Method Article

Ocena funkcji bioenergetycznych w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych

DOI:

10.3791/54847

⸱

November 19th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, West Virginia University, 2Mitochondrial Evaluation Core, West Virginia University, 3Experimental Stroke Core, West Virginia University, 4Center for Basic and Translational Stroke Research, West Virginia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondria komórek śródbłonka są niezbędne do utrzymania integralności bariery krew-mózg. Wprowadzamy protokół pomiaru funkcji bioenergetycznych w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Integralność bariery krew-mózg (BBB) jest kluczowa dla zapobiegania urazom mózgu. Komórki śródbłonka naczyń mózgowych (CVE) są jednym z typów komórek wchodzących w skład bariery krew-mózg; Komórki te mają bardzo duże zapotrzebowanie na energię, co wymaga optymalnego funkcjonowania mitochondriów. W przypadku choroby lub urazu funkcja mitochondriów w tych komórkach może zostać zmieniona, co prowadzi do choroby lub otwarcia bariery krew-mózg. W tym manuskrypcie przedstawiamy metodę pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach CVE przy użyciu całych, nienaruszonych komórek i bioanalizatora. Test mitostresu służy do rzucenia wyzwania komórkom, które zostały zaburzone, fizycznie lub chemicznie, i oceny ich funkcji bioenergetycznej. Ponadto metoda ta stanowi również użyteczny sposób badania przesiewowego nowych terapii, które mają bezpośredni wpływ na funkcję mitochondriów. Zoptymalizowaliśmy gęstość komórek niezbędną do uzyskania wskaźników zużycia tlenu, które pozwalają na obliczenie różnych parametrów mitochondriów, w tym produkcji ATP, maksymalnego oddychania i wolnej pojemności. Pokazujemy również czułość testu, wykazując, że wprowadzenie mikroRNA, miR-34a, prowadzi do wyraźnego i wykrywalnego spadku aktywności mitochondriów. Chociaż dane przedstawione w tym artykule są zoptymalizowane pod kątem linii komórkowej bEnd.3, zoptymalizowaliśmy również protokół dla pierwotnych komórek CVE, co dodatkowo sugeruje użyteczność w modelach przedklinicznych i klinicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powszechnie uznaje się, że bariera krew-mózg (BBB) tworzona przez komórki śródbłonka naczyń mózgowych (CVE) ma bardzo wyraźne i unikalne funkcje kluczowe dla biologii naczyniowej. Te komórki śródbłonka wykorzystują mitochondria do generowania większości komórkowego zaopatrzenia w adenozynotrójfosforan (ATP) jako źródło energii chemicznej. Oprócz dostarczania ATP dla komórek CVE, mitochondria regulują różne procesy komórkowe w komórkach śródbłonka naczyń krwionośnych, takie jak sygnalizacja komórkowa1-4, apoptoza5 oraz kontrola cyklu komórkowego i wzrostu komórek6. Rozregulowanie bioenergetycznej funkcji mitochondriów w komórkach CVE może wpływać na biogenezę mitochondriów, prowadząc do upośledzenia aktywności śródbłonka naczyń krwionośnych oraz zaostrzać choroby naczyń mózgowych i zaburzenia neurodegeneracyjne, np. udarmózgu 7,8 i chorobę Alzheimera (AD)9. Wykazaliśmy, że uszkodzenia komórek CVE po ekspozycji na lipopolisacharyd (LPS) upośledzają funkcję mitochondriów w komórkach CVE i pogarszają wyniki udaru7. Tert-butylohydrochinon (tBHQ) zwiększa śmiertelność z powodu udaru mózgu poprzez zakłócanie fosforylacji oksydacyjnej w komórkach CVE10. W związku z tym ilościowy model funkcji bioenergetycznej w komórkach CVE nie tylko pilotuje serię badań związanych z mechanizmami chorób ośrodkowego układu nerwowego (OUN), ale także stanowi przełom w badaniach przesiewowych leków ukierunkowanych na funkcję mitochondriów w biologii naczyniowej.

Izolowane mitochondria zostały użyte do pomiaru funkcji bioenergetycznej. My7 i inni11 opisaliśmy oceny bioenergetyki komórkowej w nienaruszonych komórkach CVE przy użyciu bioanalizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Analizator zapewnia przewagę endogennej komórkowej oceny bioenergetycznej. Ten czuły i spójny test mierzy mitochondrialny metabolizm komórek CVE i może być wykorzystany do oceny upośledzenia bioenergetycznego przez bodźce, badania mechanizmów mitochondrialnych szlaków sygnałowych oraz badań przesiewowych leków lub terapii, które wpływają na funkcję mitochondriów w komórkach CVE. Wskaźnik zużycia tlenu (OCR) jest rejestrowany przez bioanalizator przy użyciu podejścia do profilowania farmakologicznego poprzez połączenie czterech mitochondrialnych substancji zaburzających: oligomycyny, cyjanku karbonylu-4 (trifluorometoksy), fenylohydrazonu (FCCP), rotenonu i antymycyny A. W tym protokole szczegółowo opisujemy zoptymalizowane podejście, które pozwala na pomiar i obliczenie parametrów funkcjonalnych mitochondriów w komórkach CVE, w tym podstawowego oddychania mitochondrialnego, produkcji ATP, wycieku protonów, maksymalnego oddychania i wolnej pojemności oddechowej, w jednym teście.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Schemat protokołu jest pokazany na rysunku 1, w tym oś czasu procedur.

1. Hodowla i przejście komórek CVE

  1. Hodowla komórek CVE (komórki bEnd.3) w kompletnym pożywce wzrostowej (zmodyfikowana pożywka Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy, DMEM) uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną w kolbie do hodowli tkankowej T75 cm2. Rosnąć w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5%CO2
    2. .
  2. Wyjąć i wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowych. Przepłukać warstwę komórkową 0,25% roztworem trypsyny-0,03% EDTA, a następnie dodać 1 - 2 ml roztworu trypsyny-EDTA do kolby i utrzymywać kolbę w temperaturze 37 °C przez 3 - 5 minut. Obserwuj komórki pod odwróconym mikroskopem, aż warstwa komórkowa zostanie oderwana. Dodać 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej i delikatnie odessać komórki, pipetując.
  3. Zdekantować płyn i komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i wirować z prędkością 700 x g przez 5 minut, aby usunąć resztki komórkowe.
  4. Wyrzucić sklarowany osad z probówki wirówkowej. Dodać 10 ml kompletnej pożywki wzrostowej i ponownie zawiesić osad komórkowy. Wiruj komórki w temperaturze 700 x g przez 5 minut.
  5. Wyrzucić sklarowany osad z probówki wirówkowej. Ponownie zawiesić osad komórkowy w kompletnej pożywce wzrostowej o stężeniu 2,0 × 105 komórek/ml (oznaczone przez liczenie za pomocą hemocytometru; wykluczyć martwe komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym).
    UWAGA: Świeżo rozmrożone komórki są hodowane przez co najmniej 3 pasaże do eksperymentów.

2. Wysiewaj i traktuj komórki na płytkach do hodowli komórkowych

  1. Komórki nasienne na 96-dołkowej płytce do hodowli komórek strumienia zewnątrzkomórkowego: 80 μl/basenik. Umieścić płytkę do hodowli komórkowej w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Uwaga: 16 × 103 komórki na studzienkę osiągną 60 - 80% konfluencji w ciągu 24 godzin.
  2. Jeśli komórki są wystawione na działanie substancji chemicznej, dodaj zabiegi, gdy komórki zostaną przymocowane do dna płytki (8 - 24 godziny po wysianiu).
    UWAGA: W przypadku eksperymentów z transfekcją nie należy dodawać antybiotyków do kompletnej pożywki wzrostowej.

3. Ocena funkcji mitochondriów za pomocą bioanalizatora

  1. Przed rozpoczęciem badania należy uwodnić wkład czujnika strumienia zewnątrzkomórkowego z kalibrantem, dodając do płytki 150 μl roztworu kalibru strumienia zewnątrzkomórkowego i inkubując O/N w temperaturze 37 °C bez CO2 .
  2. Za pomocą stacji myjki płytkowej zmień pożywkę do hodowli komórkowych na pożywkę do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego o pH 7,0. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C bez CO2 przez 30–60 minut.
  3. Przygotować roztwory robocze 8 μM oligomycyny, 4,5 μM FCCP, 10 μM rotenonu i 10 μM antymycyny A w DMEM. Załadować 25 μl roztworów podstawowych do portów iniekcji wkładu: port A, oligomycyna; Port B, FCCP; Port C, rotenon i antymycyna A z pożywką do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego. Wdrożyć protokół oznaczania zgodnie z opisem w tabeli 1.
  4. Załaduj uwodniony wkład do bioanalizatora i przeprowadź kalibrację, klikając przycisk "Start". Po zakończeniu kalibracji zdejmij dolną płytę wkładu i załaduj płytkę ogniwa, klikając monit "Rozładuj wkład". Kontynuować test do końca wszystkich pomiarów.
  5. Otwórz plik danych i uzyskaj wartości szybkości z bioanalizatora. Wyeksportuj dane do pliku arkusza kalkulacyjnego.

4. Analizy danych

UWAGA: Obliczenia do analiz danych są sformułowane poniżej. Wartości są uzyskiwane z bioanalizatora jako OCR przedstawiony na rysunku 2.

  1. Aby obliczyć oddychanie podstawowe, odejmij oddychanie niemitochondrialne (pomiary 10 - 12) od wartości podstawowej (pomiar 3).
    UWAGA: Oddychanie podstawowe = Podstawowe - oddychanie niemitochondrialne = Szybkość (3) - Szybkość (10)~(12).
  2. Aby obliczyć produkcję ATP, odejmij oddychanie sprzężone z ATP (pomiary 4 - 6) od wartości podstawowej (pomiar 3).
    UWAGA: Produkcja ATP = Podstawowa - oddychanie związane z ATP = Szybkość (3) - Szybkość (4) ~ (6).
  3. Aby obliczyć maksymalne oddychanie, odejmij oddychanie niemitochondrialne (pomiary 10 - 12) od maksymalnego oddychania (pomiary 7 - 9).
    UWAGA: Maksymalne oddychanie = Maksymalne oddychanie - oddychanie niemitochondrialne = Szybkość (7) ~ (9) - Szybkość (10) ~ (12).
  4. Aby obliczyć wolną pojemność, odejmij wartość podstawową (pomiar 3) od maksymalnego oddechu (pomiary 7 - 9).
    UWAGA: Wolna pojemność = Maksymalne oddychanie - Podstawowe = Szybkość (7) ~ (9) - Szybkość (3).
  5. Aby obliczyć wyciek protonów, odejmij oddychanie niemitochondrialne (pomiar 10 - 12) od oddychania sprzężonego z ATP (pomiar 4).
    UWAGA: Wyciek protonów = oddychanie związane z ATP - oddychanie niemitochondrialne = Szybkość (4) - Szybkość (10)~(12).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby ocenić bioenergetyczną funkcję komórek CVE w odpowiedzi na stres oksydacyjny, wybraliśmy linię komórkową mikronaczyniowego śródbłonka mózgu mysiego bEnd.3, która wykazuje takie same cechy bariery porównawczej jak pierwotne komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu12. Biorąc pod uwagę, że kinetyka i względna intensywność odpowiedzi są zróżnicowane wśród różnych typów komórek, pierwsza seria eksperymentów została zaprojektowana w celu uzyskania mierzalnych poziomów OCR poprzez zidentyfikowanie optymalnej liczby komórek bEnd.3 do wykorzystania w teście profilowania metabolicznego, pokazanego na rysunku 2. Po dokonaniu oceny dane określa się ilościowo i przedstawia na rys. 3. Oddychanie podstawowe, oddychanie maksymalne i zapasowa pojemność oddechowa wykazywały proporcjonalną odpowiedź wraz z gęstością komórek. Jednak produkcja ATP zmniejszyła się, gdy wybrano 64 × 103 komórek na studzienkę, co sugeruje, że nadmiernie zlewająca się hodowla komórkowa nie jest odpowiednia dla tego eksperymentu. Optymalna gęstość komórek występuje między 8 - 32 × 103 komórek na studzienkę, w oparciu o odpowiedź na mitochondrialne substancje zaburzające.

Do kolejnych eksperymentów użyto gęstości wysiewu 16 ×10 3 komórek na studzienkę, aby umożliwić optymalne wykrycie zmian w OCR. Używając 16 × 103 komórek na studzienkę, zaobserwowaliśmy oczekiwane odpowiedzi w OCR i wykazaliśmy, że mikroRNA miR-34a zmniejsza funkcję mitochondriów w komórkach CVE (Figura 4). Wcześniej informowaliśmy, że miR-34a zmniejszył fosforylację oksydacyjną w tych komórkach13. Powtórzone eksperymenty wykazały również, że maksymalne oddychanie i zapasowa pojemność zostały znacznie zmniejszone przez nadekspresję miR-34a w CVE w 24 godziny po transfekcji, mimo że oddychanie podstawowe, produkcja ATP i wyciek protonów nie miały znaczących zmian (Figura 4). Dane te pokazują czułość bioanalizatora na wykrywanie zmian w funkcji mitochondriów w CVE.

figure-results-1
Rysunek 1. Planowanie strategiczne eksperymentu. Wskazany jest harmonogram przygotowania ogniwa, płytki i wkładu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Reprezentatywne surowe dane funkcji bioenergetycznej w komórkach CVE o różnej gęstości komórek. Wskaźniki zużycia tlenu mierzono w komórkach CVE o różnej gęstości komórek. Dane reprezentują średnią ± SD (n = 5); OCR: wskaźnik zużycia tlenu; FCCP: cyjanek karbonylu-4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon; Zgnilizna / Anty-A: rotenon i antymycyna A. (1), (2) i (3) wskazują na oddychanie podstawowe; (4), (5) i (6) wskazują na oddychanie związane z ATP; (7), (8) i (9) wskazują maksymalny oddech; (10), (11) i (12) wskazują na oddychanie niemitochondrialne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki funkcji bioenergetycznej w komórkach CVE o różnej gęstości komórek. Oddychanie podstawowe, produkcja ATP, maksymalne oddychanie i wolna pojemność są obliczane na podstawie surowych danych wygenerowanych przez bioenergetyczny test funkcjonalny na rysunku 2 przy użyciu wzorów wskazanych w sekcji 4. Dane reprezentują średnią ± SD (n = 5); OCR: Wskaźnik zużycia tlenu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Ryc. 4: Reprezentatywne wyniki obniżenia funkcji bioenergetycznych przez miR-34a. (A) Surowe dane dotyczące funkcji mitochondriów po nadekspresji miR-34a w 24 godziny po transfekcji. (B) Oddychanie podstawowe, produkcja ATP, maksymalne oddychanie i wolna pojemność są obliczane na podstawie surowych danych wygenerowanych przez bioenergetyczny test funkcjonalny na rysunku 4A; parametry oblicza się według wzorów wskazanych w sekcji 4. Nadekspresja miR-34a zmniejsza funkcję mitochondriów w komórkach CVE po 24 godzinach od transfekcji. Dane reprezentują średnią ± SD (n = 5); OCR: Wskaźnik zużycia tlenu. , P < 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Tabela 1. Protokół uruchomienia instrumentu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten stanowi metodę oceny fenotypu bioenergetycznego w komórkach śródbłonka naczyń mózgowych. Służy jako podstawowy test do oceny mitochondriów komórek śródbłonka i jest optymalny do eksperymentów mających na celu zbadanie mechanizmów bodźców, które mogą wpływać na mitochondrialny szlak sygnałowy w komórkach CVE. Stanowi również metodę testowania potencjalnych metod leczenia chorób związanych z zaburzeniem bariery krew-mózg.

Kluczowe kroki w ramach protokołu

Bioanalizatory strumienia zewnątrzkomórkowego mają możliwość pomiaru OCR w czasie rzeczywistym. W tym teście określenie odpowiedniej gęstości komórek ma kluczowe znaczenie. Jeśli gęstość komórek jest mniejsza niż 8 × 103 komórek na studzienkę, podstawowy OCR jest zbyt niski, aby można go było analizować (ryc. 2 i ryc. 3); jeśli gęstość komórek przekracza 32 × 103 komórek na studzienkę, komórki nie reagują na leczenie oligomycyną lub FCCP (ryc. 2 i ryc. 3). Optymalna gęstość komórek dla tej linii komórkowej w naszym modelu eksperymentalnym wynosi 16 × 103 komórek na studzienkę, co świadczy o powtarzalnych wynikach i wrażliwości na bodźce7 i zabiegi10,14. Jeśli używany jest bioanalizator 24-dołkowy, do testu wymagane byłoby nowe miareczkowanie gęstości komórek.

Udokumentowano, że CVE mają dużą objętość mitochondriów w porównaniu z innymi komórkami śródbłonka lub typami tkanek15,16, co sugeruje potrzebę większej produkcji energii i mniejszej liczby komórek do pomiaru metabolizmu bioenergetycznego. Przetestowaliśmy kilka typów komórek śródbłonka mózgu, takich jak pierwotne i unieśmiertelnione mysie komórki śródbłonka naczyń mózgowych7 oraz unieśmiertelnione ludzkie komórki śródbłonka naczyń mózgowych (dane niepublikowane). Komórki te wymagały podobnej gęstości komórek, aby osiągnąć akceptowalny OCR (OCR oddychania podstawowego w zakresie 40 - 160 pmol/min dla płytek 96-dołkowych i 50 - 400 pmol/min dla płytek 24-dołkowych) podczas wykonywania testu bioenergetycznego. Kaczara i wsp. poinformowali o pomiarze metabolizmu bioenergetycznego w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), w których wykorzystano większą gęstość komórek17.

Nasza grupa nie oceniała komórek naczyń krwionośnych z innych tkanek lub narządów. Teoretycznie bioanalizator może być potencjalnie stosowany na każdym typie komórek, ale wymaga optymalizacji testu pod kątem gęstości komórek, pożywki do hodowli komórkowej i warunków hodowli (niektóre określone komórki mogą wymagać powlekanych płytek, aby dobrze rosnąć). Wymagane jest, aby eksperymenty zostały zakończone, aby upewnić się, że szybkość OCR mieści się w dopuszczalnym zakresie. Jeśli OCR w komórkach śródbłonka z innych narządów jest niższy niż CVE z mózgu, zwiększenie gęstości komórek może pomóc w osiągnięciu akceptowalnego zakresu OCR. Alternatywnie, jeśli komórki nie wykorzystują fosforylacji oksydacyjnej jako głównego źródła energii, bioanalizator nie byłby optymalnym testem.

Bioanalizator pozwala na sekwencyjne przerwanie łańcucha transportu elektronów, w oparciu o kolejność, w jakiej odczynniki są stosowane. Najpierw stosuje się oligomycynę, która hamuje mitochondrialny kompleks V (syntazę ATP). Po drugie, stosuje się FCCP, czyli rozprzęgacz elektronów, który prowadzi do zakłócenia gradientu protonów. Wreszcie, rotenon i antymycyna A, które hamują odpowiednio kompleksy mitochondrialne I i III, są stosowane w celu doprowadzenia do całkowitego zahamowania przepływu elektronów. Kolejność ekspozycji na leki jest istotna, ponieważ leki blokują specyficzną reakcję łańcuchową transportu elektronów, a sekwencyjne zmiany można zmierzyć, aby odzwierciedlić funkcję mitochondriów.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów

Aby ocenić odpowiedź mitochondriów na bodźce w komórkach CVE, zaleca się, aby bodźce były podawane do komórek po przyklejeniu komórek do dna płytki hodowli komórkowej (patrz oś czasu pokazana na rysunku 1; zwykle trwa to co najmniej 6 godzin). Aby uzyskać powtarzalne wyniki za pomocą zabiegów, niezwykle ważne jest utrzymanie stałej gęstości komórek. Jeżeli obróbka wstępna jest projektowana przed wysiewem komórek, gęstość komórek dla każdego zabiegu wstępnego powinna być dokładnie zmierzona, z wyłączeniem martwych komórek przeznaczonych do wysiewu. Jeżeli transfekcja jest uwzględniona w projekcie doświadczalnym, należy zapoznać się z protokołem transfekcji producenta. Jak wykazano w danych przedstawionych na rycinie 4, miR-34a transfekowano do komórek CVE przy użyciu zestawu do transfekcji lipofektaminy, który wymaga pożywki do hodowli komórkowej wolnej od antybiotyków i testu mito-stresu w celu oceny zmian w funkcji metabolicznej z nadekspresją miR-34a. Dawki plazmidu mogą być również zoptymalizowane, jak wcześniej opublikowano13. Kolejną zmianą, którą można wprowadzić do protokołu, jest zmiana stężeń odczynników. Można ukończyć krzywą miareczkowania oligomycyny, FCCP i/lub rotenonu i antymycyny A.

Ponadto, jeśli test ten jest używany do wysokoprzepustowych analiz różnych leków, sugeruje się, aby uwzględnić równoległy test do pomiaru żywotności komórek i proliferacji komórek, co zostało opisane w naszych poprzednich publikacjach7,13. Na wartości OCR znaczący wpływ ma liczba komórek (ryc. 2 i 3), a testy proliferacji komórek i żywotności korzystnie wpływają na normalizację danych. Jednak wykonanie tych testów leży w gestii każdego laboratorium z osobna.

Ograniczenia techniki

Głównym ograniczeniem tego protokołu jest to, że w badaniu użyliśmy tylko modelu hodowli komórkowej in vitro . Obecnie nie ma dostępnych modeli ex vivo ani modeli zwierzęcych, które mogłyby zajmować się funkcją mitochondriów komórek śródbłonka. Oczekuje się, że w przyszłych badaniach zostaną opracowane nowe modele do oceny funkcji bioenergetycznych in vivo i ex vivo .

Kolejnym ograniczeniem jest rozszerzenie ocen barier w ślad za działaniami bioenergetycznymi. Doświadczenia nie mogą być przeprowadzone, ponieważ, po pierwsze, po zakończeniu pomiarów bioenergetycznych, żywotność komórki jest zmniejszona w wyniku całkowitego przerwania łańcucha transportu elektronów; Po drugie, do wykrywania wartości bioenergetycznych wymagane są specjalne płytki i wkładki do hodowli komórkowych, które nie pasują do wkładek do oceny bariery. W związku z tym nie ma wielu testów funkcjonalnych, które można wykonać po teście bioenergetycznym. Oczekuje się jednak, że uda się opracować specjalne urządzenia do wykonywania testów funkcjonalnych przed testem bioenergetycznym.

Znaczenie techniki w odniesieniu do istniejących/alternatywnych metod

Poprzednie techniki oceny funkcji mitochondriów wymagały izolacji mitochondriów od komórek18. Ta nowa technika wykorzystująca bioanalizator pozwala na pomiar aktywności mitochondriów w nienaruszonych komórkach, co pozwala zachować więcej środowiska komórkowego niż ocena izolowanych mitochondriów.

Przyszłe zastosowania lub wskazówki po opanowaniu tej techniki

Protokół ten został zaprojektowany i opracowany dla linii komórkowej bEnd.3, ale jest również kompatybilny z pierwotnymi komórkami śródbłonka naczyń mózgowych (pCVE)7 lub innymi komórkami śródbłonka, co wykazaliśmy w naszej poprzedniej publikacji przy użyciu komórek pCVE7. W przypadku stosowania innych rodzajów śródbłonka może być wymagane pokrycie płytki hodowlanej i zastosowanie czynników wzrostu. Jednak test miareczkowania jest zalecany również dla innych typów komórek. Protokół ten oferuje ogólną metodę, którą należy przyjąć w ocenie bioenergetyki komórek CVE i może być dalej stosowany do badań mechanizmów lub odpowiedzi terapeutycznych w ten sposób.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak potencjalnych konfliktów interesów w odniesieniu do badań, autorstwa i/lub publikacji tego artykułu. Opłaty za otwarty dostęp do tego artykułu zostały zapewnione przez Agilent Technologies.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez następujące granty: AHA 16SDG31170008 dla X.R. i NIH P20 GM109098, P01 AG027956, oraz U54 GM104942 dla J.W.S.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
bEnd.3 linia komórkowaATCCCRL-229925 - 30 przejść
Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM)ATCC30-2002
Surowica bydlęca płoduAtlanta BiologicalsS1245010% stężenie końcowe
Penicylina / SteptomycynaHyklonSV300101 razy; 100 pończochy
0,25% trypsyna, 0,03% roztwór EDTACorning25-053-CI
Pirogronian soduCorning25-000-CI1,0 i mikro; M stężenie końcowe
GlukozaSigmaCAS 50-99-725 mM stężenie końcowe
OligomycynaSigmaO48761,0 &mikro; M stężenie końcowe
4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon karbonilocyjanku (FCCP)SigmaC29200,5 &mikro; M stężenie końcowe
RotenonSigmaR88751.0 &mikro; M końcowe stężenie
Antymycyna ASigmaCAS 1397-94-01,0 &mikro; M stężenie końcowe
Stacja mycia płytekSeahorse Bioscience Bioanalizator
strumienia zewnątrzkomórkowego   Seahorse BioscienceXFe96
Płytka do hodowli komórek strumienia zewnątrzkomórkowegoSeahorse Bioscience102416-100
Wkład czujnika strumienia zewnątrzkomórkowegoSeahorse Bioscience102416-100
Roztwór kalibru strumienia zewnątrzkomórkowegoSeahorse Bioscience100840-000
Pożywka do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowegoSeahorse Bioscience102365-100PH buforowane przed badaniem

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).">Quintero, M., Colombo, S. L., Godfrey, A., Moncada, S. Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).
  2. Endothelial cytoskeletal elements are critical for flow-mediated dilation in human coronary arterioles. Med Biol Eng Comput. 46, 469-478 (2008).">Liu, Y., Li, H., Bubolz, A. H., Zhang, D. X., Gutterman, D. D. Endothelial cytoskeletal elements are critical for flow-mediated dilation in human coronary arterioles. Med Biol Eng Comput. 46, 469-478 (2008).
  3. Perinuclear mitochondrial clustering creates an oxidant-rich nuclear domain required for hypoxia-induced transcription. Sci Signal. 5, ra47(2012).">Al-Mehdi, A. B., et al. Perinuclear mitochondrial clustering creates an oxidant-rich nuclear domain required for hypoxia-induced transcription. Sci Signal. 5, ra47(2012).
  4. [Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release. J Biol Chem. 280, 715-721 (2005).">Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. [Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release. J Biol Chem. 280, 715-721 (2005).
  5. The role of Nogo and the mitochondria-endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 3, 88ra55(2011).">Sutendra, G., et al. The role of Nogo and the mitochondria-endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 3, 88ra55(2011).
  6. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11960-11965 (2009).">Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11960-11965 (2009).
  7. Mitochondrial crisis in cerebrovascular endothelial cells opens the blood-brain barrier. Stroke. 46, 1681-1689 (2015).">Doll, D. N., et al. Mitochondrial crisis in cerebrovascular endothelial cells opens the blood-brain barrier. Stroke. 46, 1681-1689 (2015).
  8. Deciphering the Blood-Brain Barrier Damage in Stroke: Mitochondrial Mechanism. J Neuroinfect Dis. S2, e002(2015).">Ren, X., Simpkins, J. W. Deciphering the Blood-Brain Barrier Damage in Stroke: Mitochondrial Mechanism. J Neuroinfect Dis. S2, e002(2015).
  9. Involvement of ROS in BBB dysfunction. Free Radic Res. 43, 348-364 (2009).">Pun, P. B., Lu, J., Moochhala, S. Involvement of ROS in BBB dysfunction. Free Radic Res. 43, 348-364 (2009).
  10. Tert-butylhydroquinone compromises survival in murine experimental stroke. Neurotoxicol Teratol. 54, 15-21 (2016).">Sun, J., Hu, H., Ren, X., Simpkins, J. W. Tert-butylhydroquinone compromises survival in murine experimental stroke. Neurotoxicol Teratol. 54, 15-21 (2016).
  11. Cellular bioenergetics is regulated by PARP1 under resting conditions and during oxidative stress. Biochem Pharmacol. 83, 633-643 (2012).">Modis, K., et al. Cellular bioenergetics is regulated by PARP1 under resting conditions and during oxidative stress. Biochem Pharmacol. 83, 633-643 (2012).
  12. Tight junction protein expression and barrier properties of immortalized mouse brain microvessel endothelial cells. Brain Res. 1130, 17-30 (2007).">Brown, R. C., Morris, A. P., O'Neil, R. G. Tight junction protein expression and barrier properties of immortalized mouse brain microvessel endothelial cells. Brain Res. 1130, 17-30 (2007).
  13. MiR-34a regulates blood-brain barrier permeability and mitochondrial function by targeting cytochrome c. J Cereb Blood Flow Metab. 36, 387-392 (2016).">Bukeirat, M., et al. MiR-34a regulates blood-brain barrier permeability and mitochondrial function by targeting cytochrome c. J Cereb Blood Flow Metab. 36, 387-392 (2016).
  14. Mitochondrial Impairment in Cerebrovascular Endothelial Cells is Involved in the Correlation between Body Temperature and Stroke Severity. Aging Dis. 7, 14-27 (2016).">Hu, H., et al. Mitochondrial Impairment in Cerebrovascular Endothelial Cells is Involved in the Correlation between Body Temperature and Stroke Severity. Aging Dis. 7, 14-27 (2016).
  15. The large apparent work capability of the blood-brain barrier: a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat. Ann Neurol. 1, 409-417 (1977).">Oldendorf, W. H., Cornford, M. E., Brown, W. J. The large apparent work capability of the blood-brain barrier: a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat. Ann Neurol. 1, 409-417 (1977).
  16. Greater number of capillary endothelial cell mitochondria in brain than in muscle. Proc Soc Exp Biol Med. 149, 736-738 (1975).">Oldendorf, W. H., Brown, W. J. Greater number of capillary endothelial cell mitochondria in brain than in muscle. Proc Soc Exp Biol Med. 149, 736-738 (1975).
  17. Carbon monoxide released by CORM-401 uncouples mitochondrial respiration and inhibits glycolysis in endothelial cells: A role for mitoBKCa channels. Biochim Biophys Acta. 1847, 1297-1309 (2015).">Kaczara, P., et al. Carbon monoxide released by CORM-401 uncouples mitochondrial respiration and inhibits glycolysis in endothelial cells: A role for mitoBKCa channels. Biochim Biophys Acta. 1847, 1297-1309 (2015).
  18. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. J Vis Exp. (96), e52350(2015).">Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. J Vis Exp. (96), e52350(2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cerebral Vascular Endothelial CellsMitochondrial Function AssessmentBioenergetic Function AnalysisMito Stress AssayOxygen Consumption RateATP Production MeasurementMaximal Respiration EvaluationSpare Respiratory CapacityExtracellular Flux AnalyzerCell Density Optimization

Related Articles