Artykuł metodologiczny

Badanie składania proteasomu za pomocą rekombinowanych proteasomów archeonów i niedenaturujących PAGE: Argumenty przemawiające za podejściem łączonym

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54860

⸱

17 grudnia 2016

 , 
1Department of Biology, Indiana University-Purdue University, Indianapolis (IUPUI)

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół wykorzystuje zarówno koekspresję podjednostek, jak i mieszanie podjednostek postlizy w celu dokładniejszego zbadania złożenia rekombinowanego proteasomu.

Streszczenie

Proteasomy znajdują się we wszystkich dziedzinach życia. Stanowią główną drogę wewnątrzkomórkowej degradacji białek u eukariontów, chociaż ich składanie nie jest w pełni zrozumiałe. Wszystkie proteasomy zawierają strukturalnie konserwowaną cząstkę rdzenia (CP) lub proteasom 20S, zawierającą dwa pierścienie podjednostek heptamerycznych β umieszczone między dwoma pierścieniami podjednostek heptamerycznych α. Archeonowe proteasomy 20S są składem prostszym w porównaniu do swoich eukariotycznych odpowiedników, ale oba mają wspólny mechanizm składania. W związku z tym proteasomy archeonów 20S nadal są ważnymi modelami składania proteasomów eukariotycznych. W szczególności rekombinowana ekspresja archeonów proteasomów 20S w połączeniu z niedenaturującą elektroforezą w żelu poliakrylamidowym (PAGE) dostarczyła wielu ważnych informacji na temat biogenezy proteasomów. W tym miejscu omawiamy sposoby ulepszenia zwykłej strategii koekspresji podjednostek proteasomu archeonów α i β przed niedenaturującym PAGE. Pokazujemy, że chociaż szybkie i wydajne, samo podejście do koekspresji może pominąć kluczowe produkty pośrednie montażu. W przypadku proteasomu koekspresja może nie pozwalać na wykrycie półproteasomu, produktu pośredniego zawierającego jeden kompletny pierścień α i jeden kompletny pierścień β. Jednak ten produkt pośredni jest łatwo wykrywalny przez mieszanie lizatu. Sugerujemy, że połączenie koekspresji z mieszaniem lizatu daje podejście, które jest bardziej dokładne w analizie montażu, ale pozostaje niepracochłonne. Takie podejście może być przydatne do badania innych rekombinowanych kompleksów wielobiałkowych.

Wprowadzenie

Kompleksy wielobiałkowe przeprowadzają wiele krytycznych działań komórkowych1. W przypadku wielu z tych kompleksów znacznie więcej wiadomo o ich budowie i funkcji niż o ich montażu2,3. Proteasom jest jednym z takich kompleksów i występuje we wszystkich dziedzinach życia. U eukariontów ta maszyna molekularna stanowi rdzeń układu ubikwityna/proteasom (UPS) i zapewnia główną drogę wewnątrzkomórkowej degradacji białek4. Proteasom eukariotyczny (określany jako proteasom 26S) składa się z dwóch głównych podzespołów: proteasomu 20S lub cząstki rdzenia (CP)5, która może być zamknięta na jednym lub obu końcach cząstką regulatorową 19S (RP)6.

Proteasom 20S to duża proteaza podzielona na przedziały. Jego czwartorzędowa struktura jest absolutnie zachowana we wszystkich dziedzinach życia i składa się ze stosu czterech siedmioczłonowych pierścieni zawierających dwa typy strukturalnie powiązanych podjednostek, α i β5,7,8. U eukariontów dwa zewnętrzne pierścienie składają się z siedmiu odrębnych podjednostek α, a dwa wewnętrzne pierścienie składają się z siedmiu odrębnych podjednostek β; Aktywność proteolityczna znajduje się w trzech β podjednostkach. Natomiast pierścienie CP archeonów i bakterii zwykle składają się tylko z jednego rodzaju α i jednego rodzaju podjednostki β. Archeomy proteasomy dostarczyły ważnego systemu modelowego do badania składania proteasomów zarówno ze względu na ich prostotę składu, jak i dzielenie wspólnego mechanizmu składania z ich eukariotycznymi odpowiednikami9-13. Krótko mówiąc, α podjednostki najpierw łączą się w α pierścienie, które służą jako rusztowanie, na którym gromadzą się β podjednostki. Powstałe półproteasomy (α7β7) dimeryzują, dając początek w pełni złożonemu CP (α7β7β7α7). Podczas dimeryzacji propeptydy obecne na podjednostkach β są autokatalitycznie usuwane, odsłaniając katalityczne N-końcowe treoniny. Wykorzystanie proteasomów archeonów do składania modeli często wykorzystuje produkcję rekombinowanych białek proteasomu archeonów w Escherichia coli. Jest to opłacalne podejście, ponieważ umożliwia wytwarzanie podjednostek w różnych kombinacjach, zarówno jako wersje WT, jak i zmutowane, w organizmie gospodarza, który nie wytwarza własnych proteasomów.

Monitorowanie biochemicznego składania kompleksów wielobiałkowych wymaga jakiejś metody frakcjonowania, która oddziela w pełni złożone kompleksy od półproduktów i prekursorów składania. Ze względu na doskonałą zdolność rozdzielczą, niedenaturująca elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE) okazała się szczególnie przydatna we frakcjonowaniu różnych dużych kompleksów wielobiałkowych14-17. Połączenie rekombinowanej produkcji proteasomu archeonów i niedenaturującego PAGE stało się potężnym podejściem do analizy składania proteasomów9,11,12,18. Jednak zwykła metoda, za pomocą której stosuje się to podejście (tj. poprzez rekombinowaną koekspresję podjednostek α i β) ma istotną wadę. Reakcje składania są kooperacyjne i silnie zależne od stężenia3. Biorąc pod uwagę, że stężenie białka wewnątrz komórek jest bardzo wysokie19, ze względu na wykluczone efekty objętościowe, reakcje składania przebiegają szybko in vivo. W związku z tym możliwe jest pominięcie ważnych półproduktów montażowych, gdy α i β podjednostki są współwyrażane.

Tutaj opowiadamy się za podejściem łączonym w badaniu składania proteasomów przy użyciu rekombinowanych podjednostek proteasomu archeonów. W tym podejściu stosuje się zarówno metody koekspresji, jak i mieszania lizatu. Pierwsza z nich pozwala na szybką analizę montażu, ponieważ koekspresja jest mniej pracochłonna. To ostatnie polega na oddzielnej ekspresji podjednostek α i β, a następnie mieszaniu. Chociaż wymaga to nieco więcej wysiłku niż koekspresja, jest to z nawiązką rekompensowane przez zdolność do wykrywania produktów pośrednich, które są pomijane podczas koekspresji. Razem te dwie metody mogą zapewnić pełniejszy obraz składania proteasomów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Ekspresja bakteryjna.

Uwaga: Plazmidy ekspresji użyte w tym badaniu są opisane w Tabeli 1. Roztwory, pożywki i użyte w tym badaniu opisano w tabeli 2. Klonowanie archeonów podjednostek proteasomu i wytwarzanie plazmidów ekspresyjnych opisano w innym miejscu18,20. Krótko mówiąc, plazmidy do rekombinowanej koekspresji podjednostek wykorzystują strategię operonu bicistronicznego, która pomaga w uzyskaniu porównywalnych poziomów ekspresji poszczególnych podjednostek18,20. Wymienione poniżej parametry ekspresji zostały empirycznie określone jako optymalne dla podjednostek proteasomu w tym badaniu. Może być konieczna optymalizacja ekspresji dla innych mutantów proteasomów, dla proteasomów z innych gatunków archeonów lub dla innych rekombinowanych kompleksów białkowych (patrz Dyskusja).

  1. Przekształć interesujący nas plazmid ekspresyjny w chemicznie kompetentne komórki E.coli BL21(DE3).
  2. Dodaj 1 - 2 μl plazmidu (zwykle 50 - 100 ng) do podwielokrotności komórek DE3, które zostały świeżo rozmrożone na lodzie i kontynuuj inkubację na lodzie przez 20 minut.
  3. Szok termiczny ogniw w temperaturze 42 °C przez 45 s i powrót rurki do lodu na dodatkowe 2 minuty.
  4. Dodać 1 ml pożywki LB i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (150 obr./min) przez 1 godzinę.
  5. Rozprowadzić 100 - 200 μL mieszaniny transformacyjnej na płytkach LB-kan (płytki zawierające stałe podłoże LB, uzupełnione kanamycyną (wszystkie plazmidy użyte w tym badaniu kodują oporność na ten antybiotyk)). Inkubować płytki w temperaturze 37 °C O/N.
  6. Następnego ranka zaszczepij pojedynczą kolonię z płytki LB-kan do 3 ml płynnej pożywki LB-kan w szklanej probówce hodowlanej. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (150 obr./min) przez około 2,5 - 3 godziny lub do momentu uzyskania zmętnienia.
  7. Zmierzyć gęstość optyczną kultury przy 600 nm (OD600) w spektrofotometrze. Rozcieńczyć hodowlę komórkową odpowiednią ilością wstępnie podgrzanej pożywki LB-kan do OD600 0,4 w końcowej objętości 6 ml. Wznowić wytrząsanie w temperaturze 37 ºC przez 40 minut.
  8. Indukować ekspresję białek w płynnych kulturach poprzez dodanie IPTG z roztworu podstawowego do końcowego stężenia 1 mM. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (150 obr./min) przez około 6-7 godzin.
  9. Zbierz kultury komórek bakteryjnych w całości do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
  10. Dodać 1,5 ml kultury do probówki do mikrowirówki. Wirować przy 10 000 × g przez 1 min.
  11. Odrzucić supernatant i dodać kolejne 1,5 ml tej samej kultury do osadu. Wirować przy 10 000 × g przez 1 min.
  12. Powtarzaj krok 1.11, aż cała kultura zostanie zebrana do probówki mikrowirówkowej.
  13. Indukowane granulki przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu lizy.

2. Liza bakteryjna i mieszanie lizatów.

Uwaga: Dla próbek badanych za pomocą koekspresji, postępuj zgodnie z sekcją 2.1 (i jej podsekcjami). W przypadku próbek wymagających mieszania lizatu należy postępować zgodnie z sekcją 2.2 (i jej podsekcjami). Analiza TSP (Total, Soluble, Pellet), która jest zawarta w protokole, jest przydatna w optymalizacji ekspresji białek, co może pomóc w zapewnieniu, że podczas mieszania lizatu łączone są w przybliżeniu równe ilości podjednostek α i β (patrz Dyskusja). Zapewnia również ważną kontrolę, jeśli dalsze wyniki nie są zgodne z oczekiwaniami (tj. sprawdza, czy białko uległo ekspresji i jest rozpuszczalne). Dlatego zdecydowanie zalecamy włączenie na początku analizy TSP. Po osiągnięciu optymalnego protokołu dla określonej kombinacji podjednostek, analiza TSP nie jest ściśle wymagana, dlatego poniżej opisano ją jako opcjonalną.

  1. Liza komórek bakteryjnych i przygotowanie frakcji rozpuszczalnych.
    1. Rozmrozić indukowaną osadkę komórkową na lodzie przez 5 minut. Zawiesić osad w 600 μl buforu do lizy.
    2. Inkubować zawiesinę w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem (150 obr./min) przez 30 minut, aby wytworzyć całkowity lizat surowy.
      nuta: Następny krok i następująca po nim podsekcja są opcjonalne.
    3. Pobrać dwie podwielokrotności o objętości 25 μl z całkowitego lizatu surowego do oddzielnych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przeprowadzić analizę TSP w następujący sposób.
      1. Do jednej z dwóch podwielokrotności o pojemności 25 μl dodać 5-krotny bufor próbki SDS do końcowego stężenia 1X. Oznaczyć probówkę symbolem "T" dla "całkowitego lizatu surowego".
      2. Inkubować próbkę "T" w temperaturze 100 °C przez 5 minut w celu całkowitej denaturacji białek.
      3. W międzyczasie pobrać drugą porcję o pojemności 25 μl i odwirować ją w temperaturze 10 000 × g przez 10 minut. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając maleńkiego osadu, i przenieść go do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Oznacz tę nową probówkę "S" dla "frakcji rozpuszczalnej".
      4. Do maleńkiej osadki pozostawionej w poprzednim kroku dodaj 25 μl buforu do lizy i wir do ponownego zawieszenia. Oznacz tę rurkę "P" dla "frakcji granulek".
      5. Dodać 6 μl buforu do próbek 5X SDS do probówek "S" i "P" i inkubować w temperaturze 100 °C, jak opisano powyżej.
        nuta: Jeżeli próbki TSP nie zostaną użyte tego dnia do analizy ekspresji, mogą one zostać zamrożone w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne. Po rozmrożeniu należy je ponownie inkubować w temperaturze 100 ºC, jak opisano powyżej, bezpośrednio przed załadowaniem na 12% i/lub 15% standardowy żel SDS-PAGE.
    4. Podczas przeprowadzania analizy TSP należy odwirować pozostałe 550 μl całkowitego lizatu surowego (lub całe 600 μl całkowitego lizatu surowego, jeśli nie przeprowadza się analizy TSP) przy stężeniu 10 000 × g przez 10 minut. Zebrać supernatant w świeżej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Jest to rozpuszczalny lizat, który będzie używany do oczyszczania.
  2. Mieszanie lizatu.
    1. Przeprowadzić lizę zgodnie z opisem w krokach 2.1.1 i 2.1.2 powyżej.
    2. Zmieszać 600 μl całkowitego surowego lizatu od bakterii wykazujących ekspresję pożądanej podjednostki α z 600 μl całkowitego surowego lizatu od bakterii wykazujących ekspresję pożądanej podjednostki β. Inkubować w temperaturze 37 °C, powoli wstrząsając przez 30 min.
      nuta: Może być konieczne zoptymalizowanie czasu inkubacji, aby osiągnąć maksymalny montaż podczas mieszania lizatu (patrz Dyskusja). Przedstawiony tutaj czas i temperatura są optymalne dla rekombinowanych białek w tym badaniu i zostały określone w innym miejscu18.
    3. Odwirować zmieszany lizat o stężeniu 10 000 × g przez 10 minut, aby oddzielić rozpuszczalny materiał od nierozpuszczalnego osadu. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Użyj tego mieszanego rozpuszczalnego lizatu do oczyszczania białka.

3. Oczyszczanie białek za pomocą unieruchomionej żywicy kobaltowej (ICAR).

  1. Zrównoważyć żywicę.
    1. Dokładnie zawiesić żywicę, odwracając butelkę i przenieść 50 μl zawiesiny do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 700 × g przez 2 minuty do granulowania żywicy. Ostrożnie odessać supernatant.
      nuta: Aspirację pipety przeprowadzamy za pomocą niebieskiej końcówki do pipety o pojemności 1 ml, aby usunąć większość płynu. Biała końcówka o pojemności 2 μl służy do dokładnej kontroli usuwania pozostałego supernatantu, pozostawiając bardzo cienką warstwę płynu pokrywającą kulki.
    2. Dodać 1 ml buforu A. Delikatnie wymieszać, aby zawiesić żywicę i odwirować przy 700 × g przez 2 minuty do granulowania żywicy. Ostrożnie odessać supernatant i powtórzyć ten etap prania jeszcze raz.
  2. Rozpuszczalny lizat otrzymany uprzednio w sekcji 2.1 lub 2.2 nanieść na zrównoważoną żywicę. Inkubować probówkę, delikatnie obracając w temperaturze 4 °C przez 60 minut. Odwirować probówkę o masie 700 × g przez 5 minut i ostrożnie zassać supernatant.
  3. Umyj żywicę w następujący sposób, aby usunąć niespecyficznie związane białka.
    1. Zawiesić żywicę w 1 ml buforu A i inkubować, delikatnie kołysząc w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Odwirować probówkę o sile 700 × g przez 5 minut i ostrożnie zassać supernatant. Powtórz ten krok prania jeszcze raz.
    2. Zawiesić żywicę w 1 ml buforu B (bufor A z 5 mM imidazolu) i inkubować z delikatnym kołysaniem w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odwirować probówkę o stężeniu 700 × g przez 5 minut i ostrożnie zassać supernatant. Powtórz ten krok prania jeszcze raz.
    3. Zawiesić żywicę w 1 ml buforu C (bufor A z 10 mM imidazolu) i inkubować z delikatnym kołysaniem w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odwirować probówkę o sile 700 × g przez 5 minut i ostrożnie zassać supernatant.
  4. Eluować białko, dodając 400 μl buforu E (bufor A z 200 mM imidazolem) do żywicy. Inkubować z delikatnym kołysaniem w temperaturze 4 ºC przez 5 minut. Wirować przy 700 × g przez 5 min.
  5. Przenieść supernatant zawierający oczyszczone białko do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  6. Oczyszczone białko odsolić przez seryjne wirowanie w następujący sposób.
    1. Do 400 μl oczyszczonego białka dodaj 100 μl buforu A (zmniejsza to stężenie imidazolu z 200 mM do 160 mM). Zastosuj oczyszczone białko do 0,5 ml filtrów ultraodśrodkowych z odcięciem masy cząsteczkowej 10 kDa. Wirować przy 14 000 × g przez 5 min.
    2. Odrzucić filtrat i dodać 400 μl buforu A w celu rozcieńczenia retentatu i ponownie odwirować. Kontynuować cykle wirowania/rozcieńczania, aż stężenie imidazolu spadnie poniżej 4 mM. Na przykład, jeśli każde wirowanie zagęszcza 500 μl do ~70 μl (lub około 7-krotnie), to dwa cykle zmniejszą początkowe stężenie imidazolu 160 mM (7×7 = 49-krotnie) do około 3,3 mM.
    3. Zmierzyć stężenie białka w odsolonej próbce za pomocą testu BCA21.
      nuta: Odsalanie jest wymagane w celu obniżenia poziomów imidazolu poniżej granicy tolerancji dla testu BCA, zgodnie z opisem w instrukcjach producenta. Nasze laboratorium preferuje test BCA, ponieważ jest czuły, ma duży zakres dynamiki i wykazuje znacznie mniejszą zmienność między białkami. Jednak inne metody oznaczania stężenia białka można zastąpić testem BCA. Kluczem jest świadomość zalet i ograniczeń każdej metody.
  7. Dodaj 5X natywny bufor próbki do końcowego stężenia 1X i przystąp do elektroforezy. Alternatywnie, próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy.

4. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym bez denaturacji (STRONA).

Uwaga: Niespolimeryzowany akrylamid jest neurotoksyną. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny.

  1. Przygotować niedenaturujący żel PAGE w następujący sposób.
    1. Przygotuj kasetę z żelem do odlewania, używając czystych szklanych płytek i stojaka odlewniczego. Umieść ekspres do gradientów na małym mieszadle magnetycznym i umieść maleńki pręt mieszadła w każdej komorze.
    2. Używając roztworów podstawowych 40% (w/v) akrylamidu i 2% (w/v) bisakryloamidu, należy przygotować 5% i 10% (w/v) roztwory żelu akrylowego w buforze o natywnej rozdzielczości. Upewnij się, że stosunek całkowitego akrylamidu do bisakryloamidu wynosi 37,5:1. Schłodzić na lodzie przed nalaniem .
      nuta: Zastosowany tutaj niedenaturujący system PAGE jest zasadniczo identyczny z systemem SDS-PAGE Laemmli, z pominięciem SDS22.
    3. Dodać nadsiarczan amonu (z 10% (w/v) roztworu podstawowego przygotowanego w wodzie) do roztworów akryloamidu, aby zainicjować polimeryzację. Końcowe stężenie nadsiarczanu amonu wynosi 0,1% (w/v).
    4. Wlej roztwory akrylamidu do dwóch komór ekspresu do gradientów. Po włożeniu rurki wylotowej między płytki kasety żelowej aktywuj mieszadło magnetyczne i otwórz zawory ekspresu gradientowego. Wlej 5 - 10% niedenaturujący żel gradientowy.
    5. Po wylaniu pokryj żel cienką warstwą izopropanolu i pozostaw żel do polimeryzacji przez 30 minut. W tym czasie należy przygotować świeży 5% roztwór żelu akrylowo-amlidowego w natywnym buforze rozdzielczym. Po stwardnieniu żelu odlej Isopropanol i spłucz wierzch żelu dejonizowaną wodą z butelki ze spryskiwaczem.
    6. Do 5% roztworu żelu przygotowanego powyżej, dodać nadsiarczan amonu (dokładnie tak, jak opisano w ppkt 4.1.3) i wlać na wierzch spolimeryzowanego żelu, aż szklane płytki będą pełne. Włóż grzebień żelowy. Pozostaw nałożony żel do polimeryzacji przez dodatkowe 30 minut.
    7. Po polimeryzacji żelu zmontuj kasetę żelową w aparacie do elektroforezy. Alternatywnie, żel należy przechowywać w temperaturze 4 ºC, zawinięty w zwilżone ręczniki papierowe i folię spożywczą, aż będzie gotowy do użycia.
  2. Po złożeniu niedenaturującego żelu PAGE w aparacie do elektroforezy, napełnij zbiornik 1X natywnym buforem roboczym przygotowanym świeżo z 10X natywnego zapasu buforowego.
  3. Załadować 10 μg oczyszczonego białka, otrzymanego na końcu sekcji 3, do każdego dołka za pomocą szklanej strzykawki.
  4. Załaduj 2 μl natywnego wzorca białka o wysokiej masie cząsteczkowej (rozcieńczonego w 1X natywnym buforze do pracy) do jednego z dołków.
  5. Uruchomić żel pod napięciem 55 V i w temperaturze 4 ºC, aż czoło barwnika spłynie z żelu (około 4 - 4,5 godziny).
  6. Oprócz żelu niedenaturującego należy przeanalizować porcje oczyszczonego białka za pomocą standardowej karty SDS-PAGE22.
    1. Zmieszać podwielokrotności (10 μg) oczyszczonych próbek białka, otrzymanych na końcu sekcji 3, z 5-krotnym buforem próbki SDS do końcowego stężenia 1X.
    2. Inkubować w temperaturze 100 ºC przez 5 minut i załadować na standardowe żele SDS-PAGE22% i/lub 15%.
    3. Pracuj przy napięciu 80 V przez 20 minut, a następnie przy napięciu 120 V, aż czoło barwnika spłynie z żelu (jest to około dodatkowe 75 minut w przypadku żelu 12% i 120 minut w przypadku żelu 15%).

5. Wizualizacja aktywności i barwienie białek.

  1. Po elektroforezie ostrożnie oddziel szklane płytki i przenieś niedenaturujący żel do tacki żelowej zawierającej 50 ml wody dejonizowanej. Płukać żel delikatnym kołysaniem przez 5 min. Wylej wodę i powtórz ten krok prania trzy razy.
  2. Wykonaj test nakładania podłoża w następujący sposób.
    1. Dodać 1 ml buforu rozwijającego zawierającego substrat peptydu fluorogenicznego Suc-LLVY-AMC i równomiernie rozprowadzić na żelu. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
      nuta: Do rozprowadzenia płynu na żelu można użyć szklanego pręta lub rozdzielacza żelu (mały klin z tworzywa sztucznego używany do oddzielania szklanych płytek).
    2. Ostrożnie przenieś żel na transiluminator UV systemu obrazowania żelu i obserwuj fluorescencję spowodowaną rozszczepionym substratem peptydowym. Nagraj obraz. Ostrożnie przenieś żel z powrotem do tacki na żel.
    3. Spłucz żel dwukrotnie 50 ml wody dejonizowanej przez 5 minut, delikatnie kołysząc.
    4. Zabarwić żel 10 ml koloidalnego odczynnika do barwienia coomassie przez 60 minut, delikatnie kołysząc. Odplamić żel 50 ml wody, aż tło stanie się czyste. Ten etap barwienia dotyczy również standardowych żeli SDS-PAGE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Montaż proteasomu (Rysunek 1) rozpoczyna się, gdy podjednostki α łączą się w pierścienie9. Można to zilustrować, gdy podjednostki α z archeona Methanococcus maripaludis S2 są eksprimowane w E. coli jako pochodne z przyłączoną do końca C-terminalnego sekwencją sześciu histydyn (znacznikiem his) (Tabela 1). Po oczyszczeniu rekombinowanego białka α-his za pomocą ICAR i analizie metodą niedenaturującego PAGE zaobserwowano dwa prążki (Rysunek 2A, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pokazujemy korzyści płynące z połączonego podejścia do analizy składania proteasomu przez niedenaturację PAGE przy użyciu rekombinowanych proteasomów archeonów. Zwykła metoda9,11 bakteryjnej koekspresji podjednostek proteasomu pozwala na szybką analizę, ale może nie ujawniać kluczowych produktów pośrednich. Sugerujemy połączenie koekspresji z mieszaniem lizatu w celu opracowania szerszego obrazu zdarzeń montażowych.

Zaletą tego połączonego podejścia jest to, że pomimo konieczności o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez Research Support Funds Grant (RSFG) z Indiana University-Purdue University, Indianapolis, a częściowo przez nagrodę od American Heart Association 14GRNT20390154, dla A.R.K.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Roztwór akrylamidu (40%)Biorad1610104Niespolimeryzowany akryloamid jest neurotoksyną. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny
Filtry odśrodkowe Amicon ultra 0,5 mlEMDMilliporeUFC501024
Nadsiarczan amonuSigmaA3678
ATPSigmaA7699
Zestaw do oznaczania BCAPierce23225
Roztwór bisakryloamidu (2%)Biorad1610142
BłękitbromofenolowySigmaB8026
DNaseISigmaDN25
Ditiothreitol (DTT)Thermo FisherBP172
E. coli BL21 kompetentne komórkiEMD Millipore69450
GelCode BlueThermo Fisher24592Koloidalny odczynnik do barwienia coomassie do żeli
Żel doc EZ systemBiorad1708270System dokumentacji żelu
Uwalniacze żeluBiorad1653320Tworzywo sztuczne w kształcie klina służące do oddzielania płytek żelowych; przydatne do rozprowadzania cieczy.
Pręt szklanyThermo Fisher11-380B
GlycerolSigma49767
GlycineThermo FisherBP3865
Strzykawka HamiltonThermo Fisher14-813-38Szklana strzykawka do ładowania żeli
HEPESUS BiologicalsH2010
HMW Natywny zestaw kalibracyjnyGE Healthcare170445-01Wzorce białek o wysokiej masie cząsteczkowej
Hoefer SG30Thermo Fisher03-500-277Producent gradientów
ImidazolUS Biologicals280671
IPTGUS BiologicalsI8500Do indukcji ekspresji białka
IsopropanolThermo FisherBP26181
Siarczan kanamycynyUS BiologicalsK0010
LysozymeSigmaL6876
MgCl2Fluka analityczny630680
Mini Protean Tetra CellBiorad1658002EDUAparat do elektroforezy żelowej
NaClThermo FisherS640-3
NaOHThermo FisherS318-1
Pefabloc SCRoche11429876001Inhibitor proteazy
pET42EMD Milipor70562Ekspresja plazmidu
Precyzja plus cały niebieski standardBiorad1610373Molekularny wzorzec białka dla SDS-PAGE
Zestaw do szybkiej zmiany mutagenezyTechnologie Agilent200521
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Thermo FisherBP166
Suc-LLVY-AMCEnzo lifesciencesBML P802-0005Podłoże fluorogenne
Talon Metal Affinity ResinClontech635502Immobilizowana żywica kobaltowa
TEMEDSigmaT7024
TrisUS BiologicalsT8600
Triton-X100Sigma93426
TryptonBacto BD
Tacka na próbki UVBiorad1708271Do obrazowania UV żeli
Ekstrakt drożdżowyBacto BD212720
211699

Bibliografia

  1. Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
  2. Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
  3. Williamson, J. R. Cooperativity in macromolecular assembly. Nat Chem Biol. 4, 458-465 (2008).
  4. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  5. Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
  6. Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
  7. Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
  8. Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
  9. Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W. Critical elements in proteasome assembly. Nat Struct Biol. 1, 765-770 (1994).
  10. Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
  11. Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
  12. Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
  13. Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
  14. Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1, 418-428 (2006).
  15. Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
  16. McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
  17. Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
  18. Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130(2015).
  19. Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
  20. Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
  21. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  22. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  23. Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
  24. Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
  25. Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metoda koekspresjimieszanie lizat wdetekcja p proteasomuarchealny proteasom 20Spodjednostki alfa i betaekspresja bakteryjnaanaliza kompleks w bia kowych

Powiązane artykuły