Wysokoprzepustowa, wspomagana robotycznie izolacja wrażliwych na temperaturę śmiertelnych mutantów u Chlamydomonas reinhardtii

Podsumowanie

Wrażliwe na temperaturę (ts) śmiertelne mutanty są cennymi narzędziami do identyfikacji i analizy podstawowych funkcji. W tym miejscu opisujemy metody generowania i klasyfikowania letalnych mutantów ts o wysokiej przepustowości.

Streszczenie

Systematyczna identyfikacja i charakterystyka zaburzeń genetycznych okazały się przydatne do rozszyfrowania funkcji genów i ścieżek komórkowych. Jednak konwencjonalne podejścia do trwałej delecji genów nie mogą być stosowane do genów podstawowych. Opracowaliśmy unikalną kolekcję ~70 wrażliwych na temperaturę (ts) śmiertelnych mutantów do badania regulacji cyklu komórkowego w jednokomórkowych zielonych algach Chlamydomonas reinhardtii¹. Mutacje te identyfikują niezbędne geny, a allele ts mogą być warunkowo inaktywowane przez zmianę temperatury, dostarczając cennych narzędzi do identyfikacji i analizy podstawowych funkcji. Kolekcje mutantów są znacznie cenniejsze, jeśli są bliskie kompleksowości, ponieważ kolekcje rozproszone mogą pomijać ważne komponenty. Wymaga to jednak skutecznego zbierania dużej liczby mutantów, zwłaszcza na szerokim ekranie docelowym. W tym miejscu opisujemy oparty na robotyce potok do generowania śmiertelnych mutantów ts i analizy ich fenotypu u Chlamydomonas. Technikę tę można zastosować do każdego mikroorganizmu rosnącego na agarze . Zebraliśmy ponad 3000 mutantów ts, prawdopodobnie zawierających mutacje w większości lub wszystkich szlakach niezbędnych dla komórki, w tym około 200 nowych kandydujących mutacji cyklu komórkowego. Późniejsza charakterystyka molekularna i komórkowa tych mutantów powinna dostarczyć nowych informacji w biologii komórek roślinnych; Kompleksowa kolekcja mutantów jest niezbędnym warunkiem wstępnym do zapewnienia pokrycia szerokiego zakresu szlaków biologicznych. Metody te są zintegrowane z dalszymi procedurami genetycznymi i bioinformatycznymi w celu skutecznego mapowania i identyfikacji mutacji powodujących, które wykraczają poza zakres tego manuskryptu.

Wprowadzenie

Charakterystyka fenotypowa systematycznych zmutowanych kolekcji organizmów modelowych jest sprawdzonym podejściem do analizowania złożoności komórkowej. Haploidalne jednokomórkowe zielone algi Chlamydomonas reinhardtii mają zestaw genów podobny do roślin, ale oddzieliły się od roślin lądowych przed wielokrotnymi duplikacjami genomu w linii roślin lądowych². Zasadniczo, brak duplikacji genów i głównie haploidalny cykl życiowy znacznie ułatwiają genetyczne podejścia do utraty funkcji. Jednak celowe zakłócenie genów będących przedmiotem zainteresowania jest prawie niemożliwe ze względu na brak wydajnej homologicznej integracji genomowej. Biblioteka losowych zakłóceń insercyjnych jest w trakcie budowy, w połączeniu z identyfikacją zakłóconego miejsca, co do tej pory dało zestaw 1935 zmapowanych zakłóceń reprezentujących 1562 geny³. Jednak to podejście (od którego oczekuje się, że na ogół spowoduje mutacje zerowe) nie ma zastosowania do niezbędnych genów. Mutacje wrażliwe na temperaturę (ts) można odzyskać w kluczowych genach, a najnowsze metody pozwalają na skuteczną identyfikację zmutowanego genu i zmiany sprawczej. Analiza fenotypowa w wysokiej temperaturze dostarcza natychmiastowych informacji na temat funkcji zmutowanego genu. Informowaliśmy o izolacji i charakterystyce mutacji letalnych ts w ~ 70 podstawowych genach w Chlamydomonas, koncentrując się szczególnie na genach zaangażowanych w progresję cyklu komórkowego i kontrolę^1,4.

Ts śmiertelne ekrany są podstawą analizy genetycznej mikroorganizmów od dziesięcioleci^5,6. W zasadzie pożądaną cechą jest zbliżenie się do "nasycenia", co oznacza, że wszystkie geny zdolne do mutacji do śmiertelności są identyfikowane przez co najmniej jednego mutanta, co pozwala na pełną analizę. Jednak w praktyce kilka czynników ogranicza podejście do nasycenia. Po pierwsze, podczas gdy prawie wszystkie geny mogą być zmutowane w wyniku utraty aktywności w wysokiej temperaturze, skuteczność odzyskiwania takich mutantów waha się co najmniej o rząd wielkości^7,8. W związku z tym losowy ekran zaczyna wychwytywać powtarzające się trafienia u "osób często podróżujących" na długo przed zbliżeniem się do nasycenia. Po drugie, podczas gdy mutacje ts zwykle skutkują zmniejszeniem funkcji, mogą nie być prawdziwymi wartościami zerowymi w temperaturze restrykcyjnej (i odwrotnie, często nie są w pełni funkcjonalne w temperaturze dopuszczającej). Problem ten można do pewnego stopnia rozwiązać, porównując wiele alleli; Jeśli wszystkie mają wspólny fenotyp, jest bardziej prawdopodobne, że odzwierciedla to wynik prostej inaktywacji genu. Allele wielokrotne są również bardzo pomocne w ostatecznej identyfikacji molekularnej zmiany przyczynowej¹. Jednak problem "osób często podróżujących" oznacza, że wiele alleli w rzadko występujących genach może być trudne do odzyskania.

Z tych powodów rozwijamy ulepszony potok do izolowania i fenotypowego charakteryzowania mutantów ts. Do tej pory zebraliśmy ponad 3000 mutantów TS, w tym około 200 nowych mutacji cyklu komórkowego. Analiza molekularna i fenotypowa tego zbioru, który już teraz prawdopodobnie obejmuje mutacje w większości lub wszystkich szlakach niezbędnych dla komórki, powinna dostarczyć nowych spostrzeżeń i hipotez w biologii komórek roślinnych. Co ważne, rurociąg ten może być stosowany do każdego mikroorganizmu, który rośnie na agarze w celu efektywnego konstruowania zmutowanych kolekcji.

Uwaga na temat sprzętu: dwa roboty są bardzo ważne dla efektywności tej procedury (zbieracz kolonii i kombinacja repliki plater/cherry picker). Pickery zazwyczaj mają metalowe kołki. Zebrane kolonie są trzymane w powietrzu na tych kołkach przez pewien czas (od sekund do minut, w zależności od modelu). Chlamydomonas umiera w ciągu około 20 sekund na metalowej szpilce w powietrzu. Ogranicza to wybór modelu dla organizmu. Precyzja ma znaczenie. Nasz zbieracz kolonii jest dość dokładny; Jest jednak nieco gwałtowny w swoim działaniu i ma pewną możliwość zanieczyszczenia krzyżowego na bazie sprayu. Nie jest używany przy gęstości większej niż 384 (4,5 mm odstęp między środkami); Przy tej gęstości dokładność jest całkowicie akceptowalna. Replika robota do galwanizacji/zbierania wiśni (różne przystawki używane do tych zastosowań) jest znacznie wolniejszy w zbieraniu, ale jest wystarczająco dokładny dla gęstości 1,536 (6,144 jest wyzwaniem, nawet dla tego bardzo dokładnego robota; oceniliśmy tę gęstość, ale zdecydowaliśmy się jej nie używać ze względu na różne trudności). Robot nie będzie działał dobrze, jeśli talerze będą ładowane nierównomiernie itp. Ważne jest, aby sprawdzać wyrywkowo, aby upewnić się, że dzieją się właściwe rzeczy; Oczywiście robot będzie działał bez nadzoru i ogólnie rzecz biorąc, wszystko pójdzie dobrze, jeśli kilka pierwszych płyt będzie prawidłowych.

Protokół

1. Mutageneza UV

1. Przygotować partię 100 - 200 prostokątnych płytek agarowych z podłożem tris-acetate-fosforanowym (TAP)^9,10. Przygotuj te płytki z kilkudniowym wyprzedzeniem i trzymaj je na stole do wyschnięcia, aby zapewnić szybkie wchłanianie zawieszonych komórek w kolejnych krokach.
2. Hodowla komórek Chlamydomonas o gęstości optycznej do 0,2 - 0,5 (OD₇₅₀; ~ 2 dni) w 100 ml płynu TAP pod światłem, w temperaturze 25 °C i wstrząsając przy 100 obr./min.
   UWAGA: Mutageneza UV jest przeprowadzana niezależnie w dwóch tłach genetycznych: Mat-Hygro^r (nadaje odporność na higromycynę B) i Mat+ Paro^r (nadaje odporność na paromomycynę). Wybór antybiotyku jest arbitralny, pod warunkiem, że oba typy kojarzenia mają komplementarną oporność na leki.
3. Sprawdzić próbkę każdej z kultur pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki są żywotne, zdrowe (pływające i nienaruszone) oraz wolne od zanieczyszczeń.
   UWAGA: Przerośnięte kultury "rozbijają się" i tracą żywotność, pojawiając się jako "duchy" w mikroskopii z kontrastem fazowym. Nie utrzymuj kultur wytrząsających, gdy osiągną nasycenie. Zjawisko "ducha" jest łatwo wykrywalne w kroku 1.3.
4. Rozcieńczyć kulturę do 0,003 OD₇₅₀. Owiń butelkę folią aluminiową, aby zapewnić jednorodną gęstość, ponieważ szczep jest ruchliwy i pływa kierunkowo w odpowiedzi na światło.
   1. Dostosuj gęstość zawiesiny w oparciu o planowaną dawkę UV, tak aby biorąc pod uwagę zabijanie komórek, na płytkach utworzyło się 200 - 600 kolonii ocalałych (ryc. 1). Patrz Tabela 1, aby uzyskać informacje na temat czasów ekspozycji na promieniowanie UV.
5. Podłącz kasetę z małą tubą, która pasuje do dozownika płynu i wykonaj serię prań w celu sterylizacji, zgodnie z instrukcjami producenta, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
6. Za pomocą dozownika 8 x 12 płynów dozuj 4 x 96 kropli po 2 μl każda na prostokątne płytki (Rysunek 1). Delikatnie postukaj w krawędź płytki, aby upewnić się, że wszystkie krople łączą się w cienki arkusz płynu i natychmiast przykryj płytki, aby zapobiec ekspozycji na światło.
   1. Aby zapewnić bardzo równomierne rozproszenie pojedynczych komórek, użyj suchych płytek, jak wspomniano powyżej, i szybko przykryj płytki, aby zapobiec pływaniu komórek w odpowiedzi na światło. Trzymaj przykryte talerze poziomo i w ciemności, aż cały płyn zostanie wchłonięty.
7. Umieść płytki pod bakteriobójczą lampą UV (30-watowa bakteriobójcza lampa UV) na okresy czasu określone empirycznie, aby zapewnić optymalną wydajność mutantów ts- wśród osób, które przeżyły. W tym przypadku użyj czasów 0,5 - 1,5 minuty w odległości 40 - 50 cm, aby uzyskać 90 - 99,9% zabójstwa. Osoby, które przeżyły, zawierają 100 - 1,000 mutacji punktowych wywołanych promieniowaniem UV, z których ~ 10% zmienia sekwencje kodujące.
   1. Aby zapewnić maksymalną siłę naświetlania promieniowaniem UV bez odwrócenia z powodu zależnej od światła naprawy DNA^11,12, na tym etapie pracuj w ciemności i natychmiast po napromieniowaniu zapakuj płytki do ciemnego pudełka.
8. Trzymaj talerze w ciemności przez 8 - 24 godziny w temperaturze pokojowej.
9. Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 21 °C z oświetleniem, aby utworzyć kolonie. Tworzenie kolonii trwa ~10 dni. Pamiętaj, aby owinąć talerze plastikowymi torbami i dodać do środka papier absorpcyjny, aby zniwelować kondensację cieczy. W przeciwnym razie cykle parowania i kondensacji mogą zapewnić drogę ciekłego filmu dla zanieczyszczeń do płyt.
10. Załaduj płytki do odpowiednich stosów jako źródła do zrobotyzowanego pobierania kolonii (Rysunek 2). Wybierz kolonie dla tablic 384 na prostokątnych płytkach i hoduj je w temperaturze 21 °C z oświetleniem (~ 1 tydzień).
11. Skondensuj matryce 384 w 1 536 tablic (4:1) za pomocą robota do galwanizacji replik (rysunek 3) i pozwól płytkom rosnąć przez ~ 3 dni w inkubatorze o temperaturze 21 °C.
12. Powtórzyć liczbę 1 536 tablic na dwie płytki każda i umieścić jedną w inkubatorze o temperaturze 21 °C (temperatura dopuszczalna), a drugą w inkubatorze o temperaturze 33 °C (temperatura ograniczona). Po upływie 24 godzin powtórzyć płytki w temperaturze 33 °C do nowego zestawu wstępnie ogrzanych płytek i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 33 °C.
    UWAGA: Powodem tego wtórnego posiewu jest to, że śmiertelne mutanty mogą w niektórych przypadkach gromadzić znaczną biomasę, nawet jeśli komórki zostaną zatrzymane w pierwszym cyklu komórkowym po posiewaniu. Drugorzędna replika eliminuje ten sygnał i znacznie zwiększa czułość.
13. Sfotografować płytki aparatem cyfrowym po 3 dniach wzrostu w temperaturze 33 °C i 5 dniach wzrostu w temperaturze 21 °C. Trzymać płytki w ustalonej ramce. Użyj "płytki siatkowej" oznaczonej dziewięcioma wskaźnikami wyrównania, która jest fotografowana razem z płytkami hodowlanymi (rysunek 4). Sfotografuj płytki hodowlane jako naprzemiennie sparowane obrazy w temperaturze 21 °C i 33 °C (21/33).
    UWAGA: W celu wyrównania wzrostu stosuje się różne czasy inkubacji, ponieważ dziki typ rośnie znacznie szybciej w temperaturze 33 °C niż w temperaturze 21 °C.

2. Identyfikacja kandydatów na mutantów ts: Pierwszy ekran

1. Przetwarzaj sparowane obrazy płyt 21/33 za pomocą niestandardowego oprogramowania do analizy obrazów Matlab, aby wyeliminować tło i podzielić obrazy na 1 536 tablic. Program określi wykrytą biomasę (całkowitą intensywność pikseli) w każdej pozycji (rysunek 5).
   UWAGA: Oprogramowanie (dostarczone w SI wraz z instrukcjami) użyje obrazu z płytki siatki do określenia lokalizacji komórek (poszczególnych wpisów) w tablicy 1,536 przy zastosowanym powiększeniu i wyrównaniu płytki oraz obliczy całkowitą intensywność pikseli w każdej komórce. Wartości te dla każdego mutanta są następnie porównywane z regulowanymi parametrami w celu określenia wymaganego wzrostu w temperaturze 21 °C w stosunku do wzorca ts+ i stopnia wrażliwości na temperaturę, zdefiniowanego jako: S(Mut₃₃)/S(WT₃₃)/S(Mut₂₁)/S(WT₂₁), gdzie S jest sygnałem (intensywność pikseli po odjęciu tła), Mut jest indywidualnym mutantem, a "WT" to losowo wybrana kolonia niewrażliwa na temperaturę (zmutagenizowany szczep, który miał fenotyp ts +). Wzrost w temperaturze 21 °C definiuje się jako S(Mut₂₁)/S(WT₂₁). Na tym pierwszym ekranie należy zastosować złagodzone kryteria wyboru (dopuszczające stosunkowo niski wzrost w temperaturze 21 °C i stosunkowo niski stopień wrażliwości na temperaturę), aby utrzymać niski odsetek wyników fałszywie ujemnych.
2. Załaduj listę wybranych kolonii wygenerowaną przez oprogramowanie jako plik instrukcji dla robotyki zbierającej pojedyncze kolonie (zwykle do tablicy 384). Przygotuj płytkę źródłową i docelową zgodnie z instrukcjami robotyki i wybierz kolonie do ustawienia (Rysunek 6).
   UWAGA: Konwencjonalne pickery wymagają pliku instrukcji w pewnym formacie, takim jak .csv, .txt lub .xls. Wszystkie selektory będą miały możliwość korzystania z plików; różne formaty będą wymagały drobnej edycji kodu MATLAB (dostarczony kod źródłowy).
3. Umieścić płytki docelowe w inkubatorze w temperaturze 21 °C na ~ 5 dni, aby wyhodować płytkę podstawową.

3. Identyfikacja mutantów ts: Drugi ekran

1. Powtórz krok 2.1, aby ponownie przetestować wybrane kolonie. Zazwyczaj 30 - 50% kolonii jest ponownie testowanych jako czyste ts lethals, uzyskując wydajność 2% - 5% ts lethals w stosunku do początkowych kolonii, które przeżyły mutagenezę UV.
2. Powtórz krok 2.2 dla wybierania dwukrotnie przesianych ts lethals, ale ze zmodyfikowanym plikiem instrukcji zaprojektowanym do układania kolonii w bloki po 100 kolonii na prostokątnych płytkach o gęstości 384. Ma to na celu wygodne badanie mikroskopowe w następnym kroku. Format pliku instrukcji jest określany w czasie wykonywania przez kod MATLAB.
3. Upewnij się, że uwzględniłeś kilka kolonii WT jako kontrolę i umieść płytki w temperaturze 21 °C na ~ 5 dni.

4. Wstępne określenie fenotypu

1. Powtórzyć 100-blokowe płytki ułożone w kroku 3.2 i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 21 °C na ~ 2 dni, aby uzyskać świeżo rosnące kolonie.
2. Powielić nową kopię 100-blokowych tabliczek (4.1) do trzech kopii. Umieścić jedną kopię w inkubatorze w temperaturze 21 °C i jedną w inkubatorze w temperaturze 33 °C jako kontrolę.
3. Umieść trzecią kopię ("płytki przesiewowe") w zrobotyzowanym ustawieniu i znajdź kolonie długimi szpilkami dotkniętymi wysterylizowaną wodą.
   UWAGA: Komórki Chlamydomonas przypięte do agaru mają tendencję do lądowania początkowo jako dość gęsta plama komórek, z kilkoma pojedynczymi komórkami dostępnymi do kontroli mikroskopowej. Aby zoptymalizować kolonie do kontroli mikroskopowej, należy dostrzec początkowo przeniesione komórki za pomocą kropli wody (objętość wody przenoszonej przez długie kołki robota wynosi ~ 100 nl). Powoduje to rozproszenie komórek w małym promieniu (~ 1 mm) wokół początkowego środka przypinania, z wieloma izolowanymi pojedynczymi komórkami.
4. Wykonać mikrofotografie obszaru każdej plamki na płytkach przesiewowych w czasie 0 (gdy są jeszcze pojedyncze, niepodzielone komórki) (ryc. 7) i umieścić płytki w temperaturze 33 °C w celu inkubacji. Określ lokalizację obrazu za pomocą ręcznej kontroli stolika zmodyfikowanego mikroskopu tetradowego ustawionego tak, aby dawał przystanki w odstępach 4,5 mm od środka do środka matrycy o gęstości 384.
5. Wyjąć płytki przesiewające z inkubatora w temperaturze 33 °C i wykonać mikrofotografie, jak w kroku 4.4, w różnych punktach czasowych (10 godzin, 20 godzin, 48 godzin). Upewnij się, że stolik, uchwyt płytki i kontroler stage są precyzyjnie skalibrowane, aby uzyskać obrazy tych samych komórek w każdym punkcie czasowym. Wykonaj szybką akwizycję mikrofotografii (~ 10 min).
6. Użyć drugiej kopii w inkubatorze w temperaturze 33 °C, aby zweryfikować fenotyp ts i upewnić się, że wahania temperatury podczas akwizycji obrazu nie mają większego wpływu na fenotyp ts.
   1. Analizuj obrazy mikroskopowe i wybieraj mutanty na podstawie pożądanych kryteriów (ryc. 8). Znajdź ostatni wybrany zestaw na 96-poziomowej płytce agarowej. Upewnij się, że każda płytka zawiera mutanty o tym samym typie krycia i odporności na leki.
   2. Dla każdej płytki należy uwzględnić dwie ostatnie kolumny pozytywną (mutacja zapytania) i negatywną (WT) kontrolę dla testu komplementacji.

5. Uzupełnianie i testowanie powiązań nowych mutantów z "często podróżującymi"

1. Przenieś duże ilości ułożonych kolonii do bezazotowego podłoża do indukcji gamet¹⁰ w 96-dołkowych mikropłytkach (gęstość każdej kolonii powinna wynosić około 0,2 OD). Inkubuj płytki pod światłem (żarówki rtęciowe o mocy 13 - 20 W) przez ~ 5 godzin, aby umożliwić gametogenezę.
   UWAGA: Ten krok można przeprowadzić za pomocą replikującej konfiguracji robotycznej lub ręcznie za pomocą prostego urządzenia do galwanizacji.
2. Zawieś zapytania z przeciwnymi typami krycia, w których znajdują się alternatywne kasety oporowe w rurkach z bezazotowym medium do indukcji gamet¹⁰ do gametogenezy.
3. Wymieszać próbki na płytce tarczowej w mieszaninie o objętości 20 μl (rysunek 9). Po ~10 minutach pod światłem wykryj 5 μl z każdej studzienki dwukrotnie: raz na płytce TAP w celu przetestowania połączeń i raz na TAP + 5 μM Paro + 9 μM Hygro w celu zbadania komplementacji.
4. Płytki łączące należy inkubować w inkubatorze w temperaturze 21 °C przez noc, a następnie zawinąć je w folię. Trzymaj je w ciemności przez 5 dni, aby umożliwić tworzenie zygospor.
5. Inkubować płytki do badania komplementacji przez ~10 dni w świetle w temperaturze 21 °C.
   UWAGA: Ilości leku są skalibrowane, aby umożliwić przeżycie podwójnie heterozygotycznych diploidów, ale nadal są wystarczające do wyeliminowania współpracujących haploidów. Ilości te zostały skalibrowane dla standardowych integracji kaset rezystancyjnych stosowanych w tym konkretnym projekcie; W przypadku nowych integracji dawki powinny zostać ponownie skalibrowane. Większość biomasy jest weryfikowana jako diploidy za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 9), chociaż zwykle obserwuje się również zmienny poziom haploidów (prawdopodobnie z mejozy i wzrostu podwójnie odpornych segregantów).
6. Powtórzyć płytki testowe komplementacji do dwóch kopii w celu identyfikacji fenotypu. Umieścić jedną kopię w temperaturze 21 °C i jedną kopię w temperaturze 33 °C na ~ 5 dni.
7. Badaj kolonie pod kątem fenotypu ts-, jak opisano w sekcji 2.1 (ryc. 5). Kolonie, które nie uzupełniają się z zapytaniem, prawdopodobnie reprezentują allele tego samego genu co zapytanie (diploidy hetero-alleliczne dla mutacji w tym samym genie).
8. W celu przetestowania sprzężenia, postępując zgodnie z krokiem 5.4, przesuń płytki z powrotem do światła, aby umożliwić mejozę i wzrost haploidalnych segregantów przez ~ 7 dni.
9. Powtórzyć płytki do testowania połączeń do TAP + 10 μM Paro i 10 μM Hygro w celu wyselekcjonowania podwójnie opornych potomków (przewiduje się, że będzie to 25% haploidalnego potomstwa, ponieważ kasety są niesprzężone) i inkubować w temperaturze 21 °C przez tydzień.
   UWAGA: Zwiększ dawkę leku dla podwójnie opornych haploidów.
10. Badaj kolonie pod kątem fenotypu ts-, jak w kroku 2.1.
    UWAGA: Fenotyp ts- jest oczekiwany (i obserwowany) dla mutantów w tej samej grupie komplementacji, co zapytanie. Ponadto fenotyp ts- w teście sprzężeń, dla mutanta, który uzupełnia zapytanie, może odzwierciedlać ścisłe powiązanie między zapytaniem a nową mutacją. Mutanty, które uzupełniają badane zapytania, są prawdopodobnie nowymi genami, które wejdą do procesu bioinformatycznej identyfikacji zmiany sprawczej, a ostatecznie do dalszej analizy fenotypowej.

Wyniki

Prezentujemy przyspieszoną procedurę izolacji mutantów temperaturoczułych (ts) u Chlamydomonas. Komórki nanosi się na płytki z agarem, a po krótkiej weryfikacji pod mikroskopem w celu sprawdzenia gęstości pojedynczych komórek, płytki poddaje się naświetlaniu promieniowaniem UV (Rysunek 1). Typowe kolonie napromieniowane są identyfikowane i przenoszone do formatu uporządkowanego po 10 dniach wzrostu w temperaturze dopuszczalnej (Rysunek 2). Powstałe płytki w formacie 384 są łączone w układ 1536 (Rycina 3). Na tym pierwszym etapie zbierania naświetlonych kolonii wyselekcjonowaliśmy do tej pory około 200 000 kolonii. Gęstość zawiesiny jest dostosowywana do planowanej dawki UV w taki sposób, aby po uwzględnieniu śmiertelności na płytkach uformowało się od 200 do 600 kolonii ocalałych. Odpowiednio przetestowano trzy czasy ekspozycji na UV (1,5 min, 1 min i 0,5 min) oraz trzy gęstości (Tabela 1Empirycznie czas ekspozycji wynoszący 1,5 min zapewnił uzyskanie większości mutantów ts (~50%); jednak zdecydowanie najwięcej kandydatów w cyklu komórkowym uzyskano przy czasie 1 min. W związku z tym kolejne rundy mutagenezy UV przeprowadzano wyłącznie przez 1 min. Istotną kwestią są rozpryski podczas wstępnego wyboru kolonii oraz kontaminacja krzyżowa (szczególnie w formatach o wysokiej gęstości). Może to prowadzić do powielenia i ponownego fenotypowania tego samego mutanta. Aby zminimalizować prawdopodobieństwo takiego scenariusza, należy zadbać o zbieranie kolonii o optymalnej wielkości i upewnić się, że podczas wstępnego testu nie pobrano sąsiadujących kolonii.

Następnie przeprowadzono dwa sekwencyjne testy fenotypowe ts- (Rysunek 5), a około 3 000 mutantów ts- wyizolowano i scharakteryzowano fenotypowo za pomocą mikroskopii poklatkowej (Rysunek 8). Ze względu na koncentrację biologiczną na badaniu cyklu komórkowego w odniesieniu do fenotypów spełniających określone kryteria, nie dążyliśmy do zgromadzenia więcej niż dwóch alleli w każdym genie docelowym. W związku z tym przeprowadziliśmy testy komplementacji i sprzężenia dla genów już scharakteryzowanych, posiadających więcej niż dwa allele (Zapytanie), w zestawieniu z nowo wyselekcjonowanymi kandydatami, aby usunąć geny o wysokiej częstotliwości występowania z dalszych etapów analizy (Rysunek 9).

Rysunek 1: Jednorodne rozprzestrzenianie komórek niepoddanych mutagenzie i mutagenza UV. (a) Za pomocą dozownika odczynników na płytkę agarową nanoszonych jest 384 krople o objętości 2 µl. (b) Losowo wybrane płytki są badane pod mikroskopem w celu weryfikacji gęstości pojedynczych komórek, a następnie naświetlane promieniami UV przez 1 min. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 2. Kolonie zmutowane promieniami UV wybrane do matryc 384-dołkowych. (a) Pojedyncze komórki naświetlone promieniami UV są hodowane przez ok. 10 dni do momentu powstania widocznych kolonii. Pasek skali = 2 cm. (b) Program do analizy obrazu rozpoznaje oddzielne kolonie zgodnie z określonymi parametrami, a następnie robotycznie rozmieszcza je w płytkach 384-dołkowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 3. Scalanie do macierzy 1,536. Cztery płytki w formacie 384 są scalane w jedną płytkę 1,536; po wyhodowaniu są one ponownie replikowane w celu przetestowania fenotypu ts-. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Obrazowanie do ilościowego oznaczania. (a) Płytki są umieszczone w ramce pod statywem do fotografii dokumentów, aby wszystkie płytki w serii były fotografowane przy identycznym powiększeniu i pozycjonowaniu. (b) Pierwszy obraz przedstawia mikropłytkę 1536-dołkową z czerwonymi kropkami umieszczonymi w narożnikach i punktach środkowych. Obraz tej „płytki-siatki” definiuje pozycję macierzy. (c) Przykład macierzy 1 536 po inkubacji. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rycina 5. Identyfikacja fenotypu ts- za pomocą półautomatycznej analizy obrazu. Obrazy płytek są analizowane przez dedykowane oprogramowanie MATLAB (dostępne w materiałach uzupełniających S.I.). Obraz jest automatycznie segmentowany na macierze komórek (96, 384 lub 1536), a następnie kwantyfikowany jest sygnał w każdej komórce. Wzrost w temperaturze 21 °C jest zaznaczony kolorem niebieskim, a wzrost w 33 °C kolorem żółtym. Wybierane i zaznaczane czarnymi kwadratami z zieloną kropką są kolonie wykazujące znacznie silniejszy wzrost w 21 °C w porównaniu do 33 °C (znormalizowane do ts+). Wybory te mogą być edytowane ręcznie. Ostateczne zestawienia są przenoszone do pliku wykorzystywanego przez robota do pobierania kolonii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 6. Robotyczne wybieranie kandydatów letalnych ts z pierwszej rundy. Robot do cherry-pickingu postępuje zgodnie z instrukcjami z pliku wygenerowanego zgodnie z opisem w kroku 2.1, aby wybrać kandydatów do nowej matrycy. Górny panel przedstawia załadunek sterylnej igły. Dolny panel przedstawia precyzyjne pobieranie z konkretnej kolonii na płytce źródłowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 7. Przesiewowe badanie time-lapse w celu wstępnej segregacji fenotypów letalnych ts. Klony, które przeszły dwie rundy protokołu przesiewowego przedstawionego na Rysunku 5, są przenoszone na płytki przy gęstości komórek pozwalającej na rozdzielenie pojedynczych komórek pod mikroskopem. Użyto zmodyfikowanego mikroskopu do sekcji tetrad w celu zidentyfikowania pozycji, z których wykonano fotomikrografie po 0 hr, 10 hr i 20 hr inkubacji w 33 °C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 8: Mutanty cyklu komórkowego Chlamydomonas zidentyfikowane za pomocą mikroskopii poklatkowej. (a) Ilustracja specyficznego cyklu komórkowego Chlamydomonas przedstawia długą fazę G1 charakteryzującą się wzrostem komórkowym, po której następują cykle podziału S-M, zakończone wykluwaniem się nowo powstałych komórek potomnych. (b) Obrazy mikroskopowe przedstawiają komórki WT podczas cyklu komórkowego oraz identyfikację typowych mutantów cyklu komórkowego, które nie kończą mitozy. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 9: Test komplementacji i sprzężenia. (a) Szczep zapytujący oporny na antybiotyk (np. Hygro) z często powtarzającym się zmutowanym genem jest krzyżowany na płytce 96-dołkowej z zestawem mutantów przeciwnego typu strzelczego, które posiadają drugą kasetę oporności na antybiotyk (np. Paro). Płytki komplementacji dają wysoką frakcję diploidów, co wykazano poprzez barwienie kwasów nukleinowych i analizę w cytometrii przepływowej (lewy dolny panel w a). (b) Mieszanina do kojarzenia jest testowana zarówno pod kątem komplementacji w diploidach, jak i sprzężenia w podwójnie opornych potomstwie meiotycznym. Kontrolą pozytywną jest sam szczep zapytujący w przeciwnym typie strzelczym i, zgodnie z oczekiwaniami, wykazuje on fenotyp ts- w 33 °C, podczas gdy kontrolą negatywną jest WT, który wykazuje fenotyp ts+. Zakreślone kolonie nie wykazują komplementacji ze szczepem zapytującym i są zatem nowymi allelami ts- dla genu zapytującego. Są one zazwyczaj wykluczane z dalszej charakterystyki, ponieważ w zestawie testów komplementacji znajdują się jedynie „częste przypadki”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Czas	O.D.	Wybrane kolonie (#)	fenotyp Ts-	Kandydaci na regulatory cyklu komórkowego
1.5’	0.012	6000 (Śr=~200)	200 (3.3%)	7 (3.5%)
1’	0.003	11,000	131 (1.19%)	15 (11.4%)
		(Śr=~360)
0.5’	6E-04	9000	40 (0.45%)	1 (2.5%)
		(Śr=~300)

Tabela 1: Kalibracja czasów naświetlania w celu maksymalizacji wydajności kandydatów na mutanty cyklu komórkowego. Przetestowano trzy czasy naświetlania (po 30 płytek dla każdego), dobierając odpowiednie wartości OD, aby zapewnić liczbę przeżywających kolonii w przedziale 200 – 600.

Dyskusja

Opisana tutaj procedura wysokowydajnej izolacji letalnych mutantów ts zapewnia, że przypuszczalnie wszystkie niezbędne dla komórek szlaki genomu Chlamydomonas są reprezentowane. Dwa najbardziej krytyczne kroki dla skutecznego zbierania potencjalnych genów cyklu komórkowego i eliminacji powtarzających się alleli "częstych lotów" to: 1) spójna definicja cech fenotypu zatrzymania dla niekompletnych cykli komórkowych oraz 2) równoległy test komplementacji wobec już zidentyfikowanych genów zapytania w celu powiększenia kolekcji o nowo wyizolowane.

Po zsynchronizowaniu przez cykle światło-ciemność, Chlamydomonas rośnie fotosyntetycznie w ciągu dnia i zwiększa rozmiar komórek > 10 razy bez replikacji DNA lub podziału komórki¹³. W przybliżeniu zbiegając się z nadejściem nocy, komórki przechodzą następnie wiele cykli naprzemiennej replikacji DNA, mitozy i podziału komórki (ryc. 8). Ten schemat regulacyjny zapewnia naturalne rozróżnienie między genami wymaganymi przede wszystkim do wzrostu i integralności komórki a genami wymaganymi specjalnie do cyklu podziału komórki. Odkryliśmy, że 10-godzinne i 20-godzinne punkty czasowe są bardzo pouczające dla początkowego przybliżonego cięcia fenotypowego¹. Szerokie klasy śmiertelnych mutantów, które obecnie rozpoznajemy, na podstawie tych obrazów (patrz SI w Tulin i Cross, 2014)¹, to: Notch, Popcorn, Round, Small, Medium, early lysis i multiple-cycle (Figura 8).

Trzy najważniejsze kategorie, na których się skupiamy, to Notch, Popcorn i Round. Wcześniej wykazano, że fenotypy "Notch" i "Popcorn" są charakterystyczne dla większości zmian specyficznych dla cyklu komórkowego (np. kinaza zależna od cykliny mitotycznej, maszyneria replikacji DNA i topoizomeraza II)¹. Pojawienie się jednej (Notch) lub wielu (Popcorn) pozornych płaszczyzn początkowego, ale nieudanego podziału komórki jest wygodnym wskaźnikiem morfologicznym inicjacji cyklu komórkowego. Mutanty te na ogół wykazują niewielkie lub żadne wady wzrostu, ze wzrostem objętości komórek podobnym do WT po 10 godzinach. Fenotypy Notch i Popcorn są widoczne po 10 godzinach i są w pełni rozwinięte (często związane z lizą komórek) po 20 godzinach. "Okrągłe" komórki rosną podobnie do WT, ale ze znacznie zmniejszoną produkcją pozornych początkowych płaszczyzn podziału, dając w ten sposób duże, okrągłe zatrzymane komórki. Wcześniejsze mutanty z tej kategorii zaliczały się do składników kompleksu promującego anafazę¹⁴ lub do genów niezbędnych do funkcjonowania mikrotubul (kofaktory zwijające tubulinę, kompleks pierścieniowy gamma-tubuliny)¹. W późniejszym czasie komórki te często wykazują wyraźną lizę komórek.

"Małe" i "średnie" komórki rosną albo nieznacznie (małe), albo znacznie mniej niż WT (średnie). Wiele z tych zidentyfikowanych do tej pory mutantów ma zmiany w genach, których adnotacje sugerują rolę w podstawowych procesach wzrostu komórkowego (translacja lub biogeneza błony). Główna mikroskopowa dyskryminacja między średnim a okrągłym opiera się na wielkości wzrostu po 10 godzinach (Okrągły: jak WT; Średni: zredukowany). Ponieważ kategorie Małe i Średnie są dość duże i prawdopodobnie odzwierciedlają zmiany w szerokim zakresie szlaków komórkowych, nie próbujemy nasycić tych kategorii; Chcemy jednak molekularnie zidentyfikować przedstawicieli tej klasy, aby zrozumieć fenotypy utraty w różnych ścieżkach. Dwie niezbadane kategorie to: 1) mutanty wcześnie ulegające lizie, które tracą integralność (utrata zielonego koloru, utrata refrakcji) po 10 godzinach, z niewielkimi dowodami na wcześniejszy wzrost komórek oraz 2) wielokrotne cykle. Komórki namnażają się podobnie do WT po 10 i 20 godzinach, choć wykazują całkowitą niezdolność do przeprowadzania długotrwałej proliferacji.

Najczęściej charakteryzujemy "karb", "popcorn" i "okrągły" i wykluczamy małe i średnio okrągłe komórki, a także nieszczelne mutanty, które kończą kilka podziałów komórkowych. Ma to na celu przede wszystkim zapewnienie, że podstawowe cechy komórkowe, takie jak wzrost i integralność błony, są funkcjonalne i zwiększają prawdopodobieństwo wystąpienia genów związanych z podziałem. Podejście to okazało się empirycznie skuteczne; jednak może się zdarzyć, że gen cyklu komórkowego jest plejotropowy i pełni dodatkowe role wcześniej w G1, przed faktycznym podziałem. Takie przypadki, które spodziewamy się, że będą rzadkie, są pomijane. Mówiąc bardziej ogólnie, dążymy do jednorodnego zatrzymania, które z dużym prawdopodobieństwem jest spowodowane jedną mutacją sprawczą, która jest całkowicie dysfunkcyjnym białkiem. Jednak z tego samego powodu, który właśnie opisano, może istnieć kilka punktów zatrzymania, dlatego wskazana jest pewna elastyczność w doborze kandydatów.

W celu wzbogacenia kolekcji o nowo zidentyfikowane geny, wybrani kandydaci są poddawani testom pod kątem komplementacji. Wymagamy ts- w kontroli pozytywnej (zapytanie przeciwko mutacji zapytania) i ts+ w kontroli ujemnej (zapytanie przeciwko WT). Nowe mutanty w tej samej grupie komplementacji co zapytanie to ts-. Przynależność do tej samej grupy komplementacji prawie zawsze odzwierciedla zmianę molekularną w tym samym genie (tak było w przypadku każdego takiego genu, który testowaliśmy). W związku z tym w przypadku "osób często podróżujących" kryterium to ma charakter wykluczający dla dalszej charakterystyki. Mutanty, które nie znajdowały się w tych samych grupach komplementacji, co badane zapytania, są kandydatami na nowe geny i są dalej charakteryzowane przez narzędzia bioinformatyczne i eksperymentalne. Wysoce zmienny odzysk alleli ts- do różnych grup komplementacji jest dobrze znanym zjawiskiem - to znaczy zmienność jest znacznie większa niż szum Poissona, ze względu na dużą wewnętrzną zmienność mutowalności do ts- między różnymi genami. Przyczyny mogą obejmować wewnętrzne różnice w termolabilności; różne wielkości białek; obecność białka jako monomeru w porównaniu z dużym, ustabilizowanym kompleksem; i mutagenne gorące punkty. To prawie czysta uciążliwość. Jednak jednym z korzystnych wyników jest to, że lista "często podróżujących" nie jest długa (tylko kilka celów zajmuje większość listy), więc pracochłonne testowanie komplementacji nie jest ogromnym przedsięwzięciem aż do późniejszych etapów projektu.

W ramach podejścia uzupełniającego przeprowadziliśmy test sprzężeń. W tym teście wybierane są podwójnie odporne potomstwo, które jest testowane pod kątem fenotypu ts-. Fenotyp ts- jest oczekiwany (i obserwowany) dla mutantów w tej samej grupie komplementacji co zapytanie lub dla mutacji ściśle powiązanych. Dla każdego z badanych genów oczekuje się, że pojawi się potomstwo WT (fenotyp ts+) z pewnym prawdopodobieństwem w zależności od odległości genetycznej. Szacujemy, że na każde krycie w tych miejscach przypada około 100 zygospor. Zakładając 100% skuteczność mejotyczną, otrzymamy około 100 podwójnie lekoopornych potomstwo z niepołączonych kaset oporności na leki (25% potomstwa mejotycznego, cztery na mejozę, ze względu na dziedziczenie mendlowskie). Dotyczy to również mutacji ts-, gdzie 25% potomstwa będzie podwójnie zmutowane, a 25% będzie WT, jeśli mutacje zapytania i testu nie są ze sobą powiązane. Dlatego z podwójnie lekoopornego potomstwa 25% będzie stanowić WT (około 25 komórek). Dzieje się tak w przypadku całkowicie niepowiązanych mutacji; jednak umiarkowane wiązanie (w granicach ~ 20 cm, około 2 Mb lub 2% genomu¹¹⁵) znacznie zmniejszy lub wyeliminuje sygnał TS+. W przypadku sprzężenia badanej mutacji z kasetą z antybiotykiem, haploidy ts+, które są podwójnie lekooporne, występują w bardzo małych ilościach. Objawia się to pozornym brakiem rekombinacji ze wszystkimi testowanymi mutantami, pomimo uzupełnienia wszystkich testowanych mutantów, co jest nieprawidłowym wynikiem, który łatwo zauważyć; W takich przypadkach krzyżowanie wsteczne rozwiąże problem.

Zarówno na podstawie wcześniejszej wiedzy, jak i analizy sekwencji, spodziewamy się, że geny cyklu komórkowego u Chlamydomonas wynoszą około 500 genów², chociaż większość, ale prawdopodobnie nie wszystkie, są niezbędne. Ocenimy konieczność dodatkowych rund mutagenezy w miarę zbierania większej liczby mutantów i wzrostu poziomu saturacji.

Procedura ta jest unikalnie zaprojektowana do badania podstawowych procesów biologicznych oraz genów i białek, które je przeprowadzają. Istnieją inne metodologie generowania perturbacji w podstawowych genach (np. transformacja losowo zmutowanych alleli¹⁶, warunkowo transkrybowanych alleli¹⁷ lub alleli hipomorficznych¹⁸). Jednak wszystkie wymagają rekombinacji homologicznej, która jest silnie tłumiona w wegetatywnych Chlamydomonas. Zgrupowany, regularnie rozmieszczony system krótkich powtórzeń palindromicznych (CRISPR)/Cas9 został uznany za potężne narzędzie do modyfikacji genów¹⁹; jednak nie działa jeszcze wydajnie w Chlamydomonas²⁰. Co najważniejsze, wszystkie te metody wymagają wcześniejszej wiedzy na temat celu. Jest to poważne ograniczenie, jeśli ktoś chce mieć możliwość nauczenia się czegoś nowego! Nasze podejście pozwoli na uzyskanie mutacji identyfikujących niezbędne geny, niezależnie od jakiejkolwiek wcześniejszej wiedzy. Dlatego też, przy obecnym poziomie technologii, izolacja losowych mutacji ts, a następnie identyfikacja genów poprzez głębokie sekwencjonowanie, może być najbardziej efektywną metodą szybkiego wejścia do biologii komórek drobnoustrojów w superkrólestwie roślin.

Identyfikacja mutacji przyczynowych (spośród ~100 mutacji zmieniających sekwencję kodującą w każdym klonie) wykracza poza zakres tego artykułu. Głębokie sekwencjonowanie dużych pul segregantów¹ jest skuteczne, ale pracochłonne. Strategia puli kombinatorycznej do oznaczania wszystkich mutacji w dużej liczbie szczepów, po sekwencjonowaniu niewielkiej liczby pul, jest bardzo opłacalna i pracochłonna. Opracowywana jest nowa strategia kombinatorycznego sekwencjonowania segregantów masowych, która pozwoli na identyfikację mutacji przyczynowych u dziesiątek mutantów jednocześnie w jednym cyklu sekwencjonowania (w przygotowaniu). Skuteczność ta jest bardzo ważna, aby umożliwić krytyczny etap identyfikacji genów i nadążanie za bardzo szybką akumulacją mutantów, która jest możliwa dzięki opisanym tutaj procedurom.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
< mocny>Sprzęt:< / strong>
Hudson RapidPick zbieracz kolonii	Hudson Robotics
MultiDrop Combi Dozownik odczynników	Thermo Scientific	5840300
Kaseta z metalową końcówką w małej tubie	Thermo Scientific	24073295
Singer Replika robota galwanicznego RotoR	Singer Instruments		Bardzo istotne dla tego procesu. W przypadku przesiewów o niższej skali można użyć własnego narzędzia ręcznego
Singer do zbierania pojedynczej kolonii (' Stinger')	Instrumenty		Można wybierać ręcznie, jednak w przypadku dużych skal jest to prawie niemożliwe
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiały:
SYTOX Zielona plama kwasu nukleinowego	ThermoFisher Naukowy	S7020

śpiewaka