Artykuł metodologiczny

Optogenetyczna mutageneza losowa z wykorzystaniem histonów-miniSOG u C. elegans

DOI:

10.3791/54810

⸱

14 listopada 2016

 , 
1Division of Biological Sciences, Section of Neurobiology, University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California in San Diego School of Medicine and Howard Hughes Medical Institute

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naprzód genetyczne badania przesiewowe w organizmach modelowych to koń pociągowy do odkrywania funkcjonalnie ważnych genów i ścieżek w wielu procesach biologicznych. W większości badań przesiewowych opartych na mutagenezie naukowcy polegali na użyciu toksycznych chemikaliów, czynników rakotwórczych lub napromieniowania, co wymaga specjalnego sprzętu, konfiguracji bezpieczeństwa i/lub utylizacji materiałów niebezpiecznych. Opracowaliśmy proste podejście do indukowania dziedzicznych mutacji u C. elegans przy użyciu histon-miniSOG wyrażonego w linii zarodkowej, indukowanego światłem silnego generatora reaktywnych form tlenu. Ta metoda mutagenezy jest wolna od toksycznych substancji chemicznych i wymaga minimalnego bezpieczeństwa laboratoryjnego i gospodarki odpadami. Indukowane modyfikacje DNA obejmują zmiany pojedynczego nukleotydu i małe delecje oraz uzupełniają te spowodowane klasyczną mutagenezą chemiczną. Metodologia ta może być również wykorzystana do indukowania integracji transgenów pozachromosomalnych. W tym miejscu podajemy szczegóły dotyczące konfiguracji diod LED i protokołów standardowej mutagenezy i integracji transgenów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetyczne badania przesiewowe są szeroko stosowane do generowania mutantów genetycznych zakłócających różne procesy biologiczne w organizmach modelowych, takich jak Caenorhabditis elegans (C. elegans)1. Analizy takich mutantów prowadzą do odkrycia funkcjonalnie ważnych genów i ich szlaków sygnałowych1,2. Tradycyjnie, mutagenezę u C. elegans osiąga się za pomocą mutagennych substancji chemicznych, promieniowania lub transpozonów2. Chemikalia, takie jak metanosulfonian etylu (EMS) i N-etylo-N-nitrozomocznik (ENU) są toksyczne dla ludzi; mutageneza promieniowania gamma lub ultrafioletowego (UV) wymaga specjalnego sprzętu; a szczepy aktywne transpozonami, takie jak szczepy mutatorowe3, mogą powodować niepotrzebne mutacje podczas konserwacji. Opracowaliśmy proste podejście do wywoływania dziedzicznych mutacji przy użyciu genetycznie kodowanego fotouczulacza4.

Reaktywne formy tlenu (ROS) mogą uszkodzić DNA5. Mini singletowy generator tlenu (miniSOG) to zielone białko fluorescencyjne składające się ze 106 aminokwasów, które zostało zaprojektowane z domeny LOV (światło, tlen i napięcie) fototropiny Arabidopsis 2 6. Po wystawieniu na działanie światła niebieskiego (~450 nm) miniSOG generuje ROS, w tym tlen singletowy z mononukleotydem flawinowym jako kofaktorem6-8, który jest obecny we wszystkich komórkach. Skonstruowaliśmy białko fuzyjne His-mSOG, znakując miniSOG do C-końca histonu-72, wariantu C. elegans histonu 3. Wygenerowano pojedynczą kopię transgenu9 do ekspresji His-mSOG w linii zarodkowej C. elegans. W normalnych warunkach hodowli w ciemności transgeniczne robaki His-mSOG mają normalną wielkość lęgu i długość życia4. Po wystawieniu na działanie niebieskiego światła LED robaki His-mSOG wytwarzają dziedziczne mutacje wśród swojego potomstwa4. Spektrum indukowanych mutacji obejmuje zmiany nukleotydowe, takie jak G:C do T:A i G:C do C:G, oraz małe delecje chromosomów4. Ta procedura mutagenezy jest prosta do wykonania i wymaga minimalnej konfiguracji bezpieczeństwa w laboratorium. W tym miejscu opisujemy konfigurację oświetlenia LED i procedury mutagenezy optogenetycznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa oświetlacza LED

UWAGA: Wymagany sprzęt LED jest podsumowany w Wykazie materiałów. Cała konfiguracja LED jest mała i można ją umieścić w dowolnym miejscu w laboratorium, chociaż zalecamy umieszczenie jej w ciemnym pomieszczeniu, aby kontrolować ekspozycję robaków na światło4.

  1. Podłącz diodę LED do sterownika za pomocą (Rysunek 1A, D).
  2. Podłącz sterownik do cyfrowego generatora/wzmacniacza funkcyjnego za pomocą BNC (Rysunek 1A, C, D).
  3. Zamocuj światło LED 10 cm nad stolikiem za pomocą niestandardowego uchwytu (Rysunek 1A).
    UWAGA: Wykonaliśmy uchwyt z metalowymi częściami.
  4. Częściowo zakryj konfigurację oświetlenia LED, ale unikaj akumulacji ciepła (Rysunek 1B), która powoduje choroby robaków.
    UWAGA: Używamy wykonanej na zamówienie pokrywy z twardego plastiku z otwartą górą i dołem (Rysunek 1A). Osłona nie jest wymagana do samej mutagenezy, ale służy do ograniczenia niepotrzebnej ekspozycji niebieskiego światła na otoczenie. Zalecamy, aby nie zakrywać całkowicie konfiguracji diod LED (Rysunek 1B), aby zapobiec przegrzaniu ślimaków.
  5. Nosić okulary chroniące przed laserem.
    UWAGA: Nosimy okulary chroniące przed laserem, ponieważ światło jest bardzo jasne. Równie dobrze mogą sprawdzić się okulary przeciwsłoneczne.
  6. Ustaw dźwignię sterownika LED w pozycji "Int." dla ciągłego oświetlenia (rysunek 1D) i ustaw ją na 65% mocy maksymalnej (rysunek 1C).
  7. Użyj fotometru, aby zmierzyć natężenie niebieskiego światła na scenie, na której umieszczane są robaki, korzystając z protokołu producenta. Konfiguracja zapewnia 2,0 mW/mm2 przy ciągłym oświetleniu.

2. Leczenie światłem niebieskim

UWAGA: Użyj szczepu CZ20310 juSi164[Pmex-5-HIS-72::miniSOG-3'UTR(tbb-2) + Cb-unc-119(+)] unc-119(ed3)III4. Szczep jest dostępny w Caenorhabditis Genetics Center (CGC, http://www.cgc.cbs.umn.edu/).

  1. Szczep His-mSOG należy utrzymywać w ciemności na standardowych płytkach z pożywką dla nicieni (NGM) z E. coli OP50 zgodnie ze standardowym protokołem10,11.
    UWAGA: W świetle otoczenia szczepy zawierające juSi164 nie wykazują szybkości mutacji powyżej spontanicznejszybkości 4. Rutynowe przechodzenie szczepu za pomocą lunety sekcyjnej z lampą halogenową na ogół również nie powoduje mutacji. Niemniej jednak należy zachować ostrożność, aby uniknąć niepotrzebnej ekspozycji na światło, np. trzymania szczepów w standardowym, ciemnym inkubatorze lub przykrywania szczepów folią. Zaleca się zamrożenie podwielokrotności szczepu po jego otrzymaniu na wypadek, gdyby z czasem nagromadziły się niepotrzebne mutacje.
  2. Zbierać młode dorosłe zwierzęta (około 12 godzin po L4) za pomocą kilofa do robaków11,
    UWAGA: Młodsze zwierzęta wykazują mniejsze działanie mutagenne4, podczas gdy starsze zwierzęta mogą mieć mniejszą liczebność lęgu.
  3. Wytnij bibułę filtracyjną tak, aby pasowała do płytki o średnicy 60 mm z kwadratowym otworem o wymiarach 25 mm x 25 mm i umieść na płytce bez nasion (Rysunek 1E).
    UWAGA: Można użyć stempla kwadratowego, ale rozmiar stempla nie musi być precyzyjny.
  4. Równomiernie upuść 100 μl 100 mM CuCl2 na bibułę filtracyjną, aby ograniczyć robaki w kwadratowym otworze na płytce.
  5. Wybierz żądaną liczbę grawitacyjnych hermafrodytów młodego dorosłego dorosłego człowieka (przykład znajduje się w kroku 3) i przenieś do środka płytki CuCl2.
  6. Nosić okulary ochronne do lasera.
  7. Włącz diodę LED i generator funkcyjny.
  8. Ustaw dźwignię sterownika LED w pozycji "Ext.", aby sterować nim za pomocą generatora funkcyjnego (Rysunek 1D).
  9. Ustaw regulator na 65% mocy maksymalnej, a generator funkcyjny jako sinusoidalną 4 Hz (rysunek 1C).
  10. Umieść płytkę CuCl2 z kroku 2.5 bez pokrywki na stoliku pod diodą LED (Rysunek 1A).
  11. Oświetl zwierzęta niebieskim światłem przez 30 minut.
  12. Przenieś zdrowo wyglądające robaki na talerz z nasionami jako P0,
    UWAGA: Żądana liczba P0 zależy od typu ekranu. Zobacz krok 3, aby zapoznać się z przykładem. Robaki P0 mogą wydawać się nieskoordynowane natychmiast po leczeniu światłem i z czasem się zregenerują.
  13. Trzymać robaki przykryte folią w inkubatorze lub w ciemności i postępować zgodnie ze standardową procedurą, aby rozpocząć badanie przesiewowe pożądanych fenotypów wśród ich potomstwa2,10.

3. Przykład genetycznego ekranu do przodu

UWAGA: Jest to przykład ekranu klonalnego ze 120 haploidalnymi genomami, aby sprawdzić, czy dioda LED i szczep działają. Rysunek 2 przedstawia schemat procedury.

  1. [Dzień 1] Po leczeniu światłem niebieskim wybierz pięć zdrowo wyglądających robaków na płytkę NGM z OP50 jako P0, trzymaj je w inkubatorze o temperaturze 20 °C i pozwól im składać jaja przez 1 dzień (tabliczka "Dzień 1").
  2. [Dzień 2] Przenieść warstwę P0 na nową płytkę z nasionami (płytka "Dzień 2").
  3. [Dzień 3] Wybierz i zabij P0 na płycie "Dzień 2", paląc go.
  4. [Dzień 4] Wybierz 30 ciężarnych młodych dorosłych F1 z talerza "Dzień 1" i przenieś je na pojedyncze płytki (30 szalek F1 dla "Dnia 1").
  5. [Dzień 5] Powtórz krok 3.4 dla płytki "Dzień 2" (30 płytek F1 dla "Dnia 2").
  6. [Dzień 7-9] Sprawdź nieprawidłową morfologię i/lub zachowanie robaków F2 w porównaniu ze szczepem WT (Figura 3A) pod standardowym mikroskopem stereoskopowym, gdy osiągną dorosłość.
    UWAGA: Mutacja dziedziczna wykazuje około jednej czwartej robaków o tym samym fenotypie wśródF2, gdy jest recesywna z wysoką penetracją. Jednak niektóre mutanty mogą rosnąć powoli i/lub wykazywać częściową penetrację. Dlatego możliwe jest, że mniej niż jedna czwarta mutantów może znaleźć się na talerzu.
  7. Zbieraj indywidualnie robaki z widocznymi fenotypami i sprawdzaj odziedziczalność fenotypu w następnym pokoleniu.

4. Przykład pozachromosomalnej integracji transgenu

  1. Wstrzyknąć interesujące nas DNA do CZ20310 juSi164[Pmex-5-HIS-72::miniSOG-3'UTR(tbb-2) + Cb-unc-119(+)] unc-119(ed3) i przygotować transgeniczne robaki o niskiej szybkości transmisji (10-30%) zgodnie ze standardowym protokołem iniekcji12,13.
    UWAGA: Alternatywnie, ustalone macierze pozachromosomalne można krzyżować ze szczepami juSi164. Aby uniknąć genotypowania dla juSi164, heterozygoty juSi164 mogą być używane jako P0, chociaż wydajność może być zmniejszona. Metoda genotypowania juSi164 jest opisana w sekcji 5.
  2. [Dzień 1] Potraktuj ~20 transgenicznych zwierząt jako P0 niebieskim światłem, jak opisano w kroku 2.
    UWAGA: W zależności od szybkości transmisji konieczne jest więcej robaków P0. Transgeny można zidentyfikować na podstawie fenotypów lub markera koiniekcyjnego12,13.
  3. Na poszczególne szalki należy pobrać 10 zdrowo wyglądających bakterii P0, umieścić je w inkubatorze w temperaturze 20 °C i pozwolić im złożyć jaja przez kilka dni (płytki P0)
  4. [Dzień 4] Wyodrębnij 20 transgenicznych robaków F1 z każdej płytki P0 na indywidualne płytki i pozwól im złożyć jaja. (20 płyt F1 x 10 P0 = łącznie 200 płyt F1).
  5. [Dzień 7] Znajdź płytki F1 z >75% F2 zawierającymi transgeny.
  6. Wybierz pięć zwierząt transgenicznych z płytek F1 o współczynniku transmisji >75% (płytki F2).
  7. [Dzień 10] Zachowaj płyty F2 ze 100% szybkością transmisji jako potencjalne zintegrowane linie.
  8. Krzyżuj potencjalne zintegrowane linie za pomocą standardowej procedury10 w celu sprawdzenia segregacji mendlowskiej i usunięcia potencjalnych mutacji tła.

5. Genotypowanie

  1. Lyse 20 przesłonił robaki F2 w buforze do lizy przy użyciu standardowego protokołu14.
  2. Przeprowadzić PCR przy użyciu starterów do insercji MosSCI9, juSi164, (Tabela 1) w temperaturze wyżarzania 58 °C zgodnie ze standardowym protokołem14.
    UWAGA: Nie ma potrzeby genotypowania unc-119(ed3), ponieważ unc-119(ed3) może zostać wykryty przez nieskoordynowane zachowanie po usunięciu ratującego transgenu (juSi164) w następujących krokach 5.4 i 5.5.
  3. Uruchom elektroforezę w żelu agarozowym15 i sprawdź rozmiary prążków (Tabela 1), aby znaleźć WT dla juSi164.
  4. Sprawdź, czy potomstwo F2 ma sparaliżowane robaki z powodu istnienia unc-119(ed3).
  5. Jeśli w kroku 5.4 zostaną znalezione nieskoordynowane robaki, należy posegregować kilka nieskoordynowanych robaków, aby uzyskać wszystkie nieskoordynowane robaki w następnym pokoleniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadziliśmy przesiewowe badanie genetyczne z CZ20310 juSi164 unc-119(ed3) przy użyciu 30-minutowej ekspozycji na światło zgodnie ze standardowym protokołem opisanym w sekcjach 2 i 3. Wśród 60 płytek F1 odpowiadających 120 mutagenizowanym genomom haploidalnym znaleźliśmy 8 płytek F1 z robakami F2 wykazującymi widoczne fenotypy, takie jak wada wielkości ciała (ryc. 3B), nieskoordynowany ruch (ryc. 3C) i śmiert...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu opisujemy szczegółową procedurę mutagenezy optogenetycznej z wykorzystaniem His-mSOG wyrażanego w linii zarodkowej i podajemy przykład genetycznego badania przesiewowego na małą skalę. W porównaniu ze standardową mutagenezą chemiczną ta metoda mutagenezy optogenetycznej ma kilka zalet. Po pierwsze, jest nietoksyczny, dzięki czemu personel laboratoryjny trzyma się z dala od toksycznych mutagenów chemicznych, takich jak EMS, ENU i trimetylopsoralen ze światłem ultrafioletowym (TMP / UV). Po drugie, eksperymen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca jest wspierana przez HHMI. Dziękujemy członkom naszego laboratorium za pomoc w testowaniu protokołu i poprawianiu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Źródło światła LED o ultra dużej mocyPrizmatixUHP-mic-LED-460460 ± 5 nm
Kontroler LEDPrizmatixUHPLCC-01
Cyfrowy generator/wzmacniacz funkcyjnyPASCOPI-9587CPI-9587C nie jest już dostępny. Zamiennikiem jest PI-8127.
BNC męski/męskiTHORLABSCA3136
Interfejs USB-TTLPrizmatixOpcjonalny
fotometrTHORLABSPM50 i model D10MM
Bibuła filtracyjnaWhatman1001-110
Mikroskop
NGMRozpuścić 5 g NaCl, 2,5 g peptonu, 20 g agaru, 10 i mikro; g/ml cholesterolu w 1 l H2O. Po autoklawowaniu dodać 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH 6,0). 
do lizy10 mM Tris(pH 8,8), 50 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 2,5 mM MgCl2, 100 &mikro; g/ml Proteinaza K
stereoskopowy Leica MZ95 Roztwór

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jorgensen, E. M., Mango, S. E. The art and design of genetic screens: caenorhabditis elegans. Nat Rev Genet. 3 (5), 356-369 (2002).
  2. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  3. Collins, J., Saari, B., Anderson, P. Activation of a transposable element in the germ line but not the soma of Caenorhabditis elegans. Nature. 328 (6132), 726-728 (1987).
  4. Noma, K., Jin, Y. Optogenetic mutagenesis in Caenorhabditis elegans. Nat Commun. 6, 8868(2015).
  5. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  6. Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms. PLoS Biol. 9 (4), 1001041(2011).
  7. Ruiz-Gonzalez, R., et al. Singlet oxygen generation by the genetically encoded tag miniSOG. J Am Chem Soc. 135 (26), 9564-9567 (2013).
  8. Pimenta, F. M., Jensen, R. L., Breitenbach, T., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Oxygen-dependent photochemistry and photophysics of "miniSOG," a protein-encased flavin. Photochem Photobiol. 89 (5), 1116-1126 (2013).
  9. Frokjaer-Jensen, C., et al. Random and targeted transgene insertion in Caenorhabditis elegans using a modified Mos1 transposon. Nat Methods. 11 (5), 529-534 (2014).
  10. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), (2011).
  12. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), (2008).
  13. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  14. Fay, D., Bender, A. Genetic mapping and manipulation: chapter 4--SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , 1-7 (2006).
  15. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  16. Westberg, M., Holmegaard, L., Pimenta, F. M., Etzerodt, M., Ogilby, P. R. Rational design of an efficient, genetically encodable, protein-encased singlet oxygen photosensitizer. J Am Chem Soc. 137 (4), 1632-1642 (2015).
  17. Xu, S., Chisholm, A. D. Highly efficient optogenetic cell ablation in C. elegans using membrane-targeted miniSOG. Sci Rep. 6, 21271(2016).
  18. Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. J Vis Exp. (82), (2013).
  19. Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
  20. Minevich, G., Park, D. S., Blankenberg, D., Poole, R. J., Hobert, O. CloudMap: A Cloud-Based Pipeline for Analysis of Mutant Genome Sequences. Genetics. 192 (>4), 1249-1269 (2012).
  21. Qi, Y., Xu, S. MiniSOG-mediated Photoablation in Caenorhabdtis elegans. Bio-protocol. 3 (1), http://www.bio-protocol.org/e316 316(2013).
  22. Qi, Y. B., Garren, E. J., Shu, X., Tsien, R. Y., Jin, Y. Photo-inducible cell ablation in Caenorhabditis elegans using the genetically encoded singlet oxygen generating protein miniSOG. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (19), 7499-7504 (2012).
  23. Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mutogeneza optogenetycznauk ad LEDforward genetic screengenerowanie ROSchlorek miedziekspresja w linii zarodkowejintegracja transgenuna wietlanie

Powiązane artykuły