Artykuł metodologiczny

Model przebudowy serca poprzez zwężenie aorty brzusznej u szczurów

DOI:

10.3791/54818

⸱

2 grudnia 2016

 ,  ,  ,  , 
1Graduate Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, Mackay Memorial Hospital, 3Mackay Medicine, Nursing and Management College, 4School of Medicine, National Taiwan University, 5Department of Internal Medicine, National Taiwan University Hosptial

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany jest szczurzy model zwężenia aorty brzusznej, który wywołuje przerost i przebudowę mięśnia sercowego. Skuteczna, wysoce powtarzalna i minimalnie inwazyjna metoda jest stosowana w celu zapewnienia prostej, ale użytecznej platformy do badań nad przerostem i dysfunkcją mięśnia sercowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niewydolność serca jest jedną z głównych przyczyn zgonów na całym świecie. Jest to złożony zespół klinicznyktóry obejmuje zmęczenie, duszność, nietolerancję wysiłku fizycznego i zatrzymywanie płynów. Zmiany w strukturze mięśnia sercowego, przewodnictwie elektrycznym i metabolizmie energetycznym rozwijają się wraz z niewydolnością serca, prowadząc do dysfunkcji skurczowych, zwiększonego ryzyka arytmii i nagłej śmierci. Nadciśnieniowa choroba serca jest jednym z kluczowych czynników przyczyniających się do przebudowy serca związanej z niewydolnością serca. Najczęściej stosowany model zwierzęcy naśladujący nadciśnieniową chorobę serca jest tworzony poprzez interwencje chirurgiczne, takie jak zwężenie aorty. Zwężenie aorty brzusznej jest przydatną techniką eksperymentalną do wywoływania przeciążenia ciśnieniowego, które prowadzi do niewydolności serca. Zabieg można łatwo przeprowadzić, bez konieczności otwierania klatki piersiowej lub wentylacji mechanicznej. Patologia serca wywołana zwężeniem aorty brzusznej postępuje stopniowo, co sprawia, że model ten jest istotny dla klinicznej nadciśnieniowej niewydolności serca. Uraz serca i przebudowę można zaobserwować po 10 tygodniach od zabiegu. Opisana tutaj metoda zapewnia proste i skuteczne podejście do stworzenia zwierzęcego modelu choroby serca z nadciśnieniem, który jest odpowiedni do badania mechanizmów choroby i testowania nowych metod terapeutycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niewydolność serca to złożony zespół kliniczny, którego objawy obejmują zmęczenie, duszność, nietolerancję wysiłku fizycznego i zatrzymanie płynów w tkankach obwodowych. Jest to główna przyczyna zgonów w krajach rozwiniętych1. Oprócz kardiomiopatii dziedzicznej spowodowanej mutacjami białek sarkomerowych lub kanałów jonowych2, dysfunkcja mięśnia sercowego może być spowodowana różnymi schorzeniami, w tym nadciśnieniem, chorobami zastawkowymi serca, otyłością i cukrzycą3. Zmiany w strukturze mięśnia sercowego, przewodnictwie elektrycznym i metabolizmie energetycznym prowadzą do niewystarczającej zdolności pompowania serca do zaspokojenia potrzeb krążenia, co ostatecznie prowadzi do niewydolności serca3,4. Badanie mechanizmów leżących u podstaw niewydolności serca ma zatem kluczowe znaczenie w dziedzinie badań sercowo-naczyniowych. Identyfikacja mechanizmów molekularnych prowadzących do progresji niewydolności serca może ostatecznie pomóc w odkryciu nowych celów terapeutycznych lub użytecznych biomarkerów1. Dlatego ważne jest, aby opracować modele zwierzęce z niewydolnością serca, które mają kluczowe cechy kliniczne z niewydolnością serca u ludzi5.

Przerost i przebudowa serca odgrywają kluczową rolę w rozwoju niewydolności serca. Nadciśnienie tętnicze serca jest kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do przerostu mięśnia sercowego i nieadaptacyjnej przebudowy obserwowanej u ludzi1. Aby naśladować te ludzkie warunki, modele zwierzęce są często tworzone za pomocą procedur chirurgicznych. W szczególności aorta poprzeczna lub brzuszna może zostać zwężona w celu zwiększenia oporu wobec lewej komory, co ostatecznie prowadzi do przeciążenia ciśnienia w sercu. Zjawisko to zwykle prowadzi do przerostu mięśnia sercowego, fizjologicznej kompensacji kardiomiocytów w celu zaspokojenia funkcjonalnego zapotrzebowania układu sercowo-naczyniowego. Jednak zapotrzebowanie funkcjonalne przeważa nad normalnymi fizjologicznymi mechanizmami kompensacyjnymi, prowadząc do zwłóknienia serca i upośledzenia kurczliwości. Operacja poprzecznego zwężenia aorty (TAC) często obejmuje skomplikowane zabiegi, w tym torakotomię, wentylację mechaniczną oraz oddzielenie grasicy i tkanki tłuszczowej od łuku aorty. Natomiast zwężenie aorty brzusznej wymaga prostszych technik eksperymentalnych6-8. Aorta brzuszna, między lewą i prawą tętnicą nerkową, jest zwężona podczas operacji. Przerost i przebudowa mięśnia sercowego można zaobserwować kilka tygodni po operacji zwężenia aorty brzusznej6-8; Powodują one ciężką chorobę nadciśnieniową serca, podobną do tej generowanej przez chirurgię poprzecznego zwężenia aorty9,10. W tym miejscu opisujemy protokół przeprowadzania zwężenia aorty brzusznej u szczurów przy użyciu skutecznej, wysoce powtarzalnej i minimalnie inwazyjnej metody. Aorta brzuszna przylegająca do tętnic nerkowych jest zwężona pętlą o średnicy 0,72 mm utworzoną z nici jedwabnej 4-0. Dziesięć tygodni po operacji można zaobserwować przerost i przebudowę mięśnia sercowego. Szczurzy model przerostu serca wywołanego zwężeniem aorty brzusznej stanowi platformę do badania mechanizmów choroby i patofizjologii, a także opracowywania potencjalnych środków terapeutycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych, opublikowanym przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (publikacja NIH nr 85-23, poprawiona w 1996 roku). Protokół ten został zatwierdzony i zgodny z wytycznymi określonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Narodowym Uniwersytecie Tajwańskim.

1. Chirurgia zwierząt

  1. Przygotować igłę do strzykawki o strzykawce 22 G, stępiając końcówkę igły na kamieniu do honowania. Za pomocą szczypiec nakręć igłę pod kątem prostym.
  2. Przed zabiegiem należy przygotować wymagane narzędzia i materiały chirurgiczne, a także klatkę rekonwalescencji. Przed użyciem należy sterylizować w autoklawie wszystkie narzędzia i materiały chirurgiczne.
  3. Utrzymuj szczury przy wadze około 200 g i utrzymuj je w 12-godzinnych cyklach światła/ciemności w kontrolowanej temperaturze (21 ± 2 °C) ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody. Uwzględnij co najmniej 6 szczurów w każdej grupie. Znieczulić szczury pentobarbitalem (75 mg/kg w 0,5 ml, i.p.) lub innym odpowiednim środkiem znieczulającym. Potwierdź głębokość znieczulenia, badając odruch ogonowy.
    UWAGA: Brak odruchu ogonowego jest wskaźnikiem odpowiedniego znieczulenia.
  4. Umieść szczura w pozycji leżącej na plecach na platformie operacyjnej z poduszką grzewczą, aby utrzymać temperaturę ciała. Ogol okolice brzucha szczura maszynką do strzyżenia włosów zwierzęcych i balsamem do depilacji, aby uniknąć zanieczyszczeń chirurgicznych. Przed zabiegiem wyszoruj gładko ogolony brzuch betadyną lub innym odczynnikiem oczyszczającym.
    UWAGA: Ważne jest, aby przez cały czas trwania zabiegu utrzymywać sterylne pole.
  5. Wykonaj 2 cm nacięcie wzdłuż linii środkowej brzucha za pomocą skalpela. Używając zwykłej soli fizjologicznej, utrzymuj narząd jamy brzusznej wilgotny podczas operacji. Ostrożnie przesuń narządy trawienne na bok za pomocą wacików, aby odsłonić żyłę główną dolną, która leży w tylnej okolicy otrzewnej. Zidentyfikuj aortę brzuszną, która leży naprzeciwko i zwykle po lewej stronie żyły głównej dolnej.
    UWAGA: Aorta brzuszna to naczynie, które pulsuje w rytm tętna.
  6. Przebij otrzewną kleszczami, aby odsłonić naczynia znajdujące się pod spodem. Delikatnie odizoluj aortę brzuszną przylegającą do tętnic nerkowych i przełóż jedwabny szew 4-0 o długości 8 cm pod aortą brzuszną między początkiem prawej i lewej tętnicy nerkowej.
  7. Wykonaj luźny podwójny węzeł ze szwem; pozostaw pętlę o średnicy 3 mm i umieść i zgiętą igłę 22 G wewnątrz pętli. Zaciśnij węzeł wokół aorty i igły, a następnie natychmiast wyjmij igłę, aby uzyskać zwężenie o średnicy 0,7 mm.
  8. Zamknij jamę brzuszną wchłanialnym materiałem szwowym 6-0. Zszyj nacięcia mięśni lub skóry za pomocą prostych szwów przerywanych. Aby zapobiec infekcji, wyszoruj miejsce operacji nalewką jodową.
  9. Uważnie obserwować zwierzę, aż odzyska wystarczającą przytomność, na co wskazuje swobodny ruch i przyjmowanie pokarmu. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku. Aby zapobiec bólowi pooperacyjnemu, należy leczyć szczura paracetamolem (300 mg/kg w 0,5 ml, i.p.).
    UWAGA: Użytkownicy powinni podawać leki przeciwbólowe zgodnie z zasadami instytucji.

2. Pobieranie próbek tkanek i krwi

  1. Po 10 tygodniach od operacji zważ szczura i znieczul go pentobarbitalem (75 mg/kg w 0,5 ml, i.p.). Przed zabiegiem potwierdź głębokość znieczulenia, badając jego odruch ogonowy. Umieść szczura na metalowej tacy.
  2. Wykonaj 2 cm nacięcie wzdłuż linii środkowej szyi za pomocą skalpela. Ostrożnie przemieszcz mięśnie kleszczami, aby odsłonić tchawicę. Obserwuj uważnie, aby zidentyfikować tętnice szyjne, które są równoległe do tchawicy i pulsują w rytm tętna.
  3. Pobrać krew z tętnicy szyjnej do probówki do pobierania krwi pokrytej EDTA. Natychmiast odwirować krew przez 15 minut przy 2 000 x g i zebrać osocze. Przechowywać osocze krwi w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będzie ono potrzebne.
  4. Wykonaj 5 cm nacięcie w okolicy klatki piersiowej, wokół linii środkowej wyrostka ksylowego. Przebij membranę ostrymi kleszczami. Za pomocą nożyczek przetnij i usuń klatkę piersiową wzdłuż linii środkowej obojczyka po obu stronach, aby odsłonić serce. Ostrożnie wytnij serce wzdłuż granic serca i naczyń krwionośnych. Delikatnie wyjmij serce, nie chwytając za chusteczkę.
  5. Zamontuj serce na zmodyfikowanym aparacie perfuzyjnym Langendorffa, przywiązując pień aorty do igły perfuzyjnej. Perfuzja serca za pomocą buforu Krebsa (zawierającego 110 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO4, 25 mMNaHCO3 i 11 mM glukozy [pH 7,4]) w celu wypłukania krwi. Zważ serce i oblicz stosunek masy serca do masy ciała. Napraw serce za pomocą 4% paraformaldehydu na lodzie. Pamiętaj o noszeniu maski, ponieważ opary paraformaldehydu są toksyczne.

3. Kwantyfikacja zwłóknienia tkanek

  1. Umieść tkankę serca utrwaloną paraformaldehydem na urządzeniu do cięcia tkanek i wytnij odcinki o grubości 2 mm. Umieść skrawki tkanki w kasecie do zatapiania. Odwodnić tkankę poprzez serię stopniowanych kąpieli alkoholowych (50%, 75%, 95% i 100% przez 1 godzinę każda).
  2. Naciekać tkankę ksylenem przez 1 godzinę, a na koniec w wosku przez 1 godzinę. Umieść naciekaną tkankę w kasecie do zatapiania i zatapiaj woskiem parafinowym. Przechowuj osadzone tkanki w blokach parafinowych w temperaturze pokojowej do czasu mikrotomizacji.
  3. Pokrój osadzoną tkankę na odcinki o grubości 4 μm. Umieścić sekcje w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C. Zanurz szkiełko szklane w łaźni wodnej pod kątem i stopniowo zbliżaj się do krawędzi sekcji parafinowej, aby umożliwić częściowe przymocowanie do szkiełka.
  4. Przesuwaj szkiełko do wanny i z powrotem, aby usunąć potencjalne kieszenie powietrzne pod sekcją tkankową i ułatwić lepsze mocowanie. Suszyć szkiełka w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę i przechowywać je w temperaturze pokojowej do barwienia histologicznego.
  5. Włóż zjeżdżalnię do zbiornika. Odparafinować szkiełko ksylenem przez 30 minut i ponownie uwodnić je w kolejno rozcieńczonym alkoholu (95%, 75% i 50% przez 3 minuty), a na koniec w wodzie destylowanej. Użyj odpowiedniego roztworu czerwieni Picrosirius, aby całkowicie pokryć skrawki tkanki na 1 godzinę. Przepłukać szkiełka w 0,5% roztworze kwasu octowego na dwie przemiany, a następnie wykonać dwa płukania w bezalkoholowym roztworze.
  6. Wysuszyć szkiełko na powietrzu i zamontować szkiełko w żywicy syntetycznej z szkiełkiem nakrywkowym. Sfotografuj szkiełko w polu światła widzialnego.
    UWAGA: Czerwony obszar na zdjęciu pokazuje czerwoną strefę dodatnią pikrosiriusa pod mikroskopem przy 200-krotnym powiększeniu. Oblicz procent czerwonej strefy dodatniej Picrosiriusa na całej powierzchni, która wskazuje na zakres zwłóknienia11.

4. Kwantyfikacja troponiny we krwi

  1. Określ ilościowo poziomy troponiny w osoczu za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA). Oznaczyć każdą próbkę w dwóch egzemplarzach. Załadować 50 μl osocza krwi i 50 μl koktajlu przeciwciał do odpowiednich studzienek. Uszczelnić płytkę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce płytek z prędkością 400 obr./min.
    UWAGA: Troponina sercowa w osoczu jest markerem uszkodzenia serca.
  2. Odessać ciecz i trzykrotnie przemyć każdą studzienkę 250 μl buforu do płukania. Po ostatnim praniu odwróć talerz i osusz go czystymi ręcznikami papierowymi, aby usunąć nadmiar płynu.
  3. Dodać 100 μl substratu tetrametylobenzydyny do każdego dołka i inkubować przez 10 minut w ciemności na wytrząsarce płytkowej z prędkością 400 obr./min. Do każdej studzienki dodać 100 μl roztworu zatrzymującego. Potrząsaj płytką na wytrząsarce przez 1 minutę, aby wymieszać. Zapisz gęstość optyczną (OD) przy 450 nm.
    UWAGA: Stężenie troponiny jest proporcjonalne do wartości OD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

10 tygodni po operacji zwężenia aorty brzusznej, przeanalizowano powstałą patologię serca. Histologię serca mierzono poprzez obliczenie stosunku masy serca do masy ciała i wykrycie ilości kolagenu w sercu. Uszkodzenie serca potwierdzono poprzez pomiar stężenia troponiny sercowej w osoczu.

Jak pokazano na rysunku 1A, rozmiar serca został powiększony po operacji zwężenia aorty brzusznej, co wykazano wyższym stosun...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba nadciśnieniowa serca, poważny problem zdrowotny, który w znacznym stopniu przyczynia się do zachorowalności i śmiertelności, może prowadzić do przerostu serca i niewydolności serca5. Patogeneza i progresja nadciśnieniowej choroby serca u ludzi jest złożona, dlatego odpowiedni model zwierzęcy ma kluczowe znaczenie dla zbadania mechanizmów leżących u podstaw i przetestowania nowych metod terapeutycznych, które mają na celu poprawę struktury i funkcji serca5. Model zwężenia aorty brzusznej, któ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca autorów została wsparta grantem z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST 103-2320-B-002-068-MY2), Narodowego Instytutu Badań nad Zdrowiem (NHRI-EX104-10418SC) oraz Narodowego Uniwersytetu Tajwańskiego (NTU 104R4000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła do strzykawki 22 G                                               BD Nauki Biologiczne                     
probówki do pobierania krwi EDTA    BD Nauki Biologiczne                     
4-0 Szew jedwabny                                                   Sharpoint &handel; Produkty                                     DC-2515N
6-0 szew jedwabny                                                   Sharpoint &handel; Produkty                                     DC-2150N
Pentobarbital                                                     Sigma Aldrich                                                           
Paraformaldehyd                                       Sigma Aldrich                                                         
ParacetamolSigma Aldrich                                                         A7085
Picrosirius czerwony roztwór                         Biblioteka                                                                               ab150681
Zestaw troponiny sercowej                                   Biblioteka                                                                               ab200016
ImagequantDynamika molekularna
Langendorff                                                         ADInstruments                                                       
309572REF3659741507002441244ML870B2

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Houser, S. R., et al. Animal models of heart failure: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 111, 131-150 (2012).
  2. Towbin, J. A. Inherited cardiomyopathies. Circ J. 78, 2347-2356 (2014).
  3. Breckenridge, R. Heart failure and mouse models. Dis Model Mech. 3, 138-143 (2010).
  4. van Bilsen, M., van Nieuwenhoven, F. A., van der Vusse, G. J. Metabolic remodelling of the failing heart: beneficial or detrimental? Cardiovasc Res. 81, 420-428 (2009).
  5. Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2, 138-144 (2009).
  6. Gu, W. L., Chen, C. X., Huang, X. Y., Gao, J. P. The effect of angoroside C on pressure overload-induced ventricular remodeling in rats. Phytomedicine. 22, 705-712 (2015).
  7. Zhang, Y., et al. Alteration of cardiac ACE2/Mas expression and cardiac remodelling in rats with aortic constriction. Chin J Physiol. 57, 335-342 (2014).
  8. Tardif, K., et al. Nestin upregulation characterizes vascular remodeling secondary to hypertension in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1265-H1274 (2015).
  9. Li, C., et al. Myeloid mineralocorticoid receptor deficiency inhibits aortic constriction-induced cardiac hypertrophy in mice. PLoS One. 9, e110950(2014).
  10. Ku, H. C., Su, M. J. DPP4 deficiency preserved cardiac function in abdominal aortic banding rats. PLoS One. 9, e85634(2014).
  11. Lee, S. Y., et al. Caffeic acid ethanolamide prevents cardiac dysfunction through sirtuin dependent cardiac bioenergetics preservation. J Biomed Sci. 22, 80(2015).
  12. Gs, A. K., Raj, B., Santhosh, K. S., Sanjay, G., Kartha, C. C. Ascending aortic constriction in rats for creation of pressure overload cardiac hypertrophy model. J Vis Exp. , e50983(2014).
  13. deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. J Vis Exp. , e1729(2010).
  14. Schaefer, A., et al. A New Animal Model for Investigation of Mechanical Unloading in Hypertrophic and Failing Hearts: Combination of Transverse Aortic Constriction and Heterotopic Heart Transplantation. PLoS One. 11, e0148259(2016).
  15. Rodriguez-Iturbe, B., Quiroz, Y., Kim, C. H., Vaziri, N. D. Hypertension induced by aortic coarctation above the renal arteries is associated with immune cell infiltration of the kidneys. Am J Hypertens. 18, 1449-1456 (2005).
  16. Ku, H. C., Lee, S. Y., Yang, K. C., Kuo, Y. H., Su, M. J. Modification of Caffeic Acid with Pyrrolidine Enhances Antioxidant Ability by Activating AKT/HO-1 Pathway in Heart. PLoS One. 11, e0148545(2016).
  17. Bovill, J. G. Intravenous anesthesia for the patient with left ventricular dysfunction. Semin Cardiothorac Vasc Anesth. 10, 43-48 (2006).
  18. Inoko, M., Kihara, Y., Morii, I., Fujiwara, H., Sasayama, S. Transition from compensatory hypertrophy to dilated, failing left ventricles in Dahl salt-sensitive rats. Am J Physiol. 267, H2471-H2482 (1994).
  19. Heyen, J. R., et al. Structural, functional, and molecular characterization of the SHHF model of heart failure. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H1775-H1784 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przew enie aorty brzusznejnadci nieniowa choroba sercaw knienie mi nia sercowegostosunek masy sercabarwienie czerwieni picrosiriusowmodel szczurzyprocedura chirurgicznaprzerost mi nia sercowegoprzeci enie ci nieniowe

Powiązane artykuły