzie I_xy oznacza intensywność polaryzacji wzbudzenia x i polaryzacji emisyjnej y.

3. Uśrednić wartości w całym zakresie widma emisji, aby obliczyć anizotropię fluorescencji w stanie ustalonym.

10. Instalacja oprogramowania Fast-NPS

1. Pobierz UCSF Chimera z http://www.cgl.ucsf.edu/chimera i postępuj zgodnie z instrukcją instalacji.
2. Wejdź na stronę internetową "Instytutu Biofizyki" Uniwersytetu w Ulm: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html. Pobierz bieżącą wersję Fast-NPS i rozpakuj ją do wybranego folderu. Otwórz podfolder "Pakiet redystrybucyjny" i zainstaluj pakiet redystrybucyjny Visual C++, który jest odpowiedni dla systemu.

11. Centrowanie pliku pdb

1. Otwórz plik (pliki) pdb, który Cię interesuje w Chimera. Wybierz wszystkie atomy kompleksu makromolekularnego i oblicz współrzędne środka ciężkości (Narzędzia|Analiza struktury|Osie/Płaszczyzny/Centroidy|Zdefiniuj środek ciężkości...|Dobrze).
2. Otwórz dziennik odpowiedzi (Ulubione|Rejestr odpowiedzi) i Narzędzie do przekształcania (Narzędzia|Ruch|Przekształć współrzędne). Wprowadź współrzędne środka ciężkości pokazanego w dzienniku odpowiedzi w polu tekstowym "Shift" w oknie Przekształć współrzędne i zmień znak każdej współrzędnej. Naciśnij "Zastosuj" i zapisz plik za pomocą "Zapisz PDB" (Plik|Zapisz plik PDB).

12. Ustawianie pozycji priorów

UWAGA: Wszystkie wartości są brane pod uwagę w angstremie.

1. Uruchom język obliczeń technicznych i zmień bieżący folder na lokalny folder Fast-NPS. Wpisz w oknie poleceń: FastNPS.
2. Utwórz nowy plik zadania w Menedżerze projektów (punkt menu Project|Nowy).
3. Ustaw pozycję przed (punkt menu Narzędzia|Barwnik modelowy wcześniej).
4. W panelu "podstawy prior" zdefiniuj rozdzielczość przestrzenną pozycji prior, wprowadzając jej wartość (zalecane jest 2).
5. Wyklucz wnętrze makrocząsteczki, aktywując pole wyboru i klikając przycisk "załaduj PDB". Wybierz i załaduj wyśrodkowany plik pdb zgodnie z opisem w sekcji 11.
6. Określ przybliżoną średnicę barwnika (zalecane jest 13 A, patrz dyskusja) barwnika, wprowadzając jego wartość.
7. Wprowadź odległość szkieletyzacji, tj. odległość, na jaką cząsteczka barwnika może wniknąć w makrocząsteczkę (zalecane jest 2 A).
8. W panelu "maksymalny rozmiar a prior" wprowadź minimalne i maksymalne współrzędne pozycji prior (zalecane: x w [-150,150], y w [-150,150] i z w [-150,150]).
9. Podczas definiowania satelity należy zaznaczyć pole wyboru "Przyłączanie za pomocą elastycznego łącznika" w panelu "Podstawy wstępne" i wprowadzić w panelu "linker" współrzędne atomu (w wyśrodkowanym pliku pdb), do którego przyłączona jest cząsteczka barwnika. Ponadto określ długość i średnicę konsolidatora, wprowadzając ich wartości (zalecane są 13 A i 4,5 A, patrz dyskusja). W przypadku anteny pomiń ten punkt.
10. Naciśnij przycisk "oblicz dostępną objętość".
11. Zapisz pozycję wcześniej i opcjonalnie wyeksportuj ją w celu wizualizacji za pomocą oprogramowania takiego jak Chimera.

13. Definiowanie geometrii sieci

1. Otwórz okno Definiuj pomiar (punkt menu Mode|Edytuj geometrię).
2. Utwórz nową cząsteczkę barwnika, naciskając przycisk "Nowy" w panelu "Barwniki".
3. Ustaw jego anizotropię fluorescencji (sekcja 9), wprowadzając wartość i wybierz model barwnika z menu rozwijanego "Model barwnika".
4. Naciśnij przycisk "Załaduj", wybierz wcześniej odpowiednią pozycję i zaznacz pole wyboru aktywuj barwnik. Powtórz tę procedurę dla wszystkich barwników, tj. dla wszystkich anten, a także dla wszystkich satelitów.
5. Po utworzeniu wszystkich barwników określ wymiary. Utwórz nowy pomiar, klikając "Nowy" w panelu "Pomiary".
6. Wybierz partnerów FRET z menu rozwijanych "Dye1" i "Dye2" poniżej.
7. Wprowadź wydajność smFRET z błędem i izotropowy promień Förstera tej pary barwników.
8. Na koniec zaznacz pole wyboru aktywuj pomiaru. Powtórz tę procedurę dla wszystkich pomiarów.
   UWAGA: Często sieć staje się coraz bardziej złożona, przez co użytkownik może być zdezorientowany. Aby zapobiec błędom, sprawdź sieć wizualnie, naciskając przycisk "Sprawdź sieć". Rysunek przedstawia aktywowane barwniki i wskazuje pomiary za pomocą linii łączących barwniki FRET.

14. Obliczenia

1. Otwórz okno Obliczenia (punkt menu Mode|Obliczenia).
2. Jeśli każdy barwnik w sieci ma przypisany określony model, wybierz "Zdefiniowany przez użytkownika" i rozpocznij obliczenia, naciskając "Obliczenia". Aby wszystkie barwniki znajdowały się w tym samym modelu, wybierz jeden z pięciu modeli (classic, iso, meanpos-iso, var-meanpos-iso i var-meanpos) i kontynuuj.
   UWAGA: Okno poleceń wskaże postęp obliczeń. Fast-NPS zrobi to za pomocą wyskakującego komunikatu, gdy obliczenia zostaną zakończone.

15. Wizualizacja wyników

1. W celu wyeksportowania wiarygodnych ilości barwników, otwórz okno Wyświetl wyniki (Model|Wyświetlanie wyników).
2. Eksport gęstości barwników:
   1. Eksportuj barwniki pojedynczo lub wszystkie jednocześnie. W celu wyeksportowania pojedynczego barwnika należy go wybrać w panelu "Wyświetlane barwniki" i wcisnąć "Eksport gęstości". Wprowadź rozdzielczość (zalecane jest 2) i wybierz typ pliku do wyeksportowania. Po prawej stronie wyświetlany jest podgląd gęstości i pokazane są niektóre z jej cech matematycznych.
   2. Aby wyeksportować wszystkie barwniki jednocześnie, naciśnij "Eksport wsadowy".
3. Otwórz wynikowe pliki gęstości w Chimerze.

16. Sprawdzanie spójności wybranej kombinacji modeli

1. Otwórz okno Wyświetl wyniki (punkt menu Model|Wyświetlanie wyników). Jeśli w panelu "Informacje o obliczeniach" w polu tekstowym "Spójność" wyświetlana jest wartość niższa niż 90%, oznacza to, że bieżący model nie odzwierciedla w wystarczającym stopniu zmierzonej wydajności smFRET i dlatego jest niespójny.
2. W przypadku niespójności naciśnij przycisk "Szczegółowa spójność". Wyszukaj pomiary, które mają wartość poniżej 90%. Jeśli jeden lub więcej barwników jest głównie zaangażowanych w te pomiary, ich modele prawdopodobnie powodują niespójność. Rozważ różne modele barwników dla tych barwników i ponownie uruchom obliczenia Fast-NPS.

Results

Transkrypcja jest pierwszym krokiem w ekspresji genów we wszystkich organizmach. W archeonach transkrypcja jest przeprowadzana przez pojedynczą polimerazę RNA (RNAP). W porównaniu z eukariontami, archeonowy RNAP wykazuje uderzające podobieństwo strukturalne do swoich eukariotycznych odpowiedników, a jednocześnie ma prostszą maszynerię transkrypcyjną. W ten sposób Archaea może być wykorzystany jako system modelowy do badania inicjacji transkrypcji eukariotycznej przez polimerazę RNA II (Pol II). Niedawno określono pełną architekturę otwartego kompleksu polimerazy archeonów RNA na podstawie jednocząsteczkowych FRET i NPS. Dane z analizy NPS wykorzystano do zbudowania modelu kompletnego archeonowego otwartego kompleksu promotorowego, który dostarcza użytecznych informacji na temat mechanizmu inicjacji transkrypcji.

Aby wyjaśnić tę strukturę, zmierzono wydajność smFRET pomiędzy nieznanymi cząsteczkami barwnika antenowego znajdującymi się w otwartym kompleksie promotorycznym a kilkoma znanymi cząsteczkami barwnika satelitarnego, które zostały włączone w pięciu miejscach referencyjnych w RNAP, których pozycje są znane ze struktur krystalograficznych (pdb-ID: 2WAQ)³⁷. Barwniki antenowe zostały przyłączone do jednej z różnych pozycji na nieszablonowym DNA, TFB, TBP lub TFE. Cała sieć wykorzystana w tym badaniu składała się z ponad 60 zmierzonych odległości.

Rysunek 7 przedstawia model kompletnego archeonowego otwartego kompleksu promotorów zbudowanego na podstawie analizy NPS. Składa się z dwuniciowego promotorowego DNA (jasnoniebieskiego i ciemnoniebieskiego), polimerazy RNA (szarej) oraz czynników inicjujących transkrypcję TBP (fioletowy), TFB (zielony) i TFE (żółty). Na model nakładają się wyniki analizy NPS, czyli wiarygodne objętości, które zostały obliczone przy użyciu modelu klasycznego (A), modelu iso (B), modelu meanpos-iso (C), modelu var-meanpos-iso (D) oraz modelu var-meanpos (E).

Rysunek 1: Przebieg procesu pozyskiwania i przetwarzania parametrów potrzebnych do obliczenia Fast-NPS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykładowy ślad intensywności fluorescencji w czasie zdarzenia smFRET. Intensywność fluorescencji donora (kolor zielony) i cząsteczki akceptora (kolor czerwony) przedstawiająca trzy charakterystyczne fazy, a mianowicie: I: smFRET, II: fluorescencja dawcy po fotowybielaniu akceptorowym, III: fluorescencja tła po fotowybielaniu donora. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schematyczna ilustracja komory przepływowej do eksperymentów smFRET. Komora przepływowa jest zamontowana na niestandardowym metalowym uchwycie z uchwytami ze szkła akrylowego. Konstrukcja warstwowa komory przepływowej składa się ze zjeżdżalni ze szkła kwarcowego (stopiona krzemionka) z dwoma otworami do mocowania przewodów dolotowych i wylotowych, folii uszczelniającej i szkiełka nakrywkowego, które zamyka komorę przepływu. Pryzmat do oświetlenia TIRF jest zamontowany w dolnej połowie komory przepływowej. z wydrążonym zapewniają wlot i wylot komory przepływowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przygotowanie szkiełka ze szkła kwarcowego i folii uszczelniającej. Rysunek mechaniczny szkiełka kwarcowego wskazujący położenie otworów (podane w milimetrach). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Rysunek mechaniczny komory przepływowej. Wymiary aluminiowego uchwytu pryzmatu, uchwytów ze szkła akrylowego i aluminiowej ramy montażowej podane są w milimetrach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Schematyczna ilustracja konfiguracji TIRF typu pryzmatycznego używanej w eksperymentach smFRET. Skróty elementów optycznych: A, apertura; DM, zwierciadło dichroiczne; F, filtr emisyjny; L, soczewka; M, lustro; O, obiektywny; P, pryzmat; PSD, fotodioda światłoczuła na położenie; S, próbka; PS, etap pozycjonowania; T, teleskop. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Wyniki symulacji różnych założeń modelu. Wszystkie zdjęcia pokazują archeonową polimerazę RNA (pdb-ID: 2WAQ, widok z góry) wraz z modelem promotora DNA (tDNA i ntDNA odpowiednio na niebiesko i niebiesko), TBP (fioletowy), TFB (zielony) i TFE (żółty) w archeonowym kompleksie otwartym³⁰. Wiarygodne objętości są nakładane na wyniki symulacji NPS dla (A) modelu klasycznego, (B) modelu iso, (C) modelu meanpos-iso, (D) modelu var-meanpos-iso i (E) modelu var-meanpos. Wszystkie tomy są pokazane z 68% wiarygodnością. Sieci klasyczne i var-meanpos są zgodne z danymi smFRET. Natomiast sieci, w których dla wszystkich barwników wybierany jest model iso, meanpos-iso lub var-meanpos-iso, są niespójne z danymi pomiarowymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Przedstawiamy konfigurację i procedurę eksperymentalną w celu dokładnego określenia wydajności FRET między barwnikami przyłączonymi za pomocą elastycznych łączników do biomakrocząsteczek, tj. kwasów nukleinowych i/lub białek.

W celu zapewnienia precyzyjnych pomiarów smFRET (sekcja 3) kluczowe jest wykluczenie powietrza z komory przepływowej w dowolnym momencie pomiaru. Ponadto należy uważać, aby nie przeciążać komory przepływowej fluoroforami. Fluorofory muszą być wyraźnie oddzielone, aby zapewnić prawidłową analizę. Ponieważ pary smFRET, które nie wykazują bielenia dawcy, muszą zostać wyłączone z analizy, upewnij się, że >80% cząsteczek w polu widzenia jest wybielonych na końcu filmu. Aby uwzględnić niejednorodności w próbce, współczynnik β i czynnik γ, korygujące przesłuchy i względną skuteczność wykrywania odpowiednio kanału donorowego i akceptorowego, są obliczane indywidualnie dla każdej pary FRET.

Ustawienia kamery (czas całkowania, wzmocnienie mnożnika elektronów, wzmocnienie przedwzmacniacza i szybkość odczytu opisane w rozdziale 3.9) powinny być ustawione na wartości zapewniające najlepszy kompromis między stosunkiem sygnału do szumu, zakresem dynamiki i rozdzielczością czasową. Muszą one zostać ponownie dostosowane do różnych eksperymentów lub jeśli używany jest inny sprzęt. Liczba ramek musi być wystarczająco duża, aby zapewnić, że większość cząsteczek dawcy wybieli się w czasie obserwacji.

W przypadku pomiarów na spektrometrze fluorescencyjnym (sekcje od 7 do 9) należy znaleźć dobry kompromis między intensywnością sygnału a rozdzielczością widmową zarejestrowanych danych. W tym celu szczeliny w ścieżce wzbudzenia i emisji spektrometru fluorescencyjnego muszą być dostosowane w zależności od użytego przyrządu i stężenia próbki.

Ponadto przedstawiono metodę analizy Fast-NPS służącą do uzyskiwania informacji strukturalnych o przejściowych lub dynamicznych kompleksach makromolekularnych. NPS zastosowano w celu ujawnienia ścieżki nici DNA bez matrycy oraz położenia czynników inicjujących transkrypcję w otwartym kompleksie polimerazy archeonów RNA. Korzystając z sieci ponad 60 różnych pomiarów odległości, wykazaliśmy, że Fast-NPS, wyposażony w nowo zaimplementowany silnik próbkowania (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., & Michaelis, J. w przygotowaniu), skraca czas potrzebny na analizę tej złożonej sieci smFRET o ≈2 rzędy wielkości, w porównaniu z oryginalną globalną metodą NPS²⁷. Solidność algorytmu jest zakorzeniona w samplerze Metropolis-within-Gibbs w połączeniu ze schematem równoległego temperowania. Fast-NPS pokazuje dokładną odtwarzalność wyników sieci i jest spójny z wynikami opublikowanymi wcześniej³⁰.

Opublikowano kilka różnych metod mających na celu wywnioskowanie informacji strukturalnych z pomiarów smFRET 11,12,13,14,15,16,17,18. Wszystkie te podejścia zapewniają tylko jeden konkretny model barwnika. Tym samym barwniki, które nie spełniają założeń przyjętych przez dany model, nie mogą być stosowane ani prowadzić do fałszywych informacji strukturalnych. Fast-NPS, wręcz przeciwnie, pozwala dobrać do każdej cząsteczki barwnika inny model. Pomaga to wyjaśnić różne zachowania konformacyjne zarówno samej cząsteczki barwnika, jak i łącznika używanego do jej przyłączania. Lokalne otoczenie molekularne cząsteczki barwnika, a także jego właściwości fizyczne określą, który model jest najbardziej odpowiedni.

Dla analizowanej sieci smFRET archeonowego kompleksu inicjacyjnego założenie izotropowe dla wszystkich cząsteczek barwnika prowadzi do drastycznego zmniejszenia wielkości wiarygodnych objętości w porównaniu z modelem klasycznym. W połączeniu z dynamicznym uśrednianiem pozycji dla wszystkich cząsteczek barwnika, mediana wszystkich wiarygodnych wielkości objętości (na poziomie 95%) zmniejsza się do mniej niż 0,5 nm³. Jednak te późniejsze cząsteczki barwnika nie są już zgodne z ich pomiarami smFRET, co wskazuje, że przyjęte założenia prowadzą do fałszywych informacji strukturalnych. Natomiast posteriory wyznaczone w modelu klasycznym są zgodne z wyznaczonymi sprawnościami smFRET.

Ponieważ założenie izotropowego i/lub dynamicznego uśredniania pozycji dla wszystkich barwników prowadzi do niespójności, Fast-NPS umożliwia wcześniejsze określenie cząsteczek barwnika, w których każdemu barwnikowi można przypisać jeden z pięciu modeli. Każdy model korzysta z tej samej dostępnej objętości. Algorytm obliczania barwnika AV przyjmuje kilka założeń. Początkowo przestrzenny kształt fluoroforu jest przybliżony przez kulę. W związku z tym należy użyć średnicy uwzględniającej szerokość, wysokość i grubość fluoroforu (sekcja 12). Ponadto kształt łącznika jest przybliżony za pomocą elastycznego pręta. Wartości przedstawione w sekcji 12 zostały obliczone dla barwnika Alexa 647 podłączonego za pomocą łącznika 12-C. Do tej pory nie jest możliwe dokładne określenie a priori, który model jest najbardziej odpowiedni, biorąc pod uwagę geometrię eksperymentalną, a zatem wszystkie modele powinny zostać przetestowane. Ogólnie rzecz biorąc, wybiera się model, który daje najmniejszy możliwy rozmiar tylny, a jednocześnie jest zgodny z danymi. Aby sprawdzić, czy wybór modeli jest zgodny z danymi smFRET, obliczamy zarówno prawdopodobieństwo, jak i a posteriori. Spójność oznacza, że ponad 90% próbek pobranych z tylnego odcinka mieści się w 95% przedziale ufności prawdopodobieństwa.

Chociaż prawdą jest, że im niższa anizotropia, tym mniejsza niepewność odległości, w sieci smFRET należy również wziąć pod uwagę geometryczne układy cząsteczek barwnika. Tak więc, podczas gdy reprezentowanie cząsteczek barwnika o niskiej anizotropii fluorescencji za pomocą modelu ISO jest typowym pierwszym wyborem, test konsystencji zapewnia bardziej bezpośredni sposób wyboru właściwego modelu barwnika. Optymalny wybór modeli barwników może prowadzić do drastycznego wzrostu precyzji lokalizacji, a jednocześnie zachować spójność sieci z danymi FRET.

Podsumowując, Fast-NPS pozwala na uzyskanie informacji strukturalnych i dynamicznych o dużych kompleksach makromolekularnych. W przeciwieństwie do powszechnych metod strukturalnych, takich jak krystalografia rentgenowska lub kriomikroskopia elektronowa, pozwala to na monitorowanie wysoce elastycznych lub przejściowych kompleksów, co znacznie poszerza naszą mechanistyczną wiedzę na temat złożonych procesów biologicznych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Przygotowanie komory przepływowej
Indywidualny uchwyt na próbki metalowe	samodzielnie zbudowany	bez
szkiełek kwarcowych, 76  mm x 26  mm	Szkiełka techniczne	26007
szkiełka nakrywkowe, 60 mm x 24  mm	do 101242		Marienfeld
, Hellmanex II	Hellma	320.001
ultraczysta woda od Synergy UV	Millipore	2512600
Myjka plazmowa Zepto	Diener	n/a
(3-aminopropylo)-trietoksysilan, p.a.	Sigma-Aldrich	A3648
walerianian metoksy PEG-sukcynimidylu, 5 kDa	Laysan Bio Inc.	MPEG-SVA-5000-1g
biotynylowany walerianian PEG-sukcynimidylu, 5 kDa	Laysan Bio Inc.	BIOTIN-PEG-SVA-5000
Biowęglan sodu	Sigma-Aldrich	S5761 Sigma
Węglan sodu	Sigma-Aldrich	S2127 Sigma-Aldrich
folia uszczelniająca (Nescofilm)	Fisher Scientific	12981805
Tygon Elastyczny przewód silikonowy, 0,8  mm ID, 2.4  mm OD	Saint-Gobain Performance Plastics	720958
Rurki polietylenowe o drobnych otworach, 0,58 mm ID, 0,96 mm OD (Smiths Medical)	Fisher Scientific	12665497
Neutravidin	Life Technologies	A2666
Mikroskop fluorescencyjny z całkowitym wewnętrznym odbiciem
Nd:YAG Laser, 532 nm	Newport Spectra-Physics	EXLSR-532-100-CDRH
pompowany diodowo laser półprzewodnikowy, 491 nm, laser diodowy Calypso	Cobolt	904010050
643 nm, iBeam smart	Toptica	iBEAM-SMART-640-S
zwierciadło dichroiczne, 532 RDC	Chroma	F33-540
zwierciadło dichroiczne, 476 RDC	Chroma	F33-476z
akustyczno-optyczny filtr przestrajalny	AA Optoelektroniczna	soczewka cylindryczna plano-wypukła AOTFnC-VIS
, f = 75 mm	Thorlabs	LJ1703L1-A
płasko-wklęsła cylindryczna, f = -300  mm	Thorlabs
PS 991	Thorlabs	PS991
, f = 75  mm	Thorlabs	LA1608-B
, PHD 2000	Harvard Apparatus	70-2002
2 silniki krokowe, Z812B	Thorlabs	Z812B
PE4	Thorlabs	PE4
IR	Edmund Optics	CPS808	część systemu autofokusa
lustro dichroiczne, 775 DCXR	Chroma	775 DCXR
detektor położenia (PSD), PDP90A	Thorlabs	PDP90A	część systemu autofokusa
obiektyw zanurzeniowy w wodzie, Plan Apo 60X WI, NA 1.2	Nikon		MRD07601
zwierciadło dichroiczne, 645 DCXR	Chroma	645 DCXR	część filtra emisji ścieżki
emisji, 3RD550-510	Omega Optical	3RD550-510	zielony kanał w filtr emisyjny ścieżki emisyjnej
, 3RD660-760	Omega Optical	3RD660-760	czerwony kanał w ścieżce emisyjnej
kamera EMCCD, iXon+ DU897EBV	Andor	AND-20-00032
Kamera EMCCD, iXon3 DU897D-BV	Andor	AND-20-000141
Różne
Varian 50	Cary		Spektrometr UV-VIS
Fluorolog2	SPEX		spektrometr fluorescencyjny
Solis (V4.15)	Oprogramowanie sterujące Andor		do kamery EM-CCD
Narzędzie użytkownika Apt  (wersja 1.022)	Oprogramowanie sterujące Thorlabs		dla silników piezoelektrycznych
Norland Optical Adhesive 68	Klej Thorlabs
PC-AFN-0.8 Nil czerwony	Kisker Biotech		fluorescencyjne koraliki multispec powlekane awidyną
Matlab	Mathworks		dla oprogramowania pisanego dla klientów
Origin (V9.0)	Oprogramowanie do tworzenia wykresów naukowych i analizy danych	Originlab
Hellma 105-202-15-40	Hellma	105-202-15-40	o średnicy 1  cm długość ścieżki
Hellma 105-251-15-40	Hellma	105-251-15-40	kuweta fluorescencyjna o długości ścieżki 3 mm