Artykuł metodologiczny

Informacje strukturalne z eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET przy użyciu systemu szybkiego nanopozycjonowania

12.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54782

⸱

9 lutego 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Biophysics, Ulm University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy konfigurację i eksperymentalną procedurę uzyskiwania danych smFRET z dużych sieci donor-akceptor za pomocą mikroskopu TIRF. Analiza tych pomiarów krok po kroku za pomocą oprogramowania do wnioskowania bayesowskiego Fast-NPS pozwala uzyskać informacje strukturalne o wysokiej rozdzielczości dzięki zastosowaniu dostosowanych modeli barwników.

Streszczenie

Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) może być używany do uzyskiwania informacji strukturalnych o kompleksach biomolekularnych w czasie rzeczywistym. W ten sposób stosuje się wielokrotne pomiary smFRET w celu zlokalizowania nieznanej pozycji barwnika w kompleksie białkowym za pomocą trilateracji. W celu uzyskania informacji ilościowych, Nano-Positioning System (NPS) wykorzystuje probabilistyczną analizę danych do łączenia informacji strukturalnych z krystalografii rentgenowskiej z danymi fluorescencji pojedynczych cząsteczek w celu obliczenia nie tylko najbardziej prawdopodobnej pozycji, ale także pełnego trójwymiarowego rozkładu prawdopodobieństwa, zwanego a posterior, co wskazuje na niepewność eksperymentalną. Koncepcja ta została uogólniona na potrzeby analizy sieci smFRET zawierających liczne cząsteczki barwnika. Najnowsza wersja NPS, Fast-NPS, zawiera nowy algorytm wykorzystujący estymację parametrów bayesowskich w oparciu o próbkowanie Monte Carlo łańcucha Markowa i równoległe temperowanie, który pozwala na analizę dużych sieci smFRET w stosunkowo krótkim czasie. Co więcej, Fast-NPS umożliwia obliczenie tylnego odcinka poprzez wybór jednego z pięciu różnych modeli dla każdego barwnika, które uwzględniają różne zachowania przestrzenne i orientacyjne wykazywane przez cząsteczki barwnika ze względu na ich lokalne środowisko.

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół uzyskiwania danych smFRET i stosowania Fast-NPS. Udostępniamy szczegółowe instrukcje dotyczące akwizycji trzech parametrów wejściowych Fast-NPS: wartości smFRET, a także wydajności kwantowej i anizotropii cząsteczek barwnika. Ostatnio NPS został wykorzystany do wyjaśnienia architektury archeonowego otwartego kompleksu promotorowego. Dane te służą do zademonstrowania wpływu pięciu różnych modeli barwnika na rozkład a posteriori.

Wprowadzenie

Wyznaczenie struktury biomolekuły jest kluczowym warunkiem wstępnym do zrozumienia jej funkcji. Dwiema uznanymi metodami wyznaczania struktury są krio-mikroskopia elektronowa oraz krystalografia rentgenowska1,2. Obecnie obie metody dostarczają wysokorozdzielczych informacji strukturalnych z rozdzielczością sięgającą poziomu angstremów. Obie te metody były szeroko stosowane do wyjaśnienia struktury dużych biomolekuł, takich jak kompleksy białkowe. Choć istniejące metody były stale udoskonalane przez ostatnie dekady, złożoność struktur biologicznych wciąż stanowi główne wyzwanie dla biologii strukturalnej, w szczególności w przypadku badania dużych, dynamicznych i przejściowych kompleksów3.

W celu badania dynamiki kompleksów makromolekularnych, a w szczególności zależności między strukturą a funkcją, niezwykle przydatne informacje dostarczyły metodologie pojedynczych cząsteczek4. Opracowano kilka nowych strategii zapewniających ortogonalne podejście do pozyskiwania informacji strukturalnych i dynamicznych. Przykładami są szybka AFM5, manipulacja mechaniczna6, mikroskopia lokalizacji fluorescencji7, a także transfer energii rezonansowej Förstera w pojedynczych cząsteczkach (smFRET)8,9. Ze względu na zależność od odległości w skali długości biomakromolekuł, FRET od dość dawna określa się mianem molekularnej linijki10.

Jednym z szczególnie interesujących zastosowań smFRET jest wykorzystanie informacji o odległości uzyskanych z pomiarów smFRET do wywnioskowania informacji strukturalnych11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. Dzięki wysokiej rozdzielczości czasowej smFRET możliwe jest zlokalizowanie pozycji ruchomych części struktury białka. Jednak w celu wyodrębnienia ilościowych informacji z danych smFRET, podczas pomiaru należy określić istotne parametry korekcyjne dotyczące cząsteczek barwnika24. Przy użyciu tych współczynników korekcyjnych można obliczyć wydajność FRET EFRET korzystając ze wzoru

Wzór na wydajność FRET \(E_{FRET}=\frac{I_A-\beta \cdot I_D}{I_A+\gamma \cdot I'_D}\); metoda spektroskopowa.,


gdzie IA i ID to odpowiednio intensywności fluorescencji cząsteczki akceptora i donora (patrz Rysunek 2). Współczynnik β uwzględnia tzw. cross-talk, czyli przenikanie emisji donora do kanału akceptora, i jest obliczany według wzoru

Wzór na równowagę statyczną, β=I'A/I'D, równanie stosowane w analizie mechanicznej.

gdzie I'A i I'D to intensywności fluorescencji cząsteczki akceptora i donora po fotowybieleniu cząsteczki akceptora.

Współczynnik γ koryguje różnicę w względnej wydajności detekcji w dwóch kanałach, a także różnice w kwantowej wydajności fluorescencji barwnika donora i akceptora. Oblicza się go dla każdego pojedynczego przebiegu czasowego według wzoru

Wzór na korekcję gamma, ΔIA/ΔID, wyrażenie matematyczne dla analizy przetwarzania obrazu.

Należy zauważyć, że opis ten pomija bezpośrednie wzbudzenie cząsteczki akceptora, co niekiedy staje się istotne i wymagałoby wprowadzenia odpowiednich korekt. Do wyznaczenia tych współczynników korekcji użyteczne jest wzbudzanie zarówno donora, jak i akceptora w schemacie naprzemiennym25, aby odróżnić zmiany fotofizyczne od dynamiki strukturalnej.

Aby uzyskać nie tylko ilościowe wartości wydajności smFRET, ale także ilościowe informacje strukturalne, w 2008 roku wprowadzono System Nanopozycjonowania (Nano-Positioning System, NPS)26. Nazwa ta została wybrana ze względu na podobieństwo do satelitarnego Systemu Pozycjonowania Globalnego (GPS). NPS jest techniką hybrydową łączącą dane smFRET i krystalografii rentgenowskiej w celu lokalizacji nieznanych pozycji barwników w kompleksach biomakromolekularnych. Struktura krystaliczna służy jako układ odniesienia, a wyniki smFRET są wykorzystywane do uzyskania informacji o odległości między nieznaną pozycją fluoroforu (antena) a pozycją znaną ze struktury krystalicznej (satelita). W kolejnych eksperymentach mierzy się odległości między anteną a kilkoma satelitami, a pozycja anteny jest wyznaczana za pomocą statystycznie rygorystycznego schematu analizy opartego na bayesowskiej estymacji parametrów. W rezultacie obliczana jest nie tylko najbardziej prawdopodobna pozycja anteny, ale także jej pełny trójwymiarowy rozkład niepewności, tzw. rozkład a posteriori, wizualizowany za pomocą objętości wiarygodnych (credible volumes). Ponadto system NPS został rozszerzony, aby umożliwić analizę kompletnych sieci smFRET27.

Metoda NPS została wykorzystana do rozwiązania szeregu istotnych kwestii dotyczących transkrypcji u eukariotów, a mianowicie przebiegu powyżej położonego DNA, DNA niematrycowego oraz powstającego mRNA w obrębie kompleksu elongacyjnego polimerazy RNA II12,28, wykazując również wpływ czynników inicjacji transkrypcji26 oraz dynamiczną architekturę otwartego kompleksu promotora29. Ponadto NPS wykorzystano do wyjaśnienia struktury otwartego kompleksu polimerazy RNA archeonów30, a w szczególności pozycji czynnika inicjacji transkrypcji TFE, który wiąże się konkurencyjnie w tym samym miejscu co czynnik elongacji transkrypcji Spt4/531.

Od tego czasu opublikowano szereg podejść strukturalnych opartych na smFRET15,18,21,23. Porównując różne strukturalne metody oparte na smFRET, staje się jasne, że pozorna precyzja metody jest w dużej mierze zależna od konkretnego wyboru modeli barwników. Należy zauważyć, że cząsteczki barwników mogą wykazywać różne zachowania przestrzenne i orientacyjne w zależności od ich lokalnego otoczenia.

W tym celu wprowadzono metodę Fast-NPS32. Fast-NPS wykorzystuje zaawansowany algorytm próbkowania, który drastycznie skraca czas obliczeń. Ponadto Fast-NPS umożliwia przeprowadzenie analizy strukturalnej, a dla każdej cząsteczki barwnika użytkownik może wybrać jeden z pięciu różnych modeli barwników, które zostaną opisane poniżej. Najbardziej konserwatywny model, nazwany classic, zakłada, że barwnik zajmuje tylko jedną, lecz nieznaną pozycję. W tej pozycji fluorofor może swobodnie obracać się wewnątrz stożka, którego rozmiar jest określany na podstawie odpowiadającej mu (zależnej od czasu) anizotropii fluorescencji. Orientacja stożka jest nieznana, co prowadzi do dużych niepewności podczas przeliczania zmierzonych wydajności smFRET na odległości. W tym względzie model ten jest konserwatywny, ponieważ w porównaniu z innymi modelami barwników prowadzi on do najmniejszej precyzji. Dopiero w przypadku bardzo krótkich odległości założenia modelu classic powinny prowadzić do zauważalnie błędnego wyznaczenia pozycji. Dla typowych wartości smFRET poprawna pozycja jest zawsze zawarta w stosunkowo dużej objętości wiarygodnej.

Ponieważ jednak pożądana jest wyższa precyzja, ważne jest opracowanie i przetestowanie alternatywnych modeli barwnika, które mogłyby pomóc w jej poprawie. Jeśli barwnik obraca się znacznie szybciej niż wynosi jego naturalny czas życia fluorescencji, można zastosować tzw. model iso. W tym przypadku czynnik orientacji κ2 (niezbędny do obliczenia charakterystycznego izotropowego promienia FörsteraR_iso=0, wzór równowagi statycznej, równanie fizyczne, użytek edukacyjny) przyjmuje wartość 2/3. W rezultacie obliczone objętości wiarygodne są niemal o dwa rzędy wielkości mniejsze w porównaniu z objętościami w modelu klasycznym32. W przypadku, gdy fluorofor znajduje się w środowisku umożliwiającym nie tylko szybką reorientację, ale dodatkowo szybki ruch w całej dostępnej dla niego objętości, należy zastosować model meanpos-iso. W tym modelu barwnik efektywnie zajmuje tylko jedną średnią pozycję, w której uśrednianie przestrzenne jest uwzględniane poprzez wielomianową konwersję odległości15. Model ten ma zastosowanie na przykład wtedy, gdy (zazwyczaj hydrofobowy) barwnik jest przyłączony do regionu hydrofilowego, np. do DNA. Zastosowanie modelu meanpos-iso prowadzi do dalszej redukcji wielkości objętości wiarygodnych o czynnik wynoszący w przybliżeniu dwa. Jednak barwnik połączony z białkiem może wiązać się odwracalnie z kilkoma płatami hydrofobowymi w swojej sterycznie dostępnej objętości (AV). Fluorofor, który natychmiast przełącza się między tymi regionami, ale w obrębie jednego regionu wykonuje swobodny obrót i szybki ruch lokalny, jest najlepiej opisany przez model var-meanpos-iso. W podobnej sytuacji, w której barwnik nie może swobodnie rotować, stosuje się model var-meanpos. Więcej szczegółów na temat tych modeli można znaleźć w naszej niedawnej publikacji32.

Modele te zapewniają szeroki repertuar, który pozwala na specyficzne uwzględnienie różnych środowisk, w jakich może znajdować się barwnik, a ich przemyślane zastosowanie optymalizuje precyzję lokalizacji. W programie Fast-NPS każdą cząsteczkę barwnika przyłączoną do określonej pozycji można przypisać do indywidualnego modelu, dzięki czemu partnerzy FRET mogą posiadać różne modele. Umożliwia to nielimitowane modelowanie, bliskie warunkom naturalnym. Ważne jest jednak, aby przeprowadzić rygorystyczne testy statystyczne w celu upewnienia się, że wynik uzyskany przez końcową kombinację modeli jest nadal zgodny z danymi eksperymentalnymi. Testy te są zawarte w oprogramowaniu Fast-NPS.

Aby zastosować metodę Fast-NPS do danych eksperymentalnych, wymagany jest pomiar (tylko) trzech parametrów wejściowych. Po pierwsze, należy wyznaczyć izotropowe promienie Förstera specyficzne dla danej pary barwników (Równanie statycznej równowagi \( R_0^{iso} \); schemat inżynieryjny lub fizyczny.). W tym celu należy zmierzyć wydajność kwantową (QY) barwnika donora, widma emisji fluorescencji donora oraz widma absorpcji akceptora. Pomiary te można przeprowadzić w roztworze objętościowym, wykorzystując standardowy spektrometr oraz standardowy spektrometr fluorescencyjny. Dla każdej pary wartość R0 jest następnie obliczana za pomocą bezpłatnego oprogramowania PhotochemCAD i może być wykorzystana w analizie NPS. Ponadto, przy użyciu spektrometru fluorescencyjnego czułego na polaryzację (i czas), należy wyznaczyć (rozdzielcze w czasie) anizotropie fluorescencji cząsteczek barwnika. Jednak najważniejszymi parametrami wejściowymi dla Fast-NPS są wydajności smFRET mierzone na układzie do mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek, takim jak mikroskop fluorescencyjny z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM).

W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół pozyskiwania danych smFRET oraz zastosowania metody Fast-NPS (Rysunek 1).

Protokół

1. Wymagania wstępne i sprzęt laboratoryjny

UWAGA: Montaż komory pomiarowej przedstawiono na Rysunku 3. Konstrukcja komory pomiarowej typu „sandwich” składa się z trzech głównych elementów: szkiełka z kwarcowego szkła (topionego), folii uszczelniającej oraz lamellki, która uszczelnia komorę przepływową. Komora pomiarowa jest zamontowana na specjalnie dostosowanym uchwycie do próbek. Wymiary komory pomiarowej oraz metalowego uchwytu są dopasowane do standardowego kwarcowego szkiełka mikroskopowego (76 mm x 26 mm).

  1. Dotnij szklane płytki kwarcowe za pomocą wiertła diamentowego (0.75 mm) w pozycjach wskazanych na Rysunku 4. Konstrukcja szklanych płytek kwarcowych jest asymetryczna, aby umożliwić odróżnienie obu stron każdej płytki.
    UWAGA: Płytki kwarcowe mogą być ponownie wykorzystywane po pomiarze, dopóki ich powierzchnia nie zostanie porysowana.
  2. Do montażu komór należy użyć dostosowanych metalowych uchwytów na próbki, przedstawionych na Rysunku 5. Uchwyty na próbki posiadają dwa gwinty (M4) w celu podłączenia rurki wlotowej i wylotowej do komory przepływowej. Ponadto należy użyć gwintów (M3) do zamontowania komory na próbkę w metalowym uchwycie, a także gwintów (M3) do przymocowania uchwytu pryzmatu do dolnej części metalowego uchwytu.
  3. Pomiary smFRET należy przeprowadzić na mikroskopie fluorescencyjnym z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) typu pryzmatycznego (Rysunek 6).
    UWAGA: TIRFM wyposażony jest w trzy lasery: zielony (532 nm, laser Nd:YAG) i czerwony (643 nm, laser diodowy) do wzbudzania cząsteczek barwnika donora i akceptora, a także niebieski (491 nm, laser stałego stanu pompowany diodowo) do wybielania fluorescencyjnych zanieczyszczeń w tle w komorze na próbkę przed pomiarem smFRET. Trzy wiązki laserowe są łączone przestrzennie i mogą być wybierane za pomocą akustooptycznego filtra strojonego (AOTF). Światło fluorescencyjne jest zbierane przez obiektyw o wysokiej aperturze, rozdzielane na kanał donora i akceptora za pomocą lustra dichroicznego i rzutowane na dwie kamery EM-CCD. Komora na próbkę jest przymocowana do stolika mikrometrycznego umożliwiającego ruch w kierunkach x i y za pomocą dwóch silników krokowych. Trzeci silnik piezoelektryczny jest używany wraz z laserem IR i detektorem czułym na pozycję do budowy systemu autofokusu w celu zapewnienia optymalnej ostrości przez cały czas trwania eksperymentu.
    1. Należy zastosować naprzemienne wzbudzanie laserowe (ALEX), gdy w trajektoriach czasowych FRET obserwuje się dynamikę25. Taka dynamika może być spowodowana zmianami konformacyjnymi w obrębie cząsteczek lub fluktuacjami jasności akceptora oraz migotaniem akceptora.
      UWAGA: ALEX umożliwia rozróżnienie między tymi dwiema możliwymi przyczynami i zapobiega błędnej interpretacji dynamicznych trajektorii FRET. Jednakże, ze względów uproszczenia, część protokołu ogranicza się do analizy filmów nagranych bez użycia ALEX.
      Ostrzeżenie: W układzie fluorescencji pojedynczych cząsteczek używane są lasery klasy 3B. Przed uruchomieniem systemu należy upewnić się, że podjęto odpowiednie środki ostrożności w zakresie bezpieczeństwa laserowego, zgodnie z lokalnymi przepisami.
  4. Pomiar absorbancji służący do wyznaczenia wydajności kwantowej należy przeprowadzić na spektrometrze UV-VIS (patrz Materiały i Metody).
  5. Pomiar widma emisji fluorescencji donora, widma absorbancji akceptora oraz anizotropii fluorescencji należy przeprowadzić na spektrometrze fluorescencyjnym (patrz Materiały i Metody).
  6. Komory na próbki należy przygotować zgodnie z opublikowanymi procedurami33. Alternatywnie można zastosować procedurę opisaną w [34].
  7. Badane próbki należy oznakować parą cząsteczek barwnika donor-akceptor odpowiednią do smFRET i upewnić się, że obecna jest grupa biotyny umożliwiająca immobilizację na powierzchni komory na próbkę.
    UWAGA: W celu zlokalizowania nieznanej pozycji barwnika antenowego za pomocą oprogramowania Fast-NPS wymagane są różne konstrukty próbek. Każdy konstrukt musi posiadać jedną etykietę w nieznanej pozycji barwnika antenowego i jedną etykietę w pozycji satelitarnej znanej ze struktury krystalicznej. Do uzyskania dokładnych wyników wymagane są co najmniej trzy różne konstrukty z barwnikami przyłączonymi do pozycji antenowej i trzy różne pozycje satelitarne. Pomiary między antenami, a także między satelitami, są również przydatne dla poprawy dokładności, jednak wymaga to wymiany cząsteczek barwnika, co musi zostać prawidłowo wprowadzone do analizy.

2. Montaż komór przepływowych w uchwycie specjalnego przeznaczenia

  1. Naciągnąć rurki silikonowe (0.8 mm ID, 2.4 mm OD) na puste w środku śruby z łebkiem (M4) i za pomocą ostrej żyletki prosto odciąć końce rurek, pozostawiając 1 cm występu z obu stron. Skorygować występ rurki tak, aby z jednej strony śruby wynosił on około 2 mm.
  2. Zamontować komorę przepływową w uchwycie na próbkę w taki sposób, aby otwory w szkiełku kwarcowym pokrywały się z gwintami w uchwycie. Delikatnie dokręcić śruby wlotowe i wylotowe, upewniając się, że wlot i wylot komory pomiarowej pozostają drożne. Delikatnie dokręcić cztery śruby uchwytu z pleksiglasu, aby ustabilizować położenie komory przepływowej.
  3. Odciąć rurki silikonowe (0.58 mm ID, 0.96 mm OD) na kawałki o długości 20 cm. Włożyć jeden z kawałków do śruby wlotowej i wylotowej komory pomiarowej. Zamknąć rurki wlotową i wylotową za pomocą zacisku.
    UWAGA: Zmontowane komory na próbki można przechowywać w temperaturze pokojowej do dwóch tygodni.

3. Pomiar smFRET na mikroskopie TIRF

  1. Za pomocą strzykawki przemyj komorę z próbką 500 µL PBS. Aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do komory z próbką, przed zmianą roztworu buforowego zawsze twórz kroplę na końcu rurki doprowadzającej.
  2. Przepłucz komorę z próbką 100 µL roztworu neutrawidyny (0,5 mg/mL w PBS) i inkubuj przez 15 min w temperaturze pokojowej.
  3. Wypłucz roztwór neutrawidyny 500 µL PBS.
  4. Przykręć metalny uchwyt pryzmatu do komory z próbką.
  5. Zamocuj komorę z próbką na stole mikrometrycznym mikroskopu TIRF. Upewnij się, że komora z próbką jest zamontowana poziomo i jak najprościej przed obiektywem, aby uniknąć rozostrzenia podczas procesu skanowania.
  6. Uruchom oprogramowanie sterujące kamerami EM-CCD oraz oprogramowanie do sterowania silnikami piezoelektrycznymi stołu.
  7. Ustaw ostrość obiektywu mikroskopu, obserwując odbicia lasera IR.
  8. Umieść pryzmat (PS991, n = 1,52) na metalowym uchwycie pryzmatu. Dostosuj boczną pozycję pryzmatu, aby upewnić się, że wiązki lasera uderzają w pryzmat, następnie użyj kleju i inkubuj w świetle UV przez 5 min.
    UWAGA: Zamontowany pryzmat można wykorzystać ponownie po oczyszczeniu.
  9. W oprogramowaniu sterującym kamerą kliknij „Setup Acquisition” i zdefiniuj następujące parametry akwizycji: czas integracji 100 ms, 401 klatek/film (kamera zielona), 400 klatek/film (kamera czerwona), wzmocnienie mnożnika elektronów 225, wzmocnienie przedwzmacniacza 5x oraz szybkość odczytu 3 MHz przy 14 bitach.
  10. Utwórz folder na lokalnym dysku twardym na pomiar. Wybierz żądaną nazwę dla plików pomiarowych, np. Rok-Miesiąc-Dzień. W ustawieniach oprogramowania przejdź do karty „Auto-Save”, włącz funkcję „Auto save” i wybierz format pliku *.sif dla akwizycji filmów. Wybierz folder na dysku twardym. Użyj nazwy folderu jako rdzenia nazwy pliku.
  11. Włącz funkcję „AutoIncrement” (ustaw wartość początkową na 1). Włącz dodawanie operatora do nazwy pliku. Użyj „DON” dla kanału donora i „ACC” dla kanału akceptora. Wybierz „_” jako separator.
  12. W oprogramowaniu sterującym kamerą kliknij „Video”, aby uruchomić obraz na żywo z kamery, i wybiel fluorescencję tła, skanując komorę z próbką przy maksymalnej intensywności wszystkich trzech laserów (łącznie ≈3 000 W/cm2 przez 10 s na pole widzenia).
  13. Wyłącz laser niebieski. Zmniejsz intensywność lasera zielonego do około 200 W/cm2, a lasera czerwonego do około 40 mW/cm2, jeśli stosowane jest naprzemienne wzbudzanie laserowe (ALEX).
  14. Rozcieńcz biotynilowaną fluorescencyjną próbkę do stężenia 50-100 pM. Wprowadź 100 µL roztworu. Próbka zostaje unieruchomiona na powierzchni komory w wyniku wiązania.
    UWAGA: Należy uważać, aby nie przepełnić komory. Sąsiednie cząsteczki muszą być od siebie oddzielone.
  15. W razie potrzeby wprowadź do komory dodatkowe 100 µL próbki o 2x większym stężeniu.
  16. Po zakończeniu wprowadzania próbki uszczelnij rurki doprowadzające i odprowadzające z komory pomiarowej za pomocą zacisków.
  17. Wyłącz wszystkie lasery i użyj silników piezoelektrycznych, aby przesunąć komorę przepływową o dwa pola widzenia dalej.
  18. W oprogramowaniu sterującym kamerą kliknij „Take signal”, aby rozpocząć nagrywanie filmu, i jednocześnie włącz laser. Poprzez regulację mocy lasera upewnij się, że do końca filmu wybielone zostanie ponad 80% cząsteczek.
  19. Powtórz kroki 3.17 i 3.18 dla całego regionu uprzednio wybielonej komory z próbką.

4. Pozyskiwanie mapy transformacji („beadmap”)

  1. Przygotować komorę przepływową zgodnie z opisem w sekcjach 1.1, 1.2 i 2.
  2. Użyć fluorescencyjnych kulek multispektralnych powlekanych awidyną, które wykazują emisję fluorescencji w kanale donora i akceptora. Wymieszać roztwór stokowy za pomocą vortexera przez 1 min, a następnie rozcieńczyć 50 µL roztworu stokowego w 50 µL ddH2O. Ponownie wymieszać na vortexerze przez 1 min, poddać sonikacji przez 1-2 min, a następnie ponownie wymieszać na vortexerze przez 10 s.
  3. Wykonać kroki opisane dla pomiarów smFRET (sekcje 3.5-3.10).
  4. Wprowadzić 100 µL (objętość jednej komory) rozcieńczonych w stosunku 1:2 fluorescencyjnych kulek do komory przepływowej. Odczekać 10 min, aż fluorescencyjne kulki zwiążą się z powierzchnią.
  5. Użyć parametrów akwizycji określonych w punkcie 3.9, zmieniając jednak długość filmu na 26 (kamera zielona) i 25 (kamera czerwona) oraz wzmocnienie mnożnika elektronów na 10.
  6. Ustawić natężenie zielonego lasera na wartość 20 W/cm2.
  7. Nagrać jeden film w polu widzenia zawierającym około 50-100 kulek.

5. Przetwarzanie i analiza danych smFRET

  1. Użyj dedykowanego oprogramowania SM FRET do analizy mapy kuleczek (beadmap, patrz Materiały i Metody) oraz zarejestrowanych filmów. Uruchom program viewPlot1.m.
  2. Kliknij Analysis|Batch Analysis, odznacz opcję „ALEX”, jeśli nie była ona używana. Dla uzyskania najlepszych wyników wybierz próg wykrywania pików „high”. Naciśnij „OK”.
  3. Wybierz „NO” w odpowiedzi na pytanie, czy mapa kuleczek została już przeanalizowana. Przejdź do folderu zawierającego zarejestrowaną mapę kuleczek i wybierz plik *.sif (poprzez dwukrotne kliknięcie). W następnym oknie dialogowym naciśnij „OK”.
    UWAGA: Jeśli mapa kuleczek została już przeanalizowana w poprzednim pomiarze, wybierz tutaj „YES” i wskaż zapisaną mapę kuleczek, przechodząc do odpowiedniego folderu i dwukrotnie klikając plik mapy *.map. Kontynuuj od kroku 5.8.
  4. Wybierz dwie pojedyncze kuleczki znajdujące się w przeciwległych rogach pola widzenia. Intensywność pikseli jest zakodowana kolorami od ciemnoniebieskiego (niska intensywność) do ciemnoczerwonego (wysoka intensywność).
  5. Kliknij w środek pierwszej kuleczki. Jeśli środek cząsteczki można wyraźnie zlokalizować dzięki kodowaniu kolorami, wybierz „YES”, w przeciwnym razie kliknij „NO” i wybierz inną parę cząsteczek.
  6. Ustaw celownik na pikselu o maksymalnej intensywności i naciśnij „KEEP”. Powtórz ten proces dla drugiego kanału.
  7. Kliknij na cząsteczkę w przeciwległym rogu i powtórz kroki 5.5 oraz 5.6.
    UWAGA: Względne przesunięcie pikseli dwóch kanałów jest wyświetlane w oknie poleceń, a mapa transformacji jest automatycznie zapisywana jako plik *.map w folderze zawierającym plik mapy kuleczek *.sif.
  8. Aby załadować filmy donora i akceptora (*.sif) do „analizy seryjnej” (batch analysis), przejdź do folderu, zaznacz wszystkie filmy, które mają zostać przeanalizowane, i kliknij „OK”. W następnym oknie dialogowym naciśnij „OK”.
    UWAGA: Analiza seryjna kończy się, gdy ostatnia linia wyświetlana w oknie poleceń zaczyna się od „Finished analyzing…”. Wykryte cząsteczki są wyświetlane w nowym oknie, które wskazuje również względne przesunięcie kanału donora i akceptora określone na podstawie mapy transformacji.
  9. Aby załadować seryjnie przetworzone pliki filmów, kliknij File|Load. Odznacz opcję „ALEX”, jeśli nie była ona używana. Ustaw parametr smoothwidth na 10 i kliknij „OK”. Wybierz folder zawierający pliki *.ttr, kliknij „select all”, a następnie „OK” w następnym menu kontekstowym.
  10. Jeśli wyświetlony ślad wykazuje charakterystyczne fazy smFRET (Rysunek 2), naciśnij przycisk przełączający „Not selected” i najpierw zaznacz punkt czasowy początku zdarzenia FRET, przesuwając linię kursorem myszy i klikając lewym przyciskiem myszy. Następnie zaznacz punkt czasowy wybielenia (bleaching) cząsteczki akceptora, a na koniec punkt czasowy wybielenia cząsteczki donora.
  11. W następnym oknie wydajność FRET jest przedstawiona kolorem niebieskim. Aby wybrać ślad, naciśnij przycisk „Yes”, w przeciwnym razie wybierz „No”. Aby powrócić do poprzedniego śladu czasowego, kliknij przycisk „Prev”.
  12. Powtarzaj procedurę aż do ostatniej cząsteczki w filmie.
  13. Po przeanalizowaniu ostatniej cząsteczki w filmie zapisz wybrane ślady, klikając „File|Save”. Zapisz wybrane ślady w tym samym folderze, co pliki *.sif.
  14. Powtórz kroki 5.10-5.13 dla wszystkich zarejestrowanych filmów.
  15. Uruchom program combine_fret_results.m. Wybierz folder zawierający pliki *.res oraz wszystkie pliki *.FRETonly_trace. Zapisz pliki FRET dla poszczególnych cząsteczek oraz FRET dla poszczególnych klatek odpowiednio jako MW.dat i FRW.dat.
    UWAGA: Pliki *.dat są zapisywane jako pliki ASCII. Plik FRW.dat zawiera sześć kolumn i jeden wiersz dla każdej klatki FRET. Szósta kolumna zawiera skorygowaną wydajność FRET dla poszczególnych klatek. Plik MW.dat zawiera 21 kolumn i jeden wiersz dla każdej wybranej cząsteczki FRET. Trzecia kolumna zawiera wydajność FRET dla poszczególnych cząsteczek.

6. Przedstawianie danych smFRET w formie histogramów

UWAGA: Aby wyznaczyć średnią wydajność smFRET ze wszystkich zarejestrowanych danych smFRET, dane klatkowe lub dane dla poszczególnych cząsteczek przedstawia się na histogramach i analizuje przy użyciu dopasowań Gaussa do (wielu) pików. W dalszej części protokołu wykorzystano komercyjne oprogramowanie do analizy danych (patrz Lista Materiałów). Można jednak zamiast niego użyć dowolnego innego dostępnego oprogramowania.

  1. Otwórz oprogramowanie do analizy danych (patrz Lista Materiałów). Kliknij Plik|Importuj|wiele plików ASCII. Wybierz folder zawierający plik FRW.dat. Zaznacz plik i naciśnij „OK”. Zaakceptuj opcję importu, klikając „OK” bez wprowadzania zmian.
  2. Zaznacz trzecią kolumnę C(Y) zawierającą skorygowane wydajności FRET, kliknij prawym przyciskiem myszy na kolumnie i wybierz Wykres|Statystyka|Histogram. W oknie histogramu dwukrotnie kliknij słupki, odznacz opcję „automatyczne grupowanie” (automatic binning) i wybierz żądaną wielkość przedziału, np. 0,05. Wybierz również wartości początkową i końcową, np. -0,025 oraz 1,025.
  3. Zaznacz słupki histogramu, klikając je lewym przyciskiem myszy. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz „przejdź do arkusza przedziałów” (go to Bin Worksheet). Zaznacz kolumnę „Liczba” (Counts), klikając ją lewym przyciskiem myszy, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Wykres|Kolumnowy/Słupkowy/Kołowy|Kolumnowy.
  4. Na wykresie kolumnowym przejdź do Analiza|Dopasowanie|Nieliniowe dopasowanie krzywej|Otwórz okno dialogowe. W sekcji Funkcja wybierz „Gaussian”, a następnie przejdź do karty „Parametry”. Odznacz automatyczną inicjalizację parametrów. Ustaw wartość offsetu (y0) na 0. Kliknij „Dopasuj” (Fit).
    UWAGA: Funkcja dopasowania oraz szczegóły dopasowania są teraz wyświetlane na wykresie kolumnowym. Wartość „xc” wskazuje środek funkcji dopasowania, tj. średnią wydajność FRET, która służy jako parametr wejściowy dla oprogramowania NPS.

7. Pomiar wydajności kwantowej

  1. Wyznaczyć wydajność kwantową metodą względną, analogicznie do procedury opisanej przez Würtha et al.35, stosując jako wzorzec Rodaminę 101 rozpuszczoną w etanolu (QY = 91.5%).
  2. Zarejestrować widma absorpcji za pomocą spektrometru UV-VIS, używając objętości 80 µL w kuwecie absorpcyjnej o drodze optycznej 1 cm. Absorbancja przy długości fali wykorzystywanej do wzbudzenia fluorescencji musi wynosić ≤ 0.05.
  3. Zarejestrować widma emisji na spektrometrze skalibrowanym do lampy, pracującym w trybie zliczania fotonów. Pomiary przeprowadzić z użyciem polaryzatorów Glana-Thompsona w drodze wzbudzenia (0°) i emisji (54.7°) (warunki kąta magicznego), stosując szerokość pasma widmowego około 5 nm dla monochromatora wzbudzenia i 2.5 nm dla monochromatora emisji. Próbki mierzyć po przeniesieniu ich do kuwety fluorescencyjnej o drodze optycznej 3 mm, dbając o to, aby szybkość zliczania nie przekraczała 106 s-1.
    1. Obliczyć wydajność kwantową zgodnie z

Równanie równowagi statycznej; schemat wzoru na wydajność kwantową fluorescencji dla badań analizy spektralnej.

gdzie n oraz nStd to odpowiednio współczynniki załamania światła rozpuszczalnika próbki i wzorca. f(λ) oraz f_Std (λ) to intensywności fluorescencji próbki i wzorca przy długości fali λ. A(λex) oraz Astd (λex) to absorbancja próbki i referencji przy długości fali wzbudzenia, a Φstd to wydajność kwantowa wzorca.

8. Obliczenie izotropowego promienia Förstera

  1. Oblicz izotropowy promień Förstera (Równanie równowagi statycznej \( R_0^{iso} \); schemat inżynieryjny lub fizyczny.) na podstawie widma emisji cząsteczki donora, widma absorpcji cząsteczki akceptora, wydajności kwantowej donora oraz współczynnika załamania światła ośrodka. Do obliczenia Równanie równowagi statycznej \( R_0^{iso} \); schemat inżynieryjny lub fizyczny. można wykorzystać bezpłatne oprogramowanie PhotochemCAD. Można jednak zamiast niego użyć dowolnego innego dostępnego oprogramowania36.

9. Pomiar anizotropii

  1. Wyznaczyć anizotropie fluorescencji w stanie stacjonarnym na podstawie zapisów widm fluorescencji przy różnych ustawieniach polaryzatorów wzbudzenia/emisji (V/V, V/H, H/V, H/H)36.
  2. Obliczyć współczynnik G, który koryguje artefakty polaryzacyjne instrumentu, dla każdej długości fali z następującego stosunku

Równanie czynnika G dla analizy polaryzacji; formuła stosunku intensywności stosowana w badaniach spektroskopowych.

      i wykorzystaj go do obliczenia wartości anizotropii dla każdej długości fali:

Równanie anizotropii fluorescencji: równowaga statyczna; wzór r(λ), naukowa analiza danych.

      gdzie Ixy oznacza intensywność dla polaryzacji wzbudzenia x oraz polaryzacji emisji y.

  1. Oblicz średnią z wartości w zakresie widma emisji, aby wyznaczyć anizotropię fluorescencji w stanie stacjonarnym.

10. Instalacja oprogramowania Fast-NPS

  1. Pobierz program UCSF Chimera ze strony http://www.cgl.ucsf.edu/chimera i postępuj zgodnie z instrukcją instalacji.
  2. Przejdź na stronę internetową „Institute of Biophysics” na Uniwersytecie w Ulm: https://www.uni-ulm.de/en/nawi/institute-of-biophysics/software.html. Pobierz aktualną wersję programu Fast-NPS i wypakuj ją do wybranego folderu. Otwórz podfolder „Redistributable” i zainstaluj pakiet Visual C++ Redistributable odpowiedni dla systemu.

11. Centrowanie pliku pdb

  1. Otwórz interesujący plik lub pliki pdb w programie Chimera. Zaznacz wszystkie atomy kompleksu makromolekularnego i oblicz współrzędne centroidu (Tools|Structure Analysis|Axes/Planes/Centroids|Define centroid…|Ok).
  2. Otwórz okno Reply Log (Favorites|Reply Log) oraz narzędzie Transformation Tool (Tools|Movement|Transform Coordinates). Wprowadź współrzędne centroidu wyświetlone w Reply Log do pola tekstowego „Shift” w oknie Transform Coordinates i zmień znak każdej współrzędnej. Naciśnij „Apply”, a następnie zapisz plik za pomocą funkcji „Save PDB” (File|Save PDB).

12. Konfiguracja rozkładów a priori dla pozycji

UWAGA: Wszystkie wartości podano w angstremach.

  1. Uruchom język obliczeń technicznych i zmień bieżący folder na lokalny folder Fast-NPS. W oknie poleceń wpisz: FastNPS.
  2. Utwórz nowy plik zadania (jobfile) w Menedżerze Projektów (Project|New).
  3. Ustaw pozycję a priori (Narzędzia|Model barwnika a priori).
  4. W panelu „prior basics” zdefiniuj rozdzielczość przestrzenną rozkładu a priori pozycji, wprowadzając jego wartość (zalecana wartość to 2).
  5. Wyklucz wnętrze makrocząsteczki, zaznaczając pole wyboru i klikając przycisk „load PDB”. Wybierz i załaduj wycentrowany plik PDB zgodnie z opisem w sekcji 11.
  6. Należy określić przybliżoną średnicę barwnika (zalecane jest 13 Å, patrz omówienie), wpisując jego wartość.
  7. Wprowadź dystans szkieletowania, t. j. odległość, na jaką cząsteczka barwnika może wniknąć w makrocząsteczkę (zalecane jest 2 Å).
  8. W panelu „maximum prior size” wprowadź minimalne i maksymalne współrzędne rozkładu a priori pozycji (zalecane: x w przedziale [-150,150], y w przedziale [-150,150] oraz z w przedziale [-150,150]).
  9. Podczas definiowania satelity należy zaznaczyć pole wyboru „attachment via flexible linker” w panelu „prior basics” i wprowadzić w panelu „linker” współrzędne atomu (w wycentrowanym pliku pdb), do którego przyłączona jest cząsteczka barwnika. Następnie należy określić długość i średnicę łącznika, wprowadzając odpowiednie wartości (zaleca się 13 Å i 4,5 Å, patrz sekcja dyskusja). W przypadku anteny należy pominąć ten krok.
  10. Naciśnij przycisk „oblicz objętość dostępną”.
  11. Zapisz pozycję początkową i opcjonalnie wyeksportuj ją w celu wizualizacji przy użyciu oprogramowania takiego jak Chimera.

13. Definiowanie geometrii sieci

  1. Otwórz okno Define Measurement (Mode|Edit Geometry).
  2. Utwórz nową cząsteczkę barwnika, naciskając przycisk „New” w panelu „Dyes”.
  3. Ustaw anizotropię fluorescencji (Sekcja 9), wpisując odpowiednią wartość, a następnie wybierz model barwnika z menu rozwijanego „Dye model”.
  4. Naciśnij przycisk „Load”, wybierz odpowiednią pozycję, a następnie zaznacz pole aktywacji danego barwnika. Powtórz tę procedurę dla wszystkich barwników. t. j. dla wszystkich anten, jak również dla wszystkich satelitów.
  5. Po przygotowaniu wszystkich barwników należy zdefiniować pomiary. Utwórz nowy pomiar, klikając „New” w panelu „Measurements”.
  6. Wybierz odpowiednich partnerów FRET w rozwijanych menu „Dye1” i „Dye2” poniżej.
  7. Wprowadź wydajność smFRET wraz z błędem oraz izotropowy promień Förstera dla tej pary barwników.
  8. Na koniec zaznacz pole wyboru aktywuj (activate) danej pomiaru. Powtórz tę procedurę dla wszystkich pomiarów.
    UWAGA: Sieć często staje się coraz bardziej złożona, co może prowadzić do pomyłek użytkownika. Aby zapobiec błędom, należy zweryfikować sieć wizualnie, naciskając przycisk „Check Network”. Rysunek przedstawia aktywowane barwniki i wskazuje pomiary za pomocą linii łączących barwniki FRET.

14. Obliczenia

  1. Otwórz okno obliczeń (Mode|Calculation).
  2. Jeśli każdemu barwnikowi w sieci przypisano konkretny model, wybierz „User defined” i rozpocznij obliczenia, naciskając „Calculation”. Aby wszystkie barwniki znajdowały się w tym samym modelu, wybierz jeden z pięciu modeli (classic, iso, meanpos-iso, var-meanpos-iso lub var-meanpos) i kontynuuj.
    UWAGA: Okno poleceń będzie wskazywać postęp obliczeń. W przypadku programu Fast-NPS po zakończeniu obliczeń pojawi się komunikat w wyskakującym oknie.

15. Wizualizacja wyników

  1. Aby wyeksportować wiarygodne objętości barwników, otwórz okno View Results (Model|View Results).
  2. Eksport gęstości barwników:
    1. Eksportuj barwniki pojedynczo lub wszystkie jednocześnie. Aby wyeksportować pojedynczy barwnik, wybierz go w panelu „Displayed Dyes” i naciśnij „Export Density”. Wprowadź rozdzielczość (zalecana wartość to 2) i wybierz typ pliku do eksportu. Po prawej stronie wyświetli się podgląd gęstości oraz niektóre z jej charakterystyk matematycznych.
    2. Aby wyeksportować wszystkie barwniki jednocześnie, naciśnij „Batch Export”.
  3. Otwórz otrzymane pliki gęstości w programie Chimera.

16. Kontrola spójności wybranej kombinacji modeli

  1. Otwórz okno View Results (Model|View Results). Jeśli w panelu „Calculation Info” pole tekstowe „Consistency” wyświetla wartość niższą niż 90%, bieżący model nie reprezentuje w sposób wystarczający zmierzonych wydajności smFRET i jest zatem niespójny.
  2. W przypadku niespójności naciśnij przycisk „Detailed Consistency”. Wyszukaj pomiary, które mają wartość poniżej 90%. Jeśli w pomiarach tych dominują jeden lub więcej barwników, prawdopodobnie ich modele powodują niespójność. Rozważ zastosowanie innych modeli dla tych barwników i ponownie uruchom obliczenia Fast-NPS.

Wyniki

Transkrypcja jest pierwszym etapem ekspresji genów u wszystkich organizmów. U archeonów transkrypcja jest prowadzona przez pojedynczą polimerazę RNA (RNAP). W porównaniu z eukariotami, archeonowa RNAP wykazuje uderzające podobieństwo strukturalne do swoich eukariotycznych odpowiedników, posiadając jednocześnie prostszy aparat transkrypcyjny. W związku z tym archeony mogą służyć jako system modelowy do badania inicjacji transkrypcji u eukariotów przez polimerazę RNA II (Pol II). Niedawno, dzięki metodom smFRET i NPS, określono pełną architekturę otwartego kompleksu polimerazy RNA u archeonów. Dane z analizy NPS zostały wykorzystane do budowy modelu pełnego otwartego kompleksu promotora u archeonów, co dostarcza cennych informacji na temat mechanizmu inicjacji transkrypcji.

Aby wyjaśnić tę strukturę, zmierzono wydajności smFRET pomiędzy nieznanymi cząsteczkami barwnika antenowego znajdującymi się w otwartym kompleksie promotora a kilkoma znanymi cząsteczkami barwnika satelitarnego, które włączono w pięciu miejscach referencyjnych w RNAP, których pozycje są znane z struktur krystalograficznych (pdb-ID: 2WAQ)37. Barwniki antenowe przyłączono do jednej z różnych pozycji w niet szablonowej nici DNA, TFB, TBP lub TFE. Kompletna sieć wykorzystana w niniejszym badaniu składała się z ponad 60 zmierzonych odległości.

Rysunek 7 przedstawia model kompletnego archeonowego otwartego kompleksu promotora zbudowany na podstawie analizy NPS. Składa się on z dwuniciowego DNA promotora (jasnoniebieski i ciemnoniebieski), polimerazy RNA (szary) oraz czynników inicjacji transkrypcji TBP (fioletowy), TFB (zielony) i TFE (żółty). Model jest nałożony na wyniki analizy NPS, czyli objętości wiarygodne, które zostały obliczone przy użyciu modelu klasycznego (A), modelu iso (B), modelu meanpos-iso (C), modelu var-meanpos-iso (D) oraz modelu var-meanpos (E).

Mikroskop TIRF, schemat spektrometru UV/VIS; wydajność FRET, promień Förstera; analiza Fast-NPS.
Rycina 1: Schemat pozyskiwania i przetwarzania parametrów niezbędnych do obliczeń Fast-NPS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres natężenia fluorescencji w funkcji czasu; analiza danych procesu wzbudzenia optycznego.
Rysunek 2: Przykładowy przebieg czasowy natężenia fluorescencji podczas zdarzenia smFRET. Natężenia fluorescencji donora (zielony) i akceptora (czerwony) wykazujące trzy charakterystyczne fazy, mianowicie I: smFRET, II: fluorescencja donora po fotobleachingowaniu akceptora, III: fluorescencja tła po fotobleachingowaniu donora. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat układu optycznego do spektroskopii z wykorzystaniem szkiełka kwarcowego, kanału przepływowego, pryzmatu i uchwytu akrylowego.
Rycina 3: Schematyczna ilustracja komory przepływowej do eksperymentów smFRET. Komora przepływowa jest zamontowana na specjalnie dostosowanym metalowym uchwycie z elementami z szyb z tworzywa akrylowego. Konstrukcja komory przepływowej typu kanapkowego składa się z szkiełka kwarcowego (topionej krzemionki) z dwoma otworami do podłączenia rurek doprowadzających i odprowadzających, folii uszczelniającej oraz szkiełka nakrywkowego, które zamyka komorę przepływową. Pryzmat do oświetlenia TIRF jest zamontowany do dolnej części komory przepływowej. Śruby z pustym rdzeniem pełnią funkcję wlotów i wylotów komory przepływowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat szklanego slajdu kwarcowego; wymiary 76x26x1mm; konstrukcja wlotowo-wylotowa do zestawów laboratoryjnych.
Rycina 4: Przygotowanie szklanego slajdu kwarcowego i folii uszczelniającej. Rysunek techniczny szklanego slajdu kwarcowego ze wskazaniem pozycji otworów (podane w milimetrach). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schematy wymiarowe uchwytu aluminiowego i akrylowego, rysunek techniczny, wykonanie sprzętu.
Rycina 5: Rysunek techniczny komory przepływowej. Wymiary uchwytu pryzmatu aluminiowego, uchwytów z pleksi oraz aluminiowej ramy montażowej podano w milimetrach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat układu spektroskopii optycznej z laserami, EM-CCD i AOTF do analizy wzbudzenia i emisji.
Rysunek 6: Schematyczny rysunek układu TIRF z pryzmatem użytego w eksperymentach smFRET. Skróty dla komponentów optycznych: A, apertura; DM, lustro dichroiczne; F, filtr emisyjny; L, soczewka; M, lustro; O, obiektyw; P, pryzmat; PSD, fotodioda czuła na położenie; S, próbka; PS, stół pozycjonujący; T, teleskop. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Molekularne modele wiązania DNA-białko, schemat przedstawiający oddziaływania ntDNA z różnymi białkami.
Rysunek 7: Wyniki symulacji dla różnych założeń modelowych. Wszystkie obrazy przedstawiają archeonową polimerazę RNA (pdb-ID: 2WAQ, widok z góry) wraz z modelem DNA promotora (tDNA i ntDNA odpowiednio w kolorze niebieskim i cyjanowym), TBP (fioletowy), TFB (zielony) i TFE (żółty) w archeonowym kompleksie otwartym30. Objętości wiarygodne są nałożone dla wyników symulacji NPS w przypadku (A) modelu klasycznego, (B) modelu iso, (C) modelu meanpos-iso, (D) modelu var-meanpos-iso oraz (E) modelu var-meanpos. Wszystkie objętości są pokazane przy wiarygodności 68%. Sieci klasyczna i var-meanpos są zgodne z danymi smFRET. W przeciwieństwie do nich, sieci, w których dla wszystkich barwników wybrano model iso, meanpos-iso lub var-meanpos-iso, są niezgodne z pomierzonymi danymi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Przedstawiamy konfigurację i procedurę eksperymentalną w celu dokładnego określenia wydajności FRET między barwnikami przyłączonymi za pomocą elastycznych łączników do biomakrocząsteczek, tj. kwasów nukleinowych i/lub białek.

W celu zapewnienia precyzyjnych pomiarów smFRET (sekcja 3) kluczowe jest wykluczenie powietrza z komory przepływowej w dowolnym momencie pomiaru. Ponadto należy uważać, aby nie przeciążać komory przepływowej fluoroforami. Fluorofory muszą być wyraźnie oddzielone, aby zapewnić prawidłową analizę. Ponieważ pary smFRET, które nie wykazują bielenia dawcy, muszą zostać wyłączone z analizy, upewnij się, że >80% cząsteczek w polu widzenia jest wybielonych na końcu filmu. Aby uwzględnić niejednorodności w próbce, współczynnik β i czynnik γ, korygujące przesłuchy i względną skuteczność wykrywania odpowiednio kanału donorowego i akceptorowego, są obliczane indywidualnie dla każdej pary FRET.

Ustawienia kamery (czas całkowania, wzmocnienie mnożnika elektronów, wzmocnienie przedwzmacniacza i szybkość odczytu opisane w rozdziale 3.9) powinny być ustawione na wartości zapewniające najlepszy kompromis między stosunkiem sygnału do szumu, zakresem dynamiki i rozdzielczością czasową. Muszą one zostać ponownie dostosowane do różnych eksperymentów lub jeśli używany jest inny sprzęt. Liczba ramek musi być wystarczająco duża, aby zapewnić, że większość cząsteczek dawcy wybieli się w czasie obserwacji.

W przypadku pomiarów na spektrometrze fluorescencyjnym (sekcje od 7 do 9) należy znaleźć dobry kompromis między intensywnością sygnału a rozdzielczością widmową zarejestrowanych danych. W tym celu szczeliny w ścieżce wzbudzenia i emisji spektrometru fluorescencyjnego muszą być dostosowane w zależności od użytego przyrządu i stężenia próbki.

Ponadto przedstawiono metodę analizy Fast-NPS służącą do uzyskiwania informacji strukturalnych o przejściowych lub dynamicznych kompleksach makromolekularnych. NPS zastosowano w celu ujawnienia ścieżki nici DNA bez matrycy oraz położenia czynników inicjujących transkrypcję w otwartym kompleksie polimerazy archeonów RNA. Korzystając z sieci ponad 60 różnych pomiarów odległości, wykazaliśmy, że Fast-NPS, wyposażony w nowo zaimplementowany silnik próbkowania (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., & Michaelis, J. w przygotowaniu), skraca czas potrzebny na analizę tej złożonej sieci smFRET o ≈2 rzędy wielkości, w porównaniu z oryginalną globalną metodą NPS27. Solidność algorytmu jest zakorzeniona w samplerze Metropolis-within-Gibbs w połączeniu ze schematem równoległego temperowania. Fast-NPS pokazuje dokładną odtwarzalność wyników sieci i jest spójny z wynikami opublikowanymi wcześniej30.

Opublikowano kilka różnych metod mających na celu wywnioskowanie informacji strukturalnych z pomiarów smFRET 11,12,13,14,15,16,17,18. Wszystkie te podejścia zapewniają tylko jeden konkretny model barwnika. Tym samym barwniki, które nie spełniają założeń przyjętych przez dany model, nie mogą być stosowane ani prowadzić do fałszywych informacji strukturalnych. Fast-NPS, wręcz przeciwnie, pozwala dobrać do każdej cząsteczki barwnika inny model. Pomaga to wyjaśnić różne zachowania konformacyjne zarówno samej cząsteczki barwnika, jak i łącznika używanego do jej przyłączania. Lokalne otoczenie molekularne cząsteczki barwnika, a także jego właściwości fizyczne określą, który model jest najbardziej odpowiedni.

Dla analizowanej sieci smFRET archeonowego kompleksu inicjacyjnego założenie izotropowe dla wszystkich cząsteczek barwnika prowadzi do drastycznego zmniejszenia wielkości wiarygodnych objętości w porównaniu z modelem klasycznym. W połączeniu z dynamicznym uśrednianiem pozycji dla wszystkich cząsteczek barwnika, mediana wszystkich wiarygodnych wielkości objętości (na poziomie 95%) zmniejsza się do mniej niż 0,5 nm3. Jednak te późniejsze cząsteczki barwnika nie są już zgodne z ich pomiarami smFRET, co wskazuje, że przyjęte założenia prowadzą do fałszywych informacji strukturalnych. Natomiast posteriory wyznaczone w modelu klasycznym są zgodne z wyznaczonymi sprawnościami smFRET.

Ponieważ założenie izotropowego i/lub dynamicznego uśredniania pozycji dla wszystkich barwników prowadzi do niespójności, Fast-NPS umożliwia wcześniejsze określenie cząsteczek barwnika, w których każdemu barwnikowi można przypisać jeden z pięciu modeli. Każdy model korzysta z tej samej dostępnej objętości. Algorytm obliczania barwnika AV przyjmuje kilka założeń. Początkowo przestrzenny kształt fluoroforu jest przybliżony przez kulę. W związku z tym należy użyć średnicy uwzględniającej szerokość, wysokość i grubość fluoroforu (sekcja 12). Ponadto kształt łącznika jest przybliżony za pomocą elastycznego pręta. Wartości przedstawione w sekcji 12 zostały obliczone dla barwnika Alexa 647 podłączonego za pomocą łącznika 12-C. Do tej pory nie jest możliwe dokładne określenie a priori, który model jest najbardziej odpowiedni, biorąc pod uwagę geometrię eksperymentalną, a zatem wszystkie modele powinny zostać przetestowane. Ogólnie rzecz biorąc, wybiera się model, który daje najmniejszy możliwy rozmiar tylny, a jednocześnie jest zgodny z danymi. Aby sprawdzić, czy wybór modeli jest zgodny z danymi smFRET, obliczamy zarówno prawdopodobieństwo, jak i a posteriori. Spójność oznacza, że ponad 90% próbek pobranych z tylnego odcinka mieści się w 95% przedziale ufności prawdopodobieństwa.

Chociaż prawdą jest, że im niższa anizotropia, tym mniejsza niepewność odległości, w sieci smFRET należy również wziąć pod uwagę geometryczne układy cząsteczek barwnika. Tak więc, podczas gdy reprezentowanie cząsteczek barwnika o niskiej anizotropii fluorescencji za pomocą modelu ISO jest typowym pierwszym wyborem, test konsystencji zapewnia bardziej bezpośredni sposób wyboru właściwego modelu barwnika. Optymalny wybór modeli barwników może prowadzić do drastycznego wzrostu precyzji lokalizacji, a jednocześnie zachować spójność sieci z danymi FRET.

Podsumowując, Fast-NPS pozwala na uzyskanie informacji strukturalnych i dynamicznych o dużych kompleksach makromolekularnych. W przeciwieństwie do powszechnych metod strukturalnych, takich jak krystalografia rentgenowska lub kriomikroskopia elektronowa, pozwala to na monitorowanie wysoce elastycznych lub przejściowych kompleksów, co znacznie poszerza naszą mechanistyczną wiedzę na temat złożonych procesów biologicznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują B. Gruchmannowi za rysunki mechaniczne komory przepływowej. Ponadto pragniemy wyrazić naszą wdzięczność Maxowi Beckersowi i Florianowi Drechslerowi za wnikliwe komentarze i dyskusje na temat NPS i leżącego u jego podstaw silnika próbkowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przygotowanie komory przepływowej
Indywidualny uchwyt na próbki metalowesamodzielnie zbudowanybez
szkiełek kwarcowych, 76  mm x 26  mmSzkiełka techniczne26007
szkiełka nakrywkowe, 60 mm x 24  mmdo 101242Marienfeld
, Hellmanex IIHellma320.001
ultraczysta woda od Synergy UVMillipore2512600
Myjka plazmowa ZeptoDienern/a
(3-aminopropylo)-trietoksysilan, p.a.Sigma-AldrichA3648
walerianian metoksy PEG-sukcynimidylu, 5 kDaLaysan Bio Inc.MPEG-SVA-5000-1g
biotynylowany walerianian PEG-sukcynimidylu, 5 kDaLaysan Bio Inc.BIOTIN-PEG-SVA-5000
Biowęglan soduSigma-AldrichS5761 Sigma 
Węglan soduSigma-AldrichS2127 Sigma-Aldrich 
folia uszczelniająca (Nescofilm)Fisher Scientific12981805
Tygon Elastyczny przewód silikonowy, 0,8  mm ID, 2.4  mm ODSaint-Gobain Performance Plastics720958
Rurki polietylenowe o drobnych otworach, 0,58 mm ID, 0,96 mm OD (Smiths Medical)Fisher Scientific12665497
NeutravidinLife TechnologiesA2666
Mikroskop fluorescencyjny z całkowitym wewnętrznym odbiciem
Nd:YAG Laser, 532 nmNewport Spectra-PhysicsEXLSR-532-100-CDRH
pompowany diodowo laser półprzewodnikowy, 491 nm, laser diodowy CalypsoCobolt904010050
643 nm, iBeam smartTopticaiBEAM-SMART-640-S
zwierciadło dichroiczne, 532 RDCChromaF33-540
zwierciadło dichroiczne, 476 RDCChromaF33-476z
akustyczno-optyczny filtr przestrajalnyAA Optoelektronicznasoczewka cylindryczna plano-wypukła AOTFnC-VIS
, f = 75 mmThorlabsLJ1703L1-A
płasko-wklęsła cylindryczna, f = -300  mmThorlabs
PS 991ThorlabsPS991
, f = 75  mmThorlabsLA1608-B
, PHD 2000Harvard Apparatus70-2002
2 silniki krokowe, Z812BThorlabsZ812B
PE4ThorlabsPE4
IREdmund OpticsCPS808część systemu autofokusa
lustro dichroiczne, 775 DCXRChroma775 DCXR
detektor położenia (PSD), PDP90AThorlabsPDP90Aczęść systemu autofokusa
obiektyw zanurzeniowy w wodzie, Plan Apo 60X WI, NA 1.2NikonMRD07601
zwierciadło dichroiczne, 645 DCXRChroma645 DCXRczęść filtra emisji ścieżki
emisji, 3RD550-510Omega Optical3RD550-510zielony kanał w filtr emisyjny ścieżki emisyjnej
, 3RD660-760Omega Optical3RD660-760czerwony kanał w ścieżce emisyjnej
kamera EMCCD, iXon+ DU897EBVAndorAND-20-00032
Kamera EMCCD, iXon3 DU897D-BVAndorAND-20-000141
Różne
Varian 50CarySpektrometr UV-VIS
Fluorolog2SPEXspektrometr fluorescencyjny
Solis (V4.15)Oprogramowanie sterujące Andordo kamery EM-CCD
Narzędzie użytkownika Apt  (wersja 1.022)Oprogramowanie sterujące Thorlabsdla silników piezoelektrycznych
Norland Optical Adhesive 68Klej Thorlabs
PC-AFN-0.8 Nil czerwonyKisker Biotechfluorescencyjne koraliki multispec powlekane awidyną 
MatlabMathworksdla oprogramowania pisanego dla klientów
Origin (V9.0)Oprogramowanie do tworzenia wykresów naukowych i analizy danychOriginlab
Hellma 105-202-15-40Hellma105-202-15-40o średnicy 1  cm długość ścieżki
Hellma 105-251-15-40Hellma105-251-15-40kuweta fluorescencyjna o długości ścieżki 3 mm
Detergent pryzmat , soczewka skupiająca Pompa strzykawkowa Siłownik piezoelektryczny , laser diodowy Techniczny język obliczeniowy Kuweta absorpcyjna

Bibliografia

  1. Cheng, Y. Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution. Cell. 161, 450-457 (2015).
  2. Garman, E. F. Developments in X-ray Crystallographic Structure Determination of Biological Macromolecules. Science. 343 (6175), 1102-1108 (2014).
  3. Sali, A. Outcome of the First wwPDB Hybrid/Integrative Methods Task Force Workshop. Structure. 23, 1156-1167 (2015).
  4. Hopfner, K. P., Michaelis, J. Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics. Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).
  5. Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. High-speed AFM and applications to biomolecular systems. Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).
  6. Neuman, K. K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, 491-505 (2008).
  7. Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  8. Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology. Annu Rev Biochem. 77 (1), 51-76 (2008).
  9. Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond. Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).
  10. Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
  11. Rasnik, I., Myong, S., Cheng, W., Lohman, T. M., Ha, T. DNA-binding Orientation and Domain Conformation of the E. coli Rep Helicase Monomer Bound to a Partial Duplex Junction: Single-molecule Studies of Fluorescently Labeled Enzymes. J Mol Biol. 336 (2), 395-408 (2004).
  12. Andrecka, J. Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 135-140 (2008).
  13. Schröder, G. F., Grubmüller, H. FRETsg: Biomolecular structure model building from multiple FRET experiments. Comput Phys Commun. 158 (3), 150-157 (2004).
  14. Margittai, M. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15516-15521 (2003).
  15. Kalinin, S. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat Methods. 9 (12), 1218-1227 (2012).
  16. Choi, J. N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation-elongation dynamics. Nat Struct Mol Biol. 23 (August 2015), 110-115 (2015).
  17. Svensson, B. FRET-based trilateration of probes bound within functional ryanodine receptors. Biophys J. 107 (9), 2037-2048 (2014).
  18. Stephenson, J. D., Kenyon, J. C., Symmons, M. F., Lever, A. M. L. Characterizing 3D RNA structure by single molecule FRET. Methods. (2016), 1-11 (2016).
  19. Lee, N. K. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophys J. 88 (4), 2939-2953 (2005).
  20. McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules. Biophys J. 99 (3), 961-970 (2010).
  21. Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J Struct Biol. 173, 497-505 (2011).
  22. Schuler, B. Single-molecule FRET of protein structure and dynamics - a primer. J nanoboitechnology. 11, Suppl 1. 1-17 (2013).
  23. Choi, U. B. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat Struct Mol Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
  24. Dale, R. E., Eisinger, J., Blumberg, W. E. The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer. Biophys J. 26 (2), 161-193 (1979).
  25. Kapanidis, A. N. Alternating-laser excitation of single molecules. Acc Chem Res. 38 (7), 523-533 (2005).
  26. Muschielok, A. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
  27. Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the nano-positioning system to the analysis of fluorescence resonance energy transfer networks. J Phys Chem B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
  28. Andrecka, J. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase ii elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
  29. Treutlein, B. Dynamic Architecture of a Minimal RNA Polymerase II Open Promoter Complex. Mol Cell. 46 (2), 136-146 (2012).
  30. Nagy, J. Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule. FRET and NPS. Nat Commun. 6, 6161(2015).
  31. Grohmann, D., et al. The Initiation Factor TFE and the Elongation Factor Spt4/5 Compete for the RNAP Clamp during Transcription Initiation and Elongation. Mol Cell. 43 (2), 263-274 (2011).
  32. Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J., Michaelis, J. Quantitative structural information from single-molecule FRET. Faraday Discuss. 184, 117-129 (2015).
  33. Bennink, M. L. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nat Struct Biol. 8 (7), 606-610 (2001).
  34. Chandradoss, S. D. Surface passivation for single-molecule protein studies. J Vis Exp. (86), e50549(2014).
  35. Würth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M., Resch-Genger, U. Relative and absolute determination of fluorescence quantum yields of transparent samples. Nat Protoc. 8 (8), 1535-1550 (2013).
  36. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer US. Boston, MA. (2006).
  37. Korkhin, Y. Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure. PLoS Biol. 7 (5), (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bayesowska estymacja parametr wmetoda Monte Carlo w a cuchach Markowabiologia strukturalnaanaliza kompleks w bia kowychpor wnywanie modeli barwnik wpomiar anizotropii fluorescencjiobliczanie obj to ci wiarygodnejpolimeraza RNA archeon w
Informacje strukturalne z eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET przy użyciu systemu szybkiego nanopozycjonowania
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.