Wizualizacja wpływu plwociny na rozwój biofilmu za pomocą komorowego modelu szkła nakrywkowego

Summary

Ten protokół opisuje wizualizację rozwoju biofilmu po ekspozycji na czynniki gospodarza za pomocą modelu komory szkiełkowej. Model ten pozwala na bezpośrednią wizualizację rozwoju biofilmu, a także analizę parametrów biofilmu za pomocą programów komputerowych.

Abstract

Biofilmy składają się z grup bakterii zamkniętych w samowydzielającej się matrycy. Odgrywają one ważną rolę w skażeniu przemysłowym, a także w rozwoju i utrzymywaniu się wielu infekcji związanych ze zdrowiem. Jeden z najlepiej opisanych i przebadanych biofilmów w chorobach człowieka występuje w przewlekłym zakażeniu płuc pacjentów z mukowiscydozą. Badając biofilmy w kontekście gospodarza, wiele czynników może wpływać na powstawanie i rozwój biofilmu. Aby określić, w jaki sposób czynniki gospodarza mogą wpływać na tworzenie i rozwój biofilmu, zastosowaliśmy metodę szkła nakrywkowego ze statyczną komorą do hodowli biofilmów w obecności czynników pochodzących od gospodarza w postaci supernatantów plwociny. Bakterie są wysiewane do komór i wystawiane na działanie filtratów plwociny. Po 48 godzinach wzrostu biofilmy są barwione komercyjnym zestawem do sprawdzania żywotności biofilmu przed mikroskopią konfokalną i analizą. Po pozyskaniu obrazu właściwości biofilmu można ocenić za pomocą różnych platform oprogramowania. Metoda ta pozwala nam zobrazować kluczowe właściwości wzrostu biofilmu w obecności różnych substancji, w tym antybiotyków.

Introduction

Biofilmy bakteryjne to grupy mikroorganizmów, które są połączone ze sobą i zamknięte w samowydzielającej się matrycy. ^1,2 Klasycznie reprezentują one bakterie fizycznie przyczepione do powierzchni abiotycznej lub biotycznej utworzonej w warunkach przepływu. Wykazano również, że biofilmy rosną w warunkach statycznych (brak przepływu) i dystalnie od powierzchni, takich jak granica powietrza i cieczy w basenach termalnych lub błonkach utworzonych w probówkach. Te biofilmy są od dawna znane w środowisku i są główną szkodą dla procesów przemysłowych, ponieważ mogą tworzyć się w zbiornikach wodnych lub w rurach, powodując biofouling, korozję i zatory wodne. ^3,4

Biofilmy są również kluczowe w placówkach służby zdrowia, ponieważ wykazano, że są zaangażowane w infekcje związane z cewnikiem, infekcje płuc u pacjentów z mukowiscydozą, a także w wielu innych infekcjach. ^5,6 Jedną z cech charakterystycznych zakażeń biofilmem jest zmniejszona podatność bakterii na antybiotyki i upośledzony klirens przez wrodzony układ odpornościowy. ^7-9 Najbardziej dobrze zbadane, klinicznie istotne scenariusze dotyczące zakażenia opartego na biofilmie występują u pacjentów z mukowiscydozą (CF), którzy są przewlekle zakażeni biofilmami Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa może ulegać wielu zmianom podczas powstawania przewlekłej infekcji, które bardzo utrudniają jej leczenie. ^10,11 Biofilmy mogą w różny sposób aktywować wrodzoną odporność i napędzać stan zapalny. ^12-14 Ponieważ zakażenia te prowadzą do zwiększonej zachorowalności i śmiertelności u pacjentów z mukowiscydozą, kluczowe znaczenie ma zrozumienie czynników, które mogą wpływać na rozwój biofilmu w tym kontekście.

Ostatnie badanie sugeruje, że czynniki gospodarza są kluczowe w tworzeniu agregatów biofilmu P. aeruginosa. ¹⁵ Te biofilmy przyczyniają się do zmniejszenia podatności na antybiotyki i mechanizmy obronne gospodarza. Obecność czynników pochodzących od gospodarza, takich jak elastaza neutrofilowa, a także produkty wydzielane przez mikroorganizmy obecne w płucach mukowiscydozy, mogą w znacznym stopniu modulować tworzenie i rozwój biofilmu. ¹⁶ Ponadto biofilmy oddziałują z gospodarzem, modulując ekspresję wielu szlaków i inicjując stan zapalny. Podczas gdy metody o wysokiej przepustowości, takie jak standardowy test fioletu krystalicznego, mogą dostarczyć pewnych informacji na temat procesu biofilmu, wizualizacja biofilmu w odpowiedzi na te czynniki dostarcza bardziej szczegółowych informacji.

W tym manuskrypcie opisujemy metodę wykorzystania czynników z plwociny pacjentów z mukowiscydozą do badania rozwoju biofilmów in vitro. Metoda ta pozwala na szybką wizualizację biofilmów narażonych na działanie plwociny zawierającej czynniki gospodarza przy użyciu komercyjnego zestawu do sprawdzania żywotności biofilmu. Technika ta może być wykorzystana do wizualnej identyfikacji zmian, które zachodzą podczas wzrostu biofilmu w obecności produktów egzogennych i stanowi ulepszoną metodę analizy zmian w rozwoju biofilmu w różnych warunkach.

Protocol

Zauważ, że Komisja Etyki Badań (REB) jest zobowiązana do pobierania i przechowywania próbek plwociny od ludzi. Badania te zostały zatwierdzone przez Szpital dla Chorych Dzieci REB#1000019444.

1. Przygotowanie próbek plwociny z mukowiscydozy

1. Pobieraj próbki plwociny od pacjentów podczas rutynowych wizyt w klinice mukowiscydozy i trzymaj na lodzie.
2. W ciągu pierwszej godziny od pobrania należy przetransportować próbkę plwociny na lodzie do laboratorium badawczego w celu poddania ją obróbce.

2. Przetwarzanie plwociny

1. Zapisać objętość uzyskanej próbki plwociny. Dodać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do 2-krotności objętości próbki (tj. 2 części PBS, 1 część próbki).
2. Dobrze wymieszać próbkę za pomocą pipety transferowej. Wirować próbkę na najwyższym ustawieniu przez 1 minutę, aby całkowicie wymieszać.
3. Porcję 1 ml powyższej mieszaniny rozlać do odpowiedniej liczby 1,5 ml probówek do mikrowirówek i odwirowywać w dół przy 5 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
4. Po odwirowaniu usunąć supernatant i wyrzucić osad.
5. Filtr Wysterylizuj supernatant przez filtr 0,22 μm i zbierz w czystej probówce do mikrowirówki.
   UWAGA: Sterylność filtratu jest testowana przez posiew na agarze LB i płynne podłoże do zaszczepiania.
6. Przechowywać supernatant plwociny w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
   UWAGA: Plwocina od wielu pacjentów może być również gromadzona po filtracji.
7. Przed użyciem rozcieńczyć filtrat z plwociny 1/10 v/v (100 μl plwociny, 900 μl pożywki) w żądanym podłożu.
   UWAGA: Tutaj użyto standardowych pożywek bulionowych lizogennych (LB).

3. Metoda komorowego szkła nakrywkowego do tworzenia biofilmu

1. Hoduj interesujący izolat bakteryjny przez noc w żądanej pożywce w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (200 obr./min).
   Uwaga: Wykorzystano szereg różnych bakterii, w tym izolaty kliniczne Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, kompleks Burkholderia cepacia i Achromobacter xylosoxidans. Wybór pożywek zależy od szczepów i warunków zainteresowania, jednak podłoża LB mogą być używane do wstępnych eksperymentów.
2. Z hodowli nocnej umieścić 40 μl kultury w 4 ml świeżej pożywki i rosnąć przez 3-4 godziny w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (200 obr./min), aby uzyskać kulturę o gęstości optycznej przy 600 nm (OD₆₀₀) wynoszącej około 0,5-0,6.
3. Rozcieńczyć kulturę od kroku 3.2 do 1/5 w żądanym pożywce z 10% filtratem plwociny lub bez filtratu plwociny (jako kontrola). Można badać inne stężenie filtratu plwociny (tj. 50% lub 100%).
4. Użyć 200 μl rozcieńczenia do zasiewu studzienek w komorach szkiełkowych.
5. Pozwól bakteriom przyczepić się przez 4 godziny w temperaturze 37 °C bez wstrząsania.
6. Po 4 godzinach usuń podłoże i delikatnie zmyj biofilm 1x świeżym podłożem. Zastąp 200 μl świeżej pożywki.
   UWAGA: Aby zbadać wpływ plwociny na biofilm, świeże podłoże powinno zawierać supernatant plwociny.
7. Pozostawić biofilmy do wzrostu przez żądany czas w temperaturze 37 °C bez wstrząsania, wymieniając pożywkę co 12 godzin, bez mycia do czasu mikroskopii.
   UWAGA: Aby zbadać wpływ supernatantów plwociny na wrażliwość biofilmu na antybiotyki, antybiotyki dodaje się do pożywki po 24 godzinach wzrostu biofilmu i utrzymuje się w pożywce do momentu barwienia i obrazowania biofilmu.

4. Barwienie biofilmów i mikroskopia konfokalna

1. Po pożądanym czasie wzrostu (najlepiej 24-48 godzin) wyjmij pożywkę z dołków komory i delikatnie umyj każdą komorę dwukrotnie 300 μl sterylnego PBS.
2. Przygotować mieszaninę barwiącą do biofilmu, mieszając 1 μl każdego barwnika (dostarczonego w zestawie żywotności) na każdy ml potrzebnego roztworu. Zrób barwnik w roztworze wody lub pożywki.
   UWAGA: Woda jest zalecana przez producenta.
3. Dodać 200 μl mieszaniny barwników do każdego dołka ze szkła nakrywkowego w komorze i inkubować w temperaturze pokojowej, w ciemności przez 45 minut.
4. Usunąć mieszaninę barwiącą z komór i umyć każdą studzienkę 300 μl sterylnego PBS. Usuń PBS i zastąp świeżą wodą lub nośnikiem.
5. Kontynuuj wizualizację biofilmów za pomocą mikroskopii konfokalnej.

5. Wizualizacja biofilmów za pomocą mikroskopii konfokalnej

1. Odczytaj wybarwione biofilmy w komorach natychmiast po barwieniu (w ciągu 1 godziny). Zminimalizuj opóźnienia w wizualizacji szkiełek, barwiąc od 1 do 2 komór 8-dołkowych na raz.
2. Obrazowanie należy wykonywać za pomocą mikroskopu konfokalnego z laserami do wzbudzenia i zestawami filtrów do akwizycji.
   UWAGA: W tym przypadku do wzbudzenia użyto układu konfokalnego z wirującym dyskiem z widmowymi laserami borealis (zielony: 491 nm, czerwony: 561 nm). Zestawy filtrów emisyjnych 515/40 i 624/40 użyto do wizualizacji plam z zestawu żywotności biofilmu.
3. Rób zdjęcia za pomocą obiektywu wodnego 25X na mikroskopie konfokalnym z kamerą.
4. Użyj Z-Stacks do modelowania biofilmu. Rób zdjęcia co 0,5-1 μm, zaczynając od pierwszej płaszczyzny ostrości do ostatniej ostrej klatki biofilmu (zwykle obejmującej 30-80 μm dla biofilmów trwających 48 godzin)
5. Zrób 3-5 zdjęć z każdej studni.
   UWAGA: Tak więc dla szkła nakrywkowego z 8 studniami zostanie wygenerowanych 24-40 obrazów.
6. Zapisz obrazy do analizy.
   UWAGA: Obrazy powinny być zapisane jako pliki OME-TIFF do analizy za pomocą COMSTAT^18,19. Instrukcje dotyczące analizy obrazu biofilmu można znaleźć na stronie http://www.comstat.dk/. Po zaimportowaniu obrazów można przeanalizować takie parametry, jak średnia grubość, biomasa i pokrycie powierzchni dla każdego kanału (czerwony i zielony).

Results

Ogólny projekt eksperymentu jest przedstawiony na rysunku 1. Zastosowanie tego protokołu zapewnia wygodną metodę wizualizacji zmian w biofilmach hodowanych przez różne okresy czasu (np. 24, 48 lub 72 godziny). Co ważne, sygnały egzogenne, takie jak filtraty plwociny, mogą być dodawane w celu wizualizacji zmian w rozwoju biofilmu. Jak widać na rysunku 2, obecność 10% filtratów plwociny może zmienić architekturę biofilmu (rysunek 2A

Discussion

Opisane tu metody pozwalają na wizualizację biofilmów bakteryjnych wyhodowanych w obecności produktów egzogennych. Nic dziwnego, że produkcja egzoproduktów ma znaczenie przy stosowaniu tego typu systemu. Na przykład ditiotreitol (DTT) jest często stosowany w próbkach ludzkiej plwociny, aby pomóc w ich upłynnieniu. Jednak sam wpływ naziemnej telewizji cyfrowej może zmniejszyć rozwój i żywotność biofilmu (dane nie pokazane). W związku z tym konieczne są odpowiednie kontrole w każdych warunkach. Co więcej, dodanie produktów...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lab-Tek II Komorowe szkło osłonowe, #1,5 borokrzemian, 8-dołkowe	Thermo Sicher Scientific	155409
Filmtracer Zestaw do nawożenia żywych/martwych biofilmów	Thermo Fisher Scientific	L10316
Płytki z agarem do krwi	Thermo Fisher Scientific	R10215	Potwierdzanie żywotności poprzez liczenie CFU lub wybór kolonii do inokulacji
COMSTAT	Oprogramowanie dostępne online		COMSTAT to oprogramowanie do analizy obrazów biofilmu. Dostępne www.comstat.dk
Millers LB Broth	Thermo Fisher Scientific	12780-052	Standardowe podłoża do nocnego wzrostu gowth/biofilmu
Millex-GV Filtry strzykawkowe	Millipore	SLGV013SL	Filtrowanie nadnantów plwociny
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (Dulbecco A)	Oxoid	BR0014G	Mycie komór biofilmu po usunięciu podłoża
Zeiss AxioVert 200M	Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD	QS Technologies Inc.
Spectral Borealis	Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity	QS Technologies Inc.		Instrukcje dotyczące tego oprogramowania można znaleźć pod adresem: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf