Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Podsumowanie

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Streszczenie

Tradycyjne miary wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych opierają się na testach końcowych. Takie testy punktów końcowych wymagają kilku dodatkowych etapów eksperymentalnych przed odczytem, takich jak liza komórek, oznaczanie jednostek tworzących kolonie lub dodawanie odczynników. Podczas wykonywania tysięcy testów, na przykład podczas wysokoprzepustowych badań przesiewowych, wysiłek wymagany w przypadku tego typu testów jest znaczny. Dlatego, aby ułatwić wysokoprzepustowe odkrywanie środków przeciwdrobnoustrojowych, opracowaliśmy test w czasie rzeczywistym, aby jednocześnie zidentyfikować inhibitory wewnątrzkomórkowego wzrostu bakterii i ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. W szczególności wykrywanie wewnątrzkomórkowego wzrostu bakterii w czasie rzeczywistym było możliwe dzięki znakowaniu szczepów przesiewowych bakterii za pomocą operonu luksa bakteryjnego (test 1^{. generacji)} lub fluorescencyjnych reporterów białkowych (test ortogonalny 2^{. generacji).} Nietoksyczny, nieprzepuszczalny dla błony komórkowej, wiążący kwasy nukleinowe barwnik został również dodany podczas początkowej infekcji makrofagów. Barwniki te są wykluczone z żywotnych komórek. Jednak niezdolne do życia komórki gospodarza tracą integralność błony, umożliwiając wnikanie i znakowanie fluorescencyjne jądrowego DNA (kwasu dezoksyrybonukleinowego). Warto zauważyć, że wiązanie DNA wiąże się z dużym wzrostem fluorescencyjnej wydajności kwantowej, która zapewnia oparty na roztworze odczyt śmierci komórki gospodarza. Wykorzystaliśmy ten połączony test do przeprowadzenia wysokoprzepustowego badania przesiewowego w formacie mikropłytki oraz do oceny wzrostu wewnątrzkomórkowego i cytotoksyczności za pomocą mikroskopii. W szczególności środki przeciwdrobnoustrojowe mogą wykazywać synergię, w której łączne działanie dwóch lub więcej środków przeciwdrobnoustrojowych stosowanych razem jest większe niż w przypadku stosowania osobno. Testowanie synergii in vitro przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym jest zwykle ogromnym zadaniem, ponieważ należy ocenić kombinatoryczne permutacje antybiotyków w różnych stężeniach. Okazało się jednak, że nasz test w czasie rzeczywistym w połączeniu ze zautomatyzowaną, cyfrową technologią dozowania umożliwił łatwe testowanie synergii. Korzystając z tych podejść, byliśmy w stanie systematycznie badać działanie dużej liczby środków przeciwdrobnoustrojowych samodzielnie i w połączeniu przeciwko wewnątrzkomórkowemu patogenowi, Legionella pneumophila.

Wprowadzenie

Patogeny, które tymczasowo rosną lub przebywają w przedziałach wewnątrzkomórkowych, są trudne do terapeutycznego wyeliminowania. Obligatoryjne lub względnie obligatoryjne patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp., Francisella tularensis i Mycobacterium spp. często wymagają długotrwałych cykli terapii przeciwbakteryjnej w celu wyleczenia, które mogą trwać od miesięcy do nawet lat. Co więcej, patogeny zewnątrzkomórkowe mogą przejściowo zajmować nisze wewnątrzkomórkowe i w ten sposób unikać usuwania przez normalny przebieg terapii przeciwdrobnoustrojowej, a później pojawiają się, aby rozpocząć nowe rundy zjadliwej infekcji. Zakażenia Staphylococcus aureus¹ i uropatogenne Enterobacteriaceae^2,3 to dwa coraz częściej rozpoznawane przykłady. Dlatego podstawowym celem odkrywania leków jest identyfikacja nowych środków przeciwdrobnoustrojowych, które przenikają do przedziałów wewnątrzkomórkowych. Szczególnie pożądana jest optymalna terapia w celu szybkiego wyeliminowania organizmów wewnątrzkomórkowych i zapobieżenia rozwojowi oporności poprzez subhamującą ekspozycję na środki przeciwdrobnoustrojowe.

W tym celu opracowaliśmy technologię wysokoprzepustowych badań przesiewowych, aby zidentyfikować wewnątrzkomórkowe środki przeciwdrobnoustrojowe ukierunkowane na wewnątrzkomórkowy wzrost modelowego patogenu, Legionella pneumophila. ⁴ Wcześniejsze obserwacje kliniczne wskazują, że standardowe testy wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe nie pozwalały dokładnie przewidzieć skuteczności terapeutycznej in vivo przeciwko temu organizmowi. ⁵ Wynikało to w szczególności z faktu, że główne klasy środków przeciwdrobnoustrojowych, takich jak β-laktamy i aminoglikozydy, chociaż wysoce skuteczne przeciwko bakterii Legionella hodowanej w osi, nie przenikają w wystarczającym stopniu do przedziałów wewnątrzkomórkowych, w których znajduje się Legionella. ^5,6 Późniejsze dowody sugerowały, że technicznie bardziej złożone testy wzrostu wewnątrzkomórkowego skutecznie przewidywały skuteczność kliniczną. ⁷ Niestety, testy te były niezwykle pracochłonnymi testami końcowymi, wymagającymi lizy zakażonych makrofagów, traktowanych środkami przeciwdrobnoustrojowymi, w różnych punktach czasowych w celu zliczenia jednostek tworzących kolonie. Takie testy są niepraktyczne do wykonania na dużą skalę i nie nadają się do wysokoprzepustowego odkrywania leków.

Dlatego opracowaliśmy technologię do określania wzrostu bakterii wewnątrzkomórkowych w czasie rzeczywistym. ⁶ Osiągnięto to dzięki zastosowaniu szczepu bakteryjnego zmodyfikowanego przez integrację operonu⁸ lucyferazy bakteryjnej (test pierwszej generacji, opisany wcześniej)⁴ lub reporterów białka fluorescencyjnego⁹ (druga generacja, test ortogonalny, opisany tutaj) z chromosomem bakteryjnym. W ten sposób sygnał luminescencyjny lub fluorescencyjny zapewnia zastępczy odczyt liczby bakterii w czasie rzeczywistym.

Jednak te atrybuty nie rozwiązują głównego problemu w testach infekcji wewnątrzkomórkowych, niezamierzonego wpływu na komórki gospodarza. W szczególności śmierć komórki gospodarza z natury ogranicza wzrost wewnątrzkomórkowy i prowadzi do fałszywie dodatniej identyfikacji działania przeciwdrobnoustrojowego. Ponieważ wiele związków w bibliotekach przesiewowych jest toksycznych dla komórek eukariotycznych, takie fałszywie dodatnie wyniki przytłoczyłyby prawdziwe środki przeciwdrobnoustrojowe, co wymagałoby dużej liczby kontrolnych testów cytotoksyczności w punkcie końcowym w celu rozwiązania problemu.

Dlatego bardzo interesujące było możliwość jednoczesnej oceny żywotności komórek eukariotycznych i wzrostu wewnątrzkomórkowego. Warto zauważyć, że cechą niezdolnych do życia komórek eukariotycznych jest utrata integralności błony komórkowej. Sondy, które badają przepuszczalność błony komórkowej, mogą być zatem wykorzystywane do oceny żywotności komórek. Wcześniej scharakteryzowaliśmy zdolność serii przypuszczalnie nieprzepuszczalnych dla błony komórkowej, fluorescencyjnych barwników wiążących DNA do uzyskiwania dostępu i barwienia jądrowego DNA martwych komórek. ⁴ Po związaniu jądrowego DNA barwniki te wykazują duży wzrost wydajności fluorescencji kwantowej, co skutkuje zwiększonym sygnałem w stosunku do fluorescencji roztworu tła. W związku z tym barwniki te zapewniły ilościowy odczyt śmierci komórek eukariotycznych. ⁴ W szczególności stwierdziliśmy, że kilka z nich było nietoksycznych podczas długotrwałej koinkubacji z makrofagami J774. Po dodaniu podczas początkowej infekcji zapewniały one fluorescencyjny odczyt śmierci komórek eukariotycznych w czasie rzeczywistym, który można zmierzyć za pomocą fluorymetru na mikropłytkach lub obserwować pod mikroskopem.

Dlatego też, łącząc użycie bakteryjnego reportera i nietoksycznych, nieprzepuszczalnych dla błony, wiążących DNA barwników, byliśmy w stanie opracować prosty, nieniszczący test w czasie rzeczywistym do jednoczesnego pomiaru zarówno obciążenia bakteryjnego, jak i cytotoksyczności komórek eukariotycznych. Ten test pozwolił nam na badanie przesiewowe w formacie płytki 384-dołkowej ~ 10 000 znanych substancji bioaktywnych, w tym ~250 środków przeciwdrobnoustrojowych i > 240 000 małych cząsteczek o funkcjonalnie niescharakteryzowanej aktywności pod kątem zdolności do hamowania wewnątrzkomórkowego wzrostu Legionella pneumophila, jednocześnie generując dane dotyczące cytotoksyczności komórek eukariotycznych dla każdego związku. ⁶ Nasza analiza znanych środków przeciwdrobnoustrojowych przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi bakterii Legionella była jak dotąd najbardziej wszechstronnym badaniem tego typu. ⁶

Opierając się na skuteczności naszego formatu testu, następnie zbadaliśmy również potencjalnie synergiczne efekty znanych środków przeciwdrobnoustrojowych stosowanych w połączeniu. Jeden z najczęstszych testów synergii, tak zwany test szachownicy, jest standardowo wykonywany poprzez ocenę efektów kombinatorycznych dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń dwóch lub więcej środków przeciwdrobnoustrojowych. ¹⁰ W tych testach synergię definiuje się poprzez zaobserwowanie większego efektu, gdy dwa lub więcej środków przeciwdrobnoustrojowych jest stosowanych razem, niż suma skutków każdego z nich zastosowanych oddzielnie. Warto zauważyć, że do tej pory przeprowadzano tylko ukierunkowane i selektywne testy synergiczne przeciwko wewnątrzkomórkowej Legionella pneumophila ze względu na ogromny wysiłek związany z tradycyjnymi testami końcowymi pomnożonymi przez wymagane permutacje kombinatoryczne.

Aby ułatwić testowanie synergii, wykorzystaliśmy nasz test wzrostu wewnątrzkomórkowego/cytotoksyczności eukariotycznej w czasie rzeczywistym w połączeniu z automatyczną technologią cyfrowego dozowania⁶. Ta automatyzacja pozwoliła nam na dozowanie seryjnych rozcieńczeń związków rozpuszczonych w DMSO lub roztworze wodnym samodzielnie lub w połączeniu w formacie 384-dołkowym. ¹¹ Co więcej, tak solidna technologia obsługi cieczy pozwoliła nam z łatwością wykonać kombinacje rozcieńczeń o wyższej rozdzielczości, pierwiastku kwadratowym z dwóch (zamiast standardowego, o niższej rozdzielczości, podwajającego) rozcieńczenia, aby osiągnąć wyższe poziomy swoistości w naszej dwuwymiarowej analizie synergii w szachownicę. Rezolucja ta była szczególnie cenna w rozwianiu obaw w dziedzinie synergii dotyczących odtwarzalności w przypadku stosowania serii rozcieńczeń^{dwukrotnych 12}. Wreszcie, nasz test był ilościowy, a zatem mierzył również gradacje hamowania. W rezultacie, test uchwycił całość informacji hamujących, wyrażalnych w izokonturowych izobologramach, w których izokontury łączą stężenia kombinatoryczne o podobnych poziomach zahamowania wzrostu. ⁶ Ta strategia kreślenia pozwoliła na wizualizację kombinatorycznych krzywych dawka-odpowiedź. Aby zilustrować naszą metodologię, opisujemy nasz protokół wykonywania tych testów i pokazujemy reprezentatywne wyniki.

Protokół

1. Analiza wzrostu wewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym i test cytotoksyczności komórek eukariotycznych

1. Przygotowanie komórek gospodarza (komórki J774A.1)
   1. Hodowla J774A.1 Mus musculus komórki macrofagopodobne w zawiesinie w pożywce RPMI 1640 z 9% płodowej surowicy cielęcej uzupełnionej o żelazo. Początkowo pasażować w kolbach do hodowli tkankowych. Po osiągnięciu przez komórki konfluencji w kolbie o powierzchni 75 cm²² kolba do hodowli tkankowych w 15 ml pożywki, rozdzielona poprzez skrobanie i rozcieńczenie do 65 ml tym samym rodzajem pożywki, z czego 15 ml przeniesiono z powrotem do kolby do hodowli tkankowej, a 50 ml przeniesiono do 250 ml bakteryjnej kolby inkubacyjnej z wytrząsaniem.
   2. W celu zwiększenia skali hodowlę prowadzić w zawiesinie w kolbach bakteriologicznych o pojemności 250 ml i/lub 1000 ml, wypełnionych w jednej piątej objętości pożywką do hodowli tkankowych. Napowietrzanie zapewnić poprzez ustawienie prędkości obrotowej na około 120 obrotów na minutę. Aby zapewnić jednolity wzrost, inkubować przy stężeniu CO2 dokładnie 5%.₂ i 37 °C.
   3. Zbierz komórki, gdy osiągną gęstość w zakresie 2,5 x 10⁶ komórek/ml do 5 x 10⁶ komórek/ml. Należy upewnić się, że odsetek martwych komórek (najłatwiej ocenić za pomocą barwienia błękitem trypanu) nie przekracza 25%, ponieważ martwe komórki zwiększą szum tła w testach cytotoksyczności.
   4. Przenieść do białych, traktowanych do hodowli tkankowych mikropłytek 384-dołkowych w zagęszczeniu 5 x 10⁴ komórki J774A.1 w 30 µl pożywki do hodowli tkankowych na każdą studzienkę. Inkubować mikropłytki przez noc, aby w dniu eksperymentu uzyskać 90% konfluencji.
2. Przygotowanie próbek luminescencyjnych lub fluorescencyjnych Legionella pneumophila
   1. Przejście L. pneumophila (Lp02::flaA::lux)⁸) bakterie na odpowiednim podłożu, t. j., podłoże buforowany ekstrakt drożdżowy z węglem aktywnym (BCYE). W przypadku użycia szczepu auksotroficznego względem tymidyny, uzupełnić podłoże o 100 µg/ml tymidyna. Przygotuj plamy bakterii do eksperymentów, gęsto nakładając organizmy na nową płytkę BCYE i inkubując je przez jeden dzień (jeśli pochodzą z poprzedniego pasażu na płytce) lub od dwóch do trzech dni (jeśli pochodzą z zamrożonego banku), aby uzyskać wzrost zlewający się.
      1. Przygotować płytki BCYE, rozpuszczając 10 g ekstraktu drożdżowego, 10 g Nkwas -(2-acetamido)-2-aminoetanosulfonowy, 0,35 g K₂HPO₄oraz 1 g jednobazowego $\alpha$-ketoglutaranu potasu w 950 ml wody dejonizowanej. Dostosować pH do wartości 6,9 za pomocą wodorotlenku potasu ($\ge 2,5$ ml roztworu 11,9 M).
      2. Dodać 15 g agaru i 2 g węgla aktywnego, a następnie dopełnić do objętości końcowej 1 L. Włożyć mieszadło magnetyczne i wysterylizować w autoklawie. Schłodzić pożywkę do 55 °C następnie dodać roztwory sterylizowane przez filtr, zawierające 0,4 g L-cysteiny oraz 0,42 g cytrynianu amonu i żelaza(III) rozpuszczonych w wodzie dejonizowanej. Przed wylaniem na szalki Petriego wymieszać roztwór za pomocą mieszadła magnetycznego.
      3. Do badania L. pneumophila wzrost w aksenicznym medium hodowlanym, przygotować bulion ACES-ekstrakt drożdżowy (AYE), łącząc wszystkie odczynniki chemiczne stosowane do BCYE z wyjątkiem węgla drzewnego i agaru. Poddaj sterylizacji przez filtrowanie i użyj niezwłocznie lub zamroź do późniejszych eksperymentów.
   2. Resuspender organizmy w tym samym medium do hodowli tkankowej, którego użyto dla komórek J774A.1, za pomocą 100 µg/ml suplementacja tymidyną w razie potrzeby.
3. Infekcja makrofagów
   1. Należy dodać interesujące związki testowe (związki przesiewowe oraz kontrole pozytywne i negatywne w zakresie hamowania wzrostu bakterii i lizy komórek eukariotycznych). Zaleca się rozpuszczenie roztworów zapasowych w stężeniu ≥500x w DMSO (dimetylosulfoksydzie) lub roztworze wodnym, aby umożliwić odpowiednie rozcieńczenie nośnika.
      1. Chociaż roztwory zapasowe można przechowywać w stanie zamrożonym, należy unikać cykli zamrażania i rozmrażania w przypadku związków labilnych oraz środków przeciwdrobnoustrojowych.
   2. Rozcieńczyć bakterie luminescencyjne do wartości docelowej 2,5 x 10⁶ CFU (jednostka tworząca kolonię)/m oraz bakterie znakowane fluorescencyjnym reporterem do 1,0 x 10⁷ CFU/ml w pożywce do hodowli tkankowych, a następnie dodać odpowiedni nietoksyczny, nieprzenikający przez błonę barwnik wiążący kwasy nukleinowe w stężeniu 2,5x stężenia końcowego w teście.
   3. Dodaj 20 µl mieszaniny do każdej studzienki z hodowlą J774A.1, końcowa objętość analizy 50 µl, końcowe stężenie bakterii 1 x 10⁶ JTK/ml (reporter operonu lux) lub 4 x 10 10⁶ Jtk/ml (reporter białka fluorescencyjnego).
   4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1–3 dni w 5% CO2₂ przy 100% wilgotności względnej, aby zapobiec efektowi brzegowemu wynikającemu z odparowywania.
4. Odczyt analizy
   1. Odczytać wzrost bakterii oraz toksyczność komórek eukariotycznych przy użyciu luminometru i fluorymetru do mikropłytek, odpowiednio do stosowanych genów reporterowych.
      1. Aby uniknąć efektów brzegowych związanych z temperaturą, przed pomiarem luminescencji należy wyrównać temperaturę mikropłytek, umieszczając je w jednej warstwie na blacie laboratoryjnym z uchylonymi pokrywkami przez około 20 minut (lub w komorze z laminarnym przepływem powietrza bez pokrywek przez około 10 minut).
   2. Wrócić mikroplatek do inkubatora, jeśli pożądany jest odczyt w czasie rzeczywistym w późniejszych punktach czasowych.

2. Analiza danych

1. Znormalizuj dane względem kontroli pozytywnej i negatywnej, aby obliczyć procent lub krotność hamowania wzrostu bakterii wewnątrzkomórkowych oraz procent cytotoksyczności dla komórek eukariotycznych.
2. W celu oceny odporności testu oblicz statystyczną separację między kontrolami pozytywną i negatywną zarówno dla hamowania wzrostu bakterii, jak i cytotoksyczności, stosując analizę współczynnika Z (Z'), gdzie Z' = 1 - 3(σ_p + σ_n)/|µ_p + µ_n|. W tym równaniu σ_p i σ_n to odpowiednio odchylenia standardowe dla studzienek kontroli pozytywnej i negatywnej; µ_p i µ_n to odpowiednio wartości średnie dla studzienek kontroli pozytywnej i negatywnej.
   1. W przypadku testów przesiewowych wysokoprzepustowych oblicz standardowe wyniki z (z-scores) (lub inne alternatywne, ilościowe miary statystyczne), aby ocenić działanie badanych związków. Alternatywnie oblicz prostą krotność redukcji lub logarytmiczną krotność redukcji jako potencjalnie bardziej istotną fizjologicznie miarę wielkości efektu dla bakterii replikujących się geometrycznie.

3. Jednowymiarowe i wielowymiarowe (t. j., Synergia) Badanie zależności dawka-odpowiedź i interpretacja danych

1. Przygotować makrofagi i bakterie zgodnie z opisem w sekcji 1 protokołu.
2. Bezpośrednio przed zakażeniem lub inkubacją akseniczną dodać badane środki przeciwdrobnoustrojowe w seryjnym szeregu rozcieńczeń dwukrotnych, tak aby zakres stężeń obejmował w górnej granicy stężenie całkowicie hamujące wzrost (tj. minimalne stężenie hamujące lub MIC) oraz w dolnej granice stężenie niewykazujące widocznej aktywności.
3. Aby ułatwić konfigurację testów pojedynczej odpowiedzi na dawkę oraz testów synergii kombinowanej, należy zastosować zautomatyzowany system dozowania cieczy, przeprowadzając bezpośrednie, zautomatyzowane dodawanie rozcieńczeń środków przeciwdrobnoustrojowych zgodnie z protokołem producenta.
4. W celu zwiększenia dokładności i powtarzalności danych należy rozważyć zastosowanie rozcieńczeń niebinarnych, na przykład serii rozcieńczeń -krotnych oraz powtórzenia analiz.
5. W przypadku zakażenia makrofagów rozcieńczyć luminescencyjne bakterie do wartości docelowej 2,5 x 10⁶ CFU (jednostek tworzących kolonie)/ml w pożywce do hodowli tkankowych. Dodać 20 µl mieszaniny do każdej studni z hodowlą J774A.1, tak aby końcowa objętość analizy wynosiła 50 µl, a końcowe stężenie bakterii 1 x 10⁶ CFU/ml; inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂ przy 100% wilgotności względnej.
   1. W celu przetestowania wzrostu aksenicznego rozcieńczyć luminescencyjne bakterie do końcowego stężenia 1 x 10⁶ CFU/ml w pożywce AYE, dodać 50 µl do każdej studni płytki 384-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂ przy 100% wilgotności względnej.
6. Obliczyć indeks frakcyjnego stężenia hamującego dla kombinacji środków przeciwdrobnoustrojowych, które hamują wzrost bakterii. Dla każdego leku w kombinacji (a, b, . . n), który powoduje całkowite lub >99% hamowanie wzrostu bakterii, obliczyć indywidualne frakcyjne stężenie hamujące (FIC_{a, b, . . n.}) w następujący sposób: FIC_a = stężenie związku „a” podzielone przez minimalne stężenie hamujące związku „a” stosowanego samodzielnie._. Korzystając z tej samej formuły, obliczyć FIC_b, itd. Następnie obliczyć kombinacyjny indeks FIC lub  FIC = FIC_a + FIC_b + . . .FIC_n dla każdej kombinacji hamującej.
   1. Do oceny synergii należy użyć indeksu kombinacyjnego, który najbardziej odbiega od wartości 1,0. Wartość ≤0,5 należy uznać za konserwatywny wskaźnik efektu synergistycznego, a wartość ≥4 za efekt antagonistyczny.¹²
   2. Sporządzić izobologramy, izobologramy izokonturowe i/lub izobologramy izopowierzchniowe⁶ jako alternatywne graficzne przedstawienia efektów kombinowanych.

Wyniki

Test wzrostu wewnątrzkomórkowego na mikropłytkach

Rycina 1 przedstawia schemat etapów analizy. Przedstawione zautomatyzowane kroki można wykonać ręcznie. Jednakże przepustowość jest znacznie zwiększona przy zastosowaniu systemów do obsługi cieczy.

Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne wyniki z 384-dołkowej mikropłytki w teście wzrostu ...

Dyskusja

Opisujemy testy w czasie rzeczywistym do jednoczesnego wykrywania wewnątrzkomórkowego wzrostu bakterii i cytotoksyczności komórek gospodarza. W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, aby zapewnić solidną wydajność testu, musi istnieć wystarczająca separacja spektralna między odczytami bakteryjnymi i cytotoksycznymi. Taka separacja jest nieodłączna dla kombinacji reporterów operonów lucyferazy i fluorescencyjnych barwników wiążących DNA. Jednak w oparciu o nasze doświadczenie (Tabela 1-3

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórki J774A.1	Kolekcja kultur typu amerykańskiego	TIB-67	Komórka gospodarza
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego
Ekstrakt drożdżowy, ultrafiltrowany	Becton-Dickinson/Difco	210929	Do wytwarzania buforowanego agaru z ekstraktem drożdżowym z węgla drzewnego i buforowanego ekstraktu drożdżowego; niższe stopnie mogą powodować upośledzenie wzrostu i/lub zmianę wrażliwości Legionelli na inhibitory wzrostu
Kwas alfa-ketoglutarowy, sól monopotasowa	Sigma-Aldrich	K2000	Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego Pożywka
Pirogronian sodu	Sigma-Aldrich	P5280	Do wytwarzania buforowanego agaru z ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego i buforowanego ekstraktu drożdżowego
Fosforan potasu, dwuzasadowy	Thermo Fisher Scientific	P288-500	Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego
L-cysteina	Sigma-Aldrich	C-7755	Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu
drożdżowegoCytrynian amonu żelaza(III)	Sigma-Aldrich	F5879	Do wytwarzania buforowanego agaru z ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego i buforowanego ekstraktu drożdżowego; zamiast tego można użyć pirofosforanu żelaza, ale jest on trudniejszy do dokładnego zważenia
Roztwór wodorotlenku potasu, skoncentrowany	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego
Woda odonionowana	Nie dotyczy		Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego
Tymidyna (klasa hodowli tkankowej)	Sigma-Aldrich	T1895	Do uzupełniania zarówno RPMI 1640, jak i buforowanego ekstraktu drożdżowego agar / pożywka i mdash; niższa klasa tymidyny może być stosowana do tego ostatniego, ale może powodować upośledzenie wzrostu komórek i/lub śmierć komórek w RPMI 1640
RPMI 1640, standardowa formuła	Corning przez Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	Do hodowli komórek J774A.1 przed posiewem; zawiera 2 mM L-glutaminy
RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej	Corning przez Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	Do posiewania komórek J774A.1 w szalkach 384 dołków (nie nadaje się do wzrostu przed posiewem); brakuje również L-glutaminy — uzupełnienie do 2 mM przed użyciem
L-glutamina, 200 mM w 0,85% NaCl (klasa hodowli tkankowej)	HyClone przez Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	Do uzupełnienia RPMI 1640 pozbawionego L-glutaminy, do 2 mM stężenie końcowe
Surowica cielęca uzupełniona żelazem	Gemini Bioproducts	100-510	Do uzupełnienia RPMI 1640, do 9,1% stężenia końcowego
Roztwór błękitu trypanowego	Sigma-Aldrich	T8154	Do barwienia J774A.1 oznaczanie śmierci komórek podczas zliczania gęstości komórek
SYTOX Green, 5 mM roztwór w DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	Do barwienia w celu określenia śmierci komórki J774A.1 za pomocą odczytu fluorescencji lub mikroskopii epifluorescencyjnej (w połączeniu z bakteriami fluorescencyjnymi pomarańczowo-czerwonymi lub dalekiej czerwieni). Stosować przy stężeniu końcowym 125 nM.
Inkubator do hodowli komórkowych	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	Do inkubacji komórek J774A.1 (zarówno przed, jak i po zakażeniu); może być również używany do inkubacji bakterii lub zamiast niego można użyć inkubatora ze standardową atmosferą)
Wytrząsarka orbitalna	BellCo Glass	7744-01010	Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed zakażeniem; mieści się w inkubatorze do hodowli komórkowych; zawiera podstawę wytrząsarki 7744-01000 i tacę 7740-01010 (są one również dostępne osobno)
Kolby do wytrząsania (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed infekcją
Zaciski wytrząsarskie do kolb (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed zakażeniem
Kolby wytrząsające (1,000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed zakażeniem
Zaciski wytrząsające do kolb (1,000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed zakażeniem
Nasadki z pianki gąbczastej do kolb (250 ml-1,000 ml)	ChemGlass Nauki przyrodnicze	CLS-1490-038	Do inkubacji wytrząsania komórek J774A.1 przed zakażeniem; zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia w porównaniu ze standardowymi nasadkami metalowymi
Programowalna wielokanałowa pompa perystaltyczna MultiDrop Combi	Thermo Fisher Scientific	5840300	Do dozowania komórek J774A.1, pożywki i zawiesiny bakteryjnej zawierającej fluorofory do dużej liczby naczyń 384 dołków
Standardowy kolektor wiertniczy Combi	Thermo Fisher Scientific	24072670	Domyślna objętość dozowania wstępnego 20 μ l jest niewystarczający do skompensowania osiadania — wzrost do 80 i #956; l
Białe 384 dobrze naczynia poddane hodowli tkankowej	Corning	3570	Do odczytu luminescencji i fluorescencji; Katalog Greiner # 781080 również pomyślnie przetestowany
DMSO (klasa hodowli tkankowej, w szczelnie zamkniętych ampułkach)	Sigma-Aldrich	D2650	Do rozpuszczania kontroli pozytywnej i związków testowych
Azytromycyna	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antybiotykowa kontrola pozytywna
Saponina (z kory Quillaja)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cytoksyczność kontrola dodatnia
Pipetor	wielokanałowyPipeta Thermo Fisher Scientific	Do	przenoszenia ustalonych ilości związków kontroli dodatniej; pipetor musi być wyposażony w cyfrowe dozowanie z zapadkami, aby umożliwić powtarzalne dozowanie o stałej objętości
Robot do przenoszenia pinów	Epson Epson/ICCB-L	(wyposażenie niestandardowe)	Do transferu stałych ilości związków testowych z tablic bibliotecznych
Cyfrowy system dozowania D300	Hewlett-Packard przez Tecan	D300	Do przenoszenia zmiennych ilości badanych związków w zakresie od 11 pikolilitrów do 10 &mikro; l
Wkłady T8+ do cyfrowego systemu dozowania D300	Hewlett-Packard przez Tecan	T8+	Do dozowania związków testowych
Mikroskop epifluorescencyjny z podłączoną do komputera kamerą cyfrową	Nikon	Ti	Do obrazowania żywych komórek; każdy standardowy mikroskop fluorescencyjny może zastąpić, z kontrastem fazowym lub optyką DIC, zdolny do obrazowania fluorescencji zielonej (fluoresceina), pomarańczowo-czerwonej do czerwonej (Texas Red) i dalekiej czerwonej (Cy5) fluorescencji, olejem 100X cel dla najwyższej rozdzielczości
Naczynia do hodowli tkankowych ze szklanym dnem	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	Do obrazowania żywych komórek. Anteny takie jak MatTek umożliwiają wizualizację mikroskopową przy powiększeniu 600X lub 1,000X dzięki zastosowaniu odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego. Te specyficzne naczynia mają średnicę nominalną 3,5 cm, średnicę wewnętrzną 3,3 cm, z szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 20 mm o grubości #1,5 włożonymi w dno.
Photoshop, CS6	Adobe		, Adobe Photoshop lub podobne programy mogą być używane do pseudokolorowania i scalania jasnych, mikroskopijnych i fluorescencyjnych obrazów.
Mathematica 10	Wolfam		Do generowania dwuwymiarowych izokonturów izokonturowych i trójwymiarowych izokonturów powierzchniowych.

Nie dotyczy,