Artykuł metodologiczny

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

DOI:

10.3791/54841

⸱

16 listopada 2016

 ,  , 
1Department of Pathology, Beth Israel Deaconess Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tradycyjne miary wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych opierają się na testach końcowych. Takie testy punktów końcowych wymagają kilku dodatkowych etapów eksperymentalnych przed odczytem, takich jak liza komórek, oznaczanie jednostek tworzących kolonie lub dodawanie odczynników. Podczas wykonywania tysięcy testów, na przykład podczas wysokoprzepustowych badań przesiewowych, wysiłek wymagany w przypadku tego typu testów jest znaczny. Dlatego, aby ułatwić wysokoprzepustowe odkrywanie środków przeciwdrobnoustrojowych, opracowaliśmy test w czasie rzeczywistym, aby jednocześnie zidentyfikować inhibitory wewnątrzkomórkowego wzrostu bakterii i ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. W szczególności wykrywanie wewnątrzkomórkowego wzrostu bakterii w czasie rzeczywistym było możliwe dzięki znakowaniu szczepów przesiewowych bakterii za pomocą operonu luksa bakteryjnego (test 1. generacji) lub fluorescencyjnych reporterów białkowych (test ortogonalny 2. generacji). Nietoksyczny, nieprzepuszczalny dla błony komórkowej, wiążący kwasy nukleinowe barwnik został również dodany podczas początkowej infekcji makrofagów. Barwniki te są wykluczone z żywotnych komórek. Jednak niezdolne do życia komórki gospodarza tracą integralność błony, umożliwiając wnikanie i znakowanie fluorescencyjne jądrowego DNA (kwasu dezoksyrybonukleinowego). Warto zauważyć, że wiązanie DNA wiąże się z dużym wzrostem fluorescencyjnej wydajności kwantowej, która zapewnia oparty na roztworze odczyt śmierci komórki gospodarza. Wykorzystaliśmy ten połączony test do przeprowadzenia wysokoprzepustowego badania przesiewowego w formacie mikropłytki oraz do oceny wzrostu wewnątrzkomórkowego i cytotoksyczności za pomocą mikroskopii. W szczególności środki przeciwdrobnoustrojowe mogą wykazywać synergię, w której łączne działanie dwóch lub więcej środków przeciwdrobnoustrojowych stosowanych razem jest większe niż w przypadku stosowania osobno. Testowanie synergii in vitro przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym jest zwykle ogromnym zadaniem, ponieważ należy ocenić kombinatoryczne permutacje antybiotyków w różnych stężeniach. Okazało się jednak, że nasz test w czasie rzeczywistym w połączeniu ze zautomatyzowaną, cyfrową technologią dozowania umożliwił łatwe testowanie synergii. Korzystając z tych podejść, byliśmy w stanie systematycznie badać działanie dużej liczby środków przeciwdrobnoustrojowych samodzielnie i w połączeniu przeciwko wewnątrzkomórkowemu patogenowi, Legionella pneumophila.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patogeny, które tymczasowo rosną lub przebywają w przedziałach wewnątrzkomórkowych, są trudne do terapeutycznego wyeliminowania. Obligatoryjne lub względnie obligatoryjne patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp., Francisella tularensis i Mycobacterium spp. często wymagają długotrwałych cykli terapii przeciwbakteryjnej w celu wyleczenia, które mogą trwać od miesięcy do nawet lat. Co więcej, patogeny zewnątrzkomórkowe mogą przejściowo zajmować nisze wewnątrzkomórkowe i w ten sposób unikać usuwania przez normalny przebieg terapii przeciwdrobnoustrojowej, a później pojawiają się, aby rozpocząć nowe rundy zjadliwej infekcji. Zakażenia Staphylococcus aureus1 i uropatogenne Enterobacteriaceae2,3 to dwa coraz częściej rozpoznawane przykłady. Dlatego podstawowym celem odkrywania leków jest identyfikacja nowych środków przeciwdrobnoustrojowych, które przenikają do przedziałów wewnątrzkomórkowych. Szczególnie pożądana jest optymalna terapia w celu szybkiego wyeliminowania organizmów wewnątrzkomórkowych i zapobieżenia rozwojowi oporności poprzez subhamującą ekspozycję na środki przeciwdrobnoustrojowe.

W tym celu opracowaliśmy technologię wysokoprzepustowych badań przesiewowych, aby zidentyfikować wewnątrzkomórkowe środki przeciwdrobnoustrojowe ukierunkowane na wewnątrzkomórkowy wzrost modelowego patogenu, Legionella pneumophila. 4 Wcześniejsze obserwacje kliniczne wskazują, że standardowe testy wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe nie pozwalały dokładnie przewidzieć skuteczności terapeutycznej in vivo przeciwko temu organizmowi. 5 Wynikało to w szczególności z faktu, że główne klasy środków przeciwdrobnoustrojowych, takich jak β-laktamy i aminoglikozydy, chociaż wysoce skuteczne przeciwko bakterii Legionella hodowanej w osi, nie przenikają w wystarczającym stopniu do przedziałów wewnątrzkomórkowych, w których znajduje się Legionella. 5,6 Późniejsze dowody sugerowały, że technicznie bardziej złożone testy wzrostu wewnątrzkomórkowego skutecznie przewidywały skuteczność kliniczną. 7 Niestety, testy te były niezwykle pracochłonnymi testami końcowymi, wymagającymi lizy zakażonych makrofagów, traktowanych środkami przeciwdrobnoustrojowymi, w różnych punktach czasowych w celu zliczenia jednostek tworzących kolonie. Takie testy są niepraktyczne do wykonania na dużą skalę i nie nadają się do wysokoprzepustowego odkrywania leków.

Dlatego opracowaliśmy technologię do określania wzrostu bakterii wewnątrzkomórkowych w czasie rzeczywistym. 6 Osiągnięto to dzięki zastosowaniu szczepu bakteryjnego zmodyfikowanego przez integrację operonu8 lucyferazy bakteryjnej (test pierwszej generacji, opisany wcześniej)4 lub reporterów białka fluorescencyjnego9 (druga generacja, test ortogonalny, opisany tutaj) z chromosomem bakteryjnym. W ten sposób sygnał luminescencyjny lub fluorescencyjny zapewnia zastępczy odczyt liczby bakterii w czasie rzeczywistym.

Jednak te atrybuty nie rozwiązują głównego problemu w testach infekcji wewnątrzkomórkowych, niezamierzonego wpływu na komórki gospodarza. W szczególności śmierć komórki gospodarza z natury ogranicza wzrost wewnątrzkomórkowy i prowadzi do fałszywie dodatniej identyfikacji działania przeciwdrobnoustrojowego. Ponieważ wiele związków w bibliotekach przesiewowych jest toksycznych dla komórek eukariotycznych, takie fałszywie dodatnie wyniki przytłoczyłyby prawdziwe środki przeciwdrobnoustrojowe, co wymagałoby dużej liczby kontrolnych testów cytotoksyczności w punkcie końcowym w celu rozwiązania problemu.

Dlatego bardzo interesujące było możliwość jednoczesnej oceny żywotności komórek eukariotycznych i wzrostu wewnątrzkomórkowego. Warto zauważyć, że cechą niezdolnych do życia komórek eukariotycznych jest utrata integralności błony komórkowej. Sondy, które badają przepuszczalność błony komórkowej, mogą być zatem wykorzystywane do oceny żywotności komórek. Wcześniej scharakteryzowaliśmy zdolność serii przypuszczalnie nieprzepuszczalnych dla błony komórkowej, fluorescencyjnych barwników wiążących DNA do uzyskiwania dostępu i barwienia jądrowego DNA martwych komórek. 4 Po związaniu jądrowego DNA barwniki te wykazują duży wzrost wydajności fluorescencji kwantowej, co skutkuje zwiększonym sygnałem w stosunku do fluorescencji roztworu tła. W związku z tym barwniki te zapewniły ilościowy odczyt śmierci komórek eukariotycznych. 4 W szczególności stwierdziliśmy, że kilka z nich było nietoksycznych podczas długotrwałej koinkubacji z makrofagami J774. Po dodaniu podczas początkowej infekcji zapewniały one fluorescencyjny odczyt śmierci komórek eukariotycznych w czasie rzeczywistym, który można zmierzyć za pomocą fluorymetru na mikropłytkach lub obserwować pod mikroskopem.

Dlatego też, łącząc użycie bakteryjnego reportera i nietoksycznych, nieprzepuszczalnych dla błony, wiążących DNA barwników, byliśmy w stanie opracować prosty, nieniszczący test w czasie rzeczywistym do jednoczesnego pomiaru zarówno obciążenia bakteryjnego, jak i cytotoksyczności komórek eukariotycznych. Ten test pozwolił nam na badanie przesiewowe w formacie płytki 384-dołkowej ~ 10 000 znanych substancji bioaktywnych, w tym ~250 środków przeciwdrobnoustrojowych i > 240 000 małych cząsteczek o funkcjonalnie niescharakteryzowanej aktywności pod kątem zdolności do hamowania wewnątrzkomórkowego wzrostu Legionella pneumophila, jednocześnie generując dane dotyczące cytotoksyczności komórek eukariotycznych dla każdego związku. 6 Nasza analiza znanych środków przeciwdrobnoustrojowych przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi bakterii Legionella była jak dotąd najbardziej wszechstronnym badaniem tego typu. 6

Opierając się na skuteczności naszego formatu testu, następnie zbadaliśmy również potencjalnie synergiczne efekty znanych środków przeciwdrobnoustrojowych stosowanych w połączeniu. Jeden z najczęstszych testów synergii, tak zwany test szachownicy, jest standardowo wykonywany poprzez ocenę efektów kombinatorycznych dwukrotnych seryjnych rozcieńczeń dwóch lub więcej środków przeciwdrobnoustrojowych. 10 W tych testach synergię definiuje się poprzez zaobserwowanie większego efektu, gdy dwa lub więcej środków przeciwdrobnoustrojowych jest stosowanych razem, niż suma skutków każdego z nich zastosowanych oddzielnie. Warto zauważyć, że do tej pory przeprowadzano tylko ukierunkowane i selektywne testy synergiczne przeciwko wewnątrzkomórkowej Legionella pneumophila ze względu na ogromny wysiłek związany z tradycyjnymi testami końcowymi pomnożonymi przez wymagane permutacje kombinatoryczne.

Aby ułatwić testowanie synergii, wykorzystaliśmy nasz test wzrostu wewnątrzkomórkowego/cytotoksyczności eukariotycznej w czasie rzeczywistym w połączeniu z automatyczną technologią cyfrowego dozowania6. Ta automatyzacja pozwoliła nam na dozowanie seryjnych rozcieńczeń związków rozpuszczonych w DMSO lub roztworze wodnym samodzielnie lub w połączeniu w formacie 384-dołkowym. 11 Co więcej, tak solidna technologia obsługi cieczy pozwoliła nam z łatwością wykonać kombinacje rozcieńczeń o wyższej rozdzielczości, pierwiastku kwadratowym z dwóch (zamiast standardowego, o niższej rozdzielczości, podwajającego) rozcieńczenia, aby osiągnąć wyższe poziomy swoistości w naszej dwuwymiarowej analizie synergii w szachownicę. Rezolucja ta była szczególnie cenna w rozwianiu obaw w dziedzinie synergii dotyczących odtwarzalności w przypadku stosowania serii rozcieńczeńdwukrotnych 12. Wreszcie, nasz test był ilościowy, a zatem mierzył również gradacje hamowania. W rezultacie, test uchwycił całość informacji hamujących, wyrażalnych w izokonturowych izobologramach, w których izokontury łączą stężenia kombinatoryczne o podobnych poziomach zahamowania wzrostu. 6 Ta strategia kreślenia pozwoliła na wizualizację kombinatorycznych krzywych dawka-odpowiedź. Aby zilustrować naszą metodologię, opisujemy nasz protokół wykonywania tych testów i pokazujemy reprezentatywne wyniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wzrost wewnątrzkomórkowy w czasie rzeczywistym i test cytotoksyczności komórek eukariotycznych

  1. Przygotowanie komórek gospodarza (komórki J774A.1)
    1. Hodowla J774A.1 Komórki podobne do makrofagów Mus musculus w zawiesinie w RPMI 1640 z 9% surowicą cielęcą uzupełnioną żelazem. Początkowo pasaż w kolbach do hodowli tkankowych. Po zlaniu się komórek w kolbie do hodowli tkankowej o długości 75cm2 w 15 ml pożywki, podziel przez zeskrobanie i rozcieńcz do 65 ml tym samym rodzajem pożywki, z czego 15 ml zawraca się do kolby do hodowli tkankowej, a 50 ml przenosi się do kolby z wytrząsarką bakteryjną o pojemności 250 ml.
    2. W celu zwiększenia skali, hodowla w zawiesinie w 250 ml i/lub 1 000 ml kolb bakteryjnych wypełnionych do jednej piątej objętości pożywką do hodowli tkankowych. Napowietrzać, ustawiając prędkość obrotową na około 120 obrotów na minutę. Aby uzyskać stały wzrost, inkubować dokładnie w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C.
    3. Zbieraj komórki, gdy osiągną gęstość w zakresie od 2,5 x 106 komórek/ml do 5 x 106 komórek/ml. Upewnij się, że procent martwych komórek (najłatwiej oznaczyć za pomocą barwienia błękitem trypanowym) nie przekracza 25%, ponieważ martwe komórki zwiększą szum tła w testach cytotoksyczności.
    4. Płytka w kolorze białym, poddana działaniu hodowli tkankowej, 384-dołkowe mikropłytki w 5 x 104 komórek J774A.1 w 30 μl pożywki do hodowli tkankowej na basenik. Inkubuj mikropłytki przez noc, aby osiągnąć 90% zbieżności w dniu eksperymentu.
  2. Przygotowanie luminescencyjnej lub fluorescencyjnej Legionella pneumophila
    1. Przejście bakterii L. pneumophila (Lp02::flaA::lux8) na odpowiednim podłożu, tj. buforowanym pożywce z ekstraktem drożdżowym z węgla drzewnego (BCYE). W przypadku stosowania szczepu auksotroficznego tymidyny należy uzupełnić pożywkę 100 μg/ml tymidyny. Przygotuj plamy bakterii do eksperymentów, rozprowadzając organizmy gęsto na nowej płytce BCYE i inkubując jeden dzień (jeśli z poprzedniego przejścia na płytkę) lub dwa do trzech dni (jeśli z zamrożonego bulionu), aby uzyskać zlewny wzrost.
      1. Przygotuj płytki BCYE, rozpuszczając 10 g ekstraktu drożdżowego, 10 g kwasu N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfonowego, 0,35 gK2HPO4 i 1 g jednozasadowego α-ketoglutaranu potasu w 950 ml wody dejonizowanej. Doprowadzić do pH 6,9 za pomocą wodorotlenku potasu (≥2,5 ml roztworu 11,9 molowego).
      2. Dodać 15 g agaru i 2 g węgla aktywnego i doprowadzić do 1 l końcowej objętości. Dodaj mieszadło magnetyczne i autoklaw. Schłodzić podłoże do temperatury 55 °C i dodać wysterylizowane przez filtr roztwory zawierające 0,4 g L-cysteiny i 0,42 g cytrynianu amonu żelaza(III) rozpuszczonego w wodzie dejonizowanej. Użyj płytki mieszającej z magnesem, aby wymieszać przed nalaniem płytek Petriego.
      3. Do badania wzrostu L. pneumophila w pożywce aksonicznej należy przygotować bulion z ekstraktu drożdżowego ACES (AYE), łącząc wszystkie odczynniki chemiczne stosowane w BCYE, z wyjątkiem węgla drzewnego i agaru. Przefiltruj, wysterylizuj i użyj natychmiast lub zamroź do późniejszych eksperymentów.
    2. Zawiesić organizmy w tej samej pożywce do hodowli tkankowej, która jest używana dla komórek J774A.1, odpowiednio z suplementacją 100 μg/ml tymidyny.
  3. Zakażenie makrofagami
    1. Dodać badane związki będące przedmiotem zainteresowania (związki przesiewowe oraz pozytywne i ujemne kontrole hamowania wzrostu bakterii i lizy komórek eukariotycznych). Zaleca się, aby roztwory podstawowe rozpuścić w ≥500x w DMSO (dimetylosulfotlenku) lub w roztworze wodnym, aby umożliwić wystarczające rozcieńczenie nośnika.
      1. Chociaż roztwory podstawowe można przechowywać w stanie zamrożonym, należy unikać cykli zamrażania i rozmrażania w przypadku labilnych związków i środków przeciwdrobnoustrojowych.
    2. Rozcieńczyć bakterie luminescencyjne do wartości docelowej 2,5 x 106 CFU (jednostka tworząca kolonię)/m, a bakterie fluorescencyjne znakowane reporterowo do 1,0 x 107 CFU/ml w pożywce do hodowli tkankowej i dodać odpowiedni nietoksyczny, nieprzepuszczalny dla błony, wiążący kwas nukleinowy barwnik o 2,5-krotnym stężeniu końcowym w teście.
    3. Dodać 20 μl mieszaniny do każdej studzienki hodowlanej J774A.1, objętość końcowego testu 50 μl, końcowe stężenie bakteryjne 1 x 106 CFU/ml (reporter operonu luksów) lub 4 x 10 106 CFU/ml (reporter białka fluorescencyjnego).
    4. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-3 dni w 5% CO2 przy 100% wilgotności względnej, aby zapobiec efektom parowania krawędzi.
  4. Odczyt testu
    1. Odczytać wzrost bakterii i toksyczność komórek eukariotycznych na luminometrze mikropłytkowym i fluorymetrze, odpowiednio do używanych reporterów.
      1. Aby uniknąć efektów krawędziowych związanych z temperaturą, należy zrównoważyć termicznie mikropłytki przed odczytem luminescencji, umieszczając je w jednej warstwie na stole laboratoryjnym z uchylonymi pokrywkami na około 20 minut (lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego ze zdjętymi pokrywkami na około 10 minut).
    2. Umieść mikropłytki z powrotem w inkubatorze, jeśli pożądany jest odczyt w czasie rzeczywistym w późniejszych punktach czasowych.

2. Analiza danych

  1. Znormalizuj dane do kontroli pozytywnych i ujemnych, aby obliczyć procentowe lub krotne zahamowanie wewnątrzkomórkowego wzrostu bakterii i procentową cytotoksyczność dla komórek eukariotycznych.
  2. Aby ocenić wiarygodność testu, należy obliczyć separację statystyczną między kontrolami dodatnimi i ujemnymi zarówno w odniesieniu do zahamowania wzrostu bakterii, jak i cytotoksyczności, przy użyciu analizy współczynnika Z (Z'), gdzie Z' = 1 - 3(σp + σn)/|μp + μn|. W tym równaniu σp i σn są odchyleniami standardowymi odpowiednio dla studni kontroli dodatniej i ujemnej; μp i μn są średnimi wartościami odpowiednio dla studzienek kontroli dodatniej i ujemnej.
    1. W przypadku wysokoprzepustowych testów przesiewowych należy obliczyć standardowe wskaźniki z (lub inne alternatywne, ilościowe miary statystyczne), aby ocenić wpływ badanych związków będących przedmiotem zainteresowania. Alternatywnie, oblicz prostą redukcję fałdową lub logarytmiczną jako potencjalnie fizjologicznie bardziej istotną miarę wielkości efektu dla geometrycznie replikujących się bakterii.

3. Jedno- i wielowymiarowe (tj. synergiczne) testowanie dawka-odpowiedź i interpretacja danych

  1. Przygotować makrofagi i bakterie zgodnie z opisem w rozdziale 1 protokołu.
  2. Tuż przed infekcją lub inkubacją akseniczną należy dodać środki przeciwdrobnoustrojowe o znaczeniu eksperymentalnym w szeregowej, podwajającej się serii rozcieńczeń, w celu uzyskania na górnym końcu stężenia, które całkowicie eliminuje wzrost (tj. minimalne stężenie hamujące lub MIC), a na dolnym końcu stężenie, które nie wykazuje oczywistej aktywności.
  3. Użyj zautomatyzowanego systemu obsługi cieczy, aby ułatwić konfigurację testowania pojedynczej dawki i synergii kombinatorycznej poprzez bezpośrednie, automatyczne dodawanie rozcieńczeń przeciwdrobnoustrojowych zgodnie z protokołem producenta.
  4. Rozważ użycie rozcieńczeń podwajających, na przykład figure-protocol-1-krotna seria rozcieńczeń i powtórzeń testu w celu zwiększenia dokładności i odtwarzalności danych.
  5. W przypadku zakażenia makrofagami rozcieńczyć bakterie luminescencyjne do wartości docelowej 2,5 x 106 CFU (jednostka tworząca kolonię)/ml w pożywce do hodowli tkankowej. Dodać 20 μl mieszaniny do każdej studzienki J774A.1, końcowa objętość testu 50 μl, końcowe stężenie bakterii 1 x 106 jtk/ml; i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przy 100% wilgotności względnej.
    1. W celu przeprowadzenia badania wzrostu aksenicznego należy rozcieńczyć bakterie luminescencyjne do końcowego stężenia 1 x 106 CFU/ml w pożywce AYE, dodać 50 μl do każdego dołka płytki 384-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przy 100% wilgotności względnej.
  6. Obliczać wskaźnik stężenia frakcyjnej inhibitora dla kombinacji przeciwdrobnoustrojowych, które hamują wzrost bakterii. Dla każdego leku w kombinacji (a, b, . . n), która powoduje całkowite lub >99% zahamowanie wzrostu bakterii, należy obliczyć indywidualne stężenie hamujące frakcję (FICa, b, ... n.) w następujący sposób: FICa = stężenie związku "a" podzielone przez minimalne stężenie inhibitora "a" przez samo w sobie. . Korzystając z tego samego wzoru, oblicz FICb itp. Następnie oblicz kombinatoryczny indeks FIC lub figure-protocol-2 FIC = FICa + FICb + . . . FICn dla każdej kombinacji hamującej.
    1. Użyj indeksu kombinatorycznego, który najbardziej odbiega od 1,0, aby ocenić synergię. Rozważ wartość odcięcia ≤0,5 jako konserwatywne wskazanie efektu synergistycznego, a ≥4 – efekt antagonistyczny. 12
    2. Wykreśl izobolologiramy, izokonturowe i/lub izopowierzchniowe izobologramy6 jako alternatywne graficzne reprezentacje efektów kombinatorycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test wzrostu wewnątrzkomórkowego mikropłytki

Rysunek 1 przedstawia etapy testu. Pokazane automatyczne kroki można wykonać ręcznie. Jednak przepustowość jest znacznie ułatwiona dzięki systemom obsługi cieczy.

Rysunek 2 pokazuje reprezentatywne wyniki testu mikropłytki z 384 dołkami, podwójnym odczytem, wzrostem wewnątrzkomórkowym w czas...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy testy w czasie rzeczywistym do jednoczesnego wykrywania wewnątrzkomórkowego wzrostu bakterii i cytotoksyczności komórek gospodarza. W protokole znajduje się kilka krytycznych kroków. Po pierwsze, aby zapewnić solidną wydajność testu, musi istnieć wystarczająca separacja spektralna między odczytami bakteryjnymi i cytotoksycznymi. Taka separacja jest nieodłączna dla kombinacji reporterów operonów lucyferazy i fluorescencyjnych barwników wiążących DNA. Jednak w oparciu o nasze doświadczenie (Tabela 1-3

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania opisane w tym manuskrypcie były wspierane przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych Narodowych Instytutów Zdrowia pod numerem R01AI099122 dla J.E.K. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. Chcielibyśmy podziękować Jennifer Smith, Davidowi Wróblowi, Su Chiangowi, Dougowi Floodowi, Seanowi Johnstonowi, Jennifer Nale, Stewartowi Rudnickiemu, Paulowi Yanowi, Richardowi Siu i Rachel Warden z ICCB-Longwood Screening Facility i/lub National Screening Laboratory for the New England Regional Centers of Excellence in Biodefense and Emerging Infectious Diseases (wspieranym przez U54AI057159) za ich pomoc w opracowywaniu i przeprowadzaniu wysokoprzepustowych testów przesiewowych. Chcielibyśmy również podziękować Kennethowi P. Smithowi za pomocne komentarze do manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki J774A.1Kolekcja kultur typu amerykańskiegoTIB-67Komórka gospodarza
ACESSigma-AldrichA9758 Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego
Ekstrakt drożdżowy, ultrafiltrowanyBecton-Dickinson/Difco210929Do wytwarzania buforowanego agaru z ekstraktem drożdżowym z węgla drzewnego i buforowanego ekstraktu drożdżowego; niższe stopnie mogą powodować upośledzenie wzrostu i/lub zmianę wrażliwości Legionelli na inhibitory wzrostu
Kwas alfa-ketoglutarowy, sól monopotasowaSigma-AldrichK2000Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego Pożywka
Pirogronian soduSigma-AldrichP5280Do wytwarzania buforowanego agaru z ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego i buforowanego ekstraktu drożdżowego
Fosforan potasu, dwuzasadowyThermo Fisher ScientificP288-500Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego
L-cysteinaSigma-AldrichC-7755Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu
drożdżowegoCytrynian amonu żelaza(III)Sigma-AldrichF5879Do wytwarzania buforowanego agaru z ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego i buforowanego ekstraktu drożdżowego; zamiast tego można użyć pirofosforanu żelaza, ale jest on trudniejszy do dokładnego zważenia
Roztwór wodorotlenku potasu, skoncentrowanyThermo Fisher ScientificSP236-500Do wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego
Woda odonionowanaNie dotyczyDo wytwarzania buforowanego ekstraktu drożdżowego z węgla drzewnego, agaru i buforowanego ekstraktu drożdżowego
Tymidyna (klasa hodowli tkankowej)Sigma-AldrichT1895Do uzupełniania zarówno RPMI 1640, jak i buforowanego ekstraktu drożdżowego agar / pożywka i mdash; niższa klasa tymidyny może być stosowana do tego ostatniego, ale może powodować upośledzenie wzrostu komórek i/lub śmierć komórek w RPMI 1640
RPMI 1640, standardowa formułaCorning przez Thermo Fisher Scientific10-040-CVDo hodowli komórek J774A.1 przed posiewem; zawiera 2 mM L-glutaminy
RPMI 1640 bez czerwieni fenolowejCorning przez Thermo Fisher Scientific17-105-CVDo posiewania komórek J774A.1 w szalkach 384 dołków (nie nadaje się do wzrostu przed posiewem); brakuje również L-glutaminy — uzupełnienie do 2 mM przed użyciem
L-glutamina, 200 mM w 0,85% NaCl (klasa hodowli tkankowej)HyClone przez Thermo Fisher ScientificSH30034.02Do uzupełnienia RPMI 1640 pozbawionego L-glutaminy, do 2 mM stężenie końcowe
Surowica cielęca uzupełniona żelazemGemini Bioproducts100-510Do uzupełnienia RPMI 1640, do 9,1% stężenia końcowego
Roztwór błękitu trypanowegoSigma-AldrichT8154Do barwienia J774A.1 oznaczanie śmierci komórek podczas zliczania gęstości komórek
SYTOX Green, 5 mM roztwór w DMSOThermo Fisher ScientificS7020Do barwienia w celu określenia śmierci komórki J774A.1 za pomocą odczytu fluorescencji lub mikroskopii epifluorescencyjnej (w połączeniu z bakteriami fluorescencyjnymi pomarańczowo-czerwonymi lub dalekiej czerwieni). Stosować przy stężeniu końcowym 125 nM.
Inkubator do hodowli komórkowychThermo Fisher Scientific13-255-26Do inkubacji komórek J774A.1 (zarówno przed, jak i po zakażeniu); może być również używany do inkubacji bakterii lub zamiast niego można użyć inkubatora ze standardową atmosferą)
Wytrząsarka orbitalnaBellCo Glass7744-01010Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed zakażeniem; mieści się w inkubatorze do hodowli komórkowych; zawiera podstawę wytrząsarki 7744-01000 i tacę 7740-01010 (są one również dostępne osobno)
Kolby do wytrząsania (250 ml)ChemGlass Life SciencesCLS-2038-04Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed infekcją
Zaciski wytrząsarskie do kolb (250 ml)BellCo Glass7744-16250Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed zakażeniem
Kolby wytrząsające (1,000 ml)ChemGlass Life SciencesCLS-2038-07Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed zakażeniem
Zaciski wytrząsające do kolb (1,000 ml)BellCo Glass7744-16100Do inkubacji wytrząsającej komórek J774A.1 przed zakażeniem
Nasadki z pianki gąbczastej do kolb (250 ml-1,000 ml)ChemGlass Nauki przyrodniczeCLS-1490-038Do inkubacji wytrząsania komórek J774A.1 przed zakażeniem; zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia w porównaniu ze standardowymi nasadkami metalowymi
Programowalna wielokanałowa pompa perystaltyczna MultiDrop CombiThermo Fisher Scientific5840300Do dozowania komórek J774A.1, pożywki i zawiesiny bakteryjnej zawierającej fluorofory do dużej liczby naczyń 384 dołków
Standardowy kolektor wiertniczy CombiThermo Fisher Scientific24072670Domyślna objętość dozowania wstępnego 20 μ l jest niewystarczający do skompensowania osiadania — wzrost do 80 i #956; l
Białe 384 dobrze naczynia poddane hodowli tkankowejCorning3570Do odczytu luminescencji i fluorescencji; Katalog Greiner # 781080 również pomyślnie przetestowany
DMSO (klasa hodowli tkankowej, w szczelnie zamkniętych ampułkach)Sigma-AldrichD2650Do rozpuszczania kontroli pozytywnej i związków testowych
AzytromycynaSigma-AldrichPHR1088Antybiotykowa kontrola pozytywna
Saponina (z kory Quillaja)Sigma-AldrichS-4521Cytoksyczność kontrola dodatnia
PipetorwielokanałowyPipeta Thermo Fisher ScientificDoprzenoszenia ustalonych ilości związków kontroli dodatniej; pipetor musi być wyposażony w cyfrowe dozowanie z zapadkami, aby umożliwić powtarzalne dozowanie o stałej objętości
Robot do przenoszenia pinówEpson Epson/ICCB-L(wyposażenie niestandardowe)Do transferu stałych ilości związków testowych z tablic bibliotecznych
Cyfrowy system dozowania D300Hewlett-Packard przez TecanD300Do przenoszenia zmiennych ilości badanych związków w zakresie od 11 pikolilitrów do 10 &mikro; l
Wkłady T8+ do cyfrowego systemu dozowania D300Hewlett-Packard przez TecanT8+Do dozowania związków testowych
Mikroskop epifluorescencyjny z podłączoną do komputera kamerą cyfrowąNikonTiDo obrazowania żywych komórek; każdy standardowy mikroskop fluorescencyjny może zastąpić, z kontrastem fazowym lub optyką DIC, zdolny do obrazowania fluorescencji zielonej (fluoresceina), pomarańczowo-czerwonej do czerwonej (Texas Red) i dalekiej czerwonej (Cy5) fluorescencji, olejem 100X cel dla najwyższej rozdzielczości
Naczynia do hodowli tkankowych ze szklanym dnemMatTek CorporationP35G-1.5-20-CDo obrazowania żywych komórek. Anteny takie jak MatTek umożliwiają wizualizację mikroskopową przy powiększeniu 600X lub 1,000X dzięki zastosowaniu odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego. Te specyficzne naczynia mają średnicę nominalną 3,5 cm, średnicę wewnętrzną 3,3 cm, z szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 20 mm o grubości #1,5 włożonymi w dno.
Photoshop, CS6Adobe, Adobe Photoshop lub podobne programy mogą być używane do pseudokolorowania i scalania jasnych, mikroskopijnych i fluorescencyjnych obrazów.
Mathematica 10WolfamDo generowania dwuwymiarowych izokonturów izokonturowych i trójwymiarowych izokonturów powierzchniowych.
Nie dotyczy,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Garzoni, C., Kelley, W. L. Staphylococcus aureus: new evidence for intracellular persistence. Trends Microbiol. 17 (2), 59-65 (2009).
  2. Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infect Immun. 76 (7), 3337-3345 (2008).
  3. Blango, M. G., Mulvey, M. A. Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics. Antimicrob Agents Chemother. 54 (5), 1855-1863 (2010).
  4. Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. Evaluation of impermeant, DNA-binding dye fluorescence as a real-time readout of eukaryotic cell toxicity in a high throughput screening format. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 219-228 (2014).
  5. Edelstein, P. H. Antimicrobial chemotherapy for legionnaires' disease: a review. Clin Infect Dis. 21 Suppl 3, S265-S276 (1995).
  6. Chiaraviglio, L., Kirby, J. E. High-Throughput Intracellular Antimicrobial Susceptibility Testing of Legionella pneumophila. Antimicrob Agents Chemother. 59 (12), 7517-7529 (2015).
  7. Pedro-Botet, L., Yu, V. L. Legionella: macrolides or quinolones? Clin Microbiol Infect. 12 Suppl 3, 25-30 (2006).
  8. Coers, J., Vance, R. E., Fontana, M. F., Dietrich, W. F. Restriction of Legionella pneumophila growth in macrophages requires the concerted action of cytokine and Naip5/Ipaf signalling pathways. Cell Microbiol. 9 (10), 2344-2357 (2007).
  9. Chu, J., et al. Non-invasive intravital imaging of cellular differentiation with a bright red-excitable fluorescent protein. Nat Methods. 11 (5), 572-578 (2014).
  10. Eliopoulos, G. M., Moellering, R. C. Ch. 9. Antimicrobial combinations. In: Antibiotics in Laboratory Medicin. Lorian, V. , Williams and Wilkins. 330-396 (1996).
  11. Jones, R. E., Zheng, W., McKew, J. C., Chen, C. Z. An alternative direct compound dispensing method using the HP D300 digital dispenser. J Lab Autom. 18 (5), 367-374 (2013).
  12. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. J Antimicrob Chemother. 52 (1), (2003).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  14. Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nat Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
  15. Berger, K. H., Merriam, J. J., Isberg, R. R. Altered intracellular targeting properties associated with mutations in the Legionella pneumophila dotA gene. Mol Microbiol. 14 (4), 809-822 (1994).
  16. Berger, K. H., Isberg, R. R. Two distinct defects in intracellular growth complemented by a single genetic locus in Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 7 (1), 7-19 (1993).
  17. Vogel, J. P., Isberg, R. R. Cell biology of Legionella pneumophila. Curr Opin Microbiol. 2 (1), 30-34 (1999).
  18. Kirby, J. E., Isberg, R. R. Legionnaires' disease: the pore macrophage and the legion of terror within. Trends Microbiol. 6 (7), 256-258 (1998).
  19. Kirby, J. E., Vogel, J. P., Andrews, H. L., Isberg, R. R. Evidence for pore-forming ability by Legionella pneumophila. Mol Microbiol. 27 (2), 323-336 (1998).
  20. Vogel, J. P., Andrews, H. L., Wong, S. K., Isberg, R. R. Conjugative transfer by the virulence system of Legionella pneumophila. Science. 279 (5352), 873-876 (1998).
  21. Song, H., Fares, M., Maguire, K. R., Sidén, A., Potácová, Z. Cytotoxic Effects of Tetracycline Analogues (Doxycycline, Minocycline and COL-3) in Acute Myeloid Leukemia HL-60 Cells. PLoS ONE. 9 (12), e114457(2014).
  22. Isberg, R. R., Falkow, S. A single genetic locus encoded by Yersinia pseudotuberculosis permits invasion of cultured animal cells by Escherichia coli K-12. Nature. 317 (6034), 262-264 (1985).
  23. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opin Drug Discov. 3 (6), 655-669 (2008).
  24. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr Chem Genomics. 3, 33-41 (2009).
  25. Mayr, L. M., Bojanic, D. Novel trends in high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 9 (5), 580-588 (2009).
  26. Dunlap, P. Biochemistry and genetics of bacterial bioluminescence. Bioluminescence: Fundamentals and Applications in Biotechnology - Volume 1. Thouand, G., Marks, R. 1, Springer. 37-64 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Real time AssayHigh throughput ScreeningBacterial Lux OperonFluorescent Protein ReportersNucleic Acid binding DyeAutomated Liquid HandlingSynergy Testing

Powiązane artykuły