Artykuł metodologiczny

Budowa modeli elementów skończonych w celu zbadania biomechaniki szczęk danio pręgowanego

11.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54811

⸱

3 grudnia 2016

 ,  ,  , 
1Physiology, Pharmacology and Neuroscience, University of Bristol, 2Earth Sciences, University of Bristol

W tym artykule

Podsumowanie

Analiza metodą elementów skończonych jest często używanym narzędziem do badania właściwości mechanicznych konstrukcji pod obciążeniem. Tutaj zastosujemy jego zastosowanie do modelowania biomechaniki szczęki danio pręgowanego.

Streszczenie

Morfogeneza szkieletu zachodzi poprzez ściśle regulowane zachowania komórek podczas rozwoju; wiele typów komórek zmienia swoje zachowanie w odpowiedzi na obciążenie mechaniczne. Stawy szkieletowe poddawane są dynamicznym obciążeniom mechanicznym. Analiza metodą elementów skończonych (MES) to metoda obliczeniowa, często stosowana w inżynierii, która może przewidzieć, jak materiał lub konstrukcja zareaguje na dane mechaniczne. Dzieląc cały system (w tym przypadku szkielet szczęki danio pręgowanego) na siatkę mniejszych "elementów skończonych", MES można wykorzystać do obliczenia mechanicznej reakcji konstrukcji na obciążenia zewnętrzne. Wyniki można wizualizować na wiele sposobów, w tym jako "mapę cieplną" pokazującą położenie maksymalnych i minimalnych odkształceń głównych (dodatnie odkształcenie główne wskazuje na rozciąganie, a ujemne oznacza ściskanie. Maksimum i minimum odnoszą się do największego i najmniejszego szczepu). Można je wykorzystać do określenia, które obszary szczęki, a tym samym które komórki mogą być narażone na szczególnie wysokie obciążenia rozciągające lub ściskające podczas ruchu szczęki, a zatem mogą być wykorzystywane do identyfikacji zależności między naprężeniami mechanicznymi a zachowaniem komórek. Protokół ten opisuje etapy generowania modeli elementów skończonych na podstawie danych obrazu konfokalnego układu mięśniowo-szkieletowego, używając dolnej szczęki danio pręgowanego jako praktycznego przykładu. Protokół prowadzi czytelnika przez szereg kroków: 1) barwienie elementów układu mięśniowo-szkieletowego, 2) obrazowanie komponentów układu mięśniowo-szkieletowego, 3) budowanie trójwymiarowej (3D) powierzchni, 4) generowanie siatki elementów skończonych, 5) rozwiązywanie MES i wreszcie 6) walidacja wyników przez porównanie z rzeczywistymi przemieszczeniami obserwowanymi w ruchach szczęki ryby.

Wprowadzenie

Modelowanie metodą elementów skończonych (FE) to technika inżynierska, która może obliczeniowo obliczać i mapować wielkość i położenie odkształceń działających na konstrukcję 1. Model składa się ze struktury 3D, reprezentowanej przez siatkę "elementów skończonych", a końcowy wynik analizy zależy od wielu czynników, w tym struktury i liczby elementów w siatce, wielkości i położenia obciążeń mechanicznych oraz właściwości materiału. Właściwości materiału opisują pewne aspekty zachowania materiału pod danym typem obciążenia; Moduł Younga (E) opisuje elastyczność materiału, podczas gdy współczynnik Poissona opisuje proporcjonalny spadek szerokości materiału do jego długości, gdy próbka jest rozciągana. Modelowanie ES można wykorzystać do obliczenia różnych zmiennych, w tym przemieszczenia, naprężeń, nacisków i odkształceń działających na model, biorąc pod uwagę unikalne dane wejściowe dotyczące kształtu konstrukcji, położenia i wielkości obciążeń oraz określonych właściwości materiału.

Modelowanie FE jest szeroko stosowane w inżynierii 2 i coraz częściej w zastosowaniach ortopedycznych 3 i paleontologicznych4. Wiadomo, że w rozwoju siły biomechaniczne działają jako bodziec w wielu komórkach do aktywacji odpowiedzi komórkowych 5-8 i jest przydatne do przewidywania zarówno względnych pozycji, jak i wielkości bodźców mechanicznych w rozwijających się układach narządów, jednak obecnie modelowanie FE jest rzadko stosowane do rozwoju danio pręgowanego.

Zarówno chrząstka, jak i kość okazały się materiałami wrażliwymi na mechano. Na przykład stwierdzono, że kompresja in vitro aktywuje szlaki chondrogenne, podczas gdy napięcie jest niezbędne do tworzenia kości 9. Analiza MES (MES) została wykorzystana do modelowania szczepów działających na próbki biologiczne, w tym tych działających na elementy szkieletu podczas tworzenia kości 10. Inne zastosowania rozwojowe obejmują jego zastosowanie do przewidywania kształtu stawu po wystawieniu go na działanie teoretycznych sił biomechanicznych 11,12 oraz do pokazania wzorca szczepów obecnych podczas morfogenezy stawu kolanowego pisklęcia 8.

Ten protokół ma na celu dzielenie się doświadczeniem w generowaniu trójwymiarowych powierzchni, siatek i modeli elementów skończonych z obrazów konfokalnych w celu zrozumienia mechaniki rozwijających się tkanek. Pokazujemy również sposoby walidacji modeli ES poprzez przechwytywanie rzeczywistych informacji o przemieszczeniu stawów in vivo. Podczas gdy używamy szczęki danio pręgowanego jako przykładu, te same techniki można zastosować na każdym małym systemie biologicznym, dla którego informacje 3D na temat struktury układu mięśniowo-szkieletowego można uzyskać za pomocą obrazowania konfokalnego lub wielofotonowego.

Protokół

Wszystkie kroki w ramach protokołu są zgodne z wytycznymi Uniwersytetu w Bristolu dotyczącymi opieki i dobrostanu zwierząt oraz wytycznymi brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych.

1. Wizualizacja anatomii układu mięśniowo-szkieletowego

UWAGA: Aby zobrazować kształt elementów szkieletu, określić ilościowo mięśnie i określić dokładne rozmieszczenie przyczepów mięśniowych, immunostain (sekcja 1.1) łowi w odpowiednim wieku dla miozyny szkieletowej (która ujawnia mięśnie) i kolagenu typu II (do wizualizacji chrząstki). Alternatywnie, wizualizuj anatomię układu mięśniowo-szkieletowego za pomocą transgenicznych fluorescencyjnych linii reporterowych, takich jak kolagen a1 reporter col2a1: mCherry 13,14 do wizualizacji chrząstki i powolny reporter ciężkiego łańcucha miozyny smyhc: GFP 15 do wizualizacji położenia przyczepów mięśniowych (sekcja 1.2).

Alternatywne linie oznaczające chrząstkę i mięśnie mogłyby działać równie dobrze.

  1. Fluorescencyjne barwienie immunologiczne
    1. Utrwalić larwy w nadmiarze 4% paraformaldehydu (PFA) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 1 godzinę. Przemyć w PBS z 0,1% Tween 20 (PBT) i odwodnić w 50% metanolu (MeOH) odpowiednio w PBT i 100% MeOH przez 5 minut.
      Uwaga: PFA jest toksyczny i należy obchodzić się z nim zgodnie z kartą charakterystyki materiału.
      UWAGA: Larwy można przechowywać w 100% MeOH, dopóki nie będą potrzebne.
    2. Uwodnić larwy w 50% MeOH w PBT przez 5 min. Myć w PBT przez 5 min.
    3. Przepuszczać larwy w 0,25% trypsyny w PBT na lodzie przez 5-6 min. Myć w 4x PBT po 5 min każde.
    4. Blokuj przez 2-3 godziny w 5% surowicy w PBT.
    5. Inkubować larwy w zalecanym rozcieńczeniu króliczego kolagenu anty-type 2 i mysich przeciwciał anty-miozyny w 5% surowicy w PBT przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Zalecany zakres rozcieńczeń znajduje się zwykle w karcie charakterystyki przeciwciał. Wybierz przeciwciała, które są hodowane przeciwko różnym gatunkom względem siebie nawzajem i które są również różne dla tkanki.
    6. Myj larwy 6x przez 15 minut w PBT.
    7. Blokuj przez 1-2 godziny w 5% surowicy w PBT.
    8. Inkubować w przeciwciałach drugorzędowych w ciemności. Użyć znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych przeciwko myszom (550) i królikom (488) w odpowiednim rozcieńczeniu w 5% surowicy i PBT dla specyficznego przeciwciała.
    9. Myj 6X przez 10 minut każdy w PBT i zobrazuj pod mikroskopem konfokalnym 10X tak szybko, jak to możliwe.
  2. Obrazowanie geometrii układu mięśniowo-szkieletowego
    1. Zamontuj larwy brzusznie na szkiełku nakrywkowym w letniej 0,3-0,5% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (LMP) w roztworze Danieau 16,
      UWAGA: Ryby transgeniczne będą musiały zostać uspokojone 0,02% MS222 (metanosulfonian trikainy, pH 7) przed zamontowaniem i podczas obrazowania.
    2. Wykonaj konfokalne zdjęcie obszaru zainteresowania za pomocą 10-krotnego obiektywu i około 2,5-krotnego zoomu cyfrowego. Przygotuj obrazy kanału zielonego i czerwonego za pomocą laserów 488 nm i 561 nm. Obraz w rozdzielczości 512 x 512 pikseli z odstępem między płaszczyznami z wynoszącym 1,3 μm i średnimi z 3 linii. Powstały stos będzie składał się z około 100 plasterków z.
    3. Wyeksportuj dane jako serię TIFF. Maksymalne wystające elementy mięśniowe i chrzęstne z larwy danio pręgowanego o wartości 5 dpf przedstawiono na rysunku 1.

2. Generowanie powierzchni 3D

  1. Wybierz reprezentatywny zestaw danych dla każdego punktu czasowego przy 3, 4 i 5 dpf (wybierz po wizualizacji wielu próbek).
  2. Otwórz 3-wymiarowy stos TIFF i wybierz wszystkie kanały w oprogramowaniu do analizy. Kliknij prawym przyciskiem myszy kanał chrząstki i wybierz filtr obrazu i wygładzanie:Gaussowski (Rysunek 2B).
  3. W widoku projektu kliknij prawym przyciskiem myszy na przefiltrowany obraz i wybierz "segmentacja obrazu", a następnie "edytuj nową etykietę". Utwórz nową etykietę dla każdego materiału, tj. chrząstki i stawu. Wybierz obszar chrząstki na obrazie (rysunek 2C, biały sygnał, fioletowy kontur) za pomocą narzędzia magicznej różdżki. Użyj narzędzia Pędzel, aby usunąć szum z konturów.
    UWAGA: Jeśli używasz narzędzia magicznej różdżki, kliknij "Wszystkie plasterki".
  4. Wybierz obszar połączenia za pomocą narzędzia pędzla i przypisz go do komponentu połączenia (Rysunek 2C, niebieski kontur)
  5. Wygładź wiele plasterków jednocześnie, wybierając segmentację w górnym menu i wygładź etykiety. Kliknij obraz prawym przyciskiem myszy i wybierz opcję generuj powierzchnię, aby utworzyć render powierzchni 3D komponentu (Rysunek 2D).
  6. Kliknij powierzchnię i zapisz dane jako plik hmascii w celu zaimportowania do oprogramowania do tworzenia siatek.

3. Obliczanie sił mięśniowych, które mają być użyte w modelu ES

  1. Policz liczbę włókien mięśniowych z obrazów konfokalnych transgenicznego danio pręgowanego smyhc:GFP (ryc. 1A, grot strzały, 1C) i zmierz średnicę włókien, aby obliczyć ich pole przekroju poprzecznego (πr2).
  2. Zidentyfikuj odpowiednią siłę na obszar jednostki mięśniowej z literatury. Wykorzystano maksymalną siłę mięśni generowaną na jednostkę powierzchni dla mięśni szkieletowych larw danio pręgowanego (40 nN/μm2) 17.
  3. Oblicz siły dla każdej anatomicznej grupy mięśni, mnożąc liczbę włókien i ich powierzchnię przez siłę na jednostkę powierzchni. Patrz tabela 1.

4. Generowanie siatki

  1. Zaimportuj model 3D wygenerowany w sekcji 2 (powyżej) do pakietu oprogramowania zdolnego do wygenerowania siatki elementów skończonych.
  2. Wygeneruj siatkę 2D powierzchni chrząstki i stawów za pomocą narzędzia do owijania folią termokurczliwą w menu 2D. Wybierz odpowiedni rozmiar elementu.
    Uwaga: Użyj elementu o rozmiarze od 1,5 do 2,5. W razie potrzeby wygeneruj szereg siatek powierzchniowych 2D o różnych rozmiarach, aby przeprowadzić optymalizację siatki 3D (sekcja 4.4).
  3. Przeprowadź kontrolę jakości siatki znajdującą się w panelu "2D>Narzędzia>Sprawdź elementy", aby sprawdzić, czy w siatce nie ma zduplikowanych elementów, wstawek i przebić. Ustal kąty dwuścienne za pomocą karty narzędzia w drzewie modelu.
  4. Wygeneruj siatkę 3D z siatek powierzchniowych 2D o różnych rozmiarach elementów za pomocą podpanelu 3D>Tetramesh.
    UWAGA: Porównaj wyniki dla różnych rozmiarów siatki i wybierz model ES o najniższym rozmiarze siatki, który zbiega się po dalszych symulacjach i nie wpływa negatywnie na definicję elementu. >Przykład na rysunku 3 zawiera 1,5 miliona czworościennych elementów dla chrząstek dolnej szczęki i miał rozmiar elementu 2D 2,0.
  5. Przekształć siatkę tak, aby model szczęki był skalowany zgodnie ze stosem konfokalnym, korzystając z podpanelu Geometria>Odległość.
    UWAGA: Upewnij się, że komponenty chrząstki i stawu są połączone w modelu, eksportując scalony model lub używając ściągów.

5. Budowa modelu metodą elementów skończonych

  1. Korzystając z komercyjnego oprogramowania do tworzenia elementów skończonych (ES), utwórz model ES. Korzystając z 3D stosów konfokalnych oznaczonych mięśniami i chrząstkami wygenerowanych w sekcji 1 jako przewodnika, przypisz węzły odpowiadające punktom przyczepu mięśni. Utwórz wektor między dwoma węzłami reprezentującymi początek i przyczep każdego mięśnia (ryc. 3).
  2. Utwórz kolektor obciążenia typu "historia", aby zastosować "obciążenie C" dla każdego mięśnia. Określ wielkość w niutonach (obliczoną w kroku 3.3) i przypisz skojarzony wektor. Rysunek 3 przedstawia punkty mocowania żuchwy przywodziciela (AM), kątomierza hyoideus (PH) i intermandibularis (IM).
    UWAGA: W przypadku tych mięśni szczęki maksymalna siła skurczu jest rozkładana między początkiem a przyczepieniem, tak że tylko 50% każdego obciążenia jest przykładane w każdym miejscu.
  3. Przypisać odpowiednie sprężyste właściwości materiału izotropowego zgodnie z opisem w literaturze. Moduł Younga dla chrząstki i międzystrefy w tym modelu wynosił odpowiednio 1,1 MPa i 0,25 MPa, a współczynnik Poissona wynosił 0,25 dla obu 18,19.
  4. Utwórz moduł zbierający obciążenia typu "granica", aby zastosować początkowe ograniczenia do modelu. Przejdź do zakładki Analiza>Wiązania i w podpanelu tworzenia wybierz węzły w modelu, które chcesz związać. Wybierz stopnie swobody (DOF), które ograniczają ruch modelu, do najlepszego przybliżenia jego naturalnego zakresu ruchu.
    UWAGA: Model na rysunku 3 został ograniczony we wszystkich osiach ruchu (DOF: 1, 2, 3 reprezentują odpowiednio x, y i z) na części ceratohyal, aby zakotwiczyć go w przestrzeni w punkcie środkowym modelu oraz na osi y i z w punkcie, w którym podniebienie łączy się z resztą czaszki danio pręgowanego (rysunek 3, Tabela 1). Model musi być ograniczony we wszystkich trzech stopniach swobody w co najmniej jednym węźle.
  5. Utwórz "Krok obciążenia" dla każdego rodzaju ruchu, który chcesz symulować (tj. otwieranie, zamykanie), w menu analizy i wybierz wszystkie odpowiednie obciążenia (wykonane w sekcji 5.2) i ograniczenia (wykonane w sekcji 5.4), aby zasymulować ten ruch. Wybierz "Statyczny" z menu rozwijanego, gdy się pojawi.
  6. Eksportuj model wraz z siatką, obciążeniami, wiązaniami i właściwościami materiału w odpowiednim formacie pliku, w tym przypadku w formacie ".inp".
  7. Załaduj model do oprogramowania do analizy ES. Utwórz i wykonaj zadanie dla modelu przy użyciu modułu Zadanie.
  8. Analizuj dane wyjściowe pod kątem naprężeń, odkształceń, przemieszczeń itp., które można znaleźć na karcie wyników i w menu wizualizacji (Rysunek 4 i 5).

6. Walidacja odległości deformacji szczęk/przemieszczenia

  1. Wybierz transgenicznego danio pręgowanego o wartości 3-6 Tg(Col2a1aBAC:mcherry).
  2. Lekko znieczulić larwy 0,02% MS222, aż przestaną reagować na dotyk, ale ich serca nadal biją.
  3. Zamontuj larwy bocznie (w znieczuleniu) na szkiełkach nakrywkowych w letniej 1% agarozie LMP (uzupełnionej w roztworze Danieau).
  4. Usuń agarozę z okolic głowy i szczęki kleszczami.
  5. Przepłukać świeży roztwór Danieau (bez MS222) nad głową larwy w celu usunięcia znieczulenia za pomocą pipety Pasteura, aż do wznowienia normalnych ruchów ust.
  6. Użyj oprogramowania do przechwytywania filmów, aby nagrywać szybkie filmy w jasnym polu ruchów ust. Nagrywaj filmy trwające około minuty z najwyższą liczbą klatek na sekundę lub wystarczającą do nagrania wielu cykli otwierania szczęki.
  7. Wybierz ramki, które pokazują szczękę otwartą do maksymalnego przemieszczenia. Zmierz odległość między przednim końcem chrząstki Meckla a górną szczęką (końcówką płytki sitowej) w μm.
  8. Oblicz średnie przemieszczenie z wielu larw ryb.
  9. Wyodrębnij dane przemieszczenia z modelu. Użyj średniego przemieszczenia obliczonego w 6.8, aby zweryfikować zachowanie przemieszczenia modelu (Rysunek 4). Jeśli model odbiega od oczekiwań, przeprowadź analizę wrażliwości, sekwencyjnie zmieniając właściwości materiału i obciążenia mięśni.

Wyniki

Immunobarwienie mięśni (Rysunek 1A) i chrząstkę (Rycina 1B) lub obrazowanie reporterów transgenicznych (Rycina 1C) pozwala na wizualizację struktury trójwymiarowej żuchwy wraz z powiązaną z nią muskulaturą. Dzięki obrazowaniu o wysokiej rozdzielczości możliwe było stworzenie modelu, który oddaje trójwymiarowy kształt żuchwy (Rycina 2) oraz lokalizację i rozmieszczenie obciążeń (Rysunek 3). Wykorzystując in vivo przemieszczenia zarejestrowane za pomocą szybkotoku wideo (Rysunek 4) zweryfikowaliśmy, czy zakres ruchu w modelu mieścił się w granicach realistycznych.

Uruchomione modele FE mogą służyć do wyświetlania szeregu danych, takich jak naprężenia (Rysunek 5A), minimalne i maksymalne odkształcenie główne (Rysunek 5B-K). Wyniki te są trójwymiarowe, zatem model można powiększyć, aby zobaczyć szczegółowe wzorce (Rysunek 5E, 5I), obracać w celu uzyskania odpowiednich widoków (Rysunek 5F, 5G, 5J, 5K) oraz poddawać cyfrowemu przekrojeniu (Rysunek 5E', 5E'', 5I', 5I''), aby pokazać, jak wzorce naprężeń, odkształceń lub ciśnienia zmieniają się w całym modelu. Możliwe jest również wyodrębnienie z modelu danych ilościowych (nie pokazano). Poprzez weryfikację modelu i zastosowanie najdokładniejszych właściwości materiałowych, obciążeń oraz kształtu siatki, model FE może zostać wykorzystany do określenia najlepszego szacunku środowiska mechanicznego, w jakim znajdują się komórki podczas tego etapu rozwoju. Wyniki modelu można bezpośrednio porównać ze zmianami w zachowaniu komórek i ekspresji genów 20.

Mikroskopia fluorescencyjna struktury mięśni owada; zielone filamenty aktynowe i czerwony egzoszkielet.
Rysunek 1: Reprezentatywne obrazy elementów mięśniowo-szkieletowych żuchwy dolnej danio pręgowanego w 5 dpf. Reprezentatywne stosy konfokalne żuchwy dolnej larw w 5 dpf, we wszystkich pokazane z częścią przednią u góry (A) Immunobarwienie przeciwciałem A4.1025, które barwi całą miozynę szkieletową (B) Immunobarwienie kolagenu typu II, który znakuje całą chrząstkę (C) Stos z żywej larwy wykazującej transgeniczne reportery col2a1:mCherry znakujące chrząstkę (czerwony) oraz smyhc:GFP znakujące mięśnie wolne (zielony). IA: intermandibularis anterior, PH: protractor hyoideus, AM: adductor mandibulae, HI: hyoideus inferior, HI: hyoideus superior, CH: sternohyoideus, MC: chrząstka Meckla, PQ: palatoquadrate, CH: ceratohyal. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces obrazowania kości; filtrowana mikroskopia i rekonstrukcja 3D; analiza stawu i chrząstki.
Rycina 2: Generowanie powierzchni 3D z danych konfokalnych. Obrazy przedstawiające przejście z danych konfokalnych do powierzchni 3D dla dolnej szczęki danio pręgowanego z większym powiększeniem obszaru stawu. (A) Surowe dane konfokalne; (B) Zbiór danych po zastosowaniu filtru Gaussa; (C) Filtrowany obrys; (D) Powierzchnia 3D. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat mechaniki pyska; siły statyczne; wektory, szczęki ryby w 5 dpf, siły otwierania/zamykania pyska.
Rycina 3: Reprezentatywne siatki przedstawiające więzy i wektory sił. Reprezentatywne siatki dla larwy w 5 dpf dla (A) zamykania pyska oraz (B) otwierania pyska. Białe kropki oznaczają miejsca, w których model jest ograniczony oraz w których wymiarach (np. x i y lub x, y i z). Białe linie oznaczają położenie mięśni, a wektor siły mięśniowej jest zaznaczony białymi strzałkami. Kolor czerwony oznacza chrząstkę, a żółty strefę międzychrząstkową. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie materiałów uzupełniających opublikowanych wcześniej w pracy Brunt et al. 15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wizualizacja przepływu, zmienne c=1,1-6,1, i=0,25-1,0, wykres głębokości z kodowaniem kolorystycznym dla stanów otwartego/zamkniętego.
Rycina 4: Badanie wrażliwości. Model FE symulujący przemieszczenie żuchwy u larw zebrafish w 5. dniu po zapłodnieniu (5dpf) dla różnych modułów Younga chrząstki i strefy przejściowej. Przemieszczenie żuchwy (od otwartej do zamkniętej w µm) jest zaznaczone na żuchwie; zapisano przy użyciu klucza kolorów. Każdy model (A-L) posiada inną kombinację właściwości chrząstki (c = 1,1, 3,1 lub 6,1 MPa) lub strefy przejściowej (i = 0,25, 0,5, 0,75 lub 1 MPa). Pozioma czarna strzałka zaznacza wartość przemieszczenia żuchwy na końcówce chrząstki Meckla (reprezentowanej przez pionową czarną strzałkę). M i N kadry z filmów przedstawiające larwy w 5. dniu po zapłodnieniu (dpf) wykazujące minimumtj. żuchwa zamknięta (M) oraz maksymalnym, t. j. pełny otwarcie żuchwy (N) z dwoma nałożonymi (O) - biała linia na O reprezentuje przemieszczenie (od 43 µm). W tym przypadku względne właściwości chrząstki wynoszące 1,1 przy strefie przejściowej równej 0,25 (A) najlepiej odpowiadają przemieszczeniom obserwowanym u żywych ryb (O). Panele A-L tej ryciny zostały wcześniej opublikowane w Brunt i wsp. 15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.

Analiza odkształceń biomechanicznych, kolorowe schematy modelu elementów skończonych ilustrujące rozkład naprężeń.
Rysunek 5: Reprezentatywne dane z modeli FE. Symulacja modelu FE dla wszystkich mięśni zastosowanych u larwy w 5 dpf (A-C). (A) Naprężenia według von Misesa (EMaxmin), (B) minimalne odkształcenie główne (E Min. P, µɛ), (C) maksymalne odkształcenie główne (E Max. P., µɛ). Symulacja modelu FE maksymalnych i minimalnych odkształceń głównych podczas otwierania szczęki. (D-K): Maksymalne odkształcenie główne (E Max. P., µɛ) w (D) widoku brzuszny szczęki oraz (E) widoku brzuszny stawu; (E) pokazuje położenie przekrojów proksymalno-dystalnych przez staw chrząstki Meckla i strefę przejściową odpowiednio w (E') i (E''). (F): boczny widok szczęki. (G): boczny widok stawu. (H-K): Minimalne odkształcenie główne (E Min. P, µɛ) w (H) widoku brzuszny szczęki oraz (I) widoku brzuszny stawu. (I) pokazuje położenie przekrojów proksymalno-dystalnych przez staw chrząstki Meckla i strefę przejściową odpowiednio w (I') i (I''), (J): boczny widok szczęki. (K): boczny widok stawu. Rysunek ten został wcześniej opublikowany w pracy Brunt et al. 15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Liczba włókien mięśniowychPole powierzchni włókna mięśniowego (µm2)Powierzchnia grupy mięśniowej (µm2)Siła (N)
5 dpf intermandibularis anterior523.81194,76e-6
mięsień protractor hyoideus w 5. dniu po zapłodnieniu (dpf)623.8142.85,71e-6
mięsień przywodziciel żuchwy w 5. dniu po zapłodnieniu (dpf)923.8214.28,57e-6

Tabela 1: Ilościowe określenie siły mięśni. Obliczone średnie siły mięśni Intermandibularis Anterior, Adductor Mandibulae i Protractor Hyoideus w 5 dpf przy użyciu 40 nN/µm2 (wartość na jednostkę powierzchni zaczerpnięta z referencji 17). (Lorga et al., 2011) (n = 3).

Dyskusja

Modele elementów skończonych wykorzystano do powiązania obszarów elementów szkieletowych, które są poddawane obciążeniu, z tymi, które podlegają tworzeniu kości 10, a także do mapowania obszarów poddanych obciążeniu podczas kostnienia chrzęstnego i morfogenezy stawów 8,12,21. W innych badaniach udało się również zastosować teoretyczne modele wzrostu do replikacji zmian podczas wspólnego rozwoju 11,12. Tutaj pokazujemy protokół budowy modeli FE dla stosunkowo prostego systemu, jakim jest szczęka danio pręgowanego 20. W przeciwieństwie do alternatywnych metod zbierania surowych obrazów do modeli FE, takich jak tomografia komputerowa 22, obrazowanie konfokalne linii transgenicznych lub genesa barwionego immunologicznie pozwala na badanie wielu tkanek. Może zatem dostarczyć bezpośrednich informacji na temat punktów przyczepu mięśni w odniesieniu do chrząstki. Wśród modeli kręgowców danio pręgowany jest szczególnie podatny na manipulacje genetyczne i farmakologiczne. Wygenerowanie modeli FE dla chrząstki twarzoczaszki danio pręgowanego otwiera obecnie możliwość dalszych badań nad wzajemnymi oddziaływaniami między biomechaniką a genetyką w morfogenezie stawów.

Proces tworzenia modelu ES składa się z kilku kluczowych etapów; Pierwszym z nich jest wygenerowanie dokładnego trójwymiarowego odwzorowania systemu. Wymaga to obrazowania w wystarczająco wysokiej rozdzielczości, aby wyraźnie określić granice. Należy pamiętać, że nawet przy obrazowaniu w wysokiej rozdzielczości, aby uzyskać dobrą powierzchnię, może być konieczne wygładzenie niektórych obszarów. Kolejnym krytycznym krokiem jest zdefiniowanie prawidłowego rozmieszczenia obciążenia i prawidłowych wiązań. Niewystarczająco ograniczony model nie zostanie rozwiązany, a nieprawidłowe rozmieszczenie obciążeń spowoduje nieprawidłowy ruch.

Konieczne jest pewne przetwarzanie danych pierwotnych (rysunek 2), ponieważ powierzchnia wygenerowana na podstawie danych pierwotnych byłaby trudna do zasiatkowania (rysunek 2B). Przefiltrowaliśmy dane za pomocą filtra Gaussa (rysunek 2C) i przeprowadziliśmy ręczne wygładzanie krzywych, aby uzyskać zestaw czystych konturów, które można przekształcić w powierzchnię 3D. Zbyt duże wygładzenie może spowodować powstanie "stopionej" powierzchni, która straciła wiele swoich cech. Wybór odpowiedniego rozmiaru elementu jest procesem iteracyjnym, ponieważ wybranie zbyt małego rozmiaru elementu tworzy zbyt dużą siatkę, co jest wymagające obliczeniowo. Jednak wybranie zbyt dużego rozmiaru elementu spowoduje, że siatka nie będzie w stanie oddać prawidłowego kształtu konstrukcji. Właściwa siatka miała najmniejszy rozmiar elementu, który uchwycił prawidłowy kształt szczęki i zbiegał się w prawidłowym roztworze, weryfikowanym za pomocą przemieszczenia szczęki. Może być również konieczna modyfikacja właściwości materiału lub obliczeń obciążenia, aby lepiej naśladować prawidłowe przemieszczenie, ponieważ różne grupy wiekowe i gatunki będą miały zasadniczo różne właściwości.

Ważne jest, aby pamiętać, że zawsze istnieją ograniczenia dotyczące hipotetycznego modelu i założeń przyjętych do uruchomienia modeli ES. W przypadku modelowania tylko jednej lub niewielkiej liczby próbek bardzo ważne jest, aby upewnić się, że wybrano reprezentatywną próbkę, ponieważ istnieje prawdopodobieństwo niewielkich różnic między osobnikami. Ponieważ uwzględniono tylko niektóre elementy żuchwy i mięśnie, model jest uproszczoną wersją układu mięśniowo-szkieletowego danio pręgowanego. W związku z tym konieczne było umiejscowienie ograniczeń w celu uwzględnienia miejsca, w którym modelowane elementy szczęki połączą się z resztą czaszki, a model został sztucznie ograniczony w środku, aby zamocować go w "przestrzeni". To sztuczne ograniczenie nie wpłynęło na interpretację wynikającą z modeli, ponieważ sam ceratohyal nie był analizowany. Włączenie większej ilości struktury twarzoczaszki, zwłaszcza innych mięśni otwierających szczękę, takich jak mostek i przyczepiona chrząstka 23, mogło przyczynić się do powstania modelu, ale ograniczenia obejmują zdolność większych modeli do działania w oprogramowaniu elementów skończonych.

Kolejnym ograniczeniem jest to, że nie modelowaliśmy przyczepu więzadła, chociaż można to osiągnąć poprzez wprowadzenie sprężyn 8. Innym założeniem przyjętym w tym przypadku było to, że model będzie zachowywał się liniowo. Wielkości szczepów na modelach były porównywalne z tymi w opublikowanych modelach i dotyczyły komórek in vitro 10,24, przy czym szczepy miały wartość poniżej +3,500 i powyżej -5,000 μɛ, z wyjątkiem ograniczeń i punktów przyczepu mięśniowego. W związku z tym odkształcenia w odpowiednich regionach modelu uznano za mieszczące się w zakresie akceptowalnym dla modelu liniowego. Chrząstka nie zachowuje się całkowicie jak materiał liniowy i była wcześniej modelowana jako materiał poroelastyczny, co umożliwiło analizę zachowania płynu w modelu 25. Rozmieszczenie punktów przyczepu mięśni w skupisku lokalnych węzłów rozprowadziłoby siły szczytowe i dokładniej reprezentowałoby przyczepienie mięśni dla niektórych mięśni.

Zastosowanie ES pozwala na ocenę odkształceń i naprężeń działających na konstrukcję. Jako technika jest często stosowana w wielu dyscyplinach biologicznych, w tym w ortopedii, paleontologii, a ostatnio w biologii rozwojowej. Tutaj opisujemy, jak zbudować FE dla dolnej szczęki danio pręgowanego. W przyszłości modele te mogą zostać rozszerzone tak, aby obejmowały całą szczękę, w tym podniebienie. Podobne techniki można wykorzystać do modelowania biomechaniki kręgosłupa u ryb, która do tej pory była badana głównie za pomocą środków kinematycznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Niektóre dane na rysunkach 3-5 zostały przedrukowane z J.Biomech, 48 (12), Brunt i wsp., Modelowanie elementów skończonych przewiduje zmiany w kształcie stawów i zachowaniu komórek z powodu utraty napięcia mięśni w rozwoju szczęki, 3112-22., 2015, za zgodą Elsevier15.

Podziękowania

LHB został sfinansowany przez Wellcome Trust Dynamic Cell PhD programme; KAR został sfinansowany z grantu MRC MR/L002566/1 (przyznanego EJR i CLH), a CLH został sfinansowany z grantu ARUK 19479. Chcielibyśmy również podziękować ośrodkowi Wolfson Bioimaging za porady dotyczące obrazowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Coll2Abcamab34712Przeciwciało kolagenowe typu II - barwi wszystkie chrząstki
A4.1025 / MF20Badania rozwojowe bank hybrydomaA4.1025Przeciwciało mysoiny szkieletowej - oznacza wszystkie mięśnie szkieletowe 
Agaroza niskotopliwaSigma A9414-5GDo montażu zebry
MS222 (metanosulfonian 3-aminobenzoesanu etylu)SigmaE10521-10GDo znieczulenia
TrypsynaFisherT/3760/48przepuszczalność próbki
Dylight 488 Mysz IgGThermofisher35502Przeciwciało wtórne
Dylight 550 IgGkrólika Thermofisher 84541Przeciwciało drugorzędowe
SP8/SP5 lub SPE konfokalneLeica Do obrazowania 
Oprogramowanie LAS Leica do przechwytywaniaOprogramowanie do obrazowaniaLeica
Aviso (wersja 7.0.0)FEI Visualization Science Group(sekcja 2)
Hypermesh część pakietu Hyperworks (wersja 10)Altair Engineering(sekcja 4-5)
Abaqus (wersja 6.14)SIMULIAFE (sekcja 5,7-5,8)
Oprogramowanie do analizy obrazów 3D Oprogramowanie do generowania modeli ES Oprogramowanie do analizy

Bibliografia

  1. Rayfield, E. J. Finite Element Analysis and Understanding the Biomechanics and Evolution of Living and Fossil Organisms. Annu. Rev. Earth Planet. Sci. 35, 541-576 (2007).
  2. Rao, S. S. The Finite Element Method in Engineering: Fifth Edition. , (2010).
  3. Taylor, M., Prendergast, P. J. Four decades of finite element analysis of orthopaedic devices: Where are we now and what are the opportunities. J Biomech. 48, 767-778 (2015).
  4. Button, D. J., Rayfield, E. J., Barrett, P. M. Cranial biomechanics underpins high sauropod diversity in resource-poor environments. Proc Royal Soc London B: Biol Sci. 281. 281, (2014).
  5. Mammoto, T., Mammoto, A., Ingber, D. E. Mechanobiology and developmental control. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 27-61 (2013).
  6. Shwartz, Y., Farkas, Z., Stern, T., Aszodi, A., Zelzer, E. Muscle contraction controls skeletal morphogenesis through regulation of chondrocyte convergent extension. Dev biol. 370, 154-163 (2012).
  7. Rolfe, R. A., et al. Identification of mechanosensitive genes during skeletal development: alteration of genes associated with cytoskeletal rearrangement and cell signalling pathways. BMC genomics. 15, 48(2014).
  8. Roddy, K. A., Kelly, G. M., van Es, M. H., Murphy, P., Prendergast, P. J. Dynamic patterns of mechanical stimulation co-localise with growth and cell proliferation during morphogenesis in the avian embryonic knee joint. J Biomech. 44, 143-149 (2011).
  9. Haudenschild, D. R., Chen, J., Steklov, N., Lotz, M. K., D'Lima, D. D. Characterization of the chondrocyte actin cytoskeleton in living three-dimensional culture: response to anabolic and catabolic stimuli. Mol cell biomech. 6, 135-144 (2009).
  10. Nowlan, N. C., Murphy, P., Prendergast, P. J. A dynamic pattern of mechanical stimulation promotes ossification in avian embryonic long bones. J Biomech. 41, 249-258 (2008).
  11. Giorgi, M., Carriero, A., Shefelbine, S. J., Nowlan, N. C. Mechanobiological simulations of prenatal joint morphogenesis. J Biomech. 47, 989-995 (2014).
  12. Heegaard, J. H., Beaupre, G. S., Carter, D. R. Mechanically modulated cartilage growth may regulate joint surface morphogenesis. J Ortho Res. 17, 509-517 (1999).
  13. Hammond, C. L., Schulte-Merker, S. Two populations of endochondral osteoblasts with differential sensitivity to Hedgehog signalling. Development. 136, 3991-4000 (2009).
  14. Mitchell, R. E., et al. New tools for studying osteoarthritis genetics in zebrafish. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarth Res Soc. 21, 269-278 (2013).
  15. Elworthy, S., Hargrave, M., Knight, R., Mebus, K., Ingham, P. W. Expression of multiple slow myosin heavy chain genes reveals a diversity of zebrafish slow twitch muscle fibres with differing requirements for Hedgehog and Prdm1 activity. Development. 135, 2115-2126 (2008).
  16. Danieau's solution (30×). Cold Spring Harb Prot. , pdb.rec12467 (2011).
  17. Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. J Gen physiol. 137, 255-270 (2011).
  18. Tanck, E., Blankevoort, L., Haaijman, A., Burger, E. H., Huiskes, R. Influence of muscular activity on local mineralization patterns in metatarsals of the embryonic mouse. J Ortho Res. 18, 613-619 (2000).
  19. Tanck, E., et al. The mechanical consequences of mineralization in embryonic bone. Bone. 35, 186-190 (2004).
  20. Brunt, L. H., Norton, J. L., Bright, J. A., Rayfield, E. J., Hammond, C. L. Finite element modelling predicts changes in joint shape and cell behaviour due to loss of muscle strain in jaw development. J Biomech. 48, 3112-3122 (2015).
  21. Roddy, K. A., Prendergast, P. J., Murphy, P. Mechanical influences on morphogenesis of the knee joint revealed through morphological, molecular and computational analysis of immobilised embryos. PloS one. 6, e17526(2011).
  22. Cuff, A. R., Bright, J. A., Rayfield, E. J. Validation experiments on finite element models of an ostrich (Struthio camelus) cranium. Peer J. 3, 1294(2015).
  23. Schilling, T. F., Kimmel, C. B. Musculoskeletal patterning in the pharyngeal segments of the zebrafish embryo. Development. 124, 2945-2960 (1997).
  24. Dowthwaite, G. P., et al. A mechanism underlying the movement requirement for synovial joint cavitation. Matrix biol. 22, 311-322 (2003).
  25. Nia, H. T., Han, L., Li, Y., Ortiz, C., Grodzinsky, A. Poroelasticity of cartilage at the nanoscale. Biophys J. 101, 2304-2313 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza element w sko czonychobrazowanie konfokalnerenderowanie powierzchni 3Dgenerowanie siatkiobci enie mechaniczneanaliza odkszta ceimmunobarwieniew a ciwo ci materia owewalidacja modelu
Budowa modeli elementów skończonych w celu zbadania biomechaniki szczęk danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.