Alternatywna i zwalidowana metoda iniekcji umożliwiająca dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przez przeztwardówkowy dostęp tylny

Summary

Zastrzyki podsiatkówkowe są najczęstszą techniką dostarczania dużych środków terapeutycznych, takich jak białka i wektory wirusowe, do fotoreceptorów i nabłonka barwnikowego siatkówki. Alternatywna metoda u myszy, która z powodzeniem celuje w przestrzeń podsiatkówkową z minimalnymi uszkodzeniami ubocznymi i krótkim czasem rekonwalescencji, jest opisana tutaj.

Abstract

Zastrzyki podsiatkówkowe były z powodzeniem stosowane zarówno u ludzi, jak i gryzoni, aby dostarczyć interwencje terapeutyczne białek, czynników wirusowych i komórek do przedziału międzyfotoreceptorowego/podsiatkówkowego, który ma bezpośrednią ekspozycję na fotoreceptory i nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE). Podsiatkówkowe zastrzyki plazminogenu, a także niedawne badania przedkliniczne i kliniczne wykazały bezpieczeństwo i/lub skuteczność dostarczania wektorów wirusowych i komórek macierzystych osobom z zaawansowaną chorobą siatkówki. Mysie modele chorób siatkówki, w szczególności dziedzicznych dystrofii siatkówki, są niezbędne do testowania tych terapii. Najczęstszą procedurą iniekcji u gryzoni jest wykonanie małych nacięć przezrogówkowych lub przeztwardówkowych z przednim dostępem do siatkówki. Dzięki takiemu podejściu igła iniekcyjna przenika do siatkówki neurosensorycznej, zaburzając leżące pod nią RPE, a po wprowadzeniu może łatwo naciąć soczewkę, powodując zmętnienie soczewki i upośledzenie nieinwazyjnego obrazowania. Dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej przez dostęp przeztwardówkowy, tylny pozwala uniknąć tych problemów: igła przecina twardówkę około 0,5 mm od nerwu wzrokowego, bez penetracji siatkówki i unika przerwania ciała szklistego. Uszkodzenia uboczne są ograniczone do tych związanych ze sklerotomią ogniskową i skutkami przejściowego, surowiczego odwarstwienia siatkówki. Prostota metody minimalizuje obrażenia oczu, zapewnia szybkie ponowne przyczepienie i regenerację siatkówki oraz ma niski wskaźnik awaryjności. Minimalne uszkodzenia siatkówki i RPE pozwalają na jasną ocenę skuteczności i bezpośrednich efektów samych środków terapeutycznych. Ten manuskrypt opisuje nowatorską technikę wstrzykiwania podsiatkówkowego, która może być stosowana do kierowania wektorów wirusowych, środków farmakologicznych, komórek macierzystych lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) do przestrzeni podsiatkówkowej u myszy z wysoką skutecznością, minimalnymi uszkodzeniami i szybkim powrotem do zdrowia.

Introduction

Zastrzyki podsiatkówkowe są głównym sposobem dostarczania czynników komórkowych i wirusowych do siatkówki myszy w celu zbadania ich wpływu na fotoreceptory i leżący u ich podstaw RPE^1,2. Większość protokołów wstrzyknięć podsiatkówkowych u myszy wykorzystuje miejsce wstrzyknięcia przezrogówkowego lub przeztwardówkowego przed równikiem (ryc. 1). Takie podejście może prowadzić do nieodłącznych uszkodzeń ubocznych, które obejmują nacinanie i wynikające z tego zmętnienie soczewki, zakłócenie integralności ciała szklistego, penetrację siatkówki neurosensorycznej i tęczówki, krwotok siatkówki, znaczne odwarstwienie siatkówki i trwały obrzęk podsiatkówkowy ^3-9. Manipulacje eksperymentalne muszą przezwyciężyć te efekty, aby ocenić efekty interwencji terapeutycznych^3,7,10,11. Badanie to zawiera szczegółowy opis i walidację metody wstrzykiwania tylnego przeztwardówkowego, która pozwala uniknąć tych powikłań, minimalizuje uraz i ma wysoki wskaźnik sukcesu w celowaniu w przestrzeń podsiatkówkową.

Zastrzyki celujące w przestrzeń podsiatkówkową u myszy są często bardzo trudne do wykonania, a większość badaczy spotyka się z dużą częstotliwością nieudanych prób, w których wektor jest dostarczany w niewłaściwe miejsce lub dochodzi do znacznego uszkodzenia siatkówki, na przykład w całkowitym odwarstwieniu siatkówki⁶. Liczba oczu wykluczonych z analizy z powodu powikłań po wstrzyknięciu zazwyczaj nie jest podawana w badaniach na myszach, ale z naszego własnego doświadczenia i w dyskusji z innymi badaczami wynika, że liczba nieudanych wstrzyknięć może sięgać nawet 50% i różnić się w zależności od doświadczenia i możliwości badacza, który wykonuje zastrzyki. Powodzenie wstrzyknięcia jest zwykle oceniane za pomocą bezpośredniego obrazowania dna oka i/lub optycznej koherentnej tomografii (OCT)^7,9. Łatwa do opanowania metoda o wysokim wskaźniku powodzenia w iniekcjach podsiatkówkowych u myszy może przyspieszyć eksperymenty i obniżyć koszty badań przedklinicznych nad leczeniem chorób siatkówki, które są główną przyczyną ślepoty w Stanach Zjednoczonych.

Opisana tutaj technika iniekcji podtwardówkowej tylnej jest adaptacją z klinicznych i przedklinicznych protokołów^9,12. Nieinwazyjne oceny diagnostyczne przeprowadzone na myszach, którym wstrzyknięto zastrzyki, wykazują łagodne i wysoce zlokalizowane uszkodzenia oraz brak dodatkowych uszkodzeń soczewek ubocznych, siatkówki i RPE. Co więcej, przy stosunkowo niewielkiej praktyce eksperymentator może osiągnąć te wyniki z wysokim wskaźnikiem sukcesu (80 - 90% lub lepszym), zmniejszając w ten sposób koszty związane z takimi badaniami. Procedura ta może być stosowana do dostarczania komórkowych, wirusowych lub farmakologicznych interwencji terapeutycznych do fotoreceptorów i/lub RPE w badaniach przedklinicznych oraz do łatwej oceny interwencji eksperymentalnych.

Protocol

Zwierzęta: Myszy typu dzikiego C57Bl/6J wyhodowane na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles (UCLA). Wszystkie zwierzęta były w wieku od 11 do 17 tygodni i obejmowały samce i samice myszy. Wszystkie myszy trzymano w grupach, utrzymywano w cyklu światło/ciemność 12:12 z jedzeniem i wodą ad libitum. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi UCLA i Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research.

UWAGA: Wszystkie leki i środki iniekcyjne są klasy Farmakopei Stanów Zjednoczonych (USP).

1. Przygotowanie chirurgiczne

1. Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym 100 mg/kg ketaminy i 8 mg/kg ksylazyny w mieszaninie soli fizjologicznej. Podaj znieczulenie na taką głębokość, aby mysz nie miała odruchów szczypania palców u nóg ani dotyku rogówki.
2. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37,0 °C za pomocą poduszki z krążącą wodą.
3. Rozszerz źrenice za pomocą kropli do oczu z 2,5% fenylefryny i przytnij wąsy, aby ułatwić wizualizację. Wąsy dostarczają myszowi znaczącego bodźca sensorycznego, dlatego przycinanie wąsów powinno usuwać tylko tę część, która blokuje wyraźny dostęp do oka, a nie do podstawy wąsa. Z naszego doświadczenia wynika, że myszy wykazują normalną regenerację po tym zabiegu. Zastosuj krople do oczu z metylocelulozą, aby zapobiec wysuszeniu i zminimalizować przejściową zaćmę wywołaną znieczuleniem¹³.
4. Sterylizuj narzędzia przed zabiegiem (tj. betadynę i etanol lub gorące kulki).
5. Przygotować rozcieńczoną fluoresceinę (0,01% przy użyciu 0,9% soli fizjologicznej) w sterylnym środowisku (tj. w komorze bezpieczeństwa biologicznego), jeśli ma być wykonywana wizualizacja (patrz sekcja 3 poniżej).

2. Przygotowanie miejsca wstrzyknięcia

1. Przygotować strzykawkę (np. strzykawkę o pojemności 5 μl) z odpowiednią objętością wstrzyknięcia (np. 0,3 do 1,0 μl).
2. Ustaw mysz tak, aby oko było skierowane do góry i dobrze widoczne w mikroskopie preparacyjnym.
3. Delikatnie ściśnij spojówkę skroniową kleszczami z cienką końcówką. Wykonaj nacięcie obwodowe pod kątem około 90 stopni za pomocą zakrzywionych nożyczek Vannas.
4. Powtórz krok 2.3 z leżącą pod spodem kapsułką Tenona.
5. Wytnij otaczającą tkankę łączną za pomocą kleszczy z cienką końcówką, obracając gałkę ziemską nosowo. Pracować w kierunku miejsca wstrzyknięcia około 0,5 mm skroniowego do nerwu wzrokowego. Zachowaj szczególną ostrożność, aby uniknąć zakłócenia zatoki zaoczodołowej.

3. Sklerotomia i wstrzyknięcie podsiatkówkowe

UWAGA: Zaleca się wstrzyknięcie 0,01% fluoresceiny do 0,9% soli fizjologicznej, aby pomóc w wizualizacji podczas nauki tej procedury. Topograficzne rozmieszczenie fluoresceiny można skutecznie udokumentować za pomocą obrazowania dna oka (patrz punkt 4 poniżej).

1. Wykonaj małe nacięcie twardówki w miejscu wstrzyknięcia, delikatnie drapiąc muszlę oczną ostrzem okulistycznym pod kątem 22,5 stopnia. To nacięcie powinno być tylko na tyle duże, aby końcówka igły mogła przejść przez twardówkę.
2. Wprowadzić igłę ze skosem 33 G (pod kątem 5 - 10° do sklerotomii ze skosem skierowanym w stronę i pod kątem równoległym do siatkówki. Wstrzyknąć żądaną objętość (np. 0,3 do 1,0 μl 0,01% fluoresceiny do celów edukacyjnych).
   UWAGA: Należy zachować sterylność strzykawki poprzez dokładne czyszczenie poprzez kolejne płukania odpowiednim rozpuszczalnikiem i wodą demineralizowaną przed każdym wstrzyknięciem.
3. Wciskać tłok powoli (ponad ~ 3 sekundy) bez przesuwania igły i z równomiernym naciskiem.
   UWAGA: Gdy igła znajduje się w przestrzeni podsiatkówkowej, podczas wciskania tłoka wyczuwalny będzie lekki opór. Opór nie będzie minimalny lub minimalny, jeśli igła przebije siatkówkę, a wysoki opór, jeśli igła nie wbije się w twardówkę lub RPE.
4. Odczekaj kilka sekund przed wyjęciem igły, aby zminimalizować przepływ wsteczny.
5. Przepłukać oko sterylnym buforowanym roztworem soli fizjologicznej i upewnić się, że oko obróciło się z powrotem do normalnej pozycji.

4. Ocena odwarstwienia siatkówki za pomocą OCT i obrazowania dna oka

1. Wykonaj obrazowanie OCT natychmiast po wstrzyknięciu, aby ocenić jakość wstrzyknięcia i w odpowiednich momentach po wstrzyknięciu, w razie potrzeby w celu oceny struktury siatkówki.
   UWAGA: Przykłady zastosowania OCT w podobnych badaniach zostały wcześniej opisane^7,14.
   1. Dostosuj i wyrównaj obraz OCT, aby celować w miejsce wstrzyknięcia. Miejsce wstrzyknięcia powinno znajdować się w linii środkowej i 0,5 mm skroniowo do głowy nerwu wzrokowego. Powtórz w razie potrzeby, jeśli odczepienie znajduje się poza kadrem lub nie jest optymalnie wyśrodkowane.
2. Wizualizacja odwarstwienia siatkówki i obszaru iniekcji barwnika za pomocą obrazowania dna twarzy ^7,14,
   UWAGA: Jeśli system obrazowania OCT nie jest dostępny, wstrzyknięcie niewielkiej ilości fluoresceiny z wektorem do ćwiczeń umożliwi wizualizację za pomocą dowolnej kamery do badania dna oka, która wykonuje angiografię fluoresceinową przy użyciu tych samych długości fal wzbudzenia i filtrów blokujących. Zlokalizowane obszary hiperfluorescencji pojawią się pod naczyniem, a układ naczyniowy będzie miał ostre i wyraźne granice, jeśli przestrzeń podsiatkówkowa zostanie prawidłowo ukierunkowana. Krawędź pęcherzyka po wstrzyknięciu zostanie wyznaczona przez przejście od hiper- do hipofluorescencji. Kilka instrumentów zapewnia tę funkcję myszy; Zastosowane tutaj oprzyrządowanie jest opisane w innym miejscu¹⁴.

5. Opieka pooperacyjna

1. Nałóż grubą warstwę kremu okulistycznego z potrójnym antybiotykiem na powierzchnię rogówki wstrzykniętego oka.
2. Umieść myszy w czystych, samotnych klatkach w celu odzyskania zdrowia. Nie należy łączyć myszy, które przeszły operację, dopóki nie zostaną w pełni wyleczone.
3. Monitoruj oddech i temperaturę podczas rekonwalescencji po znieczuleniu. Monitoruj zwierzęta, dopóki nie będą w stanie utrzymać pozycji leżącej mostka.
4. Należy przeprowadzić dodatkowe odpowiednie monitorowanie i leczenie pooperacyjne, w tym podskórne wstrzyknięcie karprofenu (5 mg/kg) w celu leczenia bólu pooperacyjnego.

6. Ocena funkcji siatkówki za pomocą elektroretinografii (ERG)

1. Wykonaj analizę ERG przed wstrzyknięciem i w odpowiednim czasie po wstrzyknięciu, w razie potrzeby, aby ocenić czynność siatkówki. Jeśli wstrzyknięcie zostało wykonane w przestrzeń podsiatkówkową, odwarstwienie siatkówki powinno ustąpić w ciągu 72 godzin.
   1. Należy zastosować standardowe techniki ERG do oceny funkcji siatkówki przed i po wstrzyknięciu, jak opisano wcześniej^14,15.

7. 3D Rekonstrukcja i kwantyfikacja objętości bleb

UWAGA: Skany OCT o wysokim kontraście, obejmujące całe oderwanie w kadrze view, są optymalne do użycia. Użyto ImageJ/Fiji^17,18 i Imaris, ale można użyć innego oprogramowania.

1. Wyeksportuj interesujący Cię b-scan, zaimportuj do ImageJ/Fiji i przytnij (Image > Crop) część skanu OCT, która ma być modelowana, za pomocą prostokątnego narzędzia do zaznaczania.
   1. Dostosuj kontrast (Obraz > Dostosuj > Jasność/Kontrast) i wyznacz brakujące granice, łącząc dwie sekcje linią.
   2. Narysuj linię prostą za pomocą narzędzia do tworzenia linii (przytrzymując Shift), która rozciąga RPE na warstwę fotoreceptorów. Zmierz (Analizuj > Zmierz) długość linii, aby uzyskać rozmiar maksymalnego odcięcia dla kroku 7.8.
2. Importuj przycięte klatki do oprogramowania do rekonstrukcji 3D (patrz tabela materiałów) za pomocą wtyczki "RGB do szarości" i środowiska uruchomieniowego kompilatora MATLAB.
3. Ustaw rozmiar woksela (w obszarze Właściwości obrazu) przy użyciu parametrów kalibracji ze skanowania OCT (x,y,z).
4. Uruchom wtyczkę "RGB do szarości" (w obszarze Właściwości obrazu), z równą wagą dla każdego kanału, aby utworzyć czwarty kanał. Usuń oryginalne kanały czerwono-zielono-niebieskie.
5. Odwróć kanał szarości za pomocą zmiany kontrastu. Przechowuj obraz.
6. Kliknij przycisk "dodaj nową powierzchnię" w zakładce Widok 3D i rozpocznij 4-etapowy proces tworzenia powierzchni z przewodnikiem.
   1. Ustawianie szczegółowości poziomu powierzchni (krok 1 z 4).
      UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że najskuteczniejszy zakres wynosił od 8,0 do 12,0.
   2. Ustawia maksymalny rozmiar sfery (w obszarze Wybór tła) na nieco mniejszy niż maksymalny rozmiar odłączenia zmierzony w 7.1.2. Utwórz powierzchnię i cofnij odwrócenie kanału szarości (krok 2 z 4).
   3. Ustaw próg na wartość maksymalną, aby powierzchnia ujemnych przestrzeni na zewnątrz siatkówki i odwarstwienie nie stykały się (krok 3 z 4).
   4. Ustaw typ filtra na liczbę wokseli i wyizoluj ujemną przestrzeń w miejscu odłączenia według rozmiaru. Wykończ powierzchnię (krok 4 z 4).
      UWAGA: Objętość powierzchni odczepiania znajduje się w sekcji objętość w zakładce statystyki.

Results

Na 31 zdrowych oczach od 16 myszy typu dzikiego wykonano zastrzyki przeztwardówkowe z dostępu tylnego z iniekcjami 0,3 μl (n = 18), 0,5 μl (n = 8) i 1,0 μl (n = 5) 0,01% fluoresceiny. Jedno oko zostało wykluczone z iniekcji ze względu na istniejące wcześniej zmętnienie rogówki, które uniemożliwiało analizę strukturalną i funkcjonalną. Każde oko, w które wykonano wstrzyknięcie, jest ujęte w tym raporcie. Nie wykryto żadnych niezamierzonych odwarstwień siatkówki, nakłuć siatkówki neurosenso...

Discussion

Iniekcje podsiatkówkowe są metodą z wyboru w dostarczaniu wektorów wirusowych i terapii pochodzącej z komórek macierzystych do manipulowania fotoreceptorami i RPE zarówno w badaniach podstawowych, jak i leczeniu klinicznym. U pacjentów wstrzyknięcia podsiatkówkowe są zwykle wykonywane z sklerotomią przednią w pars plana, witrektomią rdzenia tylnego i penetracją siatkówki przez igłę z bezpośrednią wizualizacją. Podobnie jak w przypadku większości zabiegów witrektomii, często dochodzi do przedwczesnego powstawania zaćmy, c...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Strzykawka x 1
Igła Hamilton 33 G, 1.0 ", 20 STOPNI, punkt 3 (stal nierdzewna 304)	Hamilton	7803-05	Igły x 6
Vannas Zakrzywione nożyczki	Ted Pella, INC.	1347	Ostrze 5 mm
Nóż mikrochirurgiczny 22,5 stopnia	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
Ketaject	Phoenix	NDC 57319-609-02	Ketamina
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Ksylazyna
Fluoresceina 10% AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 mg / ml
0,9% Sól fizjologiczna USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0,9% NaCl
Maść antybiotykowa	Akorn	NDC 17478-235-35	okulistyczna
Pompa obiegowa	Gaymar	TP-500 T/pompa	Nr kat. 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	R-Series	Komercyjna
kamera do badania dna oka Phoenix	Research Laboratories	Pęseta MICRON III
Typ 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2,5% Phenylephrine	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	Okulistyczny
IMARIS8	Bitplane		Wersja 8.1.2
ImageJ	NIH		V1.8.0_77
Hypromeloza  2,5%	Goniovisc	AX0401	Metylocelulozowe
krople do oczu (do płukania)	Bausch & Mikroskop	roztworu soli
	Mikroskop Zeiss	Stemi 2000
Źródło światła	Fostec	P/N 20520	Źródło światła