Obserwacja i kwantyfikacja zachowań godowych nicieni sosnówki, Bursaphelenchus xylophilus

Podsumowanie

Przedstawiono protokół badania zachowań godowych nicienia sosnowego, Bursaphelenchus xylophilus. Cechy behawioralne B. xylophilus są opisane w procesie krycia.

Streszczenie

Metoda obserwacji i ilościowego określania zachowań godowych nicienia sosnowego, Bursaphelenchus xylophilus, została opracowana pod mikroskopem stereoskopowym. Aby poprawić efektywność krycia B. xylophilus i zwiększyć szanse na obserwację krycia, dziewicze dorosłe osobniki wyhodowano i wykorzystano do badań. Jaja uzyskano, trzymając nicienie w wodzie i pozwalając samicom na składanie jaj przez 10 minut. Młodociane osobniki drugiego etapu (J2) synchronizowano przez inkubację jaj przez 24 godziny w temperaturze 25 °C w ciemności, a wczesne J4 uzyskano przez hodowlę J2 z szarą pleśnią, Botrytis cinerea, przez kolejne 52 godziny. W tym momencie większość nicieni J4 można było wyraźnie odróżnić jako samce lub samice na podstawie morfologii narządów płciowych. Samce i samice J4 zebrano i hodowano oddzielnie na dwóch różnych szalkach Petriego przez 24 godziny, aby uzyskać dziewicze dorosłe nicienie. Dziewiczy mężczyzna i dziewicza samica zostali połączeni w pary w kropli wody w studni wklęsłej zjeżdżalni. Zachowanie godowe zostało sfilmowane za pomocą magnetowidu pod mikroskopem stereoskopowym. Cały okres procesu krycia wynosił 82,8 ±3,91 min (średnia ±SE) i można go podzielić na 4 różne fazy: poszukiwanie, kontakt, kopulację i przebywanie. Średni czas trwania wynosił odpowiednio 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 i 7,2 ± 0,5. Opisano jedenaście podzachowań: rejs, zbliżanie się, napotykanie, dotykanie, obręczowanie, lokalizowanie, przyczepianie się, wytrysk, oddzielanie, spokój i wędrowanie. Co ciekawe, wyraźną konkurencję wewnątrzpłciową zaobserwowano, gdy jedna samica była grupowana z 3 samcami lub jeden samiec z 3 samicami. Protokół ten jest przydatny i cenny, nie tylko w badaniu zachowań godowych B. xylophilus, ale także jako punkt odniesienia dla badań etologicznych innych nicieni.

Wprowadzenie

Nicień sosnowy, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner i Buhrer) Nickle, jest jednym z najbardziej destrukcyjnych gatunków inwazyjnych, powodującym więdnięcie i ostateczną śmierć sosen. Uważa się, że ten chorobotwórczy nicień pochodzi z USA, ale został przetransportowany do kilku krajów, w tym do Chin, Japonii, Korei Południowej i Portugalii. Ostatnio odnotowano go również w Hiszpanii, zabijając miliony sosen przy ogromnych stratach ekonomicznych i zagrażając produkcji leśnej i stabilności ekologicznej^1-5.

Gdy sosna gospodarza zostanie zainfekowana przez nicienie sosnowe, tysiące milionów potomstwa jest szybko rozmnażanych w pniu. Powoduje to dysfunkcję ksylemu, powodującą więdnięcie i ostatecznie śmierć drzewa gospodarza⁶. Jednak obecnie nie ma skutecznego sposobu na kontrolowanie tej choroby. Zachowania godowe mogą odgrywać ważną rolę w wysokiej płodności tego nicienia⁷. W związku z tym zbadaliśmy zachowania godowe B. xylophilus w laboratorium, próbując znaleźć skuteczny sposób na zakłócenie jego krycia i zmniejszenie jego płodności.

Ten protokół ma na celu wprowadzenie szczegółowych metod pozyskiwania dziewiczych dorosłych osobników B. xylophilus oraz obserwacji i analizy zachowań godowych za pomocą magnetowidu i stereomikroskopu. Protokół ten może być również wykorzystany jako odniesienie do badań behawioralnych innych nicieni.

Protokół

1. Pozyskiwanie dziewiczych dorosłych nicieni

1. Izolat nicieni sosnowych i warunki hodowli
   UWAGA: Izolat B. xylophilus Nxy61 został pierwotnie wyekstrahowany z chorego Pinus massoniana w rejonie Ningbo w prowincji Zhejiang w Chinach.
   1. Przygotuj talerze z agarem z dekstrozą ziemniaczaną (PDA, patrz tabela materiałów) do uprawy Botrytis cinerea.
   2. W celu zaszczepienia należy wybić kawałek maty przeciwgrzybiczej o średnicy 10 mm z maty B. cinerea i umieścić go na środku nowej płytki PDA. Hodowla B. cinerea przez 5 dni w temperaturze 25 °C w ciemności.
   3. Hodowlę nicieni sosnowych na przygotowanej szalce Petriego zawierającej B. cinerea w temperaturze 25 °C w ciemności.
2. Pozyskiwanie jaj B. xylophilus
   1. Umieść zaciśniętą gumową rurkę pod lejkiem i przytrzymaj przygotowany lejek w stojaku, aby zmontować aparat lejkowy Baermann. Umieść dwie warstwy bibuły filtracyjnej zamiast gazy w otworze lejka.
   2. Przenieś kultury grzybów do lejka i dodaj wodę, aż mata grzybowa zostanie zanurzona. Odczekaj 2 godziny, a nicienie wyjdą z kultury grzybów, przetną bibułę filtracyjną i osiądą w najniższej części lejka Baermanna.
   3. Zbierz kilka pierwszych kropli wody z dna probówki do probówki o pojemności 15 ml i zbierz nicienie, powoli zwalniając zacisk na probówce.
   4. Odwirować powyższe zbiory w temperaturze 3 000 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
   5. Usunąć górną warstwę wody za pomocą pipety i ponownie zawiesić ją z 1 ml sterylnego podwójnie destylowanego (dd)_H2O.
   6. Za pomocą pipety przenieść powyższą zawiesinę na nową szklaną szalkę Petriego (o średnicy 6 cm). Dodać 3 ml sterylnego dd_H2Odo szalki Petriego, aby upewnić się, że nicienie są w stanie swobodnie pływać.
   7. Nicienie należy przechowywać w szklanej szalce Petriego przez 10 minut w temperaturze 25 °C w ciemności. Jaja będą składane przez ciężarne samice. Ze względu na powierzchnię glikoproteiny jaja będą przyklejać się do dna szklanej szalki Petriego.
   8. Ostrożnie usuń wodę i robaki, nie naruszając jaj. Natychmiast dodać 3 ml sterylnego dd_H2Odo szklanej szalki Petriego, aby zapobiec wysychaniu jaj.
   9. Powtórz krok 1.2.8 3x, aby usunąć wszystkie larwy i dorosłe osobniki i uzyskać czyste jaja. Dodać dodatkowe 2 ml (łącznie 5 ml) sterylnego dd_H2Odo szalki Petriego.
3. Pozyskiwanie młodocianych osobników czwartego stadium (larwy J4)
   1. Zebrane jaja wykluwać się przez 24 godziny w ciemności w temperaturze 25 °C w celu uzyskania larw J2.
   2. Przenieść larwy J2 za pomocą pipety do probówki o pojemności 15 ml, odwirować przy 3 000 x g przez 2 minuty i usunąć górną warstwę wody.
   3. Zawiesić larwy J2 w 200 μl sterylnego_{dd H2O}, a następnie przenieść je na płytkę PDA zawierającą B. cinerea.
   4. Hodowlę larw J2 należy prowadzić przez 52 godziny w temperaturze 25 °C w ciemności. W tym momencie większość larw J2 rozwinie się we wczesnym stadium larw J4.
4. Pozyskiwanie dziewiczych dorosłych nicieni
   1. Przygotuj igłę do zbierania nicieni, rysując szklaną kapilarnę po podgrzaniu jej nad palnikiem alkoholowym.
      UWAGA: Końcówka tej igły kapilarnej zwykle musi mieć średnicę 50 μm, czyli mniej więcej szerokość ciała dorosłego nicienia, aby można ją było wykorzystać jako narzędzie do wyłapywania pojedynczego nicienia.
   2. Złożyć lejek Baermanna i ekstrahować nicienie z kultur grzybów przez 2 godziny, jak opisano w krokach 1.2.1 - 1.2.3.
   3. Przenieś J4 z wodą na czystą szalkę Petriego.
   4. Obserwuj nicienie pod mikroskopem stereoskopowym i rozróżnij samce i samice na podstawie morfologii narządów płciowych, jak opisali Mamiya i Kiyohara⁸ (ryc. 1). Za pomocą przygotowanej igły kapilarnej należy pobrać nicienie o pożądanej płci i przenieść je na odpowiednią płytkę do hodowli grzybów dla samców lub samic.
      UWAGA: Jest więcej kobiet niż mężczyzn, przy czym odsetek kobiet wynosi 60 - 70%. Żeński srom różni się oczywiście od męskiej spicule. W porównaniu z dorosłym, spikula lub srom we wczesnym stadium J4 są mniejsze, ale nadal można je łatwo zobaczyć i odróżnić. Nicienie zawsze poruszają się w wodzie, co czasami zwiększa trudność w odróżnieniu samców i samic.
   5. Hodowlę larw J4 należy prowadzić przez kolejne 24 godziny w temperaturze 25 °C w ciemności.
      UWAGA: Wszystkie nicienie powinny rozwinąć się w dorosłe osobniki, ale ponieważ nie są kojarzone, uważa się je za dziewicze dorosłe osobniki.
   6. Zebrać dwa lejki Baermanna i ekstrahować dziewicze dorosłe osobniki z kultur grzybów przez 2 godziny, jak opisano w krokach 1.2.1 - 1.2.3, a następnie przenieść dziewicze dorosłe samce i samice na dwie oddzielne, czyste szalki Petriego.

2. Obserwacja i nagrywanie wideo zachowań godowych

1. Przygotować kilka wklęsłych szkiełek i dodać 200 μl sterylnego_{dd H 2}O do każdego z ich studzienek.
2. Podnieś przygotowanego dziewiczego dorosłego samca lub samicę za pomocą igły kapilarnej i włóż tylko jednego nicienia do wody z każdej wklęsłej szkiełka.
3. Trzymaj dziewicze dorosłe osobniki w studni przez 1 godzinę, aby mogły przystosować się do nowego środowiska wodnego.
4. Połącz dziewiczego samca i samicę, przenosząc jednego z nich z jednego dołka do drugiego za pomocą pipety.
5. Obserwuj zachowanie łączeniowe kombinacji 1♀ + 1♂ na wklęsłym szkiełku pod mikroskopem stereoskopowym.
6. Aby przeanalizować skuteczność krycia dziewiczych dorosłych osobników, oblicz ich wskaźnik sukcesu krycia (R) i porównaj go z losowo wybranymi dorosłymi parami. Obliczyć R jako odsetek kontrprób, w których zaobserwowano kopulację, w porównaniu z całkowitą liczbą badanych kontrprób.
7. Aby zbadać wybór krycia i konkurencję wewnątrzpłciową, grupuj i obserwuj dziewicze nicienie w dwóch różnych kombinacjach: 1♀ + 3♂ i 3♀ + 1♂.
8. Aby zebrać dane do analizy jakościowej i ilościowej, sfilmuj zachowanie godowe za pomocą mikroskopii wideo. Zwykle cały proces krycia, od momentu umieszczenia nicieni w studzience wklęsłego zjeżdżalni do momentu, gdy oddalają się po kopulacji, kończy się w ciągu 2 godzin. W związku z tym należy rejestrować proces krycia w sposób ciągły przez co najmniej 2 godziny jako jedną kontrpróbę. Ukończ co najmniej 30 powtórzeń dla każdej kombinacji.
   UWAGA: Co 0,5 godziny dodawać do studzienki więcej sterylnego_{dd H 2}O (zwykle 50 μL), aby skompensować parowanie podczas procesu nagrywania.

3. Zbieranie danych

1. Uważnie obejrzyj wszystkie filmy na ekranie komputera i scharakteryzuj jakościowo podzachowania.
2. Zmierz czas krycia za pomocą funkcji klatka po klatce magnetowidu. Ręcznie odejmij czas rozpoczęcia od punktu końcowego.
3. W przypadku kombinacji 1♀ + 1♂ przeanalizuj każde nagranie wideo i zmierz czas trwania następujących zdarzeń:
   1. Zmierz czas trwania poszukiwań (tj. czas od momentu, w którym samica i samiec zostają wprowadzeni do studni wklęsłej zjeżdżalni, do momentu, w którym spotykają się i stykają ze sobą).
   2. Zmierz czas kontaktu (tj. czas od pierwszego kontaktu do momentu, w którym samiec jest precyzyjnie ustawiony na sromie samicy do pierwszej kopulacji).
   3. Zmierz czas trwania kopulacji (tj. czas od momentu, gdy samiec jest precyzyjnie umieszczony na sromie samicy, aż zsuwa się z ciała samicy po wytrysku). Uwaga: Niektóre nicienie mogą kopulować kilka razy w ciągu 2 godzin. W takich przypadkach należy zmierzyć czas trwania kopulacji od pierwszej kopulacji do końca ostatniej, w tym czas pomiędzy.
   4. Zmierz czas trwania utrzymywania się (tj. okres po kopulacji, aż do momentu, gdy samiec i samica oddalają się od siebie i są oddzielone odległością większą niż długość ciała nicieni (zwykle 1 mm)).
4. Policz częstotliwość i czas trwania każdej kopulacji oraz średni czas trwania wszystkich kopulacji w ciągu 2 godzin dla każdej z różnych kombinacji (tj. 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ i 1♀ + 3♂).
5. Oblicz wskaźnik powodzenia krycia dla pierwszego kontaktu (P) dla różnych kombinacji jako wskaźnik powodzenia krycia po pierwszym kontakcie, który jest przeprowadzany natychmiast i bez żadnej przerwy. W fazie kontaktu można zaobserwować kilka kontaktów przed właściwą kopulacją.
   1. Gdy odległość między dwiema osobami jest większa niż długość ciała, uznaj, że jeden kontakt się skończył. Dla jednej kontrpróby należy zapisać P jako 100%, gdy kopulację obserwuje się bezpośrednio po pierwszym kontakcie, bez przerwy, lub 0,00%, jeśli nie zaobserwowano kopulacji lub jeśli kopulacja miała miejsce, ale po dwóch lub więcej kontaktach.
      UWAGA: Dla każdej opisanej tutaj kombinacji przypadło 30 powtórzeń.

Wyniki

Wskaźnik sukcesu kopulacji (R) u dziewiczych osobników dorosłych wyniósł średnio 86,67%, co było wartością istotnie wyższą niż w przypadku osobników dorosłych wybranych losowo: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, df = 1, P = 0,0001) (Rysunek 2). Wynik ten sugeruje, że zachowania kopulacyjne B. xylophilus są łatwiejsze do zaobserwowania u dziewiczych osobników dorosłych niż u osobników wybranych losowo.

Dyskusja

Testy behawioralne są podstawowym aspektem ekologii chemicznej, neurobiologii, biologii molekularnej i genetyki. Nicienie, a zwłaszcza C. elegans, są szeroko wykorzystywane do badań w tych obszarach. Zachowania godowe C. elegans były badane wcześniej^10-11. Jednak B. xylophilus jest gonochorystyczny i różni się od hermafrodytycznego C. elegans, a jego proces godowy ma różne cechy behawioralne⁹. Ostatnio odnotowano zachowania godowe Bursaphelenchus okinawaensis<...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
B. xylophilus izolat Nxy61			Ekstrahowany z Pinus massoniana w rejonie Ningbo w Chinach
		szarej pleśni	Uzyskany z Chińskiej Akademii Leśnictwa
Lejki Baermanna	Sengong
	Sengong
pipeta	Sengong
sterylna dd H2O			Sterylizowana pod wysokim ciśnieniem pary w temperaturze 121 & stopni; C przez 30 min.
Szalki Petriego	Sengong
PDA medium	Huankai Bio.	021050
inkubator	Sengong
Przepływ laminarny	Szklana
Stereoskop	Sengong
Szkiełka wklęsłe

Szczep Probówki sokoła Wirówka kapilara Sengong Mikroskop stereoskopowy Leica LED5000 RL Zeiss A1 Sengong