Ten protokół opisuje, jak ocenić ekspresję dużej liczby genów na poziomie klonalnym. Jednokomórkowy RT-qPCR daje wysoce wiarygodne wyniki z dużą czułością dla setek próbek i genów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ekspresja genów w pojedynczej komórce za pomocą multipleksu RT-qPCR w celu scharakteryzowania heterogeniczności rzadkich populacji limfoidalnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niejednorodność ekspresji genów jest interesującą cechą do zbadania w populacjach limfoidalnych. Ekspresja genów w tych komórkach zmienia się podczas aktywacji komórek, stresu lub stymulacji. Ekspresja genów w multipleksie pojedynczej komórki umożliwia jednoczesną ocenę dziesiątek genów1,2,3. Na poziomie pojedynczej komórki ekspresja genów multipleksowych określa heterogeniczność populacji4,5. Pozwala na rozróżnienie niejednorodności populacji poprzez określenie zarówno prawdopodobnej mieszanki różnych etapów prekursorowych wśród dojrzałych komórek, jak i różnorodności odpowiedzi komórek na bodźce.
Wrodzone komórki limfoidalne (ILC) zostały niedawno opisane jako populacja wrodzonych efektorów odpowiedzi immunologicznej6,7. W tym protokole badana jest heterogeniczność komórek przedziału wątrobowego ILC podczas homeostazy.
Obecnie najczęściej używaną techniką oceny ekspresji genów jest RT-qPCR. Ta metoda mierzy ekspresję genu tylko jednego genu na raz. Ponadto metoda ta nie może oszacować niejednorodności ekspresji genów, ponieważ do jednego testu potrzebnych jest wiele komórek. Prowadzi to do pomiaru średniej ekspresji genów w populacji. Przy ocenie dużej liczby genów RT-qPCR staje się metodą czasochłonną, odczynnikową i pochłaniającą próbki. W związku z tym kompromisy ograniczają liczbę genów lub populacji komórek, które można ocenić, zwiększając ryzyko pominięcia globalnego obrazu.
Ten manuskrypt opisuje, jak można wykorzystać multipleksowy RT-qPCR z pojedynczą komórką do pokonania tych ograniczeń. Technika ta skorzystała z najnowszych osiągnięć technologicznych w dziedzinie mikrofluidyki1,2. Reakcje zachodzące w multipleksowych chipach RT-qPCR nie przekraczają poziomu nanolitrów. W związku z tym ekspresja genów w pojedynczej komórce, a także jednoczesna ekspresja wielu genów, może być przeprowadzana w sposób opłacalny i odczynnikowy, próbkowy i kosztowy. Możliwe jest badanie niejednorodności sygnatur genów komórkowych na poziomie klonalnym między podzbiorami komórek w populacji na różnych etapach rozwoju lub w różnych warunkach4,5. Praca na rzadkich populacjach z dużą liczbą schorzeń na poziomie pojedynczej komórki nie jest już ograniczeniem.
Wprowadzenie
W ciągu ostatnich kilku lat, wrodzone komórki limfoidalne (ILC) były coraz częściej badane. Pomimo braku receptorów specyficznych dla antygenu, należą one do linii limfatycznej i stanowią ważnych strażników homeostazy tkanek i stanu zapalnego. ILC są obecnie podzielone na trzy grupy w zależności od ekspresji specyficznych kombinacji czynników transkrypcyjnych i ich zdolności do wytwarzania cytokin6,7.
ILC przyczyniają się do licznych sytuacji homeostatycznych i patofizjologicznych w różnych narządach poprzez specyficzną produkcję cytokin8,9. Aby móc zrozumieć rolę tych komórek, ważne jest określenie różnych subpopulacji ILC na narząd i zidentyfikowanie ich relacji rozwojowych. Ponadto zjawiska plastyczności pomiędzy różnymi podzbiorami zostały ze sobą powiązane. Badając niejednorodność komórek obecnych w jednym narządzie, możliwe jest określenie ich etapu dojrzewania i rozróżnienie ich specyficznych funkcji.
Aby zilustrować technikę monokomórkowego multipleksu RT-qPCR, wybrano wątrobowe ILC, ze szczególnym naciskiem na ich heterogeniczność w obrębie tej samej grupy ILC (typ 1 ILC)10. Po pierwsze, dzięki zastosowaniu cytometrii przepływowej, scharakteryzowano trzy odrębne populacje ILC w wątrobie. ILC grupy 1 reprezentuje około 80% wrodzonych efektorów, podczas gdy dwie pozostałe populacje to rzadkie populacje ILC wątroby (mniej niż 5% wrodzonych efektorów). Populacje te posortowano przy użyciu szeroko wyrażonych markerów powierzchni komórek populacji ILC. W rezultacie, posortowane populacje ILC w wątrobie wyglądają zasadniczo podobnie do siebie.
Jednokomórkowy multipleksowy RT-qPCR okazał się jedną z najlepszych technik szybkiego badania heterogeniczności tych populacji11. Dwie główne cechy są określane przez wykorzystanie techniki multipleksu pojedynczej komórki RT-qPCR. Po pierwsze, patrząc na poziom klonalny, możliwe jest odzyskanie ekspresji genów specyficznych dla komórki w celu porównania między komórkami, które najwyraźniej wykazują podobne etapy rozwoju. Następnie, patrząc na wstępnie wybraną kombinację ekspresji genów, określimy nowe sygnatury genów na podstawie jednoczesnych wzorców ekspresji genów w jednym punkcie czasowym. Aspekty te pozwalają na gromadzenie szerokiej gamy danych dotyczących ekspresji dla dużej liczby komórek, nawet w rzadkich populacjach, ponieważ technika ta jest wykonywana na poziomie klonalnym. W ten sposób można odpowiednio ocenić niejednorodność ILC w wątrobie.
Następnie, sortując wszystkie komórki o globalnym fenotypie ILC, uzyskuje się szeroki przegląd ekspresji wielogenowej w populacjach ILC wątroby, mimo że reprezentują one niezwykle rzadkie populacje. Chip oparty na mikroprzepływach pozwala na eksperymentowanie nawet z niewielką ilością materiału komórkowego. W konsekwencji można uzyskać profile ekspresji genów w rzadkich populacjach komórek. Korzystając z oprogramowania do analizy sygnatur genetycznych online, można badać klastry populacji komórek i potencjalne relacje między komórkami. W związku z tym można przeprowadzić testy funkcjonalne w celu walidacji danych grupowania na poziomie in vivo.
Dziesiątki ekspresji genów mogą być oceniane jednocześnie na setkach lub więcej pojedynczych komórek na tym samym chipie3,11,12. Projekt testu jest najdłuższą i najważniejszą częścią eksperymentu. Określenie genów istotnych dla hipotezy, która ma być badana, ma zasadnicze znaczenie dla uzyskania odpowiednich wyników. Po drugie, potrzebna jest kontrola wewnętrzna (np. znane znaczniki powierzchni używane do sortowania) i szczególne kontrole. Ma to kluczowe znaczenie dla przetestowania swoistości amplifikacji startera, skuteczności wzmocnienia i braku konkurencji ze starterami. Dlatego praca z multipleksem pojedynczych komórek RT-qPCR jest techniką oszczędzającą czas, ponieważ w tym samym czasie oceniana jest ekspresja wielu genów w komórce.
Używanie tego samego chipa i mieszanki odczynników dla wszystkich komórek ogranicza możliwe błędy manipulacji i pozwala na powtarzalność między próbkami. Podsumowując, różne aspekty multipleksu pojedynczej komórki RT-qPCR pozwalają na uzyskanie wysoce wiarygodnych wyników na poziomie klonalnym, z dużym poziomem czułości dla szerokiej gamy próbek i genów. Uzyskane wyniki dostarczają potężnych i solidnych danych do testów biostatystycznych.
To można osiągnąć dzięki mikroprzepływowemu aspektowi metody, który pozwala na pracę na bardzo małych ilościach materiału i prowadzi do wyczerpujących wyników. Wreszcie, za pomocą oprogramowania online, można porównać pożądane populacje.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Bezpieczeństwa Instytutu Pasteura zgodnie z wytycznymi francuskiego Ministerstwa Rolnictwa oraz wytycznymi UE.
1. Przygotowanie 96-dołkowej płytki do sortowania pojedynczych komórek
- Przygotować mieszaninę do preamplifikacji w probówce o pojemności 1,5 ml, dodając 5,0 µl specyficznego buforu do odwrotnej transkrypcji, 1,3 µl buforu TE o niskiej zawartości kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (roztwór TE 10 mM, pH 8 oraz roztwór EDTA 0,1 mM; filtrowany 0,2 µM) oraz 0,2 µl polimerazy Taq DNA na każdą studzienkę (Rysunek 1a).
- Na płytce 96-dołkowej rozdzielić po 6,5 µl mieszaniny do preamplifikacji do każdej studzienki (do 48 studzienek). Płytka ta służy jako 96-dołkowa płytka do sortowania pojedynczych komórek.
UWAGA: W tym protokole zaleca się stosowanie pipety elektronicznej. Pozwala ona na precyzyjne i powtarzalne pomiary objętości oraz oszczędza czas.
Rycina 1: Procedura napełniania płytki 96-dołkowej. Napełnianie płytek 96-dołkowych należy przeprowadzić bardzo starannie, ponieważ będzie miało to wpływ na dalszy przebieg eksperymentu.aNa 96-dołkową płytkę do sortowania pojedynczych komórek w pierwszej kolejności nanosi się mieszaninę do preamplifikacji, a następnie 0,2x mieszaninę testową.b) Rejestr pozycji każdej pojedynczej komórki powinien być prowadzony w arkuszu kalkulacyjnym. Dołek bez komórki nazywa się dołkiem „bez wkładu” (no input) i może on służyć jako kontrola. Dwa rzędy można przeznaczyć do kontroli wydajności starterów poprzez rozcieńczenie cDNA (sekwencyjne rozcieńczenia dziesięciokrotne, zaczynając od ilości równoważnej 105 komórek do jednej komórki). (Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.Na płytce testowej z 96 dołkami w pierwszej kolejności rozprowadza się odczynnik do ładowania testu, a następnie dodaje primery. Należy pamiętać o sporządzeniu schematu rozmieszczenia każdego primera. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Przygotować mieszaninę analityczną 0,2x w probówce 1,5 ml, dodając 1,4 µl każdego primera (primery 20x; do 48 różnych sond; patrz Tabela 1). Uzupełnić końcową objętość do 140 µl za pomocą buforu TE z niską zawartością EDTA.
- Rozdzielić 2,5 µl mieszaniny analitycznej 0,2x do 48 studzienek w 96-dołkowej płytce do sortowania pojedynczych komórek zawierającej mieszaninę do preamplifikacji.
UWAGA: Końcowa objętość w każdej studzience 96-dołkowej płytki z próbkami powinna wynosić 9 µl. - Uszczelnić płytkę folią pokrywową. Wymieszać płytkę wstrząsarze wirowym (vortex) i odwirować przy 280 x g przez 45 s. Przechowywać 96-dołkową płytkę do sortowania pojedynczych komórek w temperaturze -20 °C lub użyć natychmiast.
2. Dysocjacja pojedynczych komórek
- Używając systemu podawania CO2, uśmierć mysz poprzez hipoksję. Unieruchom mysz na płytce sekcyjnej i otwórz jamę otrzewną wzdłużnie za pomocą nożyczek.
- Wyizoluj ILC z wątroby.
- Przed izolacją wątroby wypłucz komórki krążące w wątrobie.
- Aby odsłonić żyłę wrotną, przesuń jelito cienkie i grube na lewą stronę myszy; żyła wrotna jest największą żyłą w jamie otrzewnej.
- Za pomocą strzykawki 10 ml i igły 0,45 mm wypłucz wątrobę przez żyłę wrotną za pomocą soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS). Aby ułatwić płukanie wątroby, przetnij tętnicę żołądkową nożyczkami.
- Aby usunąć pęcherzyk żółciowy, uciśnij podstawę pęcherzyka szczypcami i oddziel go od wątroby nożyczkami.
- Aby wyizolować wątrobę, uciśnij podstawę wątroby szczypcami i za pomocą nożyczek oddziel wątrobę od reszty jamy otrzewnej.
- Przenieś wątrobę do probówki typu Potter z 5 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) z 2% płatkową surowicą cielęcą (FCS).
- Przed izolacją wątroby wypłucz komórki krążące w wątrobie.
- Rozbij wątrobę mechanicznie za pomocą tłuczka. Przenieś zawiesinę do probówki 15 ml. Uzupełnij całkowitą objętość do 14 ml za pomocą RPMI 2% FCS. Pozostaw zawiesinę komórkową na lodzie przez 15-20 min, aby odciąć hepatocyty.
- Przenieś nadsącz (bez hepatocytów) do nowej probówki 15 ml za pomocą pipety 1 ml (przewidywana objętość nadsączu to 12 ml). Wirować przy 120 x g przez 7 min w temperaturze 10 °C. Po wirowaniu odrzuć nadsącz.
- Resuspenduj osad uzyskany w kroku 2.4 w 14 ml pożywki do gradientu gęstości (np. Percoll 40%). Wirować przy 600 x g przez 20 min w temperaturze 20 °C. Usuń nadsącz poprzez aspirację.
- Resuspenduj osad w 1 ml octanu potasu (ACK). Pozostaw w temperaturze pokojowej przez 1 min. Po 1 min uzupełnij całkowitą objętość do 14 ml za pomocą zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) z 2% FCS. Wirować przy 120 x g przez 7 min w temperaturze 10 °C. Odrzuć nadsącz.
- Przebarw komórki.
- Resuspenduj osad w 300 µl mieszanki przeciwciał biotynylowanych (patrz Tabela Materiałów; dodaj wszystkie wymienione przeciwciała biotynylowane) i przenieś komórki do probówki 1,5 ml. Pozostaw w ciemności przez 20 min w temperaturze 4 °C.
- Uzupełnij całkowitą objętość do 1 ml za pomocą HBSS 2% FCS. Wirować przy 120 x g przez 7 min w temperaturze 10 °C. Resuspenduj osad w 30 µl mieszanki przeciwciał sprzężonych z fluorochromem oraz streptawidyny sprzężonej z fluorochromem (patrz Tabela Materiałów; dodaj wszystkie wymienione przeciwciała sprzężone z fluorochromem). Pozostaw w ciemności przez 20 min w temperaturze 4 °C.
- Uzupełnij całkowitą objętość do 1 ml za pomocą HBSS 2% FCS. Wirować przy 120 x g przez 7 min w temperaturze 10 °C. Usuń nadsącz za pomocą pipety 1 ml. Resuspenduj osad w 1 ml HBSS i jodku propidium (Pi; 1:4 0).
UWAGA: Przy zastosowaniu szeroko ekspresyjnych markerów powierzchniowych komórek ILC definiuje się 3 populacje: NKp46+ IL-7Rα-, NKp46+ IL-7Rα+ oraz NKp46- IL-7Rα+. Wszystkie populacje są sortowane jako lineage- CD3- CD4- CD45.2+.
3. Sortowanie komórek pojedynczych metodą fluorescencyjnej aktywowanej sorterowania komórek (FACS)
- Użyj metody FACS do sortowania pojedynczych komórek13.
UWAGA: Różne typy komórek mogą być sortowane na tej samej 96-dołkowej płytce do sortowania pojedynczych komórek (Rysunek 2).- Za pomocą FACS posortuj jedną komórkę na dołek zawierający 0,2x mieszaninę do analizy oraz mieszaninę do preamplifikacji na 96-dołkowej płytce do sortowania pojedynczych komórek. Użyj świeżo przygotowanej 96-dołkowej płytki do sortowania pojedynczych komórek lub rozmroź ją, jeśli była przechowywana w temperaturze -20 °C.
- Umieść zapieczętowaną płytkę 96-dołkową w uchwycie do płytek FACS. W ramach testu użyj pustej płytki 96-dołkowej. Ustaw płytkę tak, aby dołek A1 znajdował się po lewej stronie i był skierowany w stronę operatora.
- Wyreguluj uchwyt płytki tak, aby uzyskać kroplę w centrum dołka A1 przy użyciu kulek weryfikacyjnych.
- Powtórz krok 3.1.1.2 dla wszystkich dołków w rzędzie A.
- Zdejmij uszczelnienie z płytki 96-dołkowej i posortuj 10 kulek weryfikacyjnych na dołek. Sprawdź, czy w centrum dołków tworzą się krople.
- Po prawidłowej regulacji umieść 96-dołkową płytkę do sortowania pojedynczych komórek w uchwycie. Sporządź układ płytki i posortuj 1 komórkę na dołek.
UWAGA: Prawidłowe rozmieszczenie każdej komórki na 96-dołkowej płytce do sortowania pojedynczych komórek jest kluczowe. Układ płytki należy prowadzić w programie do arkuszy kalkulacyjnych. Układ płytki będzie wykorzystywany w kolejnych kilku krokach (Rysunek 1b)14. Pozostaw jeden dołek zawierający 0,2x mieszaninę do analizy i mieszaninę do preamplifikacji na 96-dołkowej płytce z próbkami bez komórek. Dołek ten służy jako kontrola bez wsadu. Pozostaw dwa rzędy po 6 dołków na rozcieńczenie cDNA. Dołki te służą jako kontrole wydajności starterów (Rysunek 1b). - Przechowuj 96-dołkową płytkę do sortowania pojedynczych komórek w temperaturze -20 °C lub użyj jej natychmiast.
- Za pomocą FACS posortuj jedną komórkę na dołek zawierający 0,2x mieszaninę do analizy oraz mieszaninę do preamplifikacji na 96-dołkowej płytce do sortowania pojedynczych komórek. Użyj świeżo przygotowanej 96-dołkowej płytki do sortowania pojedynczych komórek lub rozmroź ją, jeśli była przechowywana w temperaturze -20 °C.
4. Preamplifikacja
- Należy użyć świeżej lub rozmrożonej 96-dołkowej płytki do sortowania pojedynczych komórek uzyskanej w kroku 3.1.1.6. Płytkę należy wymieszać na wortexie, a następnie odwirować (280 x g przez 45 s).
- Umieść 96-dołkową płytkę do sortowania pojedynczych komórek w termocyklerze. Przeprowadź odwrotną transkrypcję oraz preamplifikację zgodnie z programem opisanym w Rycina 3 i Tabela 2.
Rycina 3: Program preamplifikacji. Aby uzyskać odpowiednią ilość materiału, konieczna jest preamplifikacja specyficznych genów docelowych w posortowanych pojedynczych komórkach. Płytkę 96-dołkową do sortowania pojedynczych komórek umieszcza się w termocyklerze w celu przeprowadzenia programu preamplifikacji. Produkty preamplifikacji są następnie rozcieńczane buforem TE z niską zawartością EDTA i mogą być użyte natychmiast lub zamrożone w temperaturze -20 °C. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Rozcieńcz próbki po wstępnej amplifikacji, dodając 36 µl buforu TE z niską zawartością EDTA do każdego dołka.
- Zabeziecz płytkę folią uszczelniającą. Wymieszaj płytkę na wortexie i odwiruj (280 g przez 45 sek). Przechowuj 96-dołkową płytkę do sortowania pojedynczych komórek po wstępnej amplifikacji w temperaturze -20 °C lub użyj jej natychmiast.
5. Przygotowanie 96-dołkowej płytki z próbkami
- Przygotować 191 µl mieszaniny głównej (master mix), dodając 175 µl qPCR master mix oraz 17,5 µl odczynnika do ładowania próbek.
- Na nowej płytce 96-dołkowej rozdzielić po 3,6 µl mieszaniny głównej do każdego dołka (do 48 dołków). Jest to 96-dołkowa płytka z próbkami.
- Przenieść 2,9 µl wstępnie amplifikowanego cDNA z 96-dołkowej płytki z próbkami na nową płytkę 96-dołkową. Zachować tę samą pozycję dla każdej próbki pomiędzy 96-dołkową płytką do sortowania pojedynczych komórek a 96-dołkową płytką z próbkami.
- Uszczelnić płytkę folią ochronną. Wymieszać płytkę na wortexie i odwirować (280 x g przez 45 sec). Umieścić nową płytkę 96-dołkową na lodzie, chroniąc ją przed światłem. Przechowywać 96-dołkową płytkę z próbkami w temperaturze -20 °C lub użyć jej niezwłocznie.
6. Przygotowanie płytki analitycznej 96-dołkowej
- Na nowej płytce 96-dołkowej rozprowadzić 3 µl odczynnika do ładowania testu w każdym dołku (do 48 dołków). Płytka ta jest nazywana 96-dołkową płytką testową.
- Do każdego dołka dodać 3 µl starterów. Prowadzić rejestr w arkuszu kalkulacyjnym (Rycina 1c oraz Tabela 1; należy użyć wszystkich starterów wymienionych w Tabeli 1). Prawidłowe rozmieszczenie każdego startera na 96-dołkowej płytce testowej jest kluczowe dla kolejnych etapów.
- Jeśli liczba próbek jest mniejsza niż 48, do niewykorzystanych dołków dodać wodę zamiast starterów.
- Uszczelnić płytkę folią ochronną. Wymieszać zawartość płytki w wortexie, a następnie odwirować (280 x g przez 45 sec). Przechowywać 96-dołkową płytkę testową w temperaturze -20 °C lub użyć jej niezwłocznie.
UWAGA: Aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania starterów, należy rozprowadzić startery do mieszaniny przedamplifikacyjnej oraz na 96-dołkową płytkę testową w tym samym czasie.
7. Chip do analizy ekspresji genów w pojedynczych komórkach
- Umieść zintegrowany układ mikrofluidyczny (IFC) na blacie i sprawdź zawory za pomocą zamkniętej strzykawki. Otwórz strzykawkę, ustaw ją prostopadle do zaworu i mocno naciśnij. Uszczelka typu O-ring powinna się poruszyć. Wypełnij chip płynem do linii kontrolnej (0,3 ml tuberkuliny).
- Powtórz krok 7.1 dla drugiego zaworu.
UWAGA: Płyn nie może rozlać się na chip. - Usuń niebieską folię z dołu chipa. Umieść chip w kontrolerze IFC. Na ekranie kontrolera IFC wybierz „PRIME”, a następnie „RUN”. Kontrola linii mikrofluidycznych trwa 10 min.
- Wyjmij chip i ponownie przyklej niebieską folię na spodzie chipa.
Rycina 4: Załadunek chipa do multipleksowej analizy ekspresji genów w pojedynczych komórkach. Kroki te wymagają dużej precyzji, szczególnie podczas przenoszenia zawartości płytki 96-dołkowej na chip do multipleksowej analizy ekspresji genów w pojedynczych komórkach. Aby uniknąć błędów w załadunku i pomyłek w rozmieszczeniu, zdecydowanie zaleca się pracę sekwencyjną. Objętość pobierana podczas każdego przeniesienia powinna być kontrolowana w trakcie pipetowania. Na koniec należy unikać powstawania pęcherzyków powietrza i usuwać je w przypadku ich uformowania. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
- Za pomocą pipety 8-kanałowej przenieś 5 µl z płytki analitycznej 96-dołkowej na stronę A1 (lewą stronę) chipa. Wypełnij lewą stronę chipa, zgodnie z Rysunkiem 4. Należy zadbać o to, aby zawsze pobierać taką samą objętość do końcówek.
- Unikaj tworzenia pęcherzyków powietrza. Jeśli pojawią się pęcherzyki, usuń je za pomocą końcówek 10 µl. Wymieniaj końcówki dla każdego dołka chipa.
- Powtórz krok 7.5 na prawej stronie chipa, używając 5 µl z 96-dołkowej płytki z próbkami.
- Usuń niebieską folię z dna chipa. Umieść chip w kontrolerze IFC. Na ekranie kontrolera IFC wybierz „RUN SCRIPT”, a następnie „RUN”. Ładowanie linii mikroprzepływowych trwa 45 min.
- Wyjmij chip i ponownie przyklej niebieską folię na jego spodzie.
8. Uruchomienie chipa
- W komputerze obsługującym mikrofluidyczny qPCR wybrać oprogramowanie „Data Collection”. Po jego uruchomieniu wybrać opcję „New Run”.
- Wybrać „Eject”, usunąć niebieską folię z dolnej części chipa i załadować chip. Umieścić chip tak, aby dołek A1 znajdował się po lewej stronie i był skierowany w stronę operatora.
- W sekcji „Project setting” wybrać „None”, a następnie „Next”.
- Wybrać „New chip run”, „New chip directory” (utworzyć folder dla eksperymentu), a następnie „Next”.
- W sekcji „Gene expression” wybrać „Passive reference = ROX” (karboksy-x-rodamina) oraz „Single probe”; wybrać odpowiedni filtr zgodnie z zastosowanymi starterami. Wybrać „Next”.
- Wybrać „Browse” i wskazać odpowiedni program zależnie od użytych starterów.
UWAGA: „Default-10min-Hotstart.pcl” jest najczęściej stosowanym programem dla pojedynczo-komórkowego multipleksowego RT-qPCR. - Wybrać „Start Run”. Reakcja trwa około 90 min.
- Po zakończeniu procesu wybrać „Eject-Done”.
9. Analiza danych
- Uruchom oprogramowanie „Real-Time PCR Analysis”, wybierz „File”, a następnie „Open”, odszukaj folder z eksperymentem i wybierz plik „ChipRun.bml”.
- Kliknij „Analysis View”, „Results Table” oraz „Heat Map View”; pola oznaczone znakiem „X” znajdują się poniżej progu detekcji i/lub wykazały nieprawidłowe krzywe amplifikacji.
- Nazwij próbki. Przejdź do „Sample Setup” i wybierz „New SBS 96”. Kliknij „Mapping”, a następnie „…”. Skopiuj i wklej projekt układu próbek z arkusza kalkulacyjnego. Zdefiniuj wklejony układ jako „Sample Name”.
- Nazwij testy. Powtórz krok 9.3, wprowadzając nazwy primerów w sekcji „Detector Setup”. Zdefiniuj wklejony układ jako „Detector Name”.
- Kliknij „Analysis view”, a następnie „Analyze”; nazwy próbek i primerów zostaną przypisane automatycznie do odpowiednich próbek i primerów (Rysunek 7).
- Oblicz Ct, Delta Ct oraz Fold Change dla każdej próbki. Jako kontrolę wewnętrzną wykorzystaj gen referencyjny (tutaj: Gapdh):
ΔCt = Ctpróbka - Ctkontrola wewnętrzna
Fold Change = 2-(ΔCtpróbka-ΔCtkontrola negatywna)- Kliknij „Detector Setup” i wybierz studzienkę bez kontroli wejściowej (wykorzystaj gen referencyjny jako kontrolę wewnętrzną do normalizacji ekspresji genów). Wybierz „Editor”, „define reference”, a następnie „Update”.
- Zaznacz wszystkie studzienki, do których zostanie zastosowana zdefiniowana powyżej kontrola wewnętrzna. Wybierz „Editor” i „define as Test”. Wybierz odpowiedni gen referencyjny i kliknij „Update”.
- Wybierz „Sample Setup”, aby wskazać studzienkę kontroli negatywnej. Wybierz „Editor” i zdefiniuj jako „Reference”. Kliknij „Update”.
- Wybierz „Analysis View”, a następnie „Analyze”; wartości Delta Ct i Fold Change zostaną obliczone automatycznie.
- Eksportuj dane. Wybierz „File” i „Export”, zapisz jako „Table Results”, wybierz folder docelowy, a następnie kliknij „Save” i „Exit”.
- Powtórz krok 9.7, ale zamiast „Table Results” zapisz plik jako „HeatMap Results”.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Populacje limfoidalne wykazują dużą różnorodność ekspresji genów. W tym protokole badano heterogeniczność kompartmentu komórek ILC w wątrobie przy użyciu jednocząstkowej wielokrotnej ekspresji genów metodą RT-qPCR. W przeciwieństwie do innych technik badania ekspresji genów, jednocząstkowa wielokrotna metoda RT-qPCR pozwala na jednoczesną pracę z kilkoma populacjami, nawet z najrzadszymi. Ta specyficzność, w połączeniu z wysoką czułością na poziomie klonalnym, umożliwia analizę różnic w s...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Protokół ten opisuje, w jaki sposób uzyskać wyczerpujące informacje o ekspresji genów na poziomie klonalnym. Tutaj zbadaliśmy niejednorodność kompartmentu ILC w wątrobie. Po posortowaniu pojedynczych komórek w różnych populacjach ILC (w oparciu o szeroko wyrażone markery powierzchniowe ILC), próbki zostały wstępnie amplifikowane pod kątem określonych, wstępnie wybranych genów. Następnie uzyskane cDNA i startery załadowano na multipleksowy chip mikroprzepływowy RT-qPCR. Ostatecznie uzyskaliśmy ekspresję 48 różnych genów z...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Institut Pasteur, INSERM, Université Paris Diderot i Ministère de la Recherche (do S.C.); Association pour la Recherche sur le Cancer (do S.C. i R.G.); Program Inwestycyjny Przyszłości REVIVE oraz Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ''Twothyme'' dla A.C.); Grant ANR "Myeloten" (dla R.G.); oraz Institut National du Cancer (Rola mikrośrodowiska immunologicznego podczas kancerogenezy wątroby, do R.G.). Dziękujemy za wsparcie Centrum Immunologii i Cytometrii Człowieka w Instytucie Pasteura.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zestaw Cells Direct One Step qRT-PCR | Applied Biosystems | 11753100 | Zestaw do wykrywania sondy startera. Zawiera 2x mieszaninę reakcyjną, enzym SSIII Platinium. |
| Bufor Low TE | EDTA Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-dołkowe płytki | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-dołkowe płytki przystosowane do sortowania komórek i termocyklingu Folia |
| osłonowa | Dominique Dutscher | 106570 | aluminiowa folia ochronna; unikaj zanieczyszczenia i parowania |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20x podkład |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20x podkład |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20x podkład |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20x podkład |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20x podkład |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20x podkład |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20x podkład |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20x podkład |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20x podkład |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20x podkład |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20x podkład |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20x podkład |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20x podkład |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20x podkład |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20x podkład |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20x podkład |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20x podkład |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20x podkład |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20x podkład |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20x podkład |
| Ił-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20x podkład |
| Ił-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20x podkład |
| Ił-1rl1 | Thermofisher Scientific Mm00434237_s1 | 20x podkład | |
| Ił-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20x podkład |
| Ił-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20x podkład |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20x podkład |
| Ił-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20x podkład |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20x podkład |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20x podkład |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20x podkład |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20x podkład |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20x podkład |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20x podkład |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20x podkład |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20x podkład |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20x podkład |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20x podkład |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20x podkład |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20x podkład |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20x podkład |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20x podkład |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20x podkład |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20x podkład |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20x podkład |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20x podkład |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20x podkład |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20x podkład |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2x Test Ładowanie odczynnika | Fluidigm | P/N 85000736 | Testy o określonej gęstości podłoża do obciążenia w multipleksowym chipie mikroprzepływowym RT-qPCR. |
| 2x Odczynnik do ładowania próbki | Fluidigm | P/N 85000735 | Medium o określonej gęstości do ładowania próbek w multipleksowym chipie mikroprzepływowym RT-qPCR. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR mikroprzepływowy chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamiczna tablica IFC do ekspresji genów; chip do jednokomórkowego multipleksu Reakcja RT-qPCR |
| 48.48 mutliplex RT qPCR mikroprzepływowy kontroler chipowy | Fluidigm | 89000020 | 48.48; kontrolować wewnętrzny układ fluidyczny chipa, ładować próbki i testy w komorach reakcyjnych |
| Termocykler mikroprzepływowy mutliplex RT qPCR | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array Termocykler IFC |
| 96-dołkowe płytki | Thermofisher Scientific | AB 1100 | Płytki 96-dołkowe przystosowane do sortowania komórek i termocyklingu |
| Myszy C57Bl/6 | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| strzykawka 10 ml | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standardowa płodowa surowica cielęca |
| Probówka Pottera | N/A | ||
| Tubka 15 ml | Corning | 352097 | |
| Probówka 1,5 ml | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| FACS Maszyna | Nie dotyczy | ||
| Wirówka | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1 000 &mikro; l końcówki | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Probówka Facs | Falcon | 352235 | |
| anty-CD8 Przeciwciało myszy biotyny | 1103520 | przeciwciało | |
| linii anty-CD19 Mysie przeciwciało biotyny | Przeciwciało linii | Sony | 1177520 |
| anty-TCRab Przeciwciało myszy Biotyna | BioLegend | 109204 | przeciwciało |
| liniowe anty-TCRgd Przeciwciało myszy biotyny | Przeciwciało | 553176 linii BD Biosciences przeciwciało | |
| anty-Ter119 Mysie przeciwciało biotyny Przeciwciało | 553672 Przeciwciało | linii | |
| anty-Gr1 Biotyna | Przeciwciało myszy BD Biosciences | 553125 | przeciwciało liniowe |
| anty-CD45.2 Przeciwciało myszy PerCPCy5.5 | BioLegend | 109828 | |
| mysie przeciwciało anty-IL7ra PeCy7 | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| mysie przeciwciało anty-CD3 BV510 | BD Biosciences | 563024 | |
| mysie przeciwciało anty-CD4 BV786 | BD Biosciences | 563727 | |
| anty-NKp46 PE mysie | przeciwciało ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptawidyna | Sony | 2626025 | |
| Jodek propidium | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Pipeta elektroniczna | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0,1 ml | Eppendorf | 30089405 | |
| Pipeta wielokanałowa | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | koraliki weryfikacyjne do FACS |
Bibliografia
- Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
- Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
- Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
- Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue - inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
- Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells - a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
- Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
- Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
- Monticelli, L. a, Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
- Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
- Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
- Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
- Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
- Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
- Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
