Method Article

Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych biorących udział w koniugacji bakteryjnej

DOI:

10.3791/54854

⸱

January 4th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, York University, 2The Centre for Research on Biomolecular Interactions, York University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do wyeliminowania interesującego genu zaangażowanego w koniugację plazmidu, a następnie analizujemy wpływ jego braku za pomocą testów kojarzenia. Funkcja genu jest dalej badana w określonym regionie jego sekwencji za pomocą mutacji delecyjnych lub punktowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfer materiału genetycznego przez koniugację bakteryjną to proces, który odbywa się za pośrednictwem kompleksów utworzonych przez specyficzne białka transferowe. W Escherichia coli te białka transferowe tworzą maszynerię transferu DNA znaną jako tworzenie par godowych lub kompleks transferu DNA, który ułatwia sprzężony transfer plazmidu. Celem tego artykułu jest przedstawienie metody, którą można wykorzystać do określenia roli specyficznego białka transferowego, które bierze udział w koniugacji przy użyciu serii delecji i/lub mutacji punktowych w połączeniu z testami kojarzenia. Gen docelowy jest wybijany na plazmidzie sprzężonym, a następnie jest dostarczany w trans za pomocą małego plazmidu regeneracyjnego, w którym znajduje się gen docelowy. Mutacje wpływające na gen docelowy na plazmidzie regeneracyjnym mogą ujawnić informacje o funkcjonalnych aspektach białka docelowego, które skutkują zmianą skuteczności kojarzenia komórek dawcy zawierających zmutowany gen. Zmiany w wydajności krycia dostarczają informacji na temat roli i znaczenia konkretnego białka transferowego lub jego regionu w ułatwianiu sprzężonego transferu DNA. Sprzężenie tego testu kojarzenia ze szczegółowymi trójwymiarowymi badaniami strukturalnymi zapewni kompleksowe zrozumienie funkcji sprzężonego białka przenoszenia, a także zapewni środki do identyfikacji i charakteryzowania regionów interakcji białko-białko.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfer genów i białek na poziomie mikroorganizmów odgrywa kluczową rolę w przetrwaniu i ewolucji bakterii, jak również w procesach infekcji. Wymiana DNA między bakteriami lub między bakterią a komórką może być osiągnięta poprzez transformację, koniugację lub transdukcję wektorową. 1,2 Koniugacja jest wyjątkowa w porównaniu z transformacją i transdukcją, ponieważ podczas koniugacji między bakteriami Gram-ujemnymi, takimi jak Escherichia coli, transfer DNA zachodzi w sposób kontrolowany przez dawcę, w którym złożony system makromolekularny łączy komórki dawcy i biorcy. Koniugacja jest również najbardziej bezpośrednim sposobem, w jaki komórki bakteryjne oddziałują z komórkami gospodarza w celu wstrzyknięcia genów, białek lub substancji chemicznych do systemów gospodarza. 3 Dość często przenoszenie takich czynników ma niezwykły wpływ na gospodarza, począwszy od patogenezy i kancerogenezy, a skończywszy na ewolucji i adaptacji gospodarza. Wykazano, że rekombinacja koniugacyjna zwiększa 3-krotnie szybkość adaptacji u bakterii o wysokim wskaźniku mutacji w warunkach stresu środowiskowego. 4 Co więcej, koniugacja jest zdecydowanie najczęstszą drogą, za pomocą której rozprzestrzeniają się geny oporności na antybiotyki w szczepach bakteryjnych. 5,6

TGL

Mikroorganizmy wyewoluowały wyspecjalizowane systemy wydzielania, aby wspierać przenoszenie makrocząsteczek przez błony komórkowe; obecnie istnieje 9 typów systemów wydzielania (TSS) u bakterii Gram-ujemnych, które zostały opisane: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, a także szlaki Sec (wydzielanie) i Tat (translokacja dwu-argininowa). 7,8 Każdy typ systemu wydzielania jest dalej podzielony na różne podtypy, co jest konieczne ze względu na różnorodność białek i odrębność zaangażowanych szlaków w różnych szczepach bakteryjnych. Na przykład w systemie wydzielania typu IV (T4SS) systemy Ti i Cag ułatwiają transport efektorowy, podczas gdy F-plazmid, R27 i pKM101 T4SS ułatwiają transfer plazmidu sprzężonego. 7,9,10 Szczegółowe zrozumienie mechanizmów, za pomocą których organizmy składają swoje odpowiednie systemy wydzielania z białek składowych i dzielą zawartość komórkową z biorcą lub otaczającym go środowiskiem, jest ważnym czynnikiem w rozwoju ukierunkowanych strategii zwalczania drobnoustrojów chorobotwórczych i procesów infekcji komórkowych.

Po wstępnej identyfikacji koniugacji bakteryjnej w E. coli przez Lederberga i Tatuma,11 zidentyfikowano i scharakteryzowano dużą liczbę plazmidów ruchomych i koniugacyjnych. 12 Takie ruchome plazmidy wykazują znaczny zakres wielkości (od 1 do ponad 200 kilozasad (kb)), jednak wszystkie ruchome plazmidy zawierają relaksazę, która rozpoznaje początek transferu (oriT), umożliwiając w ten sposób transmisję plazmidu. Plazmidy koniugacyjne dodatkowo kodują geny do składania funkcjonalnego T4SS, a także białka sprzęgającego typu IV. 12 Na przykład plazmid F E. coli o wielkości 100 kb koduje wszystkie geny koniugacyjne w regionie transferu (tra) o długości 33,3 kB. 13 Geny w regionie tra plazmidu F kodują wszystkie białka, które ułatwiają tworzenie pilusa, tworzenie par godowych (Mpf), transfer DNA i funkcje wykluczania podczas sprzężonego transferu plazmidu. 10,14,15 Znaczna część wiedzy na temat koniugacyjnych T4SS jest dostępna, jednak szczegółowe badania strukturalne białek i kompleksów koniugacyjnych stają się dostępne dopiero niedawno. 16-28 Rozdział 16-28

Aby stworzyć całościowy obraz procesu koniugacyjnego, wymagane jest połączenie szczegółowych badań strukturalnych z analizami mutacji sprzęganych białek transferowych. Można to osiągnąć za pomocą testów kojarzenia koniugacyjnego. W przypadku plazmidu F każde białko kodowane w regionie tra odgrywa rolę w koniugacji za pośrednictwem F; w związku z tym nokaut / delecja genu transferowego zniesie zdolność koniugacyjną komórki (ryc. 1). Podczas gdy mniejsze ruchome plazmidy bardziej sprzyjają standardowym procedurom delecji, w przypadku większych plazmidów sprzężonych, takich jak F, nokauty genów są łatwiejsze do osiągnięcia poprzez rekombinację homologiczną, w której gen docelowy jest zastępowany genem przenoszącym odrębny gen oporności na antybiotyki. W obecnym protokole stosujemy rekombinację homologiczną w celu zastąpienia interesującego genu transferu acetylotransferazą chloramfenikolu (CAT) w pochodnej plazmidu F o pojemności 55 kb pOX38-Tc; 29,30 powstały plazmid nokautujący, pOX38-Tc Δgene::Cm, zwiększa odporność na obecność chloramfenikolu (Cm) w pożywce wzrostowej. Komórki dawcy zawierające pOX38-Tc Δgen::Cm nie są w stanie wpływać na sprzęgany transfer/kojarzenie DNA, co zaobserwowano za pomocą testu kojarzenia; skuteczność krycia komórki dawcy pOX38-Tc Δgene::Cm i normalnego biorcy zmniejszy się lub, częściej, zostanie zniesiona. Sprzężony transfer plazmidu Δgen pOX38-Tc::Cm może zostać przywrócony za pomocą małego plazmidu regeneracyjnego, w którym znajduje się gen docelowego transferu. Ten plazmid regeneracyjny może być taki, który zapewnia konstytutywną ekspresję, taki jak plazmid pK184 (gen pK184) lub taki, który zapewnia indukowaną ekspresję, o ile plazmid prawidłowo kieruje gen do właściwego miejsca w komórce (cytoplazma lub peryplazma). W związku z tym, w testach kojarzenia między tym nowym dawcą (zawierającym plazmidy genu pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184-gen) a komórką biorcy, oczekuje się, że skuteczność krycia powróci do prawie takiej samej jak w normalnym teście kojarzenia dawca-biorca. System ten umożliwia badanie funkcji znokautowanego genu poprzez generowanie serii konstruktów genu pK184 (delecje lub mutacje punktowe) i testowanie zdolności każdego konstruktu do przywrócenia zdolności kojarzenia pOX38-Tc Δgen::Cm zawierającego komórki dawcy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generowanie konstruktów DNA

  1. Projektowanie oligomerów do homologicznej rekombinacji genu docelowego
    1. Zaprojektuj pojedynczy oligomer do przodu 55-72 pz w następujący sposób: (a) wybierz sekwencję nukleotydową o długości 19-32 pz, która jest homologiczna do sekwencji DNA w regionie 10-100 pz przed miejscem początkowym 5' genu acetylotransferazy chloramfenikolu w komercyjnym plazmidzie pBAD33, 32 i (b) wybierz sekwencję nukleotydową o długości 36-54 pz homologiczną do regionu 10-150 pz za miejscem początkowym 5' docelowego genu będącego przedmiotem zainteresowania.
      1. Połącz koniec 3' sekwencji nukleotydowej wybranej w (b) z końcem 5' sekwencji nukleotydowej wybranej w (a), uzyskując w ten sposób pojedynczy oligomer 55-72 long forward.
    2. Zaprojektuj pojedynczy odwrócony oligomer 55-72 pz w następujący sposób: (a) wybierz sekwencję nukleotydową o długości 19-32 pz, która jest homologiczna do sekwencji DNA w regionie 10-100 pz poniżej końca 3' genu chloramfenikolu w komercyjnym plazmidzie pBAD33 i (b) wybierz sekwencję nukleotydową o długości 36-54 pz homologiczną do regionu w zakresie 10-150 pz przed miejscem końcowym 3' docelowego genu.
      1. Połącz koniec 3' sekwencji nukleotydowej wybranej w (b) z końcem 5' sekwencji nukleotydowej wybranej w (a), aby uzyskać pojedynczy oligomer.
      2. Skopiuj ten oligomer do dowolnego dostępnego oprogramowania bioinformatycznego i przekształć sekwencję w jej odwrotne dopełnienie. Da to pojedynczy odwrócony oligomer o długości 55-72 pz.
    3. Korzystając z dowolnego dostępnego programu oligoanalizatora, sprawdź, czy oligomery rekombinacyjne mają zawartość GC między 40-60%, niską temperaturę topnienia spinki do włosów (Tm), niską samo- i heterodimeryzację TM. Zamów startery do syntezy i wysyłki w dowolnej preferowanej firmie biotechnologicznej.
  2. Amplifikacja kasety CAT z plazmidu pBAD33 (CmR) przy użyciu oligomerów przeznaczonych do parowania homologicznego
    1. Hodować przez noc (O/N, 16-18 h) hodowlę komórek DH5α zawierających plazmid pBAD33 w sterylnym bulionie lizogenicznym (LB) z 20 μg/ml chloramfenikolu (Cm) z wytrząsaniem przy 200 obr./min i 37 °C.
    2. Odwirować 6-8 ml kultury O/N w temperaturze pokojowej, 5 000 x g przez 3 minuty. Zdekantować supernatant i wyekstrahować plazmid pBAD33 z osadu za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu (tabela materiałów) i protokołu producenta.
    3. Przeprowadzić trawienie plazmidowego DNA pBAD33, dodając następujące składniki do sterylnej probówki w podanej kolejności: odpowiednia objętość podwójnie destylowanej wody (ddH2O) do końcowej objętości 50 μL, 1 μg objętość plazmidu pBAD33, 5 μl 10x buforu reakcji enzymatycznej i 0,5 μL enzymu restrykcyjnego AvaI (RE). Delikatnie wymieszać pipetując i pozostawić reakcję w toku przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Ogrzewać dezaktywację reakcji przez 20 minut (min) w temperaturze 80 °C. Przechowywać próbki w temperaturze -20 °C nie dłużej niż 24 godziny, aby zminimalizować degradację lepkich końcówek.
    4. Przygotować 1,2% żel rozdzielający agarozę, mieszając 1,2 g agarozy ze 100 ml 1x buforu TAE (40 mM Tris, pH 8,5; 20 mM kwasu octowego; 1 mM EDTA) w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Podgrzej i zawiruj, aby całkowicie rozpuścić się w kuchence mikrofalowej. Natychmiast przerwij ogrzewanie, gdy ciecz zacznie wrzeć i zakręć kolbą.
      1. Schłodzić płynną agarozę przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, wirując, dodać 2 μl 10 mg/ml bromku etydyny i zamieszać do wymieszania. Wlej agarozę do tacki na żel ze dobrze nasadzonym grzebieniem i pozostaw do zestalenia się na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przechowywać żele w temperaturze 4 °C do 2 dni w 1x buforze TAE.
    5. Zmieszać każdy RE wytrawiony z 1.2.3 z 0,2 objętości barwnika ładującego DNA (10 μl barwnika na 50 μl reakcji) przez pipetowanie. Załadować 5 μl drabinki DNA o stężeniu 500 μg/ml do pierwszego dołka, a całą mieszaninę RE digest-dye do innego dołka na żelu agarozowym. Użyj 2-3 dołków, aby załadować całą objętość reakcji na żel.
      1. Uruchom żel ledwo zanurzony w buforze 1x TAE i działający pod napięciem 45-50 V (4,5-5 V/cm) przez 65 minut w urządzeniu do elektroforezy żelowej.
    6. Korzystając z szafki UV i sterylnej maszynki do golenia, szybko wytnij z żelu pasmo 2,8 kb, które odpowiada sekwencji CAT, aby zminimalizować ekspozycję DNA na promieniowanie UV. Wyodrębnij DNA z wyciętego plastra żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta.
      Uwaga: Uważaj, aby nie wystawiać skóry bezpośrednio na promieniowanie UV i obchodzić się z maszynką do golenia ostrożnie.
    7. Amplifikować kasetę CAT wyekstrahowaną z 1.2.6 przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy użyciu starterów zaprojektowanych w 1.1, które zawierają zwisy homologiczne do sekwencji genu, aby umożliwić rekombinację homologiczną. Reakcje PCR przeprowadza się na lodzie zgodnie z wytycznymi producenta (tabela materiałów) w następującej kolejności:
      1. Do sterylnej probówki PCR dodać odpowiednią objętość ddH2O do końcowej objętości 50 μL, a następnie 10 μl buforu PCR, 1 μl 10 mM dNTP, 2,5 μl 10 μM startera do przodu, 2,5 μL 10 μM startera wstecznego, 1-25 ng matrycy DNA z 1.2.6 i 0,5 μl 100 jednostek/μl polimerazy DNA.
      2. Ustanowić kontrolę ujemną, która zawiera te same składniki co w ppkt 1.2.7.1, ale z wyjątkiem matrycowego DNA. Użyj odpowiedniej objętości ddH2O zamiast matrycowego DNA. Ustaw kontrolę pozytywną przy użyciu matrycy DNA i starterów, które udowodniono działanie w reakcji PCR, takich jak te dostarczone przez producenta jako kontrola pozytywna.
      3. Delikatnie wymieszać całą zawartość reakcji, pipetując.
      4. Amplifikować metodą PCR przy użyciu następujących ustawień: początkowa denaturacja przez 30 s w temperaturze 98 °C, 30 cykli denaturacji przez 10 s w temperaturze 98 °C, wyżarzanie startera przez 20 s, przedłużenie przez 20 s na kilobazę amplikonu w temperaturze 72 °C i końcowe przedłużenie przez 10 minut w temperaturze 72 °C. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
    8. Potwierdzić prawidłową wielkość amplifikacji za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (patrz 1.2.4-1.2.5), używając tylko 5 μl każdej reakcji. Oczyść amplikon PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR i protokołu producenta. Oczyszczone DNA przechowywać w temperaturze -20 ºC.
  3. Plazmid odzyskiwania genu pK184
    1. Zaprojektuj starter do przodu, zaczynając od jego końca 5' i idąc w kierunku końca 3' w następującej kolejności: (a) wybierz 4 losowe nukleotydy (połączenie adeniny, tyminy, guaniny i cytozyny) w celu zwiększenia wydajności cięcia, przyłączone do (b) sekwencji miejsca cięcia enzymu restrykcyjnego EcoRI (RE) (GAATTC), a następnie (c) sekwencji nukleotydowej o długości 21-25 pz, która jest homologiczna do końca 5' genu będącego przedmiotem zainteresowania, w tym kodon START. Jeśli gen docelowy zawiera miejsce EcoRI, wybierz inny odpowiedni RE z miejsca wielokrotnego klonowania pK184.
    2. Zaprojektuj starter odwrotny w następującej kolejności: (a) wybierz 4 losowe nukleotydy pod kątem wydajności cięcia, a następnie (b) sekwencję miejsca cięcia HindIII (AAGCTT), a następnie (c) odwrotny dopełniacz o długości 21-25 pz końca 3' interesującego genu, w tym kodon stop. Jeśli gen docelowy zawiera miejsce HindIII, wybierz inny RE w miejscu wielokrotnego klonowania pK184.
    3. W przypadku genów kodujących białka peryplazmatyczne należy uwzględnić dodatkową sekwencję lidera między miejscem RE a kodonem start na starterze do przodu.
    4. Korzystając z dowolnego dostępnego oligoanalizatora, sprawdź, czy startery mają zawartość GC między 40-60%, niską gęstość włosów Tm, niską samo-i heterodimeryzację TM. Zamów startery do syntezy.
    5. Hodować kulturę O/N komórek DY330R pOX38-Tc w sterylnym LB zawierającym 10 μg/ml tetracykliny (Tc) z wytrząsaniem w temperaturze 32 ºC i 200 obr./min. Odwirować 6-8 ml kultury O/N w temperaturze pokojowej, 5 000 x g przez 3 min. Zdekantować supernatant i wyekstrahować plazmidowe DNA z osadu za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu (tabela materiałów) i protokołu producenta.
    6. Amplifikuj cały gen będący przedmiotem zainteresowania starterami z 1.3.1-1.3.5, używając pOX38-Tc jako matrycy (patrz 1.2.7.1-1.2.7.3).
    7. Potwierdzić prawidłową wielkość amplifikacji za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (patrz 1.2.4-1.2.5), używając tylko 5 μl każdej reakcji. Oczyść amplifikowane DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR i protokołu producenta. Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
    8. Przeprowadzić podwójne trawienie zarówno dostępnego w handlu plazmidowego DNA pK184, jak i amplifikowanego genu (z ppkt 1.3.7.), dodając do sterylnej probówki w podanej kolejności: odpowiednią objętość ddH2O do końcowej objętości 50 μL, 1 μg objętość plazmidu pK184, 5 μL 10x bufor reakcji enzymatycznej, i 1 μL każdego EcoRI i HindIII.
      1. Delikatnie wymieszać pipetując i pozostawić reakcję w toku przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Podgrzewać inaktywację reakcji przez 20 minut w temperaturze 80 °C. Przechowywać próbki w temperaturze -20 °C nie dłużej niż 24 godziny, aby zminimalizować degradację lepkich końców.
        Uwaga: Rodzaj zastosowanej tutaj nukleazy restrykcyjnej zależy od miejsca nukleazy restrykcyjnej, które zostało zaprojektowane w starterach w krokach 1.3.1 i 1.3.2.
      2. Jako kontrolę pozytywną, ustawić pojedyncze trawienia plazmidu pK184, przygotowując taką samą reakcję jak w 1.3.8, z wyjątkiem dodania tylko jednego z RE do probówki reakcyjnej. Zrób to oddzielnie dla obu RE.
    9. Uruchom trawienie na 1,2% żelu agarozowym, korzystając z protokołów 1.2.4-1.2.5 Wyodrębnij podwójne fragmenty DNA zarówno pK184, jak i genu będącego przedmiotem zainteresowania zgodnie z krokiem 1.2.6.
    10. Zligować wstawkę genu do wektora pK184, dodając składniki do sterylnej probówki w następującej kolejności: 2 μL 10x buforu ligazy DNA T4, łącznie 100 ng DNA złożonego ze stosunku wektor:insert 1:3 (pK184:gen), ddH2O do całkowitej objętości 20 μL i 1 μL ligazy DNA T4. Jako kontrolę negatywną ustaw podobną reakcję przy użyciu 100 ng wektora bez genu insercyjnego.
      1. Delikatnie wymieszać całą zawartość reakcji za pomocą mikropipety i inkubować przez 30 minut w temperaturze 25 °C. Reakcję ligacji dezaktywować termicznie przez 10 minut w temperaturze 65 °C, a następnie umieścić na lodzie.
    11. Będąc na lodzie, dodaj 15 μl reakcji ligacji genu pK184 z kroku 1.3.10 do 100 μl chemicznie kompetentnych komórek DH5α w sterylnej probówce o pojemności 1,5 ml. Delikatnie wymieszać pipetując i inkubować na lodzie przez 10 minut. To samo należy zrobić z ujemną próbą kontrolną. Do kontroli pozytywnej użyj 20-100 ng plazmidu, takiego jak pBAD33 i przekształć go w 50 μl komórek DHα.
    12. Bezpośrednio przenieść próbki z lodu do łaźni wodnej o temperaturze 42 °C i inkubować przez 90 sekund. Zapewnia to komórkom szok cieplny i pozwala im na wychwyt plazmidowego DNA.
    13. Umieść komórki z powrotem na lodzie na kolejne 5 minut, a następnie dodaj 900 μl sterylnego LB. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, wstrząsając z prędkością 125 obr./min.
    14. Podwielokrotność 100 μl próbki z każdej reakcji ligacji w ppkt 1.3.13 ułożyć na płytkę agarową zawierającą 50 μg/ml kanamycyny (Km) i rozprowadzić komórki za pomocą sterylnego rozsiewacza. Na płytce kontroli pozytywnej powinny znajdować się odpowiednie antybiotyki. Utrzymuj obszar w sterylnym stanie i pracuj w pobliżu płomienia. Inkubować płytkę do góry nogami w temperaturze 37 °C przez noc.
    15. Za pomocą sterylnej pipety lub pętli zbierz pojedynczą odrębną kolonię komórek i zaszczep sterylny LB o pojemności 20 ml za pomocą 50 μg/ml Km. Utrzymuj obszar w sterylnej pozycji i pracuj w pobliżu płomienia. Hodować komórki O/N w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
    16. Wykonaj 3-5 zapasów glicerolu z przekształconych komórek DH5α, mieszając 500 μl kultury O/N z 500 μL sterylnego 100% glicerolu (końcowe 50% v/v) w sterylnych krioprobówkach. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
    17. Należy również odwirować 6-8 ml kultury O/N w temperaturze pokojowej, 5 000 x g przez 3 minuty. Zdekantować supernatant i wyekstrahować plazmid odzyskiwania genu pK184 z osadu za pomocą zestawu do mini-przygotowania plazmidu (tabela materiałów) i protokołu producenta.
  4. Mutanty genu pK184
    Uwaga: Startery przeznaczone do delecji, insercji i/lub mutacji punktowych można łatwo wygenerować za pomocą narzędzi dostępnych online przez producentów.
    1. Zaprojektuj każdy starter do przodu, wybierając sekwencję nukleotydową o długości 18-32 pz, która jest homologiczna do końca 5' genu będącego przedmiotem zainteresowania, w tym kodonu start. Zaprojektuj startery w taki sposób, aby każdy starter do przodu wyżarzał się 30-180 pz za poprzednim, co skutkuje mutantami delecji pozbawionymi N-końcowych fragmentów peptydu o odpowiednich długościach.
    2. Zaprojektuj odwrócony starter, wybierając sekwencję nukleotydową o długości 18-32 pz, która jest homologiczna do końca 3' interesującego genu, w tym kodonu stop. Skopiuj ten elementarz do dowolnego dostępnego programu bioinformatycznego i przekształć sekwencję w jej odwrotne dopełnienie. To jest odwrócony starter.
      1. W przypadku genów kodujących białka peryplazmatyczne należy zaprojektować starter odwrotny, który jest odwrotnym dopełnieniem końca 3' sekwencji lidera, która flankuje koniec genu 5' i jest wymagana do prawidłowej lokalizacji produktu białkowego w peryplazmie.
    3. Korzystając z dowolnego dostępnego programu do analizy oligo, sprawdź, czy startery delecyjne mają zawartość GC między 40-60%, niską temperaturę topnienia spinki do włosów (Tm), niską samo- i heterodimeryzację TM. Zamów startery do syntezy i wysyłki w dowolnej dostępnej firmie biotechnologicznej.
    4. Korzystając z konstruktu genu pK184 uzyskanego w Protokole 1.3 jako matrycy i wytycznych w 1.2.7-1.2.8, PCR amplifikuje konstrukty delecji za pomocą starterów zaprojektowanych w krokach 1.4.1-1.4.3 w celu wygenerowania amplikonówΔX genu pK184. Amplifikowane DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
    5. Zwiąż amplifikowany konstrukt za pomocą dowolnego dostępnego zestawu do mutagenezy (Tabela Materiałów).
    6. Przekształć każdy z ligatówΔX genu pK184 oddzielnie w chemicznie kompetentne komórki DH5α przy użyciu standardowego protokołu szoku cieplnego (patrz 1.3.11-1.3.13).
    7. Porcjować 100 μl objętości próbki z każdej reakcji ligacji w ppkt 1.4.12 na płytkę agarową zawierającą 50 μg/ml Km i rozprowadzić komórki za pomocą sterylnego rozsiewacza. Utrzymuj obszar w sterylnym stanie i pracuj w pobliżu płomienia. Inkubować płytkę do góry nogami w temperaturze 37 °C przez noc.
    8. Za pomocą sterylnej pipety lub pętli zbierz pojedynczą odrębną kolonię komórek i zaszczep sterylną pożywkę LB o pojemności 20 ml za pomocą 50 μg/ml Km. Utrzymuj obszar sterylny i pracuj w pobliżu płomienia. Hodować komórki O/N w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
    9. Wykonaj 3-5 zapasów glicerolu z przekształconych komórek DH5α, mieszając 500 μl kultury O/N z 500 μL sterylnego 100% glicerolu (końcowe 50% v/v) w sterylnych krioprobówkach. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
    10. Odwirować 6-8 ml kultury O/N w temperaturze pokojowej, 5 000 x g przez 3 minuty. Zdekantować supernatant i wyekstrahować konstrukt plazmidu ΔX genu pK184 z osadu za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu (tabela materiałów) i protokołu producenta. DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Generacja szczepów pOX38-Tc Δgene::Cm

  1. DY330R pOX38-Tc Δgene::Cm nokauty
    1. Przygotować hodowlę O/N komórek DY330R pOX38-Tc w 10 ml sterylnego LB zawierającego 10 μg/ml Tc. Hodować kulturę O/N w temperaturze 32 °C i 200 obr./min.
    2. Rozcieńczyć kulturę O/N w stosunku 1:70 do 20 ml świeżego sterylnego LB. Hodować komórki w temperaturze 32 °C aż do wzrostu w połowie fazy logarytmicznej (OD600nm 0,4-0,6).
    3. Przenieść 10 ml kultury do sterylnej kolby i inkubować w temperaturze 42 °C przez 15 minut przy 150 obr./min w wytrząsającej łaźni wodnej. Spowoduje to ekspresję białek specyficznych dla rekombinacji w DY330R.
    4. Schłodzić kulturę w lodowatej kąpieli wodnej przez 10 minut. Przygotować elektrokompetentne ogniwa w następujący sposób.
      1. Przenieść schłodzone komórki do wstępnie schłodzonych stożkowych probówek i odwirować przy 4 000 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Wszystkie probówki i pipety, które mają być użyte w kolejnych krokach, należy umieścić w temperaturze 4 °C lub na lodzie do ostygnięcia.
      2. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić komórki w 1 ml lodowatego ddH2O. Dodać kolejne 30 ml lodowatego ddH2O.
      3. Odwirować komórki (4 000 x g, 7 min, 4 °C), odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić komórki w 1 ml lodowatego ddH2O.
      4. Przenieść zawieszone komórki do wstępnie schłodzonych probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 ºC.
      5. Delikatnie zawiesić osad w 200 μl lodowatego ddH2O i podwielokrotność w objętości 50 μl. Elektrokompetentne ogniwa mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C
    5. Dodać 300 ng amplifikowanej kasety CAT z 1,2 do 50 μl elektrokompetentnych ogniw DY330R pOX38-Tc, mieszając na lodzie, delikatnie pipetując w górę iw dół. Powtórz ten krok, używając niezmodyfikowanego plazmidu pBAD33 jako kontroli pozytywnej.
    6. Przenieść ogniwa do wstępnie schłodzonej (-20 °C) kuwety elektroporacyjnej o średnicy 1 mm. Elektroporować ogniwa napięciem 1,8 kV ze stałą czasową 5,5 ms, za pomocą elektroporatora. Natychmiast po zastosowaniu impulsu rozcieńczyć komórki 1 ml pożywki SOC i przenieść do świeżej probówki do mikrofuge. Inkubować komórki w temperaturze 32 °C przez 2 godziny.
    7. Porcję 100 μl każdej próbki rozprowadzić na płytkach agarowych zawierających 10 μg/ml Tc i 20 μg/ml Cm i rozprowadzić za pomocą sterylnego rozsiewacza. Utrzymuj obszar w sterylnym stanie i pracuj w pobliżu płomienia. Inkubować płytkę do góry dnem w temperaturze 32 °C przez noc, aby wybrać skuteczne rekombinanty. Kaseta CAT wprowadzona do komórki przejdzie rekombinację homologiczną z genem będącym przedmiotem zainteresowania i stworzy klon DY330R pOX38-Tc Δgene::Cm (RifR,Tc R, CmR).
      Uwaga: Ważne jest, aby hodować ogniwa DY330R w temperaturze 32 °C, z wyjątkiem 15-minutowej indukcji w temperaturze 42 °C w kroku 2.1.3 przed wytworzeniem ogniw elektrokompetentnych, ponieważ długotrwały wzrost w podwyższonych temperaturach grozi śmiercią komórki z powodu wytwarzania toksycznych produktów z operonu pL odpowiedzialnego za funkcje rekombinacji w DY330R. 33,34
      8. pkt.
    8. Przygotuj O/N komórek DY330R pOX38-Tc Δgen::Cm, zbierając pojedynczą odrębną kolonię komórek za pomocą sterylnej pipety lub pętli i zaszczepiając 20 ml sterylnej pożywki LB 10 μg/ml Tc i 20 μg/ml Cm. Utrzymuj obszar sterylny i pracuj w pobliżu płomienia. Hodować komórki O/N w temperaturze 32 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
    9. Przygotuj 3-5 zapasów glicerolu z O/N, mieszając 500 μl kultury O/N z 500 μL sterylnego 100% glicerolu (końcowe 50% v/v) w sterylnych krioprobówkach. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
    10. Odwirować 6-8 ml kultury O/N w temperaturze pokojowej, 5 000 x g przez 3 minuty. Zdekantować supernatant i wyekstrahować konstrukt pOX38-Tc Δgen::Cm z osadu za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu (tabela materiałów) i protokołu producenta; przechowywać oczyszczone DNA w temperaturze -20 °C.
    11. Wykonaj test kojarzenia koniugacyjnego przy użyciu komórek XK1200 jako biorcy, aby potwierdzić zakłócenie koniugacji przez nokaut genu zgodnie z protokołem 3.1.
  2. DY330R pOX38-Tc Δgen::Cm + pK184-gen
    1. Przekształć elektrokompetentne komórki DY330R pOX38-Tc Δgen::Cm z 300 ng konstruktu genu pK184 za pomocą elektroporacji zgodnie z krokami 2.1.4-2.1.7. Wszystkie podłoża selektywne muszą zawierać 20 μg/ml cm i 50 μg/ml Km. Inkubować w temperaturze 32 °C. Regeneracyjny plazmid w elektroporowanych komórkach przywróci teraz funkcję znokautowanego genu w komórkach DY330R pOX38-Tc Δgene::Cm.
    2. Przygotować O/N komórek rekombinowanych genu DY330R pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184-gen, zbierając pojedynczą odrębną kolonię komórek za pomocą sterylnej pipety lub pętli i zaszczepiając 20 ml sterylnej pożywki LB 20 μg/ml Cm i 50 μg/ml Km. Utrzymuj obszar sterylny i pracuj w pobliżu płomienia. Hodować komórki O/N w temperaturze 32 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
    3. Przygotuj 3-5 zapasów glicerolu z O/N, mieszając 500 μl kultury O/N z 500 μL sterylnego 100% glicerolu (końcowe 50% v/v) w sterylnych krioprobówkach. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
    4. Wykonaj również protokół 3.1, aby wygenerować komórki rekombinowane XK1200 pOX38-Tc Δgene::CM.
  3. XK1200 pOX38-Tc Δgen::Cm + pK184-gen i mutanty
    1. Przygotować elektrokompetentne ogniwa XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm (od kroku 2.2.4).
    2. Oddzielnie elektroportować 300 ng plazmidów z mutacją genu pK184 lub pK184 do 50 μl elektrokompetentnych komórek XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm zgodnie z krokami 2.1.4-2.1.7. Wszystkie selektywne podłoża powinny zawierać 10 μg/ml kwasu nalidyksowego (Nal), 20 μg/ml Cm i 50 μg/ml Km i być inkubowane w temperaturze 37 °C.
    3. Przygotuj O/N komórek rekombinowanych genu XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm+ pK184-gen, zbierając pojedynczą odrębną kolonię komórek za pomocą sterylnej pipety lub pętli i zaszczepiając 20 ml sterylnego podłoża LB Nal, 20 μg/mL Cm i 50 μg/mL Km. Utrzymuj obszar sterylny i pracuj w pobliżu płomienia. Hodować komórki O/N w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
    4. Przygotuj 3-5 zapasów glicerolu z O/N, mieszając 500 μl kultury O/N z 500 μL sterylnego 100% glicerolu (końcowe 50% v/v) w sterylnych krioprobówkach. Przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Testy krycia koniugacyjnego

  1. Kojarzenie koniugacyjne w celu wygenerowania komórek XK1200 pOX38-Tc δgene::Cm
    1. Przygotować 20 ml sterylnej hodowli LB O/N komórek genu DY330R pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184 za pomocą sterylnej pipety lub pętli do zaszczepienia 20 ml sterylnego LB zawierającego 20 μg/ml Cm i 50 μg/ml Km bulionem glicerolu lub pojedynczą kolonią na płytce agarowej. Rosnąć w temperaturze 32 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Przygotuj to samo dla komórek XK1200 w 20 ml sterylnego LB z 10 μg/ml Nal, rosnącego w temperaturze 37 °C.
    2. Każdą kulturę rozcieńczyć oddzielnie w proporcji 1:70 w 2 ml sterylnego LB o tej samej zawartości antybiotyku; dodać glukozę do końcowego stężenia 100 mM do wszystkich komórek dawcy. Hodować komórki do środkowej fazy logarytmicznej (OD600 0,5-0,7) w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
    3. Odwirować (4 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C) w celu osadzenia komórek, wyrzucić supernatant, przemyć raz zimnym sterylnym LB w celu usunięcia antybiotyków i ponownie zawiesić komórki w 2 ml zimnego sterylnego LB.
    4. Podzielić 100 μl każdej kultury na 800 μl sterylnej pożywki LB i pozostawić do połączenia w temperaturze 32 °C przez 1 godzinę bez wstrząsania.
    5. Wiruj komórki przez 30 sekund, aby zakłócić par godowych i umieść je na lodzie na 10 minut, aby zapobiec dalszemu kryciu.
    6. Podwielokrotność 100 μl mieszaniny komórek na płytkę agarową zawierającą 10 μg/ml Nal i 20 μg/ml Cm w celu wybrania komórek XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm. Rozłóż komórki za pomocą sterylnego rozsiewacza. Utrzymuj obszar w sterylnym stanie i pracuj w pobliżu płomienia. Inkubować płytkę O/N w temperaturze 37 °C do góry nogami.
    7. Zbierz pojedynczą kolonię nowego szczepu XK1200 pOX38-Tc Δgen::Cm za pomocą sterylnej pipety lub pętli i hoduj w sterylnym LB z 20 μg/ml Cm, O/N w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Przygotuj 3-5 zapasów glicerolu z O/N, mieszając 500 μl kultury O/N z 500 μL sterylnego 100% glicerolu (końcowe 50% v/v) w sterylnych krioprobówkach. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
      Uwaga: Powstałe w ten sposób komórki mogą być teraz kompetentne do transformacji za pomocą konstruktów genu pK184 (protokoły 1.3 i 1.4) w celu oceny genu i jego mutantów pod kątem zdolności do odzyskania transferu koniugacyjnego w protokole 3.2.
  2. Test krycia koniugacyjnego od dawców XK1200 do biorców MC4100
    1. Przygotować kulturę O/N komórek XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184 w 20 ml sterylnych komórek LB z 20 μg/mL Cm, 50 μg/mL Km i MC4100 w 5 ml LB z 50 μg/ml streptomycyny (Sm) przy użyciu komórek z glicerolu lub pojedynczej kolonii na płytce agarowej i sterylnej pipecie lub pętli. Hoduj kultury w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem 200 obr./min.
    2. Wykonać rozcieńczenia w stosunku 1:70 z każdej kultury O/N oddzielnie w 2 ml sterylnego LB z tymi samymi antybiotykami. Dodać glukozę do końcowego stężenia 100 mM do wszystkich komórek dawcy. Hodować komórki do środkowej fazy logarytmicznej (OD600 0,5-0,7) w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
    3. Odwirować (4 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C) w celu osadzenia komórek, wyrzucić supernatant, przemyć raz zimnym sterylnym LB w celu usunięcia antybiotyków i ponownie zawiesić komórki w 2 ml zimnego sterylnego LB.
    4. Powtórzyć 100 μl każdej kultury na 800 μl sterylnej pożywki LB i pozostawić do połączenia w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę bez wstrząsania.
    5. Wiruj komórki przez 30 sekund, aby zakłócić par godowych i umieść je na lodzie na 10 minut, aby zapobiec dalszemu kryciu.
    6. Korzystając z kultur mid-log z kroku 3.2.2 i świeżego sterylnego LB, przygotować 6 seryjnych rozcieńczeń komórek dawcy i biorcy od 10-2 do 10-7.
    7. Na każdej z dwóch połówek płytki agarowej zawierającej 10 μg/ml Nal, 20 μg/ml Cm i 50 μg/ml Km umieścić 10 μl podwielokrotności każdego rozcieńczenia komórek dawcy XK1200, jak pokazano na rysunku 2. Powtórzyć dla rozcieńczeń komórek biorcy MC4100 na płytkach agarowych zawierających 50 μg/ml Sm. Inkubować płytki O/N w temperaturze 37 °C.
    8. Używając mieszaniny wirowej z kroku 3.2.5 i świeżego sterylnego LB, przygotować 6 rozcieńczeń (10-2 do 10-7) transkoniugantów. Wybrać dla transkoniugantu MC4100 pOX38-Tc Δgene::Cm, zauważając 10 μl podwielokrotności każdego z rozcieńczeń na każdej połówce płytek agarowych zawierających 50 μg/ml Sm i 20 μg/ml Cm, jak pokazano na rysunku 2. Powtórz dla obu zduplikowanych mieszanin. Utrzymuj obszar w sterylnym stanie i pracuj w pobliżu płomienia. Inkubować płytki O/N w temperaturze 37 °C.
    9. Określić skuteczność krycia każdego konstruktu zgodnie z opisem w protokole 3.3.
    10. Powtórz ten protokół dla wszystkich plazmidów regeneracyjnych, aby ocenić wpływ określonej mutacji na skuteczność koniugacji.
  3. Obliczanie efektywności krycia
    1. Policz liczbę kolonii z tego samego plamienia rozcieńczenia dla każdego dawcy, biorcy i komórek transkoniuganta na ich odpowiednich płytkach.
    2. Policz kolonie biorców, aby przetestować wszelkie odchylenia, które wynikałyby z posiadania większej liczby transkoniugantów niż biorców przy danym rozcieńczeniu.
    3. Oblicz efektywność krycia jako liczbę kolonii transkoniugantów podzieloną przez liczbę kolonii dawcy. Pomnóż przez 100, aby uzyskać wartość wydajności na 100 komórek dawcy.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proces koniugacji bakteryjnej opartej na plazmidzie F jest skoordynowanym procesem, który obejmuje przenoszenie białek w regionie tra plazmidu F, który składa T4SS w celu ułatwienia syntezy pilusa i transferu sprzężonego DNA. Białko TraF (akces GenBank # BAA97961; UniProt ID P14497) jest wymagany do sprzężonego tworzenia F-pilus. 10,14,35-37 Białko zawiera C-końcową domenę podobną do tioredoksyny, chociaż nie ma katalitycznego motywu CXXC. 35...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proces koniugacji bakterii zapewnia sposób, w jaki bakterie mogą rozprzestrzeniać geny, zapewniając ewolucyjną przewagę w rozwoju w trudnych warunkach, takich jak rozprzestrzenianie się markerów oporności na antybiotyki. Ponieważ wiele plazmidów koniugacyjnych jest tak dużych, badania funkcjonalne białek biorących udział w tworzeniu aparatu transferowego poprzez mutację genów docelowych na samym plazmidzie koniugacyjnym są nieporęczne. Protokoły wyszczególnione w niniejszym dokumencie zapewniają środki, za pom...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Grant Odkrywczy od Kanadyjskiej Rady Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zestaw do mini-przygotowania plazmidu GeneJetFisher ScientificK0503
Zestaw do ekstrakcji żelu GeneJetFisher ScientificK0692
Zestaw do mutagenezy ukierunkowanej na miejsce
N0303A Szalki
PetriegoFisher ScientificFB0875713
ElektroporatorEppendorf4309000027
Kuwety do elektroporacjiKuwety Fisher ScientificFB101mają odstęp 1 mm.
Enzymes
AvaINew England BiolabsR0152S
EcoRINew England BiolabsR0101S
HindIIINew England BiolabsR0104L
NdeINew England BiolabsR0111S
Phusion DNA Polimeraza NewEngland BiolabsM0530L
Ligaza DNA T4New England BiolabsM0202S
DpnINew England BiolabsR0176S
AntybiotykiStężenia końcowe
Chloramfenikol (cm)Fisher ScientificBP904-10020 &mikro; g/ml
Kanamycyny (km)BioBasic Inc.DB028650 &mikro; g/ml
kwasu nalidyksowego (Nal)Sigma-AldrichN8878-25G10 &mikro; g/ml
Ryfampicyna (Rif)Calbiochem55730320 &mikro; g/ml
Tetracyklina (Tc)Fisher ScientificBP912-10010 &mikro; g/ml
Streptomycyna (Sm)Fisher ScientificBP910-5050 µ g/ml
Zestaw do oczyszczania GeneJet PCR Fisher Scientific K0702 Q5 New England Biolabs E0554S Drabina DNA o szerokim zakresie New England Biolabs

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms. Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).
  2. Furuya, E. Y., Lowy, F. D. Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting. Nat Rev Microbiol. 4 (1), 36-45 (2006).
  3. Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R., Gelbart, W. An Introduction to Genetic Analysis, 7th Edition. , W.H. Freeman. San Fransisco. (2000).
  4. Cooper, T. F. Recombination Speeds Adaptation by Reducing Competition between Beneficial Mutations in Populations of Escherichia coli. PLoS Biol. Barton, N. H. 5 (9), 225(2007).
  5. Lujan, S. A., Guogas, L. M., Ragonese, H., Matson, S. W., Redinbo, M. R. Disrupting antibiotic resistance propagation by inhibiting the conjugative DNA relaxase. Proc Natl Acad Sci. 104 (30), 12282-12287 (2007).
  6. Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
  7. Shala, A., Ferraro, M., Audette, G. F. Bacterial Secretion Systems: Nanomachines for Infection and Genetic Diversity. Handbook of Clinical Nanomedicine: Nanoparticles, Imaging, Therapy and Clinical Applications. Bawa, R., Audette, G. F., Rubenstein, I. , Pan Sanford Publishing. Singapore. 657-686 (2016).
  8. Tseng, T. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), Suppl 1 2(2009).
  9. Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
  10. Lawley, T. D., Klimke, W. A., Gubbins, M. J., Frost, L. S. F factor conjugation is a true type IV secretion system. FEMS Microbiol Lett. 224 (1), 1-15 (2003).
  11. Lederberg, J., Tatum, E. L. Gene Recombination in Escherichia Coli. Nature. 158 (4016), 558-558 (1946).
  12. Smillie, C., Garcillan-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P. C., de la Cruz, F. Mobility of Plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
  13. Willetts, N., Skurray, R. The Conjugation System of F-Like Plasmids. Annu Rev Genet. 14 (1), 41-76 (1980).
  14. Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., Skurray, R. A. Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor. Microbiol Rev. 58 (2), 162-210 (1994).
  15. Audette, G. F., Manchak, J., Beatty, P., Klimke, W. A., Frost, L. S. Entry exclusion in F-like plasmids requires intact TraG in the donor that recognizes its cognate TraS in the recipient. Microbiology. 153, Pt 2 442-451 (2007).
  16. Christie, P. J., Atmakuri, K., Krishnamoorthy, V., Jakubowski, S., Cascales, E. Biogenesis, Architecture, and Function of Bacterial Type Iv Secretion Systems. Annu Rev Microbiol. 59 (1), 451-485 (2005).
  17. Christie, P. J. Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1694 (1-3), 219-234 (2004).
  18. Bhatty, M., Laverde Gomez, J. a, Christie, P. J. The expanding bacterial type IV secretion lexicon. Res Microbiol. 164 (6), 620-639 (2013).
  19. Christie, P. J., Cascales, E. Structural and dynamic properties of bacterial Type IV secretion systems (Review). Mol Membr Biol. 22 (1-2), 51-61 (2005).
  20. Christie, P. J. Type IV secretion: Intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines. Mol Microbiol. 40 (2), 294-305 (2001).
  21. Christie, P. J., Whitaker, N., González-Rivera, C. Mechanism and structure of the bacterial type IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1578-1591 (2014).
  22. Cascales, E. The type VI secretion toolkit. EMBO Rep. 9, 735(2008).
  23. Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. Structure and Regulation of the Type VI Secretion System. Annu Rev Microbiol. 66 (1), 453-472 (2012).
  24. Chandran, V., et al. Structure of the outer membrane complex of a type IV secretion system. Nature. 462 (7276), 1011-1015 (2009).
  25. Rivera-Calzada, A., et al. Structure of a bacterial type IV secretion core complex at subnanometre resolution. EMBO J. 32 (8), 1195-1204 (2013).
  26. Waksman, G., Fronzes, R. Molecular architecture of bacterial type IV secretion systems. Trends Biochem Sci. 35, 691(2010).
  27. Fronzes, R., Christie, P. J., Waksman, G. The structural biology of type IV secretion systems. Nat Rev Microbiol. 7 (10), 703-714 (2009).
  28. Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 5-9 (2015).
  29. Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 45, Pt 1 135-140 (1981).
  30. Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
  31. Jobling, M. G., Holmes, R. K. Construction of vectors with the pl5a replicon, kanamycin resistance, inducible lacZα and pUC18 or pUC19 multiple cloning sites. Nucleic Acids Res. 18 (17), 5315(1990).
  32. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P(BAD) promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
  33. Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5978-5983 (2009).
  34. Lawley, T. D., Gilmour, M. W., Gunton, J. E., Standeven, L. J., Taylor, D. E. Functional and Mutational Analysis of Conjugative Transfer Region 1 (Tra1) from the IncHI1 Plasmid R27. J Bacteriol. 184 (8), 2173-2180 (2002).
  35. Elton, T. C., Holland, S. J., Frost, L. S., Hazes, B. F-Like Type IV Secretion Systems Encode Proteins with Thioredoxin Folds That Are Putative DsbC Homologues. J Bacteriol. 187 (24), 8267-8277 (2005).
  36. Hazes, B., Frost, L. Towards a systems biology approach to study type II/IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1778, 1839-1850 (2008).
  37. Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. Tsolis, R. 590 (3), 376-386 (2016).
  38. Audette, G. F., Van Schaik, E. J., Hazes, B., Irvin, R. T. DNA-binding protein nanotubes: Learning from nature's nanotech examples. Nano Lett. 4, 1897-1902 (2004).
  39. Harris, R. L., Silverman, P. A. Tra proteins characteristic of F-like type IV secretion systems constitute an interaction group by yeast two-hybrid analysis. J Bacteriol. 186 (16), 5480-5485 (2004).
  40. Moore, D., et al. Characterization of the F-Plasmid Conjugative Transfer Gene traU. J Bacteriol. 172 (8), 4263-4270 (1990).
  41. Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
  42. Klimke, W. A., Frost, L. S. Genetic analysis of the role of the transfer gene, traN, of the F and R100-1 plasmids in mating pair stabilization during conjugation. J Bacteriol. 180 (16), 4036-4043 (1998).
  43. Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69 (1), 209-228 (2015).
  44. Dahlberg, C., Bergstrom, M., Andreasen, M., Christensen, B. B., Molin, S., Hermansson, M. Interspecies bacterial conjugation by plasmids from marine environments visualized by gfp expression. Mol Biol Evol. 15 (4), 385-390 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bacterial ConjugationConjugative Mating AssaysTransfer Protein AnalysisType Four Secretion SystemPlasmid Transfer EfficiencyGene Knockout MethodHomologous RecombinationMating Efficiency CalculationDonor Recipient CellsProtein protein Interactions

Related Articles