Synteza kationizowanej magnetoferytyny do ultraszybkiego namagnesowania komórek

Podsumowanie

Przedstawiono protokół syntezy i kationizacji magnetoferytyny domieszkowanej kobaltem, a także metodę szybkiego magnesowania komórek macierzystych za pomocą kationizowanej magnetoferytyny.

Streszczenie

Wiele ważnych zastosowań biomedycznych, takich jak obrazowanie komórek i zdalna manipulacja, można osiągnąć poprzez znakowanie komórek za pomocą superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (SPION). Osiągnięcie wystarczającego wychwytu komórkowego SPION-ów jest wyzwaniem, któremu tradycyjnie sprostano poprzez wystawienie komórek na podwyższone stężenia SPION lub wydłużenie czasu ekspozycji (do 72 godzin). Jednak strategie te mogą pośredniczyć w toksyczności. W tym miejscu przedstawiamy syntezę magnetoferytyny SPION na bazie białka, a także łatwy protokół funkcjonalizacji powierzchni, który umożliwia szybkie namagnesowanie komórek przy niskich stężeniach ekspozycji. Rdzeń magnetoferytyny SPION składa się z domieszkowanego kobaltem tlenku żelaza o średniej średnicy cząstek 8,2 nm, zmineralizowanego wewnątrz jamy apo-ferrytyny śledziony konia. Chemiczna kationizacja magnetoferytyny pozwoliła na wytworzenie nowego, wysoce aktywnego błonowo SPION, który namagnesował ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) przy użyciu czasu inkubacji wynoszącego zaledwie jedną minutę i stężenia żelaza tak niskie, jak 0,2 mM.

Wprowadzenie

Wiązanie powierzchni lub internalizacja superparamagnetycznych nanocząstek tlenku żelaza (SPION) umożliwiła magnetyzację różnych typów komórek do zastosowań takich jak obrazowanie i zdalna manipulacja. ¹ Jednak osiągnięcie wystarczającego namagnesowania komórkowego może być wyzwaniem, szczególnie gdy interakcja między SPION a powierzchnią komórki jest słaba. ² W przeszłości długotrwałe narażenie lub wysokie stężenia SPION były stosowane jako strategie przezwyciężania tego wyzwania. ^3,4 Niemniej jednak strategie te są problematyczne, ponieważ zwiększają toksyczność^5,6 i mają bardzo ograniczony sukces w typach komórek o niskich wskaźnikach internalizacji, takich jak limfocyty. ⁷ Aby zwiększyć wychwyt komórkowy SPION, zbadano kilka podejść do funkcjonalizacji powierzchni. Na przykład, przeciwciała są stosowane do promowania endocytozy za pośrednictwem receptorów,8 podczas gdy niespecyficzny wychwyt można osiągnąć za pomocą środków transfekcyjnych^9,10 lub gatunków penetrujących komórki, takich jak peptyd tatowy HIV. ^11,12 Jednak podejścia do funkcjonalizacji przeciwciał i peptydów są ograniczone przez drogie odczynniki i złożone preparaty syntetyczne, podczas gdy środki transfekcyjne mogą indukować wytrącanie się nanocząstek i niekorzystnie wpływać na funkcję komórek. ^{Pytania z kategorii 13,14}

Niedawno informowaliśmy o syntezie chemicznie kationizowanej magnetoferytyny, nowego SPION, który był bardzo skuteczny w magnesowaniu ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC) przy użyciu czasu inkubacji tak krótkiego jak jedna minuta. ¹⁵ Magnetoferytyna jest syntetyzowana przez odtworzenie SPION w zdemineralizowanej jamie ferrytyny białka magazynującego żelazo. ¹⁶ Ten oparty na białku SPION łączy w sobie wiele właściwości, które sprawiają, że dobrze nadaje się do magnetyzacji komórek, takich jak kontrola właściwości magnetycznych rdzenia ^{magnetycznego,17-19} oraz biokompatybilność i rozpuszczalność w wodzie zapewniana przez otoczkę białkową. Co więcej, funkcjonalizacja powierzchni jest łatwa do osiągnięcia dzięki adresowalnym aminokwasom, które mogą być chemicznie^20-22 lub genetycznie modyfikowane. ^23-25 Wykazaliśmy, że kationizacja chemiczna kwasowych reszt aminokwasowych otoczki białkowej generuje stabilną nanocząstkę, która łatwo oddziałuje z domenami anionowymi na powierzchni komórki, prowadząc do szybkiego i trwałego namagnesowania komórki. Procedura ta eliminuje potrzebę pracochłonnej funkcjonalizacji i długich protokołów inkubacji, a ze względu na niespecyficzny mechanizm znakowania, ta strategia szybkiego magnesowania powinna znaleźć szerokie zastosowanie w innych typach komórek. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy raport na temat ultraszybkiej metody znakowania komórek, w tym szczegółowe protokoły syntezy, oczyszczania i funkcjonalizacji powierzchni kationizowanej magnetoferytyny.

Protokół

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSC) pobrano z szpiku kostnego bliższej części kości udowej pacjentów z chorobą zwyrodnieniową stawów poddawanych całkowitej endoprotezoplastyce stawu biodrowego, w pełnej zgodności z wytycznymi Komitetu Etyki Badań Szpitala Bristol Southmead (numer referencyjny #078/01) oraz po uzyskaniu zgody pacjentów.

1. Synteza i oczyszczanie magnetoferrytyny

1. Uwagi ogólne
   1. Syntezę magnetoferrytyny należy przeprowadzić w szczelnym, dwupłaszczowym naczyniu reakcyjnym w temperaturze 65 °C w atmosferze azotu, aby ograniczyć utlenianie prekursorów metali. Roztwory soli metali oraz nadtlenek wodoru należy wprowadzać do naczynia reakcyjnego przez porty w pokrywie przy użyciu pompy strzykawkowej.
   2. Po syntezie magnetoferrytyny białko należy oczyścić za pomocą chromatografii wymiany anionowej (patrz sekcja 1.4) w celu usunięcia nanocząsteczek niezamkniętych w kawernie białka, a następnie za pomocą chromatografii wykluczania rozmiarów (patrz sekcja 1.5), aby wyizolować monomery białka. Stężenie białka należy oznaczyć metodą Bradforda (patrz sekcja 1.6).
2. Przygotowania przed syntezą
   1. Odgazować 500 ml wody dejonizowanej, umieszczając w niej rurkę podłączoną do butli z azotem, uszczelniając naczynie folią spożywczą i przepuszczając gazowy azot przez około 60 min.
   2. Rozgrzać łaźnię wodną połączoną z dwupłaszczowym naczyniem reakcyjnym do 65 °C. Do naczynia reakcyjnego dodać 75 ml buforu 50 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) (pH 8.6), uszczelnić naczynie i odgazować poprzez przepuszczanie gazowego azotu przez roztwór buforu przez około 20 min. Jednocześnie mieszać roztwór buforu za pomocą mieszadła magnetycznego.
   3. Po odgazowaniu roztworu buforu HEPES wyjąć rurkę doprowadzającą azot z buforu i pozostawić ją zawieszoną w naczyniu, aby utrzymać atmosferę azotu. Dodać apoferrytynę tak, aby uzyskać stężenie końcowe 3 mg/ml. Kontynuować mieszanie magnetyczne, zmniejszając prędkość mieszania w przypadku wystąpienia pienienia.
   4. Przygotować roztwór stokowy siarczanu kobaltu siedmiowodnego o stężeniu 25 mM, rozpuszczając 0.19 g w 50 ml odgazowanej wody dejonizowanej.
   5. Przygotować roztwór siarczanu żelaza(III)-ammoniumu sześciowodnego o stężeniu 25 mM, rozpuszczając 0.98 g w 100 ml odgazowanej wody dejonizowanej.
   6. Odebrać 2.5 ml roztworu siarczanu żelaza(III)-ammoniumu sześciowodnego i zastąpić go 2.5 ml siarczanu kobaltu siedmiowodnego.
   7. Przygotować roztwór nadtlenku wodoru o stężeniu 8.33 mM w odgazowanej wodzie dejonizowanej, dodając najpierw 965 μl roztworu nadtlenku wodoru (30% m/m) do 9 ml odgazowanej wody dejonizowanej, a następnie dodając 1 ml tego roztworu pośredniego do 99 ml odgazowanej wody dejonizowanej.
3. Synteza magnetoferrytyny
   1. Wstrzyknąć jednocześnie 10.1 ml prekursora żelazo-kobalt oraz 10.1 ml nadtlenku wodoru do roztworu apoferrytyny (mieszanego magnetycznie) z szybkością przepływu 0.15 ml/min przy użyciu dwóch pomp strzykawkowych (całkowita objętość wstrzyknięta: 20.2 ml).
   2. W czasie wstrzykiwania odgazować kolejne 500 ml wody dejonizowanej.
      UWAGA: W miarę postępu reakcji zawartość naczynia reakcyjnego stopniowo przybiera ciemnobrązowy kolor.
   3. Krótko przed zakończeniem pierwszego wstrzykiwania przygotować kolejne 100 ml prekursora żelazo-kobalt oraz roztworu nadtlenku wodoru, używając świeżo odgazowanej wody dejonizowanej.
   4. Powtórzyć etap wstrzykiwania opisany w punkcie 1.3.1, używając świeżo przygotowanych roztworów żelazo-kobaltu i nadtlenku wodoru.
   5. W czasie wstrzykiwania odgazować kolejne 500 ml wody dejonizowanej i postąpić zgodnie z opisem w punktach 1.3.3 i 1.3.4.
   6. Po trzecim wstrzykiwaniu pozostawić roztwór do dojrzewania na 15 min przy mieszaniu.
   7. Do naczynia reakcyjnego dodać 1.5 ml 1 M roztworu cytrynianu sodu, aby chelatować wolne jony metali w roztworze.
   8. Przenieść roztwór z naczynia reakcyjnego do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml, wirować przez 30 min przy 4,350 x g, a następnie przepuścić nadsącz przez filtr strzykawkowy 0.22 µm. Na tym etapie przefiltrowany nadsącz można przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu oczyszczania.
4. Chromatografia wymiany jonowej
   1. Nałożyć próbkę na kolumnę (średnica 2.5 cm, długość 20 cm) zawierającą macierz kationową, używając pompy perystaltycznej przy szybkości przepływu 10 ml/min.
   2. Przemyć kolumnę około 100 ml buforu doprowadzającego (bufor 50 mM Tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris), pH 8.0) za pomocą pompy gradientowej przy szybkości przepływu 10 ml/min.
   3. Aby eluować białko, przemyć kolumnę z szybkością 10 ml/min roztworami chlorku sodu (NaCl) o rosnących stężeniach w buforze Tris: końcowe stężenia NaCl 150, 500 i 1,000 mM, po 150 ml dla każdego stężenia.
   4. Ponieważ białko eluuje przy stężeniu NaCl 500 mM, zbierać je w frakcjach po 50 ml za pomocą automatycznego zbieracza frakcji.
      UWAGA: Szczegółowy protokół chromatografii wymiany jonowej znajduje się w wcześniej opublikowanych protokołach.²⁶
5. Chromatografia wykluczania rozmiarów
   1. Skoncentrować 150 ml magnetoferrytyny do objętości około 2 ml, używając jednostki filtrującej do wirowania o pojemności 15 ml, a następnie jednostki o pojemności 4 ml. Szczegółowy protokół tej procedury znajduje się w instrukcji producenta jednostek filtrujących do wirowania (patrz lista materiałów).
   2. Nałożyć skoncentrowaną próbkę na kolumnę do filtracji żelowej za pomocą pętli wtryskowej.
   3. Przemyć kolumnę buforem doprowadzającym (bufor 50 mM Tris, pH 8.0, zawierający 150 mM NaCl) z szybkością przepływu 1.3 ml/min.
   4. Zbierać frakcje po 6 ml za pomocą automatycznego zbieracza frakcji. Monomery białka eluują na końcu. Na tym etapie oczyszczoną magnetoferrytynę można przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu kationizacji.
      UWAGA: Szczegółowy protokół chromatografii wykluczania rozmiarów z użyciem kolumny do filtracji żelowej znajduje się w wcześniej opublikowanych protokołach.²⁷
6. Oznaczanie stężenia białka
   1. Przygotować standardy ferrytyny o stężeniach 0.06, 0.125, 0.25, 0.5 i 1 mg/ml w buforze 50 mM Tris, używając komercyjnie dostępnej ferrytyny z śledziony konia.
      UWAGA: Stężenie białka w komercyjnie dostępnej ferrytynie jest podane na butelce. Jeśli go brakuje, należy skontaktować się z dostawcą w celu uzyskania tej informacji.
   2. Rozcieńczyć próbki magnetoferrytyny o nieznanym stężeniu w buforze 50 mM Tris, aż kolor roztworu będzie w przybliżeniu odpowiadał kolorowi standardu 0.5 mg/ml. Zapisać czynnik rozcieńczenia.
   3. Do dołków płytki 96-dołkowej dodać po 10 μl każdego standardu oraz próbki magnetoferrytyny w trzech powtórzeniach.
   4. Do każdego dołka dodać 200 μl gotowego odczynnika Bradforda (szczegóły dotyczące odczynnika do analizy metodą Bradforda znajdują się w liście materiałów).
   5. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 8 minut.
   6. Zmierzyć absorbancję przy λ = 595 nm za pomocą czytnika mikroplatek.
   7. Wykreślić średnią absorbancję standardów ferrytyny jako funkcję stężenia białka i wykorzystać nachylenie oraz punkt przecięcia dopasowania liniowego do obliczenia stężenia próbki magnetoferrytyny.
      UWAGA: Należy uwzględnić czynnik rozcieńczenia, który został zastosowany w celu dopasowania próbki magnetoferrytyny do krzywej wzorcowej.

2. Kationizacja magnetoferrytyny

1. Uwagi ogólne
   UWAGA: W celu kationizacji magnetoferrytyny, N,N-dimetylo-1,3-propanodiaminę (DMPA) sprzęgnięto z resztami kwasu asparaginowego i glutaminowego na powierzchni MF przy użyciu chlorowodorku N-(3-dimetylaminopropyl)-N'-etylokarbodiimidu (EDC).
   1. Reakcję należy prowadzić w temperaturze pokojowej przy mieszaniu. Poniższy protokół dotyczy kationizacji 10 mg magnetoferrytyny w całkowitej objętości 5 ml (stężenie białka 2 mg/ml). Można jednak zwiększyć lub zmniejszyć skalę, zachowując stałe proporcje białka:DMPA:EDC, a także objętości buforu i roztworu magnetoferrytyny.
   2. Przed reakcją kationizacji próbki magnetoferrytyny należy poddać dializie przeciwko 50 mM buforowi fosforanowemu (pH 7) zawierającemu 50 mM NaCl. Jest to istotne w celu usunięcia buforu elucyjnego Tris i uniknięcia niepożądanych reakcji między aminą Tris a aktywowanymi przez EDC resztami kwasu karboksylowego. Po dializie należy oznaczyć stężenie białka i dostosować je do 4 mg/ml przed kationizacją.
2. Protokół kationizacji
   1. Odważyć 374 mg DMPA i rozpuścić w 2,5 ml 200 mM buforu z kwasem 2-(N-morfolino)etanosulfonowym (MES).
   2. Dostosować pH roztworu do wartości około 7 za pomocą stężonego (6 M) kwasu solnego (HCl).
      OSTROŻNIE: Ten krok należy wykonać w dygestorium, ponieważ dodanie kwasu do DMPA powoduje wydzielanie toksycznych oparów!
   3. Dodać 2,5 ml roztworu magnetoferrytyny o stężeniu 4 mg/ml (końcowe stężenie MES wynosi 100 mM, końcowe stężenie magnetoferrytyny 2 mg/ml, całkowita ilość białka to 10 mg).
   4. Włożyć mieszadło magnetyczne i mieszać przez 2 h w celu osiągnięcia równowagi.
   5. Ostrożnie dostosować pH roztworu do 5,0 za pomocą 1 M HCl.
   6. Dodać 141 mg proszku EDC do roztworu DMPA/magnetoferrytyny.
   7. Kontynuować mieszanie przez 3,5 h.
   8. Przefiltrować roztwór przez filtr strzykawkowy 0,22 µm w celu usunięcia ewentualnych osadów.
   9. Przenieść roztwór do rurki dializacyjnej z granicą odcięcia masy cząsteczkowej 12-14 kDa i dializować przeciwko 4 L 50 mM buforu fosforanowego (pH 7) zawierającego 50 mM NaCl przez 2 dni w temperaturze 4 °C, wymieniając bufor dializacyjny co najmniej trzy razy w tym okresie.
      UWAGA: Na tym etapie kationizowaną magnetoferrytynę można przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.

3. Znakowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych kationizowaną magnetoferrytyną

1. Uwagi ogólne
   1. Wszystkie hodowle komórkowe należy prowadzić w laminarnych szafach klasy II oraz w inkubatorach z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i atmosferze 5% dwutlenku węgla.
   2. Komórki hodowano jako monowarstwy w kolbach 175 cm² w 20 ml pożywki hodowlanej, którą uzupełniano co 3-4 dni. Pożywka hodowlana składała się z DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) zawierającego 1 000 mg/L glukozy, 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej, 1% (v/v) roztworu penicyliny/streptomycyny, 1% (v/v) roztworu L-alanylo-L-glutaminy oraz 5 ng/ml świeżo dodanego ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów.
2. Znakowanie magnetyczne hMSC kationizowaną magnetoferrytyną
   1. Wysiać 150 000 hMSC do kolb 25 cm² i pozostawić do adhezji przez noc w temperaturze 37 °C.
   2. Kationizowaną magnetoferrytynę wysterylizować przez filtr strzykawkowy 0,22 µm i oznaczyć stężenie białka.
   3. Zachowując warunki sterylne, przygotować 0,5 μM roztwór kationizowanej magnetoferrytyny w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Przechowywać w zamkniętym naczyniu w sterylnej komorze do momentu użycia.
   4. Przemyć wysiane komórki 2 ml PBS w temperaturze pokojowej.
   5. Dodać 1 ml wysterylizowanego roztworu kationizowanej magnetoferrytyny do wysianych komórek i inkubować przez pożądany czas (od 1 min do 1 h).
   6. Przemyć komórki PBS, a następnie zebrać komórki, dodając 0,5 ml trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubując w 37 °C przez 5 min.
   7. Dodać 1 ml pożywki hodowlanej w celu inaktywacji trypsyny/EDTA, przenieść roztwór do probówki wirówkowej 15 ml i wirować przez 5 min przy 524 x g.
   8. Odlać nadsącz i zawiesić osad komórkowy w 0,5 ml buforu do separacji magnetycznej, składającego się z 0,5% (w/v) płodowej surowicy bydlęcej i 2 mM EDTA w PBS.
3. Magnetyczna separacja komórek
   1. Przymocować magnes do wielostanu i założyć do niego kolumnę do separacji magnetycznej. Na kolumnie umieścić filtr wstępny.
   2. Wlać 0,5 ml buforu do separacji magnetycznej do filtra wstępnego i pozwolić mu przepłynąć przez filtr i kolumnę, aby je przemyć i nawilżyć.
   3. Pod kolumną umieścić probówkę wirówkową 15 ml.
   4. Dodać 0,5 ml zawiesiny komórkowej do zbiorniczka filtra kolumny do separacji magnetycznej.
   5. Po opróżnieniu zbiorniczka dodać 0,5 ml buforu do separacji magnetycznej.
   6. Po opróżnieniu zbiorniczka dodać kolejne 0,5 ml buforu do separacji magnetycznej.
   7. Powtórzyć czynność jeszcze raz (całkowita objętość buforu do separacji magnetycznej użyta do płukania powinna wynosić 1,5 ml). Ten etap płukania eluiuje z kolumny wszystkie nieznakowane magnetycznie komórki (frakcja komórek nieznakowanych).
   8. Zdjąć kolumnę z magnesu i umieścić ją w nowej probówce wirówkowej 15 ml. Usunąć filtr ze zbiorniczka kolumny.
   9. Dodać 1 ml buforu do separacji magnetycznej do zbiorniczka i natychmiast przepchnąć go przez kolumnę za pomocą tłoka dostarczonego przez producenta. Powoduje to elucję komórek znakowanych magnetycznie z kolumny do probówki wirówkowej (frakcja komórek znakowanych).
   10. Wirować obie probówki przez 5 min przy 524 x g.
   11. Odlać nadsącz i zawiesić osady komórkowe w 0,3 ml PBS.
   12. Policzyć liczbę komórek w każdej frakcji za pomocą komory hemocytometrycznej.
   13. Wyznaczyć frakcję komórek znakowanych magnetycznie, M(%), korzystając z następującego równania:
        
       gdzie n(M) to liczba komórek w frakcji znakowanej magnetycznie, a n(M+NM) to suma liczby komórek w frakcjach znakowanych i nieznakowanych magnetycznie.
4. Przygotowanie hMSC znakowanych kationizowaną magnetoferrytyną do oznaczania ilości żelaza metodą spektroskopii emisyjnej z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICP-OES)
   UWAGA: Protokół może wymagać dostosowania do innych aparatów ICP-OES. Zaleca się konsultację z odpowiedzialnym technikiem.
   1. Wirować znaną liczbę komórek przez 5 min przy 524 x g.
   2. Usunąć nadsącz PBS i dodać 0,25 ml 50% (v/v) kwasu azotowego.
   3. Wymieszać zakwaszoną zawiesinę komórkową na wirówce typu vortex.
   4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez noc.
   5. Dodać 4,75 ml wody destylowanej do każdej próbki i wymieszać na vortexie.
   6. Przeanalizować metodą ICP-OES.²⁸
   7. Znormalizować zmierzoną zawartość żelaza do liczby komórek, aby wyznaczyć wartość zawartości żelaza w komórkach.

Wyniki

Do potwierdzenia mineralizacji nanocząstek wewnątrz wnęki apoferrytyny oraz określenia średniej wielkości rdzenia wykorzystano TEM (Rycina 1A i 1B). Analiza obrazu niebarwionych próbek magnetoferrytyny wykazała średnicę rdzenia wynoszącą 8,2 ± 0,7 nm, a barwienie aurotioglukozą potwierdziło obecność nanocząstek wewnątrz klatki białkowej. Należy zauważyć, że na obrazach przedstawiono próbkę magnetoferrytyny, która została dodatkowo oczyszczona za pomocą separacji magnetycznej w celu wyizolowania jednorodnych rdzeni nanocząstek. Próbki magnetoferrytyny, które nie zostały oczyszczone magnetycznie, charakteryzują się nieco szerszym rozkładem wielkości rdzenia.²⁹ Analiza struktury rdzenia magnetoferrytyny z wykorzystaniem dyfrakcji elektronów z wybranej powierzchni (SAED) wskazała na możliwą obecność struktury spinelu odwróconego na bazie magnetytu (Fe₃O₄) i/lub maghemytu (γ-Fe₂O₃), a także struktury spinelu wynikającej z obecności Co₃O₄. Ponadto widma Ramana wykazały piki przypisane do Fe₃O₄, niewielkich ilości γ-Fe₂O₃ oraz ferrytu kobaltu (Rycina 1 C). Analiza ICP-OES magnetoferrytyny wykazała średnio 102 μg żelaza i 0,9 μg kobaltu na miligram magnetoferrytyny.

Dołączono schemat ilustrujący kolejny etap kationizacji (Rysunek 2 A). Średnica hydrodynamiczna magnetoferrytyny oraz kationizowanej magnetoferrytyny wynosiła odpowiednio 11,8 ± 1,1 nm i 12,5 ± 1,4 nm, co określono za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. Efektywność kationizacji poprzez kowalencyjne sprzęganie DMPA z magnetoferrytyną oceniono za pomocą potencjometrii zeta oraz spektrometrii mas MALDI-TOF (desorpcja/jonizacja laserowa wspomagana macierzą z analizą czasu przelotu). Potencjał zeta zmienił się z -10,5 mV dla MF na + 8,3 mV dla kationizowanej magnetoferrytyny, co potwierdza zmianę potencjału powierzchniowego z ujemnego na dodatni (Tabela 1). Doświadczenia ze spektrometrii mas wykazały masę cząsteczkową podjednostki wynoszącą 20,1 kDa dla natywnej apoferrytyny i 21,1 kDa dla kationizowanej apoferrytyny (Rysunek 2 B). Ten przyrost masy odpowiada około 12 sprzężonym cząsteczkom DMPA na podjednostkę białka oraz kationizacji 288 reszt w całym 24-podjednostkowym białku.

Nasycenie magnetyczne i podatność magnetyczną zmierzono za pomocą magnetometrii SQUID, natomiast relaksywność poprzeczną i podłużną zmierzono przy użyciu obrazowania rezonansem magnetycznym. Właściwości magnetyczne były podobne dla magnetoferrytyny i kationizowanej magnetoferrytyny, co wskazuje, że kationizacja miała pomijalny wpływ na właściwości magnetyczne zamkniętych wewnątrz SPION (Tabela 1). Ponadto właściwości te są zbliżone do innych nanocząsteczek opartych na tlenku żelaza,^19,30 co dowodzi, że kationizowana magnetoferrytyna byłaby tak samo odpowiednia jak konwencjonalne środki kontrastowe do MRI oparte na SPION w celu zwiększenia kontrastu obrazowania.

Po 30-minutowej ekspozycji powierzchnia komórek była gęsto pokryta kationizowaną magnetoferrytyną (Rycina 3 A). Jednakże po tygodniu na powierzchni komórek nie stwierdzono obecności nanocząsteczek (Rycina 3 B). Kationizowana magnetoferrytyna okazała się niezwykle skuteczna w znakowaniu magnetycznym hMSC. Co istotne, wystawienie komórek na działanie kationizowanej magnetoferrytyny przez jedną minutę doprowadziło do namagnesowania 92% populacji komórek i dostarczenia 3,6 pg żelaza na komórkę. Wydłużenie czasu inkubacji do 15 minut poskutkowało namagnesowaniem całej populacji komórek (Rycina 3 C).

Rycina 1: Charakterystyka rdzeni magnetoferrytyny domieszkowanej 5% kobaltu. Obrazy TEM magnetoferrytyny barwionej aurotioglukozą (A) i niebarwionej (B). Wstawka przedstawia odpowiadającą dyfrakcję elektronów z indeksami magnetytu. Pasek skali: 20 nm. (C) Widmo Ramanowskie magnetoferrytyny. Strzałki wskazują główne mody wibracyjne Ramanowskie dla ferrytu kobaltu (T_2g), magnetytu i maghemytu (oba A_1g).^31,32 Wykorzystana długość fali lasera wynosiła 532 nm. (Obraz zaadaptowany z Okuda et al.¹⁸). Należy zauważyć, że ta próbka magnetoferrytyny została dodatkowo oczyszczona za pomocą separacji magnetycznej, co pozwoliło na wyizolowanie jednorodnie obciążonych cząstek magnetoferrytyny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 2: Kationizacja magnetoferrytyny. A) Reprezentacje dostępnej dla rozpuszczalnika powierzchni białka ukazujące rozkład kwasowych (czerwonych) i zasadowych (żółtych) reszt aminokwasowych na powierzchni białka. Magnetoferrytyna (1) zostaje przekształcona w kationizowaną magnetoferrytynę (2) poprzez sieciowanie DMPA z kwasowymi resztami aminokwasowymi na powierzchni białka (3) za pośrednictwem karbodiimidu. B) Analiza spektrometryczna podjednostek apoferrytyny i kationizowanej apoferrytyny. Widmo stosunku masy do ładunku (m/z) apoferrytyny (ApoF) i kationizowanej apoferrytyny (cat-ApoF) uzyskane metodą MALDI-TOF. Po kationizacji obserwuje się wzrost masy z 20.1 kDa do 21.1 kDa. (Obraz zaadaptowany z Correia Carreira et al.¹⁵) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Znakowanie magnetyczne i separacja komórek hMSC inkubowanych z kationizowaną magnetoferrytyną. A) Obraz TEM komórek hMSC po 30-minutowej inkubacji z kationizowaną magnetoferrytyną. Strzałka wskazuje obecność rdzeni magnetoferrytyny gęsto upakowanych na powierzchni komórki. Paski skali: 200 nm. B) Obraz TEM komórki hMSC tydzień po znakowaniu. Powierzchnia komórki jest wolna od kationizowanej magnetoferrytyny. C) Badanie szybkości znakowania magnetycznego: 92% populacji komórek zostało namagnesowanych po jednominutowej ekspozycji na 0.5 μM kationizowanej magnetoferrytyny, a cała populacja komórek została namagnesowana w ciągu 15 minut. Zawartość żelaza na komórkę określono za pomocą ICP-OES. Przedstawiono średnią i odchylenie standardowe z trzech powtórzeń biologicznych. (Obraz zaadaptowany z Correia Carreira et al.¹⁵) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

	MF	cat-MF
Średnica hydrodynamiczna [nm]	11.8 ± 1.1	12.5 ± 1.4
Potencjał zeta [mv]	(-)10.4 ± 0.2	8.3 ± 0.7
Magnetyczny moment nasycenia [Am2 kg-1]	54.9 ± 1.6	55.3 ± 1.4
Podatność masowa [x 104 m3 kg-1]	1.75 ± 0.08	1.75± 0.07
Relaksywność podłużna [mM-1 sec-1]	2.6 ± 0.1	2.3 ± 0.1
Relaksywność poprzeczna [mM-1 sec-1]	44.6 ± 1.0	52.8 ± 0.8

Tabela 1: Charakterystyka fizykochemiczna magnetoferrytyny (MF) i kationizowanej magnetoferrytyny (cat-MF). (Tabela zaadaptowana z Correia Carreira et al.¹⁵)

Dyskusja

TEM próbek magnetoferytyny barwionych aurothioglukozą ujawnił udaną mineralizację nanocząstek wewnątrz klatki białkowej. Dyfrakcja elektronów i analiza Ramana rdzenia nanocząstki wykazały obecność ferrytu kobaltu, co wskazuje na udane domieszkowanie rdzenia nanocząstki kobaltem. Pokazuje to, że nanocząstki o mieszanym tlenku mogą być z powodzeniem mineralizowane w jamie apo-ferrytyny. Ponadto wykazaliśmy wcześniej, że domieszkowanie kobaltem można zmieniać poprzez zmianę ilości prekursora kobaltu dodawanego do mieszaniny reakcyjnej, co umożliwia dostrojenie właściwości magnetycznych. ^{Rozdział 18}

Syntezę magnetoferrytyny można przeprowadzać w różnych naczyniach, o ile są one szczelnie zamknięte i mają porty dostępowe, przez które można wprowadzać reagenty (np. kolba okrągłodenna z trzema szyjkami). Temperatura reakcji powinna być utrzymywana na poziomie 65 °C albo poprzez umieszczenie naczynia w kąpieli wodno-olejowej, albo przez użycie naczynia z podwójnym płaszczem. W tym przypadku do przeprowadzenia syntezy użyliśmy dwupłaszczowego zestawu ogniw elektrochemicznych. Aby zagwarantować udaną syntezę, kluczowe znaczenie ma utrzymanie prawidłowego pH i unikanie zanieczyszczenia roztworów wodnych tlenem. Roztwory soli metali należy zawsze przygotowywać na świeżo przed użyciem, a nie wcześniej. Ponadto komercyjne roztwory apoferrytyny mogą różnić się jakością i wpływać na wynik syntezy (np. wielkość zmineralizowanego rdzenia nanocząsteczkowego). Może pomóc w dializie roztworu apoferrytyny do 50 mM buforu HEPES (pH 8,6) przed syntezą w celu usunięcia wszelkich pozostałości środka redukującego stosowanego przez producenta. Przydatne jest zanotowanie numeru partii roztworu apo-ferrytyny używanego do syntezy, aby można było o niego wyraźnie poprosić producenta, jeśli konieczne jest zakupienie dodatkowego materiału. Ponadto na butelce należy podać stężenie białka w dostępnej w handlu apo-ferrytynie, która może być wykorzystana do obliczenia objętości roztworu apo-ferrytyny potrzebnego do syntezy. Jeśli tak nie jest, skontaktuj się z dostawcą, aby uzyskać te informacje.

Zaletą stopniowego dodawania soli metali i nadtlenku wodoru – przedstawionej tutaj i w poprzednich raportach – jest to, że mineralizacja rdzenia nanocząstek może być kontrolowana w taki sposób, że można osiągnąć różne współczynniki obciążenia (tj. rozmiary nanocząstek). ³³ Ponadto możliwe jest dalsze oczyszczanie magnetoferrytyny za pomocą magnetycznej kolumny separacyjnej, np. kolumny wypełnionej proszkiem ze stali nierdzewnej zabezpieczonym wewnątrz elektromagnesu. ³⁴ W ten sposób wysoce monodyspersyjne rdzenie nanocząstek można wyizolować z próbki magnetoferytyny w masie. Jednak w przypadku etykietowania komórek magnetycznych, jak to tutaj przedstawiono, nie jest to wymagane. Ograniczeniem syntezy magnetoferytyny jest stosunkowo niska wydajność syntezy wynosząca około 10% oraz stosunkowo wysoki koszt komercyjnych roztworów apo-ferrytyny. Jednak apo-ferrytyna może być również wytwarzana z taniej dostępnej ferrytyny śledziony końskiej, postępując zgodnie z ustalonymi protokołami demineralizacji. ¹⁶

Kationizację magnetoferytyny osiągnięto poprzez dodanie stosunku molowego 250 cząsteczek DMPA i 50 cząsteczek EDC na ujemnie naładowaną resztę (obliczenia oparte na sekwencji aminokwasowej ferrytyny śledziony konia). Ten nadmiar odczynnika nad białkiem skutkował wysoką wydajnością kationizacji, porównywalną również z wcześniej zgłaszanymi wynikami dla kationizacji ferrytyny. ³⁵ Do analizy MALDI-TOF użyto apoferrytyny i kationizowanej apoferrytyny ze względu na nadmierną masę cząsteczkową rdzenia magnetoferytyny. Aby uzyskać wysoką wydajność kationizacji, kluczowe znaczenie ma również optymalne pH. Sieciowanie za pośrednictwem EDC jest najskuteczniejsze w łagodnie kwaśnych warunkach i stwierdziliśmy, że pH 5 daje optymalne wyniki kationizacji magnetoferrytyny. Jednak w przypadku innych białek kationizacja pH może wymagać optymalizacji. Należy unikać kationizacji w punkcie izoelektrycznym białka lub w jego pobliżu, ponieważ może to prowadzić do silnych opadów.

Namagnesowanie komórek macierzystych za pomocą kationizowanej magnetoferytyny było bardzo wydajne i można je było osiągnąć przy użyciu czasu inkubacji znacznie poniżej 30 minut. Nawet jednominutowa inkubacja spowodowała zawartość żelaza w komórkach wynoszącą 3,6 pg, co mieści się w zgłoszonym zakresie wymaganym do wpłynięcia na kontrast T2 i T2* w MRI. ^36,37 Godne uwagi jest również to, że to skuteczne znakowanie osiąga się przy niskich stężeniach żelaza w zewnątrzkomórkach. Na przykład wcześniejsze badania z wykorzystaniem nanocząstek anionowych wykazały poziom żelaza wynoszący 10 pg na komórkę po 30-minutowym okresie inkubacji z 5 mM żelaza. ³⁸ Dla porównania, inkubacja z kationizowanym roztworem magnetoferytyny zawierającym białko 0,5 μM odpowiada inkubacji z około 0,2 mM żelaza, a także daje około 10 pg żelaza na komórkę po 30 minutach. Nie byliśmy w stanie jednoznacznie zidentyfikować żadnych pęcherzyków endocytotycznych za pomocą TEM. Jednak wcześniejsze badania z użyciem kationizowanej ferrytyny wykazały, że internalizacja nastąpiła w ciągu pierwszych dziesięciu minut ekspozycji. ^39,40 Kationizowana ferrytyna może być zlokalizowana w pokrytych pęcherzykach, co wskazuje na endocytozę zależną od klatryny lub kaweoliny. Te same badania wykazały również, że po 30 minutach inkubacji kationizowana ferrytyna była nadal obecna na powierzchni komórki, a także w ciałach wielopęcherzykowych, przypominających lizosomy.

Dalsze zastosowania mogą obejmować kationizację klatek apo-ferrytynowych obciążonych innymi nanocząstkami i/lub cząsteczkami funkcjonalnymi, takimi jak leki przeciwnowotworowe⁴¹ lub kropki kwantowe⁴². Kationizacja tych konstruktów ferrytyny może skutkować szybszym i bardziej wydajnym dostarczaniem ich ładunku do komórek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)	Proszek Fisher Scientific	BPE310-1	; przygotować 1 M roztwór podstawowy o pH 8,6 i rozcieńczyć do 50  mM przed użyciem. Sprawdź dokładnie pH przed syntezą!
apoferrytyna ze śledziony	koni Sigma Aldrich	A3641	użyliśmy LOT# 081M7011V
siarczan kobaltu siedmiowodny	Sigma Aldrich	C6768	przygotować świeże roztwory z soli przed syntezą
sześciowodnego siarczanu amonu i żelaza	Sigma Aldrich	F1543	przygotować świeże roztwory z soli przed syntezą
roztwór nadtlenku wodoru (30%)	Sigma Aldrich	216763	przygotować świeże roztwory z soli przed syntezą
cytrynian sodu	Sigma Aldrich	S1804	w proszku; można przygotować 1 M roztwór i przechowywać go w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy
Jednostka filtrująca Millex GP, 0,22  mikronowy	filtr strzykawkowy	Merck Millipore	SLGP033RS
Trizma base	Sigma Aldrich	T1503	w proszku; przygotować 1 M roztwór podstawowy o pH 8,0 i rozcieńczyć do 50  mM przed użyciem
chlorek sodu	Sigma Aldrich	31434	poweder; dodać do w razie potrzeby
Filtry odśrodkowe Centriprep	Merck Millipore	4310	Ultracel YM-50, objętość 12 ml; stosować do początkowego zatężania do momentu zagęszczenia roztworu magnetoferytyny z około 150 ml do 20 ml; ml
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-4 z	Merck Millipore	UFC801024	Ultracel-10, 4  objętość ml; Służy do zagęszczania roztworu magnetoferytyny od około 20 ml do  2 ml
ANX Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare	17-1287-04	sami zapakowaliśmy tę kolumnę
Kolumna HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR	GE Healthcare	17-1196-01	ta kolumna została zakupiona w stanie gotowym do zapakowania
Ä System oczyszczania KTA	Pompa	28406264
P-960	GE Healthcare	18-6727-00	załaduj próbkę z natężeniem przepływu 10 ml/min
automatyczny kolektor frakcji Frac-950	GE Healthcare	18-6083-00
Odczynnik do oznaczania Bradford	Sigma Aldrich	B6916	roztwór gotowy do użycia
Ferrytyna, Typ I: ze śledziony konia	Sigma Aldrich	F4503	przygotuj wzorce ferrytyny z tego roztworu, aby określić stężenie magnetoferrytyny
N,N-dimetylo-1,3-propanodiamina (DMPA)	Sigma Aldrich	308110	UWAGA: podczas regulacji pH roztworu DMPA wykonaj ten krok w dygestorio
N-(3-dimetyloaminopropylo)-N'-etylokarbodimid ( EDC)	Sigma Aldrich	E6383	przechowywać w zamrażarce, ale przed otwarciem butelki doprowadzić do temperatury pokojowej
Kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy (MES)	AppliChem	A0689,0500	przygotować 200 M roztwór podstawowy o pH 5
rurka do dializy membrana celulozowa	Sigma Aldrich	D9652	przed użyciem
namoczyć 10 minut w wodzie dejonizowanejDulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium (DMEM), 1,000 mg/L glukozy	Sigma Aldrich	D5546	ciepły w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
płodowa surowica bydlęca	Sigma Aldrich	F7524	dodaj do zapasów butelka DMEM, 10% (v/v) końcowe stężenie
roztwór penicyliny/streptomycyny	Sigma Aldrich	P0781	dodaj do zapasów Butelka DMEM, 1% (v/v) końcowe stężenie
roztwór glutamax	Gibco	35050-087	dodaj do magazynu Butelka DMEM, 1% (v/v) stężenie końcowe
ludzki czynnik wzrostu fibroblastów	PeproTech	100-18B	dodawać do DMEM świeżo do kolby do hodowli komórkowych przy każdej zmianie pożywki; stężenie końcowe 5 ng/ml
sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Sigma	Aldrich D8537	sterylny roztwór, do komórek cultrue
roztwór trypsyny/EDTA	Sigma Aldrich	E5134	przechowywać w zamrażarce i rozmrażać w 37  ° C kąpiel wodna przed użyciem
kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma Aldrich	E5134	proszek; przygotować 2 mM roztwór w PBS
albumina surowicy bydlęcej	Sigma Aldrich	A7030	dodać 0,5% (w/v) do 2  Roztwór mM EDTA w PBS; ostrożnie wymieszać mieszadłem magnetycznym, unikać pienienia; filtr sterylizuj przez filtr strzykawkowy 0,22 mikrona
MACS multi stand	Miltenyi Biotec	130-042-303	do mocowania magnesu MACS
Kolumny MACS MS	Miltenyi Biotec	130-042-201	jednorazowe; przeznaczone do jednorazowego użytku, ale jeśli sterylność nie jest wymagana, można je ponownie użyć: umyć wodą dejonizowaną i 100% etanolem i umieścić w suszarce; wyrzucić, jeśli zauważysz zardzewiałe plamy
Magnes separatora MiniMACS	Miltenyi Biotec	130-042-102	można kupić jako zestaw startowy, razem z kolumnami i stojakami
Filtr wstępnej separacji kolumn MACS	Miltenyi Biotec	130-041-407	Filtr 30 mm
Kwas azotowy, 64-66%	Sigma Aldrich	7006
Titrando 907, pompa strzykawkowa	Metrohm	2.907.0020
Sprzęt używany do charakteryzowania magnetoferrytyny i kationizowanej magnetoferytynyUrządzenia
	molekularne	SpectraMax M5	Służy do pomiaru absorbancji w teście Bradforda
JEM 1200 EX	JEOL		Służy do obrazowania TEM magnetoferrytyny
Spektrometr Ramana InVia	Renishaw		Używany do spektroskopii Ramana
Laser Torus DPSS	Laser Quantum		Używany do spektroskopii Ramana
Bruker UltrafleXtreme	Applied Biosystems		Używany do analizy MALDI-TOF apoferrytyny i kationizowanej apoferrytyny
ZetaSizer Nano-ZS	Malvern Instruments		Służy do pomiaru średnicy hydrodynamicznej i potencjału zeta magnetoferrytyny i kationizowanej magnetoferrytyny
System pomiaru właściwości magnetycznych	Projekt kwantowy		Służy do pomiaru momentu nasycenia magnetycznego i podatności magnetycznej
Magnetom Skyra	Siemens		Służy do wyznaczania relaksatywności wzdłużnej i poprzecznej
Tecnai 12 BioTwin Spirit	FEI		Służy do obrazowania TEM hMSC znakowanego kationizowaną magnetoferytyną
710 ICP-OES	Agilent		Służy do oznaczania zawartości żelaza w komórkach