Testy kojarzenia koniugacyjnego do specyficznej dla sekwencji analizy białek transferowych biorących udział w koniugacji bakteryjnej

Transfer genów i białek na poziomie mikroorganizmów odgrywa kluczową rolę w przetrwaniu i ewolucji bakterii, jak również w procesach infekcji. Wymiana DNA między bakteriami lub między bakterią a komórką może być osiągnięta poprzez transformację, koniugację lub transdukcję wektorową. ^1,2 Koniugacja jest wyjątkowa w porównaniu z transformacją i transdukcją, ponieważ podczas koniugacji między bakteriami Gram-ujemnymi, takimi jak Escherichia coli, transfer DNA zachodzi w sposób kontrolowany przez dawcę, w którym złożony system makromolekularny łączy komórki dawcy i biorcy. Koniugacja jest również najbardziej bezpośrednim sposobem, w jaki komórki bakteryjne oddziałują z komórkami gospodarza w celu wstrzyknięcia genów, białek lub substancji chemicznych do systemów gospodarza. ³ Dość często przenoszenie takich czynników ma niezwykły wpływ na gospodarza, począwszy od patogenezy i kancerogenezy, a skończywszy na ewolucji i adaptacji gospodarza. Wykazano, że rekombinacja koniugacyjna zwiększa 3-krotnie szybkość adaptacji u bakterii o wysokim wskaźniku mutacji w warunkach stresu środowiskowego. ⁴ Co więcej, koniugacja jest zdecydowanie najczęstszą drogą, za pomocą której rozprzestrzeniają się geny oporności na antybiotyki w szczepach bakteryjnych. ^5,6

Mikroorganizmy wyewoluowały wyspecjalizowane systemy wydzielania, aby wspierać przenoszenie makrocząsteczek przez błony komórkowe; obecnie istnieje 9 typów systemów wydzielania (TSS) u bakterii Gram-ujemnych, które zostały opisane: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, a także szlaki Sec (wydzielanie) i Tat (translokacja dwu-argininowa). ^7,8 Każdy typ systemu wydzielania jest dalej podzielony na różne podtypy, co jest konieczne ze względu na różnorodność białek i odrębność zaangażowanych szlaków w różnych szczepach bakteryjnych. Na przykład w systemie wydzielania typu IV (T4SS) systemy Ti i Cag ułatwiają transport efektorowy, podczas gdy F-plazmid, R27 i pKM101 T4SS ułatwiają transfer plazmidu sprzężonego. ^7,9,10 Szczegółowe zrozumienie mechanizmów, za pomocą których organizmy składają swoje odpowiednie systemy wydzielania z białek składowych i dzielą zawartość komórkową z biorcą lub otaczającym go środowiskiem, jest ważnym czynnikiem w rozwoju ukierunkowanych strategii zwalczania drobnoustrojów chorobotwórczych i procesów infekcji komórkowych.

Po wstępnej identyfikacji koniugacji bakteryjnej w E. coli przez Lederberga i ^Tatuma,11 zidentyfikowano i scharakteryzowano dużą liczbę plazmidów ruchomych i koniugacyjnych. ¹² Takie ruchome plazmidy wykazują znaczny zakres wielkości (od 1 do ponad 200 kilozasad (kb)), jednak wszystkie ruchome plazmidy zawierają relaksazę, która rozpoznaje początek transferu (oriT), umożliwiając w ten sposób transmisję plazmidu. Plazmidy koniugacyjne dodatkowo kodują geny do składania funkcjonalnego T4SS, a także białka sprzęgającego typu IV. ¹² Na przykład plazmid F E. coli o wielkości 100 kb koduje wszystkie geny koniugacyjne w regionie transferu (tra) o długości 33,3 kB. ¹³ Geny w regionie tra plazmidu F kodują wszystkie białka, które ułatwiają tworzenie pilusa, tworzenie par godowych (Mpf), transfer DNA i funkcje wykluczania podczas sprzężonego transferu plazmidu. ^10,14,15 Znaczna część wiedzy na temat koniugacyjnych T4SS jest dostępna, jednak szczegółowe badania strukturalne białek i kompleksów koniugacyjnych stają się dostępne dopiero niedawno. ^{16-28 Rozdział 16-28}

Aby stworzyć całościowy obraz procesu koniugacyjnego, wymagane jest połączenie szczegółowych badań strukturalnych z analizami mutacji sprzęganych białek transferowych. Można to osiągnąć za pomocą testów kojarzenia koniugacyjnego. W przypadku plazmidu F każde białko kodowane w regionie tra odgrywa rolę w koniugacji za pośrednictwem F; w związku z tym nokaut / delecja genu transferowego zniesie zdolność koniugacyjną komórki (ryc. 1). Podczas gdy mniejsze ruchome plazmidy bardziej sprzyjają standardowym procedurom delecji, w przypadku większych plazmidów sprzężonych, takich jak F, nokauty genów są łatwiejsze do osiągnięcia poprzez rekombinację homologiczną, w której gen docelowy jest zastępowany genem przenoszącym odrębny gen oporności na antybiotyki. W obecnym protokole stosujemy rekombinację homologiczną w celu zastąpienia interesującego genu transferu acetylotransferazą chloramfenikolu (CAT) w pochodnej plazmidu F o pojemności 55 kb pOX38-Tc; ^29,30 powstały plazmid nokautujący, pOX38-Tc Δgene::Cm, zwiększa odporność na obecność chloramfenikolu (Cm) w pożywce wzrostowej. Komórki dawcy zawierające pOX38-Tc Δgen::Cm nie są w stanie wpływać na sprzęgany transfer/kojarzenie DNA, co zaobserwowano za pomocą testu kojarzenia; skuteczność krycia komórki dawcy pOX38-Tc Δgene::Cm i normalnego biorcy zmniejszy się lub, częściej, zostanie zniesiona. Sprzężony transfer plazmidu Δgen pOX38-Tc::Cm może zostać przywrócony za pomocą małego plazmidu regeneracyjnego, w którym znajduje się gen docelowego transferu. Ten plazmid regeneracyjny może być taki, który zapewnia konstytutywną ekspresję, taki jak plazmid pK184 (gen pK184^{) lub taki}, który zapewnia indukowaną ekspresję, o ile plazmid prawidłowo kieruje gen do właściwego miejsca w komórce (cytoplazma lub peryplazma). W związku z tym, w testach kojarzenia między tym nowym dawcą (zawierającym plazmidy genu pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184-gen) a komórką biorcy, oczekuje się, że skuteczność krycia powróci do prawie takiej samej jak w normalnym teście kojarzenia dawca-biorca. System ten umożliwia badanie funkcji znokautowanego genu poprzez generowanie serii konstruktów genu pK184 (delecje lub mutacje punktowe) i testowanie zdolności każdego konstruktu do przywrócenia zdolności kojarzenia pOX38-Tc Δgen::Cm zawierającego komórki dawcy.

1. Generowanie konstruktów DNA

1. Projektowanie oligomerów do homologicznej rekombinacji genu docelowego
   1. Zaprojektuj pojedynczy oligomer do przodu 55-72 pz w następujący sposób: (a) wybierz sekwencję nukleotydową o długości 19-32 pz, która jest homologiczna do sekwencji DNA w regionie 10-100 pz przed miejscem początkowym 5' genu acetylotransferazy chloramfenikolu w komercyjnym plazmidzie pBAD33, ³² i (b) wybierz sekwencję nukleotydową o długości 36-54 pz homologiczną do regionu 10-150 pz za miejscem początkowym 5' docelowego genu będącego przedmiotem zainteresowania.
      1. Połącz koniec 3' sekwencji nukleotydowej wybranej w (b) z końcem 5' sekwencji nukleotydowej wybranej w (a), uzyskując w ten sposób pojedynczy oligomer 55-72 long forward.
   2. Zaprojektuj pojedynczy odwrócony oligomer 55-72 pz w następujący sposób: (a) wybierz sekwencję nukleotydową o długości 19-32 pz, która jest homologiczna do sekwencji DNA w regionie 10-100 pz poniżej końca 3' genu chloramfenikolu w komercyjnym plazmidzie pBAD33 i (b) wybierz sekwencję nukleotydową o długości 36-54 pz homologiczną do regionu w zakresie 10-150 pz przed miejscem końcowym 3' docelowego genu.
      1. Połącz koniec 3' sekwencji nukleotydowej wybranej w (b) z końcem 5' sekwencji nukleotydowej wybranej w (a), aby uzyskać pojedynczy oligomer.
      2. Skopiuj ten oligomer do dowolnego dostępnego oprogramowania bioinformatycznego i przekształć sekwencję w jej odwrotne dopełnienie. Da to pojedynczy odwrócony oligomer o długości 55-72 pz.
   3. Korzystając z dowolnego dostępnego programu oligoanalizatora, sprawdź, czy oligomery rekombinacyjne mają zawartość GC między 40-60%, niską temperaturę topnienia spinki do włosów (T_m), niską samo- i heterodimeryzację TM. Zamów startery do syntezy i wysyłki w dowolnej preferowanej firmie biotechnologicznej.
2. Amplifikacja kasety CAT z plazmidu pBAD33 (Cm^R) przy użyciu oligomerów przeznaczonych do parowania homologicznego
   1. Hodować przez noc (O/N, 16-18 h) hodowlę komórek DH5α zawierających plazmid pBAD33 w sterylnym bulionie lizogenicznym (LB) z 20 μg/ml chloramfenikolu (Cm) z wytrząsaniem przy 200 obr./min i 37 °C.
   2. Odwirować 6-8 ml kultury O/N w temperaturze pokojowej, 5 000 x g przez 3 minuty. Zdekantować supernatant i wyekstrahować plazmid pBAD33 z osadu za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu (tabela materiałów) i protokołu producenta.
   3. Przeprowadzić trawienie plazmidowego DNA pBAD33, dodając następujące składniki do sterylnej probówki w podanej kolejności: odpowiednia objętość podwójnie destylowanej wody (ddH₂O) do końcowej objętości 50 μL, 1 μg objętość plazmidu pBAD33, 5 μl 10x buforu reakcji enzymatycznej i 0,5 μL enzymu restrykcyjnego AvaI (RE). Delikatnie wymieszać pipetując i pozostawić reakcję w toku przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Ogrzewać dezaktywację reakcji przez 20 minut (min) w temperaturze 80 °C. Przechowywać próbki w temperaturze -20 °C nie dłużej niż 24 godziny, aby zminimalizować degradację lepkich końcówek.
   4. Przygotować 1,2% żel rozdzielający agarozę, mieszając 1,2 g agarozy ze 100 ml 1x buforu TAE (40 mM Tris, pH 8,5; 20 mM kwasu octowego; 1 mM EDTA) w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Podgrzej i zawiruj, aby całkowicie rozpuścić się w kuchence mikrofalowej. Natychmiast przerwij ogrzewanie, gdy ciecz zacznie wrzeć i zakręć kolbą.
      1. Schłodzić płynną agarozę przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, wirując, dodać 2 μl 10 mg/ml bromku etydyny i zamieszać do wymieszania. Wlej agarozę do tacki na żel ze dobrze nasadzonym grzebieniem i pozostaw do zestalenia się na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przechowywać żele w temperaturze 4 °C do 2 dni w 1x buforze TAE.
   5. Zmieszać każdy RE wytrawiony z 1.2.3 z 0,2 objętości barwnika ładującego DNA (10 μl barwnika na 50 μl reakcji) przez pipetowanie. Załadować 5 μl drabinki DNA o stężeniu 500 μg/ml do pierwszego dołka, a całą mieszaninę RE digest-dye do innego dołka na żelu agarozowym. Użyj 2-3 dołków, aby załadować całą objętość reakcji na żel.
      1. Uruchom żel ledwo zanurzony w buforze 1x TAE i działający pod napięciem 45-50 V (4,5-5 V/cm) przez 65 minut w urządzeniu do elektroforezy żelowej.
   6. Korzystając z szafki UV i sterylnej maszynki do golenia, szybko wytnij z żelu pasmo 2,8 kb, które odpowiada sekwencji CAT, aby zminimalizować ekspozycję DNA na promieniowanie UV. Wyodrębnij DNA z wyciętego plastra żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (tabela materiałów) zgodnie z protokołem producenta.
      Uwaga: Uważaj, aby nie wystawiać skóry bezpośrednio na promieniowanie UV i obchodzić się z maszynką do golenia ostrożnie.
   7. Amplifikować kasetę CAT wyekstrahowaną z 1.2.6 przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) przy użyciu starterów zaprojektowanych w 1.1, które zawierają zwisy homologiczne do sekwencji genu, aby umożliwić rekombinację homologiczną. Reakcje PCR przeprowadza się na lodzie zgodnie z wytycznymi producenta (tabela materiałów) w następującej kolejności:
      1. Do sterylnej probówki PCR dodać odpowiednią objętość ddH₂O do końcowej objętości 50 μL, a następnie 10 μl buforu PCR, 1 μl 10 mM dNTP, 2,5 μl 10 μM startera do przodu, 2,5 μL 10 μM startera wstecznego, 1-25 ng matrycy DNA z 1.2.6 i 0,5 μl 100 jednostek/μl polimerazy DNA.
      2. Ustanowić kontrolę ujemną, która zawiera te same składniki co w ppkt 1.2.7.1, ale z wyjątkiem matrycowego DNA. Użyj odpowiedniej objętości ddH₂O zamiast matrycowego DNA. Ustaw kontrolę pozytywną przy użyciu matrycy DNA i starterów, które udowodniono działanie w reakcji PCR, takich jak te dostarczone przez producenta jako kontrola pozytywna.
      3. Delikatnie wymieszać całą zawartość reakcji, pipetując.
      4. Amplifikować metodą PCR przy użyciu następujących ustawień: początkowa denaturacja przez 30 s w temperaturze 98 °C, 30 cykli denaturacji przez 10 s w temperaturze 98 °C, wyżarzanie startera przez 20 s, przedłużenie przez 20 s na kilobazę amplikonu w temperaturze 72 °C i końcowe przedłużenie przez 10 minut w temperaturze 72 °C. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
   8. Potwierdzić prawidłową wielkość amplifikacji za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (patrz 1.2.4-1.2.5), używając tylko 5 μl każdej reakcji. Oczyść amplikon PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR i protokołu producenta. Oczyszczone DNA przechowywać w temperaturze -20 ºC.
3. Plazmid odzyskiwania genu pK184
   1. Zaprojektuj starter do przodu, zaczynając od jego końca 5' i idąc w kierunku końca 3' w następującej kolejności: (a) wybierz 4 losowe nukleotydy (połączenie adeniny, tyminy, guaniny i cytozyny) w celu zwiększenia wydajności cięcia, przyłączone do (b) sekwencji miejsca cięcia enzymu restrykcyjnego EcoRI (RE) (GAATTC), a następnie (c) sekwencji nukleotydowej o długości 21-25 pz, która jest homologiczna do końca 5' genu będącego przedmiotem zainteresowania, w tym kodon START. Jeśli gen docelowy zawiera miejsce EcoRI, wybierz inny odpowiedni RE z miejsca wielokrotnego klonowania pK184.
   2. Zaprojektuj starter odwrotny w następującej kolejności: (a) wybierz 4 losowe nukleotydy pod kątem wydajności cięcia, a następnie (b) sekwencję miejsca cięcia HindIII (AAGCTT), a następnie (c) odwrotny dopełniacz o długości 21-25 pz końca 3' interesującego genu, w tym kodon stop. Jeśli gen docelowy zawiera miejsce HindIII, wybierz inny RE w miejscu wielokrotnego klonowania pK184.
   3. W przypadku genów kodujących białka peryplazmatyczne należy uwzględnić dodatkową sekwencję lidera między miejscem RE a kodonem start na starterze do przodu.
   4. Korzystając z dowolnego dostępnego oligoanalizatora, sprawdź, czy startery mają zawartość GC między 40-60%, niską gęstość włosów T_m, niską samo-i heterodimeryzację TM. Zamów startery do syntezy.
   5. Hodować kulturę O/N komórek DY330R pOX38-Tc w sterylnym LB zawierającym 10 μg/ml tetracykliny (Tc) z wytrząsaniem w temperaturze 32 ºC i 200 obr./min. Odwirować 6-8 ml kultury O/N w temperaturze pokojowej, 5 000 x g przez 3 min. Zdekantować supernatant i wyekstrahować plazmidowe DNA z osadu za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu (tabela materiałów) i protokołu producenta.
   6. Amplifikuj cały gen będący przedmiotem zainteresowania starterami z 1.3.1-1.3.5, używając pOX38-Tc jako matrycy (patrz 1.2.7.1-1.2.7.3).
   7. Potwierdzić prawidłową wielkość amplifikacji za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (patrz 1.2.4-1.2.5), używając tylko 5 μl każdej reakcji. Oczyść amplifikowane DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR i protokołu producenta. Oczyszczone DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
   8. Przeprowadzić podwójne trawienie zarówno dostępnego w handlu plazmidowego DNA pK184, jak i amplifikowanego genu (z ppkt 1.3.7.), dodając do sterylnej probówki w podanej kolejności: odpowiednią objętość ddH₂O do końcowej objętości 50 μL, 1 μg objętość plazmidu pK184, 5 μL 10x bufor reakcji enzymatycznej, i 1 μL każdego EcoRI i HindIII.
      1. Delikatnie wymieszać pipetując i pozostawić reakcję w toku przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Podgrzewać inaktywację reakcji przez 20 minut w temperaturze 80 °C. Przechowywać próbki w temperaturze -20 °C nie dłużej niż 24 godziny, aby zminimalizować degradację lepkich końców.
         Uwaga: Rodzaj zastosowanej tutaj nukleazy restrykcyjnej zależy od miejsca nukleazy restrykcyjnej, które zostało zaprojektowane w starterach w krokach 1.3.1 i 1.3.2.
      2. Jako kontrolę pozytywną, ustawić pojedyncze trawienia plazmidu pK184, przygotowując taką samą reakcję jak w 1.3.8, z wyjątkiem dodania tylko jednego z RE do probówki reakcyjnej. Zrób to oddzielnie dla obu RE.
   9. Uruchom trawienie na 1,2% żelu agarozowym, korzystając z protokołów 1.2.4-1.2.5 Wyodrębnij podwójne fragmenty DNA zarówno pK184, jak i genu będącego przedmiotem zainteresowania zgodnie z krokiem 1.2.6.
   10. Zligować wstawkę genu do wektora pK184, dodając składniki do sterylnej probówki w następującej kolejności: 2 μL 10x buforu ligazy DNA T4, łącznie 100 ng DNA złożonego ze stosunku wektor:insert 1:3 (pK184:gen), ddH₂O do całkowitej objętości 20 μL i 1 μL ligazy DNA T4. Jako kontrolę negatywną ustaw podobną reakcję przy użyciu 100 ng wektora bez genu insercyjnego.
       1. Delikatnie wymieszać całą zawartość reakcji za pomocą mikropipety i inkubować przez 30 minut w temperaturze 25 °C. Reakcję ligacji dezaktywować termicznie przez 10 minut w temperaturze 65 °C, a następnie umieścić na lodzie.
   11. Będąc na lodzie, dodaj 15 μl reakcji ligacji genu pK184 z kroku 1.3.10 do 100 μl chemicznie kompetentnych komórek DH5α w sterylnej probówce o pojemności 1,5 ml. Delikatnie wymieszać pipetując i inkubować na lodzie przez 10 minut. To samo należy zrobić z ujemną próbą kontrolną. Do kontroli pozytywnej użyj 20-100 ng plazmidu, takiego jak pBAD33 i przekształć go w 50 μl komórek DHα.
   12. Bezpośrednio przenieść próbki z lodu do łaźni wodnej o temperaturze 42 °C i inkubować przez 90 sekund. Zapewnia to komórkom szok cieplny i pozwala im na wychwyt plazmidowego DNA.
   13. Umieść komórki z powrotem na lodzie na kolejne 5 minut, a następnie dodaj 900 μl sterylnego LB. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, wstrząsając z prędkością 125 obr./min.
   14. Podwielokrotność 100 μl próbki z każdej reakcji ligacji w ppkt 1.3.13 ułożyć na płytkę agarową zawierającą 50 μg/ml kanamycyny (Km) i rozprowadzić komórki za pomocą sterylnego rozsiewacza. Na płytce kontroli pozytywnej powinny znajdować się odpowiednie antybiotyki. Utrzymuj obszar w sterylnym stanie i pracuj w pobliżu płomienia. Inkubować płytkę do góry nogami w temperaturze 37 °C przez noc.
   15. Za pomocą sterylnej pipety lub pętli zbierz pojedynczą odrębną kolonię komórek i zaszczep sterylny LB o pojemności 20 ml za pomocą 50 μg/ml Km. Utrzymuj obszar w sterylnej pozycji i pracuj w pobliżu płomienia. Hodować komórki O/N w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
   16. Wykonaj 3-5 zapasów glicerolu z przekształconych komórek DH5α, mieszając 500 μl kultury O/N z 500 μL sterylnego 100% glicerolu (końcowe 50% v/v) w sterylnych krioprobówkach. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
   17. Należy również odwirować 6-8 ml kultury O/N w temperaturze pokojowej, 5 000 x g przez 3 minuty. Zdekantować supernatant i wyekstrahować plazmid odzyskiwania genu pK184 z osadu za pomocą zestawu do mini-przygotowania plazmidu (tabela materiałów) i protokołu producenta.
4. Mutanty genu pK184
   Uwaga: Startery przeznaczone do delecji, insercji i/lub mutacji punktowych można łatwo wygenerować za pomocą narzędzi dostępnych online przez producentów.
   1. Zaprojektuj każdy starter do przodu, wybierając sekwencję nukleotydową o długości 18-32 pz, która jest homologiczna do końca 5' genu będącego przedmiotem zainteresowania, w tym kodonu start. Zaprojektuj startery w taki sposób, aby każdy starter do przodu wyżarzał się 30-180 pz za poprzednim, co skutkuje mutantami delecji pozbawionymi N-końcowych fragmentów peptydu o odpowiednich długościach.
   2. Zaprojektuj odwrócony starter, wybierając sekwencję nukleotydową o długości 18-32 pz, która jest homologiczna do końca 3' interesującego genu, w tym kodonu stop. Skopiuj ten elementarz do dowolnego dostępnego programu bioinformatycznego i przekształć sekwencję w jej odwrotne dopełnienie. To jest odwrócony starter.
      1. W przypadku genów kodujących białka peryplazmatyczne należy zaprojektować starter odwrotny, który jest odwrotnym dopełnieniem końca 3' sekwencji lidera, która flankuje koniec genu 5' i jest wymagana do prawidłowej lokalizacji produktu białkowego w peryplazmie.
   3. Korzystając z dowolnego dostępnego programu do analizy oligo, sprawdź, czy startery delecyjne mają zawartość GC między 40-60%, niską temperaturę topnienia spinki do włosów (T_m), niską samo- i heterodimeryzację TM. Zamów startery do syntezy i wysyłki w dowolnej dostępnej firmie biotechnologicznej.
   4. Korzystając z konstruktu genu pK184 uzyskanego w Protokole 1.3 jako matrycy i wytycznych w 1.2.7-1.2.8, PCR amplifikuje konstrukty delecji za pomocą starterów zaprojektowanych w krokach 1.4.1-1.4.3 w celu wygenerowania amplikonów_ΔX genu pK184. Amplifikowane DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C.
   5. Zwiąż amplifikowany konstrukt za pomocą dowolnego dostępnego zestawu do mutagenezy (Tabela Materiałów).
   6. Przekształć każdy z ligatów_ΔX genu pK184 oddzielnie w chemicznie kompetentne komórki DH5α przy użyciu standardowego protokołu szoku cieplnego (patrz 1.3.11-1.3.13).
   7. Porcjować 100 μl objętości próbki z każdej reakcji ligacji w ppkt 1.4.12 na płytkę agarową zawierającą 50 μg/ml Km i rozprowadzić komórki za pomocą sterylnego rozsiewacza. Utrzymuj obszar w sterylnym stanie i pracuj w pobliżu płomienia. Inkubować płytkę do góry nogami w temperaturze 37 °C przez noc.
   8. Za pomocą sterylnej pipety lub pętli zbierz pojedynczą odrębną kolonię komórek i zaszczep sterylną pożywkę LB o pojemności 20 ml za pomocą 50 μg/ml Km. Utrzymuj obszar sterylny i pracuj w pobliżu płomienia. Hodować komórki O/N w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
   9. Wykonaj 3-5 zapasów glicerolu z przekształconych komórek DH5α, mieszając 500 μl kultury O/N z 500 μL sterylnego 100% glicerolu (końcowe 50% v/v) w sterylnych krioprobówkach. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
   10. Odwirować 6-8 ml kultury O/N w temperaturze pokojowej, 5 000 x g przez 3 minuty. Zdekantować supernatant i wyekstrahować konstrukt plazmidu _ΔX genu pK184 z osadu za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu (tabela materiałów) i protokołu producenta. DNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C.

2. Generacja szczepów pOX38-Tc Δgene::Cm

1. DY330R pOX38-Tc Δgene::Cm nokauty
   1. Przygotować hodowlę O/N komórek DY330R pOX38-Tc w 10 ml sterylnego LB zawierającego 10 μg/ml Tc. Hodować kulturę O/N w temperaturze 32 °C i 200 obr./min.
   2. Rozcieńczyć kulturę O/N w stosunku 1:70 do 20 ml świeżego sterylnego LB. Hodować komórki w temperaturze 32 °C aż do wzrostu w połowie fazy logarytmicznej (OD_600nm 0,4-0,6).
   3. Przenieść 10 ml kultury do sterylnej kolby i inkubować w temperaturze 42 °C przez 15 minut przy 150 obr./min w wytrząsającej łaźni wodnej. Spowoduje to ekspresję białek specyficznych dla rekombinacji w DY330R.
   4. Schłodzić kulturę w lodowatej kąpieli wodnej przez 10 minut. Przygotować elektrokompetentne ogniwa w następujący sposób.
      1. Przenieść schłodzone komórki do wstępnie schłodzonych stożkowych probówek i odwirować przy 4 000 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Wszystkie probówki i pipety, które mają być użyte w kolejnych krokach, należy umieścić w temperaturze 4 °C lub na lodzie do ostygnięcia.
      2. Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić komórki w 1 ml lodowatego ddH₂O. Dodać kolejne 30 ml lodowatego ddH₂O.
      3. Odwirować komórki (4 000 x g, 7 min, 4 °C), odrzucić supernatant i delikatnie zawiesić komórki w 1 ml lodowatego ddH₂O.
      4. Przenieść zawieszone komórki do wstępnie schłodzonych probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 15 000 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 ºC.
      5. Delikatnie zawiesić osad w 200 μl lodowatego ddH₂O i podwielokrotność w objętości 50 μl. Elektrokompetentne ogniwa mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C
   5. Dodać 300 ng amplifikowanej kasety CAT z 1,2 do 50 μl elektrokompetentnych ogniw DY330R pOX38-Tc, mieszając na lodzie, delikatnie pipetując w górę iw dół. Powtórz ten krok, używając niezmodyfikowanego plazmidu pBAD33 jako kontroli pozytywnej.
   6. Przenieść ogniwa do wstępnie schłodzonej (-20 °C) kuwety elektroporacyjnej o średnicy 1 mm. Elektroporować ogniwa napięciem 1,8 kV ze stałą czasową 5,5 ms, za pomocą elektroporatora. Natychmiast po zastosowaniu impulsu rozcieńczyć komórki 1 ml pożywki SOC i przenieść do świeżej probówki do mikrofuge. Inkubować komórki w temperaturze 32 °C przez 2 godziny.
   7. Porcję 100 μl każdej próbki rozprowadzić na płytkach agarowych zawierających 10 μg/ml Tc i 20 μg/ml Cm i rozprowadzić za pomocą sterylnego rozsiewacza. Utrzymuj obszar w sterylnym stanie i pracuj w pobliżu płomienia. Inkubować płytkę do góry dnem w temperaturze 32 °C przez noc, aby wybrać skuteczne rekombinanty. Kaseta CAT wprowadzona do komórki przejdzie rekombinację homologiczną z genem będącym przedmiotem zainteresowania i stworzy klon DY330R pOX38-Tc Δgene::Cm (Rif^{R,Tc R}, Cm^R).
      Uwaga: Ważne jest, aby hodować ogniwa DY330R w temperaturze 32 °C, z wyjątkiem 15-minutowej indukcji w temperaturze 42 °C w kroku 2.1.3 przed wytworzeniem ogniw elektrokompetentnych, ponieważ długotrwały wzrost w podwyższonych temperaturach grozi śmiercią komórki z powodu wytwarzania toksycznych produktów z operonu p_L odpowiedzialnego za funkcje rekombinacji w DY330R. ^33,34
   pkt.
   8. Przygotuj O/N komórek DY330R pOX38-Tc Δgen::Cm, zbierając pojedynczą odrębną kolonię komórek za pomocą sterylnej pipety lub pętli i zaszczepiając 20 ml sterylnej pożywki LB 10 μg/ml Tc i 20 μg/ml Cm. Utrzymuj obszar sterylny i pracuj w pobliżu płomienia. Hodować komórki O/N w temperaturze 32 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
   9. Przygotuj 3-5 zapasów glicerolu z O/N, mieszając 500 μl kultury O/N z 500 μL sterylnego 100% glicerolu (końcowe 50% v/v) w sterylnych krioprobówkach. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
   10. Odwirować 6-8 ml kultury O/N w temperaturze pokojowej, 5 000 x g przez 3 minuty. Zdekantować supernatant i wyekstrahować konstrukt pOX38-Tc Δgen::Cm z osadu za pomocą zestawu do miniprzygotowania plazmidu (tabela materiałów) i protokołu producenta; przechowywać oczyszczone DNA w temperaturze -20 °C.
   11. Wykonaj test kojarzenia koniugacyjnego przy użyciu komórek XK1200 jako biorcy, aby potwierdzić zakłócenie koniugacji przez nokaut genu zgodnie z protokołem 3.1.
2. DY330R pOX38-Tc Δgen::Cm + pK184-gen
   1. Przekształć elektrokompetentne komórki DY330R pOX38-Tc Δgen::Cm z 300 ng konstruktu genu pK184 za pomocą elektroporacji zgodnie z krokami 2.1.4-2.1.7. Wszystkie podłoża selektywne muszą zawierać 20 μg/ml cm i 50 μg/ml Km. Inkubować w temperaturze 32 °C. Regeneracyjny plazmid w elektroporowanych komórkach przywróci teraz funkcję znokautowanego genu w komórkach DY330R pOX38-Tc Δgene::Cm.
   2. Przygotować O/N komórek rekombinowanych genu DY330R pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184-gen, zbierając pojedynczą odrębną kolonię komórek za pomocą sterylnej pipety lub pętli i zaszczepiając 20 ml sterylnej pożywki LB 20 μg/ml Cm i 50 μg/ml Km. Utrzymuj obszar sterylny i pracuj w pobliżu płomienia. Hodować komórki O/N w temperaturze 32 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
   3. Przygotuj 3-5 zapasów glicerolu z O/N, mieszając 500 μl kultury O/N z 500 μL sterylnego 100% glicerolu (końcowe 50% v/v) w sterylnych krioprobówkach. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
   4. Wykonaj również protokół 3.1, aby wygenerować komórki rekombinowane XK1200 pOX38-Tc Δgene::CM.
3. XK1200 pOX38-Tc Δgen::Cm + pK184-gen i mutanty
   1. Przygotować elektrokompetentne ogniwa XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm (od kroku 2.2.4).
   2. Oddzielnie elektroportować 300 ng plazmidów z mutacją genu pK184 lub pK184 do 50 μl elektrokompetentnych komórek XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm zgodnie z krokami 2.1.4-2.1.7. Wszystkie selektywne podłoża powinny zawierać 10 μg/ml kwasu nalidyksowego (Nal), 20 μg/ml Cm i 50 μg/ml Km i być inkubowane w temperaturze 37 °C.
   3. Przygotuj O/N komórek rekombinowanych genu XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm+ pK184-gen, zbierając pojedynczą odrębną kolonię komórek za pomocą sterylnej pipety lub pętli i zaszczepiając 20 ml sterylnego podłoża LB Nal, 20 μg/mL Cm i 50 μg/mL Km. Utrzymuj obszar sterylny i pracuj w pobliżu płomienia. Hodować komórki O/N w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
   4. Przygotuj 3-5 zapasów glicerolu z O/N, mieszając 500 μl kultury O/N z 500 μL sterylnego 100% glicerolu (końcowe 50% v/v) w sterylnych krioprobówkach. Przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Testy krycia koniugacyjnego

1. Kojarzenie koniugacyjne w celu wygenerowania komórek XK1200 pOX38-Tc δgene::Cm
   1. Przygotować 20 ml sterylnej hodowli LB O/N komórek genu DY330R pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184 za pomocą sterylnej pipety lub pętli do zaszczepienia 20 ml sterylnego LB zawierającego 20 μg/ml Cm i 50 μg/ml Km bulionem glicerolu lub pojedynczą kolonią na płytce agarowej. Rosnąć w temperaturze 32 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Przygotuj to samo dla komórek XK1200 w 20 ml sterylnego LB z 10 μg/ml Nal, rosnącego w temperaturze 37 °C.
   2. Każdą kulturę rozcieńczyć oddzielnie w proporcji 1:70 w 2 ml sterylnego LB o tej samej zawartości antybiotyku; dodać glukozę do końcowego stężenia 100 mM do wszystkich komórek dawcy. Hodować komórki do środkowej fazy logarytmicznej (OD₆₀₀ 0,5-0,7) w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
   3. Odwirować (4 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C) w celu osadzenia komórek, wyrzucić supernatant, przemyć raz zimnym sterylnym LB w celu usunięcia antybiotyków i ponownie zawiesić komórki w 2 ml zimnego sterylnego LB.
   4. Podzielić 100 μl każdej kultury na 800 μl sterylnej pożywki LB i pozostawić do połączenia w temperaturze 32 °C przez 1 godzinę bez wstrząsania.
   5. Wiruj komórki przez 30 sekund, aby zakłócić par godowych i umieść je na lodzie na 10 minut, aby zapobiec dalszemu kryciu.
   6. Podwielokrotność 100 μl mieszaniny komórek na płytkę agarową zawierającą 10 μg/ml Nal i 20 μg/ml Cm w celu wybrania komórek XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm. Rozłóż komórki za pomocą sterylnego rozsiewacza. Utrzymuj obszar w sterylnym stanie i pracuj w pobliżu płomienia. Inkubować płytkę O/N w temperaturze 37 °C do góry nogami.
   7. Zbierz pojedynczą kolonię nowego szczepu XK1200 pOX38-Tc Δgen::Cm za pomocą sterylnej pipety lub pętli i hoduj w sterylnym LB z 20 μg/ml Cm, O/N w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Przygotuj 3-5 zapasów glicerolu z O/N, mieszając 500 μl kultury O/N z 500 μL sterylnego 100% glicerolu (końcowe 50% v/v) w sterylnych krioprobówkach. Przechowywać w temperaturze -80 °C.
      Uwaga: Powstałe w ten sposób komórki mogą być teraz kompetentne do transformacji za pomocą konstruktów genu pK184 (protokoły 1.3 i 1.4) w celu oceny genu i jego mutantów pod kątem zdolności do odzyskania transferu koniugacyjnego w protokole 3.2.
2. Test krycia koniugacyjnego od dawców XK1200 do biorców MC4100
   1. Przygotować kulturę O/N komórek XK1200 pOX38-Tc Δgene::Cm + pK184 w 20 ml sterylnych komórek LB z 20 μg/mL Cm, 50 μg/mL Km i MC4100 w 5 ml LB z 50 μg/ml streptomycyny (Sm) przy użyciu komórek z glicerolu lub pojedynczej kolonii na płytce agarowej i sterylnej pipecie lub pętli. Hoduj kultury w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem 200 obr./min.
   2. Wykonać rozcieńczenia w stosunku 1:70 z każdej kultury O/N oddzielnie w 2 ml sterylnego LB z tymi samymi antybiotykami. Dodać glukozę do końcowego stężenia 100 mM do wszystkich komórek dawcy. Hodować komórki do środkowej fazy logarytmicznej (OD₆₀₀ 0,5-0,7) w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
   3. Odwirować (4 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C) w celu osadzenia komórek, wyrzucić supernatant, przemyć raz zimnym sterylnym LB w celu usunięcia antybiotyków i ponownie zawiesić komórki w 2 ml zimnego sterylnego LB.
   4. Powtórzyć 100 μl każdej kultury na 800 μl sterylnej pożywki LB i pozostawić do połączenia w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę bez wstrząsania.
   5. Wiruj komórki przez 30 sekund, aby zakłócić par godowych i umieść je na lodzie na 10 minut, aby zapobiec dalszemu kryciu.
   6. Korzystając z kultur mid-log z kroku 3.2.2 i świeżego sterylnego LB, przygotować 6 seryjnych rozcieńczeń komórek dawcy i biorcy od ^10-2 do ^10-7.
   7. Na każdej z dwóch połówek płytki agarowej zawierającej 10 μg/ml Nal, 20 μg/ml Cm i 50 μg/ml Km umieścić 10 μl podwielokrotności każdego rozcieńczenia komórek dawcy XK1200, jak pokazano na rysunku 2. Powtórzyć dla rozcieńczeń komórek biorcy MC4100 na płytkach agarowych zawierających 50 μg/ml Sm. Inkubować płytki O/N w temperaturze 37 °C.
   8. Używając mieszaniny wirowej z kroku 3.2.5 i świeżego sterylnego LB, przygotować 6 rozcieńczeń (^10-2 do ^10-7) transkoniugantów. Wybrać dla transkoniugantu MC4100 pOX38-Tc Δgene::Cm, zauważając 10 μl podwielokrotności każdego z rozcieńczeń na każdej połówce płytek agarowych zawierających 50 μg/ml Sm i 20 μg/ml Cm, jak pokazano na rysunku 2. Powtórz dla obu zduplikowanych mieszanin. Utrzymuj obszar w sterylnym stanie i pracuj w pobliżu płomienia. Inkubować płytki O/N w temperaturze 37 °C.
   9. Określić skuteczność krycia każdego konstruktu zgodnie z opisem w protokole 3.3.
   10. Powtórz ten protokół dla wszystkich plazmidów regeneracyjnych, aby ocenić wpływ określonej mutacji na skuteczność koniugacji.
3. Obliczanie efektywności krycia
   1. Policz liczbę kolonii z tego samego plamienia rozcieńczenia dla każdego dawcy, biorcy i komórek transkoniuganta na ich odpowiednich płytkach.
   2. Policz kolonie biorców, aby przetestować wszelkie odchylenia, które wynikałyby z posiadania większej liczby transkoniugantów niż biorców przy danym rozcieńczeniu.
   3. Oblicz efektywność krycia jako liczbę kolonii transkoniugantów podzieloną przez liczbę kolonii dawcy. Pomnóż przez 100, aby uzyskać wartość wydajności na 100 komórek dawcy.

Proces koniugacji bakteryjnej opartej na plazmidzie F jest skoordynowanym procesem, który obejmuje przenoszenie białek w regionie tra plazmidu F, który składa T4SS w celu ułatwienia syntezy pilusa i transferu sprzężonego DNA. Białko TraF (akces GenBank # BAA97961; UniProt ID P14497) jest wymagany do sprzężonego tworzenia F-pilus. 10,14,35-37 Białko zawiera C-końcową domenę podobną do tioredoksyny, chociaż nie ma katalitycznego motywu CXXC. 35,38 Chociaż przewiduje się, że białko będzie oddziaływać z białkiem TraH poprzez jego domenę N-końcową,39 region, który okazał się bardziej dynamiczny niż jego domena C-końcowa,37 niewiele więcej wiadomo o cechach strukturalnych białka. Aby ocenić funkcjonalne aspekty białka TraF w połączeniu z badaniami strukturalnymi, najpierw wyeliminowaliśmy gen traF na pOX38-Tc poprzez rekombinację homologiczną, generując plazmid pOX38-Tc ΔtraF::Cm (Tabela 1) w komórkach E. coli DY330R. 33,34 Wygenerowano również plazmid pK184-TraF ze starterów specyficznych dla traF (Tabela 2), aby zapewnić odzyskanie koniugacji i umożliwić sondowanie sekwencji białka. Przeniesienie plazmidu pOX38-Tc ΔtraF::Cm do komórek XK120040 z komórek DY330R, gdy pK184-TraF podano w trans (transkoniuganty hodowane na 10 μg/mL Nal, 10 μg/mL Tc i 20 μg/mL Cm) wskazuje, że (a) nokaut traF w pOx38-Tc ΔtraF::Cm zapewnia kasetę CAT w ramce, oraz (b) że pK184-TraF może przywrócić funkcję koniugacyjną.

Seria mutantów TraF została wygenerowana do analizy przy użyciu testu kojarzenia koniugacyjnego37 przy użyciu XK1200 pOX38-Tc ΔtraF::Cm + komórekΔX pK184-TraF i komórek MC410041 odpowiednio jako dawców i biorców. Jednym z reprezentatywnych mutantów jest TraF55-247 (Tabela 1), N-końcowy mutant delecji, który usuwa region białka, co do którego przewiduje się, że będzie oddziaływać z TraH. Gdy białko TraF o pełnej długości zostanie dostarczone do komórek dawcy, transfer koniugacyjny zostanie przywrócony (ryc. 2), podczas gdy pusty plazmid pK184 nie zostanie dostarczony (Tabela 3). Podobnie, funkcja koniugacyjna w komórkach dawcy XK1200 nie zostaje przywrócona, gdy jest zaopatrzona w plazmid pK184-TraF55-247 (Tabela 3). Wskazuje to, że skrócony region białka jest ważny dla funkcji TraF w aparacie koniugacyjnym, prawdopodobnie poprzez interakcję z TraH, i zapewnia region białka, który jest celem dalszej analizy mutacyjnej.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie testu kojarzenia koniugacyjnego. W Kroku 1 geny docelowe są eliminowane przez rekombinację homologiczną w komórkach DY330R, wydajnym szczepie rekombinacyjnym, przy użyciu kasety CAT generowanej przez PCR z nawisami homologicznymi dla genu docelowego. Powstały w ten sposób klon DY330R zawiera plazmid pOX38-Tc Δgene::Cm, który nie jest w stanie ułatwić koniugacji, chyba że znokautowany gen jest dostarczany w trans przez plazmid regeneracyjny (gen pK184). Powstały plazmid pOX38-Tc Δgene::Cm jest przenoszony do szczepu XK1200 (Krok 2) w celu dalszej oceny genu za pomocą testów kojarzeniowych z biorcą MC4100 (Krok 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Test krycia w celu oceny funkcji genu docelowego w koniugacji. Komórkami dawcy i biorcy były E. coli XK1200 pOX38-Tc ΔtraF::Cm przekształcone odpowiednio za pomocą pK184-TraF i MC4100. Powstałe w ten sposób transkoniuwanty (MC4100 pOX38-Tc ΔtraF::Cm) rosną na płytkach zawierających Sm i Cm, co wskazuje na pomyślne odzyskanie funkcji koniugacyjnych. Eksperyment przeprowadza się w dwóch egzemplarzach na pojedynczej płytce agarowej i stosuje się seryjne rozcieńczenia w celu obliczenia skuteczności kojarzenia regenerujących mutantów genowych (Tabela 2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Szczepy i plazmidy E. coli użyte w tym badaniu.

Tabela 2: Lista starterów użytych w tym badaniu.

Tabela 3: Zniesiono efektywność krycia za pomocą konstrukcji usuwania TraF.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.