Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Summary

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Abstract

Tradycyjne miary wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych opierają się na testach końcowych. Takie testy punktów końcowych wymagają kilku dodatkowych etapów eksperymentalnych przed odczytem, takich jak liza komórek, oznaczanie jednostek tworzących kolonie lub dodawanie odczynników. Podczas wykonywania tysięcy testów, na przykład podczas wysokoprzepustowych badań przesiewowych, wysiłek wymagany w przypadku tego typu testów jest znaczny. Dlatego, aby ułatwić wysokoprzepustowe odkrywanie środków przeciwdrobnoustrojowych, opracowaliśmy test w czasie rzeczywistym, aby jednocześnie zidentyfikować inhibitory wewnątrzkomórkowego wzrostu bakterii i ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. W szczególności wykrywanie wewnątrzkomórkowego wzrostu bakterii w czasie rzeczywistym było możliwe dzięki znakowaniu szczepów przesiewowych bakterii za pomocą operonu luksa bakteryjnego (test 1^{. generacji)} lub fluorescencyjnych reporterów białkowych (test ortogonalny 2^{. generacji).} Nietoksyczny, nieprzepuszczalny dla błony komórkowej, wiążący kwasy nukleinowe barwnik został również dodany podczas początkowej infekcji makrofagów. Barwniki te są wykluczone z żywotnych komórek. Jednak niezdolne do życia komórki gospodarza tracą integralność błony, umożliwiając wnikanie i znakowanie fluorescencyjne jądrowego DNA (kwasu dezoksyrybonukleinowego). Warto zauważyć, że wiązanie DNA wiąże się z dużym wzrostem fluorescencyjnej wydajności kwantowej, która zapewnia oparty na roztworze odczyt śmierci komórki gospodarza. Wykorzystaliśmy ten połączony test do przeprowadzenia wysokoprzepustowego badania przesiewowego w formacie mikropłytki oraz do oceny wzrostu wewnątrzkomórkowego i cytotoksyczności za pomocą mikroskopii. W szczególności środki przeciwdrobnoustrojowe mogą wykazywać synergię, w której łączne działanie dwóch lub więcej środków przeciwdrobnoustrojowych stosowanych razem jest większe niż w przypadku stosowania osobno. Testowanie synergii in vitro przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym jest zwykle ogromnym zadaniem, ponieważ należy ocenić kombinatoryczne permutacje antybiotyków w różnych stężeniach. Okazało się jednak, że nasz test w czasie rzeczywistym w połączeniu ze zautomatyzowaną, cyfrową technologią dozowania umożliwił łatwe testowanie synergii. Korzystając z tych podejść, byliśmy w stanie systematycznie badać działanie dużej liczby środków przeciwdrobnoustrojowych samodzielnie i w połączeniu przeciwko wewnątrzkomórkowemu patogenowi, Legionella pneumophila.

Introduction

Patogeny, które tymczasowo rosną lub przebywają w przedziałach wewnątrzkomórkowych, są trudne do terapeutycznego wyeliminowania. Obligatoryjne lub względnie obligatoryjne patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp., Francisella tularensis i Mycobacterium spp. często wymagają długotrwałych cykli terapii przeciwbakteryjnej w celu wyleczenia, które mogą trwać od miesięcy do nawet lat. Co więcej, patogeny zewnątrzkomórkowe mogą przejściowo zajmować nisze wewnątrzkomórkowe i w ten sposób unikać usuwania przez normalny przebieg terapii przeciwdrobnoustrojowej, a później ....

Protocol

1. Wzrost wewnątrzkomórkowy w czasie rzeczywistym i test cytotoksyczności komórek eukariotycznych

1. Przygotowanie komórek gospodarza (komórki J774A.1)
   1. Hodowla J774A.1 Komórki podobne do makrofagów Mus musculus w zawiesinie w RPMI 1640 z 9% surowicą cielęcą uzupełnioną żelazem. Początkowo pasaż w kolbach do hodowli tkankowych. Po zlaniu się komórek w kolbie do hodowli tkankowej o długości 75^cm2 w 15 ml pożywki, podziel przez zeskrobanie i rozcieńcz do 65 ml tym samym rodzajem pożywki, z czego 15 ml zawraca się do kolby do hodowli tkankowej, a 50 ml przenosi się do kolby z wytrząsarką bakteryjną o pojemności 250 ml.
   2. ....

Results

Test wzrostu wewnątrzkomórkowego mikropłytki

Rysunek 1 przedstawia etapy testu. Pokazane automatyczne kroki można wykonać ręcznie. Jednak przepustowość jest znacznie ułatwiona dzięki systemom obsługi cieczy.

Rysunek 2 pokazuje reprezentatywne wyniki testu mikropłytki z 384 dołkami, podwójnym odczytem, wzrostem wewnątrzkomórkowym w czas.......

Discussion

Opisujemy testy w czasie rzeczywistym do jednoczesnego wykrywania wewnątrzkomórkowego wzrostu bakterii i cytotoksyczności komórek gospodarza. W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, aby zapewnić solidną wydajność testu, musi istnieć wystarczająca separacja spektralna między odczytami bakteryjnymi i cytotoksycznymi. Taka separacja jest nieodłączna dla kombinacji reporterów operonów lucyferazy i fluorescencyjnych barwników wiążących DNA. Jednak w oparciu o nasze doświadczenie (Tabela 1-3

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Komórki J774A.1	Kolekcja kultur typu amerykańskiego	TIB-67	Komórka gospodarza
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego
Ekstrakt drożdżowy, ultrafiltrowany	Becton-Dickinson/Difco	210929	Do wytwarzania buforowanego agaru z ekstraktem drożdżowym z węgla drzewnego i buforowanego ekstraktu drożdżowego; niższe stopnie mogą powodować upośledzenie wzrostu i/lub zmianę wrażliwości Legionelli na inhibitory wzrostu
Kwas alfa-ketoglutarowy, sól monopotasowa	Sigma-Aldrich	K2000	Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego Pożywka
Pirogronian sodu	Sigma-Aldrich	P5280	Do wytwarzania buforowanego agaru z ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego i buforowanego ekstraktu drożdżowego
Fosforan potasu, dwuzasadowy	Thermo Fisher Scientific	P288-500	Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego
L-cysteina	Sigma-Aldrich	C-7755	Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu
drożdżowegoCytrynian amonu żelaza(III)	Sigma-Aldrich	F5879	Do wytwarzania buforowanego agaru z ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego i buforowanego ekstraktu drożdżowego; zamiast tego można użyć pirofosforanu żelaza, ale jest on trudniejszy do dokładnego zważenia
Roztwór wodorotlenku potasu, skoncentrowany	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego
Woda odonionowana	Nie dotyczy		Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego
Tymidyna (klasa hodowli tkankowej)	Sigma-Aldrich	T1895	Do uzupełniania zarówno RPMI 1640, jak i buforowanego ekstraktu drożdżowego agar / pożywka i mdash; niższa klasa tymidyny może być stosowana do tego ostatniego, ale może powodować upośledzenie wzrostu komórek i/lub śmierć komórek w RPMI 1640
RPMI 1640, standardowa formuła	Corning przez Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	Do hodowli komórek J774A.1 przed posiewem; zawiera 2 mM L-glutaminy
RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej	Corning przez Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	Do posiewania komórek J774A.1 w szalkach 384 dołków (nie nadaje się do wzrostu przed posiewem); brakuje również L-glutaminy — uzupełnienie do 2 mM przed użyciem
L-glutamina, 200 mM w 0,85% NaCl (klasa hodowli tkankowej)	HyClone przez Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	Do uzupełnienia RPMI 1640 pozbawionego L-glutaminy, do 2 mM stężenie końcowe
Surowica cielęca uzupełniona żelazem	Gemini Bioproducts	100-510	Do uzupełnienia RPMI 1640, do 9,1% stężenia końcowego
Roztwór błękitu trypanowego	Sigma-Aldrich	T8154	Do barwienia J774A.1 oznaczanie śmierci komórek podczas zliczania gęstości komórek
SYTOX Green, 5 mM roztwór w DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	Do barwienia w celu określenia śmierci komórki J774A.1 za pomocą odczytu fluorescencji lub mikroskopii epifluorescencyjnej (w połączeniu z bakteriami fluorescencyjnymi pomarańczowo-czerwonymi lub dalekiej czerwieni). Stosować przy stężeniu końcowym 125 nM.
Inkubator do hodowli komórkowych	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	Do inkubacji komórek J774A.1 (zarówno przed, jak i po zakażeniu); może być również używany do inkubacji bakterii lub zamiast niego można użyć inkubatora ze standardową atmosferą)
Wytrząsarka orbitalna	BellCo Glass	7744-01010	Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed zakażeniem; mieści się w inkubatorze do hodowli komórkowych; zawiera podstawę wytrząsarki 7744-01000 i tacę 7740-01010 (są one również dostępne osobno)
Kolby do wytrząsania (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed infekcją
Zaciski wytrząsarskie do kolb (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed zakażeniem
Kolby wytrząsające (1,000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed zakażeniem
Zaciski wytrząsające do kolb (1,000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed zakażeniem
Nasadki z pianki gąbczastej do kolb (250 ml-1,000 ml)	ChemGlass Nauki przyrodnicze	CLS-1490-038	Do inkubacji wytrząsania komórek J774A.1 przed zakażeniem; zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia w porównaniu ze standardowymi nasadkami metalowymi
Programowalna wielokanałowa pompa perystaltyczna MultiDrop Combi	Thermo Fisher Scientific	5840300	Do dozowania komórek J774A.1, pożywki i zawiesiny bakteryjnej zawierającej fluorofory do dużej liczby naczyń 384 dołków
Standardowy kolektor wiertniczy Combi	Thermo Fisher Scientific	24072670	Domyślna objętość dozowania wstępnego 20 μ l jest niewystarczający do skompensowania osiadania — wzrost do 80 i #956; l
Białe 384 dobrze naczynia poddane hodowli tkankowej	Corning	3570	Do odczytu luminescencji i fluorescencji; Katalog Greiner # 781080 również pomyślnie przetestowany
DMSO (klasa hodowli tkankowej, w szczelnie zamkniętych ampułkach)	Sigma-Aldrich	D2650	Do rozpuszczania kontroli pozytywnej i związków testowych
Azytromycyna	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antybiotykowa kontrola pozytywna
Saponina (z kory Quillaja)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cytoksyczność kontrola dodatnia
Pipetor	wielokanałowyPipeta Thermo Fisher Scientific	Do	przenoszenia ustalonych ilości związków kontroli dodatniej; pipetor musi być wyposażony w cyfrowe dozowanie z zapadkami, aby umożliwić powtarzalne dozowanie o stałej objętości
Robot do przenoszenia pinów	Epson Epson/ICCB-L	(wyposażenie niestandardowe)	Do transferu stałych ilości związków testowych z tablic bibliotecznych
Cyfrowy system dozowania D300	Hewlett-Packard przez Tecan	D300	Do przenoszenia zmiennych ilości badanych związków w zakresie od 11 pikolilitrów do 10 &mikro; l
Wkłady T8+ do cyfrowego systemu dozowania D300	Hewlett-Packard przez Tecan	T8+	Do dozowania związków testowych
Mikroskop epifluorescencyjny z podłączoną do komputera kamerą cyfrową	Nikon	Ti	Do obrazowania żywych komórek; każdy standardowy mikroskop fluorescencyjny może zastąpić, z kontrastem fazowym lub optyką DIC, zdolny do obrazowania fluorescencji zielonej (fluoresceina), pomarańczowo-czerwonej do czerwonej (Texas Red) i dalekiej czerwonej (Cy5) fluorescencji, olejem 100X cel dla najwyższej rozdzielczości
Naczynia do hodowli tkankowych ze szklanym dnem	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	Do obrazowania żywych komórek. Anteny takie jak MatTek umożliwiają wizualizację mikroskopową przy powiększeniu 600X lub 1,000X dzięki zastosowaniu odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego. Te specyficzne naczynia mają średnicę nominalną 3,5 cm, średnicę wewnętrzną 3,3 cm, z szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 20 mm o grubości #1,5 włożonymi w dno.
Photoshop, CS6	Adobe		, Adobe Photoshop lub podobne programy mogą być używane do pseudokolorowania i scalania jasnych, mikroskopijnych i fluorescencyjnych obrazów.
Mathematica 10	Wolfam		Do generowania dwuwymiarowych izokonturów izokonturowych i trójwymiarowych izokonturów powierzchniowych.