Method Article

Ekspresja genów w pojedynczej komórce za pomocą multipleksu RT-qPCR w celu scharakteryzowania heterogeniczności rzadkich populacji limfoidalnych

DOI:

10.3791/54858

⸱

January 19th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Unit for Lymphopoieseis, Immunology Department, INSERM U1223, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur, 2Center for Translational Science, Institut Pasteur, INSERM UMS20

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak ocenić ekspresję dużej liczby genów na poziomie klonalnym. Jednokomórkowy RT-qPCR daje wysoce wiarygodne wyniki z dużą czułością dla setek próbek i genów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niejednorodność ekspresji genów jest interesującą cechą do zbadania w populacjach limfoidalnych. Ekspresja genów w tych komórkach zmienia się podczas aktywacji komórek, stresu lub stymulacji. Ekspresja genów w multipleksie pojedynczej komórki umożliwia jednoczesną ocenę dziesiątek genów1,2,3. Na poziomie pojedynczej komórki ekspresja genów multipleksowych określa heterogeniczność populacji4,5. Pozwala na rozróżnienie niejednorodności populacji poprzez określenie zarówno prawdopodobnej mieszanki różnych etapów prekursorowych wśród dojrzałych komórek, jak i różnorodności odpowiedzi komórek na bodźce.

Wrodzone komórki limfoidalne (ILC) zostały niedawno opisane jako populacja wrodzonych efektorów odpowiedzi immunologicznej6,7. W tym protokole badana jest heterogeniczność komórek przedziału wątrobowego ILC podczas homeostazy.

Obecnie najczęściej używaną techniką oceny ekspresji genów jest RT-qPCR. Ta metoda mierzy ekspresję genu tylko jednego genu na raz. Ponadto metoda ta nie może oszacować niejednorodności ekspresji genów, ponieważ do jednego testu potrzebnych jest wiele komórek. Prowadzi to do pomiaru średniej ekspresji genów w populacji. Przy ocenie dużej liczby genów RT-qPCR staje się metodą czasochłonną, odczynnikową i pochłaniającą próbki. W związku z tym kompromisy ograniczają liczbę genów lub populacji komórek, które można ocenić, zwiększając ryzyko pominięcia globalnego obrazu.

Ten manuskrypt opisuje, jak można wykorzystać multipleksowy RT-qPCR z pojedynczą komórką do pokonania tych ograniczeń. Technika ta skorzystała z najnowszych osiągnięć technologicznych w dziedzinie mikrofluidyki1,2. Reakcje zachodzące w multipleksowych chipach RT-qPCR nie przekraczają poziomu nanolitrów. W związku z tym ekspresja genów w pojedynczej komórce, a także jednoczesna ekspresja wielu genów, może być przeprowadzana w sposób opłacalny i odczynnikowy, próbkowy i kosztowy. Możliwe jest badanie niejednorodności sygnatur genów komórkowych na poziomie klonalnym między podzbiorami komórek w populacji na różnych etapach rozwoju lub w różnych warunkach4,5. Praca na rzadkich populacjach z dużą liczbą schorzeń na poziomie pojedynczej komórki nie jest już ograniczeniem.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich kilku lat, wrodzone komórki limfoidalne (ILC) były coraz częściej badane. Pomimo braku receptorów specyficznych dla antygenu, należą one do linii limfatycznej i stanowią ważnych strażników homeostazy tkanek i stanu zapalnego. ILC są obecnie podzielone na trzy grupy w zależności od ekspresji specyficznych kombinacji czynników transkrypcyjnych i ich zdolności do wytwarzania cytokin6,7.

ILC przyczyniają się do licznych sytuacji homeostatycznych i patofizjologicznych w różnych narządach poprzez specyficzną produkcję cytokin8,9. Aby móc zrozumieć rolę tych komórek, ważne jest określenie różnych subpopulacji ILC na narząd i zidentyfikowanie ich relacji rozwojowych. Ponadto zjawiska plastyczności pomiędzy różnymi podzbiorami zostały ze sobą powiązane. Badając niejednorodność komórek obecnych w jednym narządzie, możliwe jest określenie ich etapu dojrzewania i rozróżnienie ich specyficznych funkcji.

Aby zilustrować technikę monokomórkowego multipleksu RT-qPCR, wybrano wątrobowe ILC, ze szczególnym naciskiem na ich heterogeniczność w obrębie tej samej grupy ILC (typ 1 ILC)10. Po pierwsze, dzięki zastosowaniu cytometrii przepływowej, scharakteryzowano trzy odrębne populacje ILC w wątrobie. ILC grupy 1 reprezentuje około 80% wrodzonych efektorów, podczas gdy dwie pozostałe populacje to rzadkie populacje ILC wątroby (mniej niż 5% wrodzonych efektorów). Populacje te posortowano przy użyciu szeroko wyrażonych markerów powierzchni komórek populacji ILC. W rezultacie, posortowane populacje ILC w wątrobie wyglądają zasadniczo podobnie do siebie.

Jednokomórkowy multipleksowy RT-qPCR okazał się jedną z najlepszych technik szybkiego badania heterogeniczności tych populacji11. Dwie główne cechy są określane przez wykorzystanie techniki multipleksu pojedynczej komórki RT-qPCR. Po pierwsze, patrząc na poziom klonalny, możliwe jest odzyskanie ekspresji genów specyficznych dla komórki w celu porównania między komórkami, które najwyraźniej wykazują podobne etapy rozwoju. Następnie, patrząc na wstępnie wybraną kombinację ekspresji genów, określimy nowe sygnatury genów na podstawie jednoczesnych wzorców ekspresji genów w jednym punkcie czasowym. Aspekty te pozwalają na gromadzenie szerokiej gamy danych dotyczących ekspresji dla dużej liczby komórek, nawet w rzadkich populacjach, ponieważ technika ta jest wykonywana na poziomie klonalnym. W ten sposób można odpowiednio ocenić niejednorodność ILC w wątrobie.

Następnie, sortując wszystkie komórki o globalnym fenotypie ILC, uzyskuje się szeroki przegląd ekspresji wielogenowej w populacjach ILC wątroby, mimo że reprezentują one niezwykle rzadkie populacje. Chip oparty na mikroprzepływach pozwala na eksperymentowanie nawet z niewielką ilością materiału komórkowego. W konsekwencji można uzyskać profile ekspresji genów w rzadkich populacjach komórek. Korzystając z oprogramowania do analizy sygnatur genetycznych online, można badać klastry populacji komórek i potencjalne relacje między komórkami. W związku z tym można przeprowadzić testy funkcjonalne w celu walidacji danych grupowania na poziomie in vivo.

Dziesiątki ekspresji genów mogą być oceniane jednocześnie na setkach lub więcej pojedynczych komórek na tym samym chipie3,11,12. Projekt testu jest najdłuższą i najważniejszą częścią eksperymentu. Określenie genów istotnych dla hipotezy, która ma być badana, ma zasadnicze znaczenie dla uzyskania odpowiednich wyników. Po drugie, potrzebna jest kontrola wewnętrzna (np. znane znaczniki powierzchni używane do sortowania) i szczególne kontrole. Ma to kluczowe znaczenie dla przetestowania swoistości amplifikacji startera, skuteczności wzmocnienia i braku konkurencji ze starterami. Dlatego praca z multipleksem pojedynczych komórek RT-qPCR jest techniką oszczędzającą czas, ponieważ w tym samym czasie oceniana jest ekspresja wielu genów w komórce.

Używanie tego samego chipa i mieszanki odczynników dla wszystkich komórek ogranicza możliwe błędy manipulacji i pozwala na powtarzalność między próbkami. Podsumowując, różne aspekty multipleksu pojedynczej komórki RT-qPCR pozwalają na uzyskanie wysoce wiarygodnych wyników na poziomie klonalnym, z dużym poziomem czułości dla szerokiej gamy próbek i genów. Uzyskane wyniki dostarczają potężnych i solidnych danych do testów biostatystycznych.

To można osiągnąć dzięki mikroprzepływowemu aspektowi metody, który pozwala na pracę na bardzo małych ilościach materiału i prowadzi do wyczerpujących wyników. Wreszcie, za pomocą oprogramowania online, można porównać pożądane populacje.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Bezpieczeństwa Instytutu Pasteura zgodnie z wytycznymi francuskiego Ministerstwa Rolnictwa i UE.

1. Przygotuj 96-dołkową jednokomórkową płytkę sortującą

  1. Przygotuj mieszaninę do wstępnej amplifikacji w probówce o pojemności 1,5 ml, dodając 5,0 μl specyficznego buforu retrotranskrypcyjnego, 1,3 μl buforu TE o niskiej zawartości etylenodiaminotetraoctowej (EDTA) (10 mM roztworu TE, pH 8 i 0,1 mM roztworu EDTA; 0,2 μM przefiltrowane) i 0,2 μl polimerazy DNA Taq na studzienkę (ryc. 1a).
  2. Na 96-dołkowej płytce rozprowadź 6,5 μl mieszanki wstępnej amplifikacji w każdym dołku (do 48 dołków). Ta płytka to 96-dołkowa jednokomórkowa płytka sortująca.
    UWAGA: W przypadku tego protokołu zaleca się korzystanie z pipety elektronicznej. Pozwala to na precyzyjne i powtarzalne pomiary objętości oraz oszczędza czas.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Procedura ładowania płytki 96-dołkowej. Ładowanie 96-dołkowych płytek powinno być wykonane bardzo ostrożnie, ponieważ będzie to miało wpływ na resztę eksperymentu. (a) Na 96-dołkowej płytce do sortowania pojedynczych komórek najpierw rozprowadza się mieszaninę przed amplifikacją, a następnie mieszankę testową 0,2x. b) Zapis każdej pozycji w pojedynczej komórce powinien być przechowywany w arkuszu kalkulacyjnym. Studnia bez komórki nazywana jest studnią "bez wejścia" i może być używana jako kontrola. Dwa rzędy można oszczędzić, aby kontrolować wydajność startera za pomocą rozcieńczenia cDNA (sekwencyjne rozcieńczenia jeden na dziesięć z odpowiednika 105 komórek na jedną komórkę). c) Na 96-dołkowej płytce testowej najpierw rozprowadza się odczynnik ładujący do testu, a następnie dodaje się startery. Nie zapomnij zachować układu każdej pozycji podkładu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Przygotować mieszankę testową 0,2x w probówce o pojemności 1,5 ml, dodając 1,4 μl każdego startera (startery 20x; do 48 różnych sond; patrz Tabela 1). Dostosować końcową objętość do 140 μl z niskim buforem EDTA TE.
  2. Rozprowadzić 2,5 μl mieszanki testowej 0,2x do 48 dołków w 96-dołkowej płytce do sortowania jednokomórkowego zawierającej mieszaninę do wstępnej amplifikacji.
    UWAGA: Końcowa objętość w każdym dołku 96-dołkowej płytki próbki powinna wynosić 9 μl.
  3. Uszczelnij płytkę folią osłonową. Obracaj płytkę i obracaj ją w dół z prędkością 280 x g przez 45 sekund. Przechowywać 96-dołkową jednokomórkową płytkę sortującą w temperaturze -20 °C lub natychmiast zużyć.

2. Dysocjacja pojedynczej komórki

  1. Korzystając z systemu dostarczania CO2 , poddaj mysz eutanazji przez niedotlenienie. Zamocuj mysz na płytce preparacyjnej i otwórz jamę otrzewnej wzdłużnie za pomocą nożyczek.
  2. Odzyskaj ILC z wątroby.
    1. Przed izolacją wątroby należy przepłukać komórki krążące w wątrobie.
      1. Aby wydobyć żyłę wrotną, przesuń jelito cienkie i grube na lewą stronę myszy; żyła wrotna pojawia się jako największa żyła w jamie otrzewnej.
      2. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i igły 0,45 mm przepłukać wątrobę roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) przez żyłę wrotną. Aby ułatwić płukanie wątroby, przetnij tętnicę żołądkową nożyczkami.
      3. Aby usunąć woreczek żółciowy, uszczypnij podstawę pęcherzyka żółciowego kleszczami i oddziel go od wątroby nożyczkami.
      4. Aby wyizolować wątrobę, uszczypnij podstawę wątroby kleszczami i za pomocą nożyczek oddziel wątrobę od reszty jamy otrzewnej.
      5. Przenieść wątrobę do probówki garncarskiej z 5 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS).
  3. Oddziel wątrobę za pomocą mechanicznej dysocjacji za pomocą tłuczka. Przenieść pożywkę do probówki o pojemności 15 ml. Zwiększ całkowitą objętość do 14 ml za pomocą RPMI 2% FCS. Pozostaw zawiesinę komórkową na lodzie na 15-20 minut, aby zdekantować hepatocyty.
  4. Odzyskać supernatant (bez hepatocytów) w nowej probówce o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 1 ml (można spodziewać się 12 ml supernatantu). Wirować w temperaturze 120 x g przez 7 minut w temperaturze 10 °C. Po odwirowaniu odrzucić supernatant.
  5. Zawiesić osad otrzymany w kroku 2.4 w 14 ml podłoża o gradiencie gęstości (np. Percoll 40%). Wirować w temperaturze 600 x g przez 20 minut w temperaturze 20 °C. Usunąć supernatant przez aspirację.
  6. Zawiesić osad w 1 ml octanu potasu (ACK). Pozostaw w temperaturze pokojowej na 1 min. Po 1 minucie zwiększ całkowitą objętość do 14 ml za pomocą Hank's Balanced Salted Solution (HBSS) 2% FCS. Wirować w temperaturze 120 x g przez 7 minut w temperaturze 10 °C. Odrzucić supernatant.
  7. Plamić komórki.
    1. Zawiesić osad w 300 μl mieszaniny przeciwciał biotynylowanych (patrz tabela materiałów; dodać wszystkie wymienione przeciwciała biotynylowane) i przenieść komórki do probówki o pojemności 1,5 ml. Pozostaw w ciemności na 20 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Doprowadzić całkowitą objętość do 1 ml za pomocą HBSS 2% FCS. Wirować w temperaturze 120 x g przez 7 minut w temperaturze 10 °C. Zawiesić osad w 300 μl mieszaniny przeciwciał sprzężonych z fluorochromem i streptawidyny sprzężonej z fluorochromem (patrz Tabela materiałów; dodać wszystkie wymienione przeciwciała sprzężone z fluorochromem). Pozostaw w ciemności na 20 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Doprowadzić całkowitą objętość do 1 ml za pomocą HBSS 2% FCS. Wirować w temperaturze 120 x g przez 7 minut w temperaturze 10 °C. Usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Zawiesić osad w 1 ml HBSS i jodku propidyny (Pi; 1:4 000).
    UWAGA: Przy użyciu szeroko wyrażonych markerów powierzchni komórek ILC definiuje się 3 populacje: NKp46+ IL-7Rα-, NKp46+ IL-7Rα+ i NKp46-IL-7Rα+. Wszystkie populacje są posortowane według linii - CD3- CD4- CD45.2+.

3. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) za pomocą pojedynczej komórki

  1. Użyj FACS do sortowania pojedynczych komórek13.
    UWAGA: Różne typy komórek można sortować na tej samej 96-dołkowej płytce do sortowania pojedynczych komórek (rysunek 2).
    1. Użyj FACS, aby posortować jedną komórkę na studzienkę zawierającą mieszaninę testową 0,2x i mieszankę wstępnej amplifikacji na 96-dołkowej płytce do sortowania pojedynczych komórek. Użyć świeżo przygotowanej 96-dołkowej jednokomórkowej płytki sortującej lub rozmrozić ją, jeśli jest przechowywana w temperaturze -20 °C.
      1. Umieść szczelnie zapieczętowaną 96-dołkową płytkę na uchwycie płytki FACS. Jako test należy użyć pustej płytki 96-dołkowej. Umieść płytkę z dołkiem A1 po lewej stronie i w kierunku eksperymentatora.
      2. Wyreguluj uchwyt płytki, aby uzyskać kroplę w środku dołka A1 z koralikami weryfikacyjnymi.
      3. Powtórzyć krok 3.1.1.2 ze wszystkimi studzienkami w linii A.
      4. Usuń uszczelkę z płytki 96-dołkowej i posortuj 100 koralików weryfikacyjnych na dołek. Sprawdź, czy w środku studzienek nie tworzy się kropla.
      5. Po prawidłowym wyregulowaniu umieść 96-dołkową jednokomórkową płytkę sortującą na uchwycie płytki. Narysuj układ płytek i posortuj 1 komórkę na studzienkę.
        UWAGA: Niezbędne jest prawidłowe ustawienie każdej komórki na 96-dołkowej płytce do sortowania pojedynczych komórek. Układ tablic powinien być przechowywany w oprogramowaniu do arkuszy kalkulacyjnych. Układ płyt zostanie użyty w kilku następnych krokach (Rysunek 1b)14. Pozostawić jedną studzienkę zawierającą 0,2-krotną mieszaninę testową i mieszaninę do wstępnej amplifikacji na 96-dołkowej płytce z próbką bez komórek. Ta studnia jest używana jako kontrola bez wejścia. Pozostaw dwa rzędy po 6 dołków do rozcieńczenia cDNA. Studnie te są używane jako elementy sterujące wydajnością podkładu (rysunek 1b).
      6. Przechowywać 96-dołkową jednokomórkową płytkę sortującą w temperaturze -20 °C lub natychmiast zużyć.

4. Wstępne wzmocnienie

  1. Użyć świeżej lub rozmrożonej 96-dołkowej jednokomórkowej płytki sortującej otrzymanej w kroku 3.1.1.6. Obracaj płytkę i obracaj ją w dół (280 x g przez 45 sekund).
  2. Umieść 96-dołkową jednokomórkową płytkę sortującą na termocyklerze. Wykonaj odwrotną transkrypcję i wstępną amplifikację zgodnie z programem wymienionym na rysunku 3 i w tabeli 2.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Program wstępnego wzmacniania. Aby uzyskać wystarczającą ilość materiału, wymagana jest wstępna amplifikacja określonych genów docelowych na posortowanych pojedynczych komórkach. 96-dołkowa jednokomórkowa płytka sortująca jest ładowana do termocyklera w celu śledzenia programu wstępnego amplifikacji. Produkty pre-amplifikacji są następnie rozcieńczane buforem o niskiej zawartości EDTA TE i mogą być natychmiast użyte lub zamrożone w temperaturze -20 °C. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Rozcieńczyć wstępnie amplifikowane próbki, dodając 36 μl buforu o niskiej zawartości EDTA TE do każdego dołka.
  2. Uszczelnij płytkę folią osłonową. Zwiruj płytkę i odwiruj ją w dół (280 g przez 45 sekund). Wstępnie wzmocnioną, 96-dołkową jednokomórkową płytkę sortującą należy przechowywać w temperaturze -20 °C lub natychmiast zużyć.

5. Przygotuj 96-dołkową płytkę z próbką

  1. Przygotować 191 μl mieszanki wzorcowej, dodając 175 μl mieszanki wzorcowej qPCR i 17,5 μl odczynnika do ładowania próbki.
  2. Na nowej 96-dołkowej płytce rozprowadzić 3,6 μl mieszanki wzorcowej w każdym dołku (do 48 dołków). To jest 96-dołkowa płytka na próbkę.
  3. Przenieś 2,9 μl wstępnie amplifikowanego cDNA z 96-dołkowej płytki próbki na nową 96-dołkową płytkę. Zachować tę samą pozycję dla każdej próbki między 96-komórkową płytką sortującą a 96-dołkową płytką do pobierania próbek.
  4. Uszczelnij płytkę folią osłonową. Obracaj płytkę i obracaj ją w dół (280 x g przez 45 sekund). Umieść nową 96-dołkową płytkę na lodzie chronionym przed światłem. Przechowywać 96-dołkową płytkę z próbką w temperaturze -20 °C lub natychmiast zużyć.

6. Przygotuj 96-dołkową płytkę testową

  1. Na nowej 96-dołkowej płytce rozprowadzić 3 μl odczynnika ładującego test w każdym dołku (do 48 dołków). Ta płytka nazywana jest 96-dołkową płytką testową.
  2. Dodaj 3 μl starterów do każdej studzienki. Zachowaj układ w oprogramowaniu arkusza kalkulacyjnego (Rysunek 1c i Tabela 1; użyj wszystkich starterów wymienionych w Tabeli 1). Prawidłowe umiejscowienie każdego startera na 96-dołkowej płytce testowej ma zasadnicze znaczenie dla kilku następnych kroków.
    1. Jeśli liczba próbek jest mniejsza niż 48, dodaj wodę zamiast starterów do nieużywanych studzienek.
  3. Uszczelnij płytkę folią osłonową. Obracaj płytkę i obracaj ją w dół (280 x g przez 45 sekund). Przechowywać 96-dołkową płytkę testową w temperaturze -20 °C lub natychmiast zużyć.
    UWAGA: Aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania starterów, należy jednocześnie rozprowadzić startery do mieszanki wstępnego amplifikacji i do 96-dołkowej płytki testowej.

7. Jednokomórkowy chip do ekspresji genów

  1. Umieść zintegrowany obwód mikroprzepływowy (IFC) na stole i sprawdź zawory za pomocą zaślepionej strzykawki. Otwórz strzykawkę, umieść ją prostopadle do zaworu i mocno dociśnij. O-ring powinien się poruszać. Napełnij chip płynem z przewodu kontrolnego (0,3 ml tuberkuliny).
  2. Powtórz krok 7.1 z drugim zaworem.
    UWAGA: Nie należy wylewać płynów na chip.
  3. Usuń niebieską folię z dolnej części chipa. Załaduj chip do kontrolera IFC. Na ekranie kontrolera IFC wybierz "PRIME", a następnie "RUN". Sterowanie liniami mikroprzepływowymi trwa 10 minut.
  4. Wysuń chip i ponownie zamknij niebieską folię na spodzie chipa.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Ładowanie chipa z ekspresją genu w monokomórce. Kroki te wymagają dużej precyzji, zwłaszcza podczas przenoszenia 96-dołkowej płytki do jednokomórkowego chipa do ekspresji genów multipleksowych. Aby uniknąć błędów ładowania i nieprawidłowych umieszczeń, zdecydowanie zaleca się pracę sekwencyjną. Objętość pobierana przy każdym transferze powinna być kontrolowana podczas procesu pipetowania. Wreszcie, ważne jest, aby unikać pęcherzyków i usuwać je w przypadku ich powstania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Za pomocą pipety 8-kanałowej przenieść 5 μl z 96-dołkowej płytki testowej po stronie A1 (lewej stronie) chipa. Wypełnij lewą stronę chipa, jak pokazano na rysunku 4. Uważaj, aby zawsze rysować tę samą objętość do końcówek.
    1. Nie twórz bąbelków. Jeśli pojawią się bąbelki, usuń je za pomocą końcówek o pojemności 10 μl. Zmień końcówki dla każdej studzienki chipa.
  2. Powtórzyć krok 7.5 po prawej stronie chipa, używając 5 μl z 96-dołkowej płytki na próbkę.
  3. Usuń niebieską folię z dolnej części chipa. Załaduj chip do kontrolera IFC. Na ekranie kontrolera IFC wybierz "URUCHOM SKRYPT", a następnie "URUCHOM". Załadunek przewodów mikroprzepływowych trwa 45 minut.
  4. Wysuń chip i ponownie zamknij niebieską folię na spodzie chipa.

8. Uruchom chip

  1. Na komputerze mikroprzepływowym qPCR wybierz oprogramowanie "Zbieranie danych". Po uruchomieniu wybierz "Nowy przebieg".
  2. Wybierz "Wysuń", usuń niebieską folię z dolnej części chipa i załaduj chip. Umieść chip, aby uzyskać dołek A1 po lewej stronie i w kierunku eksperymentatora.
  3. W "Ustawienia projektu" wybierz "Brak", a następnie "Dalej".
  4. Wybierz "Nowy przebieg chipa", "Nowy katalog chipów" (utwórz folder dla eksperymentu) i "Dalej".
  5. W polu "Ekspresja genów" wybierz "Odniesienie pasywne = ROX" (karboksyl-x-rodamina) i "Pojedyncza sonda; " Wybierz odpowiedni filtr zgodnie ze starterami. Wybierz "Dalej".
  6. Wybierz "Przeglądaj" i wybierz odpowiedni program zgodnie z użytymi podkładami.
    UWAGA: "Default-10min-Hotstart.pcl" jest najczęściej używanym programem do multipleksu RT-qPCR dla pojedynczych komórek.
  7. Wybierz "Rozpocznij bieg". Reakcja trwa około 90 minut.
  8. Po zakończeniu wybierz "Wysuń-Gotowe".

9. Analiza danych

  1. Otwórz oprogramowanie "Real-Time PCR Analysis", wybierz "Plik" i "Otwórz", znajdź folder eksperymentu i wybierz "Plik ChipRun.mm".
  2. Kliknij "Widok analizy", "Tabela wyników" i "Widok mapy cieplnej"; " pola oznaczone symbolem "X" znajdują się poniżej progowego poziomu detekcji i/lub mają nieprawidłowe krzywe amplifikacji.
  3. Nazwij przykłady. Przejdź do "Przykładowa konfiguracja" i wybierz "Nowy SBS 96". Kliknij "Mapowanie" i wybierz "..." Skopiuj i wklej przykładowy projekt układu z oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. Zdefiniuj wklejony układ jako "Przykładowa nazwa".
  4. Nazwij testy. Powtórz krok 9.3 z nazwami starterów w "Konfiguracja detektora". Zdefiniuj wklejony układ jako "Nazwa detektora".
  5. Kliknij "Widok analizy" i "Analizuj; " nazwy próbek i starterów zostaną automatycznie przypisane do próbek i starterów (rysunek 7).
  6. Oblicz Ct, Delta Ct i zmianę krotności dla każdej próbki. Użyj genu sprzątania jako kontroli wewnętrznej (tutaj, Gapdh):
    ΔCt =Ct próbka -Ct kontrola wewnętrzna
    Zmiana krotności = 2-(ΔCtpróbka-ΔCtkontrola ujemna)
    1. Kliknij "Ustawienia detektora" i wybierz studnię bez kontroli wejściowej (użyj genu porządkowania jako kontroli wewnętrznej, aby znormalizować ekspresję genów). Wybierz "Edytor", "zdefiniuj odniesienie" i "Aktualizuj".
    2. Należy zaznaczyć wszystkie studzienki, do których zostanie zastosowana wyżej zdefiniowana kontrola wewnętrzna. Wybierz "Edytor" i "zdefiniuj jako test". Wybierz odpowiedni gen referencyjny i kliknij "Aktualizuj".
    3. Wybierz "Sample Setup", aby wybrać dołek kontroli ujemnej. Wybierz "Edytor" i zdefiniuj "Odniesienie". Kliknij "Aktualizuj".
    4. Wybierz "Widok analizy" i "Analizuj; " Delta Ct i zmiana krotności zostaną obliczone automatycznie.
  7. Eksportuj dane. Wybierz "Plik" i "Eksportuj", zapisz jako "Wyniki tabeli", wybierz folder docelowy i naciśnij "Zapisz" i "Wyjdź".
  8. Powtórz krok 9.7, ale zamiast "Wyniki tabeli" zapisz jako "Wyniki mapy cieplnej".

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Populacje limfoidalne wykazują dużą różnorodność w ekspresji genów. W tym protokole badano heterogeniczność kompartmentów ILC wątroby przy użyciu ekspresji genu RT-qPCR w multipleksie pojedynczej komórki. W przeciwieństwie do innych technik ekspresji genów, ekspresja genu RT-qPCR w multipleksie pojedynczym komórkowym pozwala na pracę na kilku populacjach, nawet tych najrzadszych, w tym samym czasie. Ta specyficzność, w połączeniu z wysoką czułością na poziomie klonalnym, pozwala na badani...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje, w jaki sposób uzyskać wyczerpujące informacje o ekspresji genów na poziomie klonalnym. Tutaj zbadaliśmy niejednorodność kompartmentu ILC w wątrobie. Po posortowaniu pojedynczych komórek w różnych populacjach ILC (w oparciu o szeroko wyrażone markery powierzchniowe ILC), próbki zostały wstępnie amplifikowane pod kątem określonych, wstępnie wybranych genów. Następnie uzyskane cDNA i startery załadowano na multipleksowy chip mikroprzepływowy RT-qPCR. Ostatecznie uzyskaliśmy ekspresję 48 różnych genów z...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Institut Pasteur, INSERM, Université Paris Diderot i Ministère de la Recherche (do S.C.); Association pour la Recherche sur le Cancer (do S.C. i R.G.); Program Inwestycyjny Przyszłości REVIVE oraz Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ''Twothyme'' dla A.C.); Grant ANR "Myeloten" (dla R.G.); oraz Institut National du Cancer (Rola mikrośrodowiska immunologicznego podczas kancerogenezy wątroby, do R.G.). Dziękujemy za wsparcie Centrum Immunologii i Cytometrii Człowieka w Instytucie Pasteura.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zestaw Cells Direct One Step qRT-PCRApplied Biosystems 11753100Zestaw do wykrywania sondy startera. Zawiera 2x mieszaninę reakcyjną, enzym SSIII Platinium.
Bufor Low TEEDTA Affymetrix75793 100ML
96-dołkowe płytkiThermofisher ScientificAB 110096-dołkowe płytki przystosowane do sortowania komórek i termocyklingu Folia
osłonowaDominique Dutscher106570aluminiowa folia ochronna; unikaj zanieczyszczenia i parowania
ActbThermofisher ScientificMm00607939_s120x podkład
AesThermofisher ScientificMm01148854_s120x podkład
AhrThermofisher ScientificMm00478932_s120x podkład
Bcl2Thermofisher ScientificMm00477631_s120x podkład
c-mycThermofisher ScientificMm00487804_s120x podkład
CbfbThermofisher ScientificMm01251026_s120x podkład
Cd27Thermofisher ScientificMm01185212_s120x podkład
Cd49aThermofisher ScientificMm01306375_s120x podkład
CD49bThermofisher ScientificMm00434371_s120x podkład
Cxcr5Thermofisher ScientificMm00432086_s120x podkład
Cxcr6Thermofisher ScientificMm02620517_s120x podkład
EomesThermofisher ScientificMm01351985_s120x podkład
Ets1Thermofisher ScientificMm01175819_s120x podkład
Foxo1Thermofisher ScientificMm00490672_s120x podkład
GapdhThermofisher ScientificMm03302249_s120x podkład
Gata3Thermofisher ScientificMm00484683_s120x podkład
Gm-csfThermofisher ScientificMm01136644_s120x podkład
Hes1Thermofisher ScientificMm01342805_s120x podkład
HprtThermofisher ScientificMm00446968_s120x podkład
Id2Thermofisher ScientificMm01293217_s120x podkład
Ił-12rb2Thermofisher ScientificMm00711781_s120x podkład
Ił-18r1Thermofisher ScientificMm00515178_s120x podkład
Ił-1rl1Thermofisher Scientific Mm00434237_s120x podkład
Ił-22Thermofisher ScientificMm001226722_s120x podkład
Ił-23rThermofisher ScientificMm00519943_s120x podkład
Il-2raThermofisher ScientificMm01340213_s120x podkład
Ił-2rbThermofisher ScientificMm01195267_s120x podkład
IL-7rThermofisher ScientificMm00434295_s120x podkład
Klr5Thermofisher ScientificMm04207528_s120x podkład
Lef1Thermofisher ScientificMm00550265_s120x podkład
Ncr1Thermofisher ScientificMm01337324_s120x podkład
Nfil3Thermofisher ScientificMm01339838_s120x podkład
Notch1Thermofisher ScientificMm00435249_s120x podkład
Notch2Thermofisher ScientificMm00803069_s120x podkład
RoraThermofisher ScientificMm01173766_s120x podkład
RorcThermofisher ScientificMm01261022_s120x podkład
Runx3Thermofisher ScientificMm00490666_s120x podkład
Tbx21Thermofisher ScientificMm01299453_s120x podkład
Tcf3Thermofisher ScientificMm01175588_s120x podkład
Tcf7Thermofisher ScientificMm00493445_s120x podkład
Tle1Thermofisher ScientificMm00495643_s120x podkład
Tle3Thermofisher ScientificMm00437097_s120x podkład
Tsc22d3Thermofisher ScientificMm01306210_s120x podkład
Tnfrsf11aThermofisher ScientificMm00437132_s120x podkład
ToxThermofisher ScientificMm00455231_s120x podkład
Zbtb16Thermofisher ScientificMm01176868_s120x podkład
Zbtb7bThermofisher ScientificMm00784709_s120x podkład
qPCR Master mix Applied BioSystemsP/N 4304437
2x Test Ładowanie odczynnikaFluidigmP/N 85000736Testy o określonej gęstości podłoża do obciążenia w multipleksowym chipie mikroprzepływowym RT-qPCR. 
2x Odczynnik do ładowania próbkiFluidigmP/N 85000735Medium o określonej gęstości do ładowania próbek w multipleksowym chipie mikroprzepływowym RT-qPCR. 
48.48 mutliplex RT qPCR mikroprzepływowy chipFluidigmBMK-M-48.4848.48 Dynamiczna tablica IFC do ekspresji genów; chip do jednokomórkowego multipleksu Reakcja RT-qPCR
48.48 mutliplex RT qPCR mikroprzepływowy kontroler chipowyFluidigm8900002048.48; kontrolować wewnętrzny układ fluidyczny chipa, ładować próbki i testy w komorach reakcyjnych
Termocykler mikroprzepływowy mutliplex RT qPCRFluidigmGE48.4848.48 Dynamic Array Termocykler IFC
96-dołkowe płytkiThermofisher ScientificAB 1100Płytki 96-dołkowe przystosowane do sortowania komórek i termocyklingu
Myszy C57Bl/6JanvierC57Bl/6 miceJ@RJ
strzykawka 10 mlBD Biosciences309639
PBSLife Technologies14040174
HBSSLife Technologies24020133
RPMILife Technologies61870044
FCSCVFSVF000UEurobio AbcysStandardowa płodowa surowica cielęca
Probówka PotteraN/A
Tubka 15 mlCorning352097
Probówka 1,5 mlSigma-AldrichT9661-1000EA
FACS MaszynaNie dotyczy
Wirówka Thermofisher Scientific75004538
1 000 &mikro; l końcówkiFisher Scientific10313272
P1000 GilsonF123602
PercollDominique Dutscher17-0891-01
Probówka FacsFalcon352235
anty-CD8 Przeciwciało myszy biotyny1103520przeciwciało
linii anty-CD19 Mysie przeciwciało biotynyPrzeciwciało liniiSony1177520
anty-TCRab Przeciwciało myszy BiotynaBioLegend109204przeciwciało
liniowe anty-TCRgd Przeciwciało myszy biotynyPrzeciwciało553176 linii BD Biosciences przeciwciało
anty-Ter119 Mysie przeciwciało biotyny Przeciwciało553672 Przeciwciałolinii
anty-Gr1 BiotynaPrzeciwciało myszy BD Biosciences553125przeciwciało liniowe
anty-CD45.2 Przeciwciało myszy PerCPCy5.5BioLegend109828
mysie przeciwciało anty-IL7ra PeCy7ebioSciences25-1271-82
mysie przeciwciało anty-CD3 BV510BD Biosciences563024
mysie przeciwciało anty-CD4 BV786BD Biosciences563727
anty-NKp46 PE mysieprzeciwciało ebioSciences12-3351-82
StreptawidynaSony2626025
Jodek propidiumSigma-AldrichP4864-10ML
Pipeta elektronicznaEppendorf4986000017
Combitips 0,1 mlEppendorf30089405
Pipeta wielokanałowaRaininL8-10XLS+
AccudropBD Biosciences345249koraliki weryfikacyjne do FACS
Kontroler IFC Sony myszy myszy

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
  2. Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
  3. Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
  4. Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
  5. Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
  6. Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
  7. Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
  8. Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
  9. Monticelli, L. a, Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
  10. Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
  11. Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
  12. Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
  13. Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
  14. Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
  15. Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
  16. Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single cell Gene ExpressionMultiplex RT qPCRRare Lymphoid PopulationsInnate Lymphoid CellsHepatic ILC CompartmentFluorescence activated Cell SortingMicrofluidic qPCR ChipPre amplification MixGene Expression HeterogeneityReal time PCR Analysis

Related Articles