Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Pomiar różnicowo metylowanych gatunków INS DNA w próbkach surowicy ludzkiej jako biomarker śmierci β komórki wyspy trzustkowej

5.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54838

⸱

21 grudnia 2016

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, 2Department of Pediartics, Omaha Children's Hospital and Medical Center, University of Nebraska Medical Center, 3Departments of Biochemistry and Molecular Biology, Medicine, and Cellular and Integrative Physiology, IU Center for Diabetes and Metabolic Disease, Indiana University School of Medicine, 4Indiana Biosciences Research Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Śmierć komórek β wysepek poprzedza rozwój cukrzycy typu 1, a wykrycie tego procesu może pozwolić na wczesną interwencję terapeutyczną. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis, w jaki sposób mierzyć różnicowo metylowane gatunki INS DNA w ludzkiej surowicy jako biomarker śmierci komórek β.

Streszczenie

Uważa się, że śmierć komórek β wysp trzustkowych leży u podstaw patogenezy praktycznie wszystkich form cukrzycy i poprzedza rozwój hiperglikemii, zwłaszcza w cukrzycy typu 1. Opracowanie czułych i wiarygodnych biomarkerów śmierci komórek β może pozwolić na wczesną interwencję terapeutyczną w celu zapobieżenia lub opóźnienia rozwoju cukrzycy. Ostatnio kilka grup, w tym nasza, doniosło, że bezkomórkowe, różnicowo metylowane DNA kodujące preproinsulinę (INS) w krążeniu jest skorelowane ze śmiercią komórek β w cukrzycy typu 1 i cukrzycy typu 1 o nowym początku. Tutaj przedstawiamy protokół krok po kroku wykorzystujący cyfrowy PCR do pomiaru bezkomórkowego DNA INS, które jest różnie metylowane w cytozynie w pozycji -69 pz (w stosunku do miejsca rozpoczęcia transkrypcji). Pokazujemy, że test może rozróżnić metylowaną i niemetylowaną cytozynę w pozycji -69 pz, jest liniowy w kilku rzędach wielkości, zapewnia bezwzględną ilościowość liczby kopii DNA i może być stosowany do próbek ludzkiej surowicy od osób z nowo rozpoznaną cukrzycą typu 1 i kontrolnych wolnych od choroby. Opisany tutaj protokół może być dostosowany do dowolnego gatunku DNA, dla którego pożądane jest wykrycie różnie metylowanych cytozyn, czy to z krążenia, czy z izolowanych komórek i tkanek, i może zapewnić bezwzględną ocenę ilościową fragmentów DNA.

Wprowadzenie

Cukrzyca typu 1 (T1D) jest chorobą autoimmunologiczną, która charakteryzuje się niszczeniem komórek β wysp trzustkowych produkujących insulinę przez autoreaktywne limfocyty T1. Rozpoznanie cukrzycy typu 1 jest zwykle stawiane na podstawie pomiaru hiperglikemii (stężenie glukozy we krwi > 200 mg/dl) u szczupłej, młodej osoby, u której może występować kwasica ketonowa jako dowód niedoboru insuliny. W momencie rozpoznania cukrzycy typu 1 istnieją dowody na znaczną utratę funkcji i masy komórek β (od 50 do 90%)2. W badaniach klinicznych kilka leków immunomodulujących, które zostały wprowadzone w momencie diagnozy, spowodowało stabilizację funkcji komórek β (i przypuszczalnie masy), ale żaden z nich nie spowodował klinicznej remisji choroby, co wzbudziło zapotrzebowanie na opracowanie biomarkerów do wcześniejszego wykrywania choroby i długotrwałego śledzenia skuteczności terapii skojarzonych3,4. Wysiłki międzynarodowych konsorcjów, takich jak Konsorcjum Sieci Badawczej Ludzkich Wysepek przy National Institutes of Heath5, podkreśliły potrzebę opracowania biomarkerów, które koncentrują się na stresie β komórkach i śmierci w cukrzycy typu 1.

Zgodnie z tymi wysiłkami, nasza grupa i inni opracowali ostatnio testy biomarkerów, które mierzą krążące, epigenetycznie zmodyfikowane fragmenty DNA, które powstają głównie w wyniku umierania β komórkach 6-9. We wszystkich opublikowanych do tej pory testach skupiono się na ilościowym określeniu ludzkiego genu kodującego preproinsulinę (INS), który wykazuje większy stopień niemetylowanych miejsc CpG w regionach kodujących i promotorowych w porównaniu z innymi typami komórek. Przypuszczano, że uwolnienie niemetylowanych fragmentów DNA INS wynika głównie z obumierania (nekrotycznych, apoptotycznych) komórek β. Nasze ostatnie badania wykazały, że u młodzieży w nowo rozpoznanym cukrzycowym T1D zaobserwowano wzrost zarówno niemetylowanego, jak i metylowanego DNA INS w pozycji -69 pz (w stosunku do miejsca rozpoczęcia transkrypcji) i razem służyły jako specyficzne biomarkery dla tej populacji6. Te testy biomarkerów obejmują izolację bezkomórkowego DNA z surowicy lub osocza przy użyciu komercyjnych zestawów do spinania, a następnie konwersję wodorosiarczynową wyizolowanego DNA (w celu przekształcenia niemetylowanych cytozyn w uracyl, pozostawiając nienaruszone metylowane cytozyny).

W tym raporcie opisujemy techniczne aspekty pobierania próbek surowicy, izolacji bezkomórkowego DNA z surowicy, konwersji wodorosiarczynu oraz wydajności kropelkowego cyfrowego PCR (odtąd cyfrowego PCR) dla różnicowo metylowanego DNA INS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Indiana. Rodzice badanych wyrazili pisemną świadomą zgodę, a dzieci w wieku powyżej 7 lat wyraziły zgodę na ich udział.

1. Przetwarzanie surowicy

UWAGA: Opisany test został rygorystycznie przetestowany przy użyciu ludzkiej surowicy wyizolowanej w następujący sposób.

  1. Zbierz krew do jednej czerwonej górnej (bez dodatków; niepowlekanej) probówki do pobierania krwi.
  2. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby mógł uformować się skrzep.
  3. Probówka wirówkowa o masie 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść supernatant (surowicę) do nowej probówki przeznaczonej do przechowywania surowicy (polipropylenowe rurki zakręcane, wielkość zależna od próbek).
  4. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą gotowe do izolacji DNA.

2. Ekstrakcja DNA z surowicy

UWAGA: DNA ekstrahuje się za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA przy użyciu 50 μl surowicy (zalecane), zgodnie z protokołem producenta z pewnymi modyfikacjami.

  1. Przygotować 200 μl buforu do lizy + 1 μl poli(A) (5 μg) na próbkę w probówce do mikrowirówki. Wiruj przez 15 sekund. Odłóż na bok do kroku 2.3.
  2. Pobrać próbki surowicy z zamrażarki o temperaturze -80 ºC i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Doprowadzić objętość próbki surowicy do całkowitej objętości 200 μl za pomocą soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu).
  3. Poddać próbkę lizie, dodając do próbki 20 μl proteazy (1,4 jednostki Ansona/ml), a następnie 200 μl mieszaniny buforu do lizy/poliA (z kroku 2.2) i wirować przez 8 sekund. Inkubować próbkę w temperaturze 56 °C przez 10 minut, a następnie krótko wirować przez 7 sekund z maksymalną prędkością w mikrowirówce (>10 000 x g).
  4. Wytrącić DNA, dodając 230 μl 100% etanolu do próbki i wirować przez 8 sekund. Krótko wirować przez 7 sekund z maksymalną prędkością (>10 000 x g).
  5. Nałożyć DNA na kolumnę wirową, dodając mieszaninę próbek o objętości 600 μl do mini kolumny wirowej. Wirować przy 6 000 x g przez 1 min. Wyrzuć przepływ i umieść kolumnę w czystej probówce.
  6. Przepłukać DNA, dodając do kolumny 500 μl buforu płuczącego 1. Wirować przy 6 000 x g przez 1 min. Wyrzuć przepływ i umieść kolumnę w czystej probówce. Dodać 500 μl buforu płuczącego 2 do kolumny i wirować z maksymalną prędkością (>10 000 x g) przez 3 minuty. Umieścić kolumnę w nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i ponownie wirować na najwyższych obrotach przez 1 minutę.
  7. Eluować DNA, umieszczając kolumnę w nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i dodając 60 μl buforu elucyjnego bezpośrednio na filtrze. Ważne jest, aby przełączać końcówki między próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, następnie odwirowywać przy 6 000 x g przez 1 minutę. Dodać kolejne 60 μl buforu elucyjnego i odwirowywać przy 6 000 x g przez 1 min.
  8. Przechowywać DNA w temperaturze -20 ºC do późniejszego użycia lub natychmiast przystąpić do konwersji wodorosiarczynu.

3. Konwersja wodorosiarczynu

UWAGA: Konwersja wodorosiarczynu odbywa się przy użyciu zestawu do konwersji wodorosiarczynu, zgodnie z protokołem producenta z pewnymi modyfikacjami.

  1. Aby przekształcić niemetylowane cytozyny w uracyle, dodaj 130 μl odczynnika konwersji wodorosiarczynu do 20 μl DNA z kroku 2.7 w probówce PCR (pojedyncza probówka PCR 0,2 ml lub 8-paskowa probówka PCR). Zachowaj pozostałe 40 μl DNA do wykorzystania w przyszłości lub użyj w replikowanych reakcjach. Wymieszaj 20 razy, pipetując w górę i w dół, a następnie krótko odwiruj, aby upewnić się, że żadne krople nie znajdują się po bokach lub pokrywie. Inkubować w łaźni wodnej lub termocyklerze w następujący sposób: 98 °C przez 8 min, 54 °C przez 60 min, 4 °C przez 5 min.
    1. Przejdź do kroku 3.2 lub przechowuj w temperaturze 4 °C do 20 godzin.
  2. Dodać 600 μl buforu wiążącego do wirowania kolumny i umieścić kolumnę w dołączonej probówce zbiorczej. Nałóż wodorosiarczynowe DNA do kolumny i wymieszaj, pipetując w górę i w dół 10 razy. Wirować z maksymalną prędkością (>10 000 x g) przez 30 sek.
  3. Przepłukać DNA, dodając 100 μl buforu płuczącego do kolumny i odwirować z maksymalną prędkością (>10 000 x g) przez 30 sekund.
  4. Przeprowadzić odsulfonowanie w celu usunięcia grupy sulfonianowej w celu sfinalizowania konwersji niemetylowanych cytozyn do uracylu poprzez dodanie 200 μl buforu odsulfonacyjnego do kolumny. Odstawić w temperaturze pokojowej na 20 minut, a następnie odwirować z maksymalną prędkością (>10 000 x g) przez 30 sekund.
  5. Przepłukać DNA, dodając 200 μl buforu płuczącego do kolumny i wirować z pełną prędkością przez 30 sekund. Odrzucić przepływ i powtórzyć ten etap płukania.
  6. Umieścić kolumnę w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Eluować DNA, dodając 10 μl buforu elucyjnego bezpośrednio do filtra kolumnowego. Inkubować przez 1 minutę. Wirować przez 30 s z pełną prędkością, aby wymyć DNA. Ilościowe określenie odzyskanego DNA za pomocą spektrofotometrii przy A260.
    UWAGA: DNA wykryte za pomocą spektrofotometrii reprezentuje przede wszystkim nośnik poliA DNA, który został dodany w kroku 2.3 powyżej. Zazwyczaj odzysk poliA wynosi ≥85% wsadu (>4,25 μg).
  7. Przechowuj DNA w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie ono gotowe do przeprowadzenia cyfrowego PCR.

4. Multipleksowy cyfrowy PCR

  1. Sporządzić mieszankę wzorcową z wystarczającą ilością roztworu dla każdej próbki i kontroli. Zawierać co najmniej jedną próbkę zawierającą wodę (kontrola ujemna), jedną próbkę plazmidu zawierającą niemetylowany INS (1 pg, kontrola pozytywna), jedną próbkę plazmidu zawierającą metylowany INS (1 pg, kontrola dodatnia) i jedną próbkę zawierającą mieszaninę plazmidów w stosunku 1:1.
    1. Aby przygotować główną mieszaninę PCR, dodaj 12,5 μl na reakcję buforu PCR (np. 125 μl na 10 próbek), 1,25 μl na mieszaninę startera reakcyjnego i sondy (np. 12,5 μl na 10 próbek), 8,25 μl na wodę reakcyjną (np. 82,5 μl na 10 próbek), 0,5 μl na enzym reakcyjny EcoR1 (np. 5 μl na 10 próbek).
      UWAGA: Użyte tutaj startery i sondy są następujące: Forward Primer: 5'-GGAAATTGTAGTAGTTTTAGTTTTTTTATTTGT-3'; Podkład odwrotny: 5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3'; Sonda FAM: FAM-5'-ACCCCTACCACCACCTAAC-3'-MGB; Sonda VIC: VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.
  2. Ustawić reakcję multipleksową PCR na 96-dołkowej płytce. Do każdego dołka dodać 19,5 μl mieszanki wzorcowej. Dodać 2,5 μl próbki DNA przekształconej w wodorosiarczyn do każdej odpowiedniej studzienki (zachowaj pozostałe 7,5 μl DNA przekształconego w wodorosiarczyn lub użyj w powtórzonych reakcjach). Mieszać przez kilkakrotne pipetowanie w górę i w dół.
    UWAGA: Wszystkie 8 studzienek w rzędzie musi zawierać kontrolę próbki lub buforu.
  3. Uszczelnić uszczelką foliową za pomocą zgrzewarki płytowej i odwirować w wirówce płytkowej, aż po bokach studzienek nie będzie płynu.
  4. Skonfiguruj automatyczny generator kropel na ekranie dotykowym.
    UWAGA: Wszystkie 8 studzienek we wkładzie musi zawierać kontrolę próbki lub buforu.
    1. Ustaw liczbę używanych rzędów, dotykając rzędów, do których ładowane są próbki, na płytce 96-dołkowej z kroku 4.2 i podświetl wiersz na niebiesko, aby wskazać aktywny wiersz.
    2. Materiały eksploatacyjne należy ładować od tyłu do przodu, aby uniknąć zanieczyszczenia. Aby rozpocząć, dodaj wkładki wzdłuż tylnego rzędu instrumentu. Załaduj końcówki do środkowego rzędu instrumentu.
      UWAGA: Wkłady mogą pasować do uchwytów tylko we właściwej orientacji.
    3. Umieść 96-dołkową płytkę w instrumencie. Wyjmij zimny blok z zamrażarki o temperaturze -20 °C i umieść w nim nową 96-dołkową płytkę z listwą w osłonie. Umieść go wewnątrz instrumentu obok próbki załadowanej płytką 96-dołkową.
    4. Dodaj olej do dozownika z przodu instrumentu. Wybierz rodzaj oleju na ekranie dotykowym.
    5. Dotknij niebieskiego przycisku start, aby rozpocząć bieg. Potwierdź konfigurację płyty i dotknij przycisku uruchamiania uruchamiania, aby rozpocząć.
  5. Po zakończeniu usuń 96-dołkową płytkę, która zawiera nowo powstałe kropelki i uszczelnij uszczelką foliową za pomocą zgrzewarki do płytek.
  6. Wykonaj PCR10 na termocyklerze przy użyciu następującego programu: 95 °C przez 10:00 min; 40 cykli w godzinach: 94 °C przez 00:30 min, 57,5 °C przez 01:00 min; 98 °C przez 10:00 min; 12 °C przez 10 min lub do 24 godzin.
  7. Umieść płytkę na czytniku kropelkowym i ustaw czytnik.
    1. Kliknij kartę ustawień. Otwórz nowy szablon, klikając szablon > nowy. Wprowadź nazwę pliku.
    2. Użyj edytora studni, aby ustawić parametry dla każdej próbki. Nadaj każdej próbce unikalną nazwę, ustaw eksperyment na wykrywanie rzadkich zdarzeń (R-RED) i ustaw miks główny na miks użyty w kroku 4.1.
    3. Nadaj Celowi 1 nazwę (tj. niemetylowany) i ustaw Cel 1 jako nieznany (U). Nadaj Celowi 2 nazwę (tj. Metylowany) i ustaw Cel 2 jako odniesienie (R).
    4. Kliknij kartę Uruchom, aby rozpocząć uruchamianie. W oknie opcji uruchamiania wybierz chemię detekcji (FAM/VIC).

5. Analiza danych

  1. Otwórz wyniki w zakładce analizy i przeanalizuj za pomocą wykresu 2D opartego na kontrolach pozytywnych (patrz rysunek 1).
  2. Eksport pliku CSV wygenerowanego przez czytnik kropelkowy do programu do arkuszy kalkulacyjnych w celu analizy danych.
  3. Aby wygenerować "kopie na μl" surowicy, należy użyć wzoru: (stężenie*250)/(objętość surowicy użytej do izolacji DNA w μl). 6
    UWAGA: Dane są zwykle konwertowane na log10, gdy są pozyskiwane z ludzkiej surowicy, aby zapewnić normalny rozkład. Alternatywnie dane można wykreślić w skali logarytmicznej10 i przeanalizować za pomocą statystyk nieparametrycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby odpowiednio interpretować dane, w każdym przebiegu cyfrowego PCR stosujemy kontrole plazmidowe dla niezmetylowanego oraz zmetylowanego docelowego DNA INS . Kontrole te zapewniają wyraźne rozróżnienie sygnałów odpowiadających zmetylowanemu i niezmetylowanemu DNA. Rysunek 1 przedstawia dwuwymiarowe wykresy rozrzutu dla kropli w przypadku kontroli plazmidowych zawierających konwertowane w procesie bisulfitowania niezmetylowane DNA INS (Rysunek ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Metylacja cytozyn przez metylotransferazy DNA pozwala na epigenetyczną kontrolę transkrypcji w wielu genach. Gen INS u ludzi ulega ekspresji prawie wyłącznie w komórkach β wysp trzustkowych i wydaje się, że istnieje korelacja między częstością metylacji cytozyn w genie INS a wyciszeniem jego transkrypcji11. W związku z tym większość typów komórek wykazuje znacznie wyższe częstotliwości metylacji genu INS przy różnych cytozynach w porównaniu z komórkamiβ 11-13

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health grant UC4 DK104166 (dla RGM). Pragniemy podziękować za pomoc Indiana Diabetes Research Center Translation Core wspieraną przez National Institutes of Health grant P30 DK097512.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Odkurzacz Red Top Beckon Dickinson366441bez dodatków, niepowlekane wnętrze, 10 ml
Cryovial TubeSimportT310-3Apolipropylen, rurka z nakrętką, dowolny rozmiar
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51106
Poly(A)SigmaP9403nielubiany w buforze TE (10 mM Tris-Cl pH 8,0 + 1 mM EDTA) do 5 &mikro; g/&mikro; l 
Etanol absolutny (200 proof)Fisher ScientificBP2818-500
DPBS (z CaCl2 i MgCl2)SigmaD8662
0,2 ml 8-paskowe probówki PCRMidSciAVST
8-paskowe nakrętki, kopułkaMidSciAVSTC-N
EZ DNA Metylacja-Lightning KitZymoD5031
ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)Biorad
sondBiorad1863052
Ludzki niemetylowany/metylowany starter/sonda mixLife TechnologiesAH21BH1
EcoR1New England BiolabsR0101L
twin.tec PCR Plate 96, półspódniczkaEppendorf951020346
Zgrzewany foliowy do przekłuwaniaBiorad1814040
PX1 Zgrzewarka do płytek PCRBiorad1814000
QX200 AutoDG Droplet Cyfrowy system PCRBiorad1864101
Automatyczny olej do generowania kropel do sondBiorad186-4110
DG32 Kartridż do automatycznego generatora kropelBiorad186-4108
Końcówki do automatycznego generatora kropelBiorad186-4120
Pojemniki na końcówki do automatycznych kropelBiorad186-4125
C1000 Termocykler dotykowyBiorad1851197
QX200 Czytnik kropelBiorad186-4003
Czytnik kropel ddPCR OilBiorad186-3004
Kontrola bufora 1863024 do

Bibliografia

  1. Lehuen, A., Diana, J., Zaccone, P., Cooke, A. Immune cell crosstalk in type 1 diabetes. Nat. Rev. Immunol. 10 (7), 501-513 (2010).
  2. Sherry, N. A., Tsai, E. B., Herold, K. C. Natural history of beta-cell function in type 1 diabetes. Diabetes. 54, Suppl 2 32-39 (2005).
  3. Maganti, A., Evans-Molina, C., Mirmira, R. From immunobiology to β-cell biology: the changing perspective on type 1 diabetes. Islets. 6 (2), 28778(2014).
  4. Matthews, J. B., Staeva, T. P., Bernstein, P. L., Peakman, M., von Herrath, M. ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group Developing combination immunotherapies for type 1 diabetes: recommendations from the ITN-JDRF Type 1 Diabetes Combination Therapy Assessment Group. Clin. Exp. Immunol. 160 (2), 176-184 (2010).
  5. Human Islet Research Network | HIRN. , Available from: https://hirnetwork.org/ (2016).
  6. Fisher, M. M., Watkins, R. A., et al. Elevations in Circulating Methylated and Unmethylated Preproinsulin DNA in New-Onset Type 1 Diabetes. Diabetes. 64 (11), 3867-3872 (2015).
  7. Husseiny, M. I., Kaye, A., Zebadua, E., Kandeel, F., Ferreri, K. Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death. PLoS ONE. 9 (4), 94591(2014).
  8. Herold, K. C., Usmani-Brown, S., et al. β cell death and dysfunction during type 1 diabetes development in at-risk individuals. J. Clin. Invest. 125 (3), 1163-1173 (2015).
  9. Lehmann-Werman, R., Neiman, D., et al. Identification of tissue-specific cell death using methylation patterns of circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (13), 1826-1834 (2016).
  10. Saiki, R. K., Gelfand, D. H., et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 239 (4839), 487-491 (1988).
  11. Kuroda, A., Rauch, T. A., et al. Insulin gene expression is regulated by DNA methylation. PloS One. 4 (9), 6953(2009).
  12. Akirav, E. M., Lebastchi, J., et al. Detection of β cell death in diabetes using differentially methylated circulating DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (47), 19018-19023 (2011).
  13. Fisher, M. M., Perez Chumbiauca, C. N., Mather, K. J., Mirmira, R. G., Tersey, S. A. Detection of islet β-cell death in vivo by multiplex PCR analysis of differentially methylated DNA. Endocrinology. 154 (9), 3476-3481 (2013).
  14. Patterson, K., Molloy, L., Qu, W., Clark, S. DNA methylation: bisulphite modification and analysis. J. Vis. Exp. (56), (2011).
  15. Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. Methylation-specific PCR unraveled. Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).
  16. Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes. PloS One. 7 (10), 47942(2012).
  17. Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  18. Sozzi, G., Roz, L., et al. Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays. J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

różnicowo zmetylowane DNAcyfrowy PCRśmierć komórek betakonwersja pirosiarczynowaDNA preproinsulinycukrzyca typu 1kwantyfikacja absolutnawolne DNAzmetylowane niezmetylowane
Pomiar różnicowo metylowanych gatunków INS DNA w próbkach surowicy ludzkiej jako biomarker śmierci β komórki wyspy trzustkowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.