Artykuł metodologiczny

Zoptymalizowany protokół do oznaczania przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni

DOI:

10.3791/54863

⸱

29 listopada 2016

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Illinois at Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy tutaj zoptymalizowany protokół fluorescencyjnych testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej (fEMSA) przy użyciu oczyszczonych białek SOX-2 wraz z sondami DNA znakowanymi barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni jako studium przypadku, aby rozwiązać ważne pytanie biologiczne.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Testy EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays) są instrumentalnym narzędziem do charakteryzowania interakcji między białkami a ich docelowymi sekwencjami DNA. Radioaktywność jest dominującą metodą znakowania DNA w EMSA. Jednak ostatnie postępy w dziedzinie barwników fluorescencyjnych i metod skanowania skłoniły do zastosowania fluorescencyjnego znakowania DNA jako alternatywy dla radioaktywności ze względu na zalety łatwej obsługi, oszczędności czasu, obniżenia kosztów i poprawy bezpieczeństwa. Niedawno wykorzystaliśmy fluorescencyjną EMSA (fEMSA), aby skutecznie odpowiedzieć na ważne pytanie biologiczne. Nasza analiza fEMSA zapewnia mechanistyczny wgląd w wpływ mutacji typu missense, G73E, w wysoce konserwatywnym czynniku transkrypcyjnym HMG SOX-2 na dywersyfikację typów neuronów węchowych. Odkryliśmy, że zmutowane białko SOX-2G73E zmienia specyficzną aktywność wiązania DNA, powodując w ten sposób transformację tożsamości neuronów węchowych. Tutaj przedstawiamy zoptymalizowany i opłacalny protokół krok po kroku dla fEMSA wykorzystujący oligonukleotydy znakowane barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni zawierające sąsiednie miejsca docelowe LIM-4 / SOX-2 i oczyszczone białka SOX-2 (WT i zmutowane białka SOX-2G73E) jako przykład biologiczny.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EMSA są używane do analizy interakcji między DNA a białkami za pomocą natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) do rozwiązania mieszaniny interesującego białka i znakowanej sondy DNA zawierającej potencjalne miejsca docelowe białka1. Sonda DNA związana z białkiem będzie migrować wolniej w porównaniu z wolną sondą DNA, a zatem jej migracja przez matrycę poliakryloamidową jest opóźniona. Znakowanie radioaktywne DNA przez 32P jest dominującą metodą wykrywania w EMSA. Chociaż zastosowanie znakowania radioaktywnego w badaniach biochemicznych jest korzystne, stosuje się alternatywne metody znakowania DNA o porównywalnej czułości ze względu na zagrożenia dla zdrowia i bezpieczeństwa związane z obchodzeniem się z promieniotwórczością. Te alternatywne metody obejmują koniugację DNA z biotyną2 lub digoksygeniną (DIG)3 (z których oba są następnie wykrywane przez systemy chemiluminescencyjne), barwienie SYBR na zielono żeli PAGE4 lub bezpośrednie wykrywanie koniugatów barwnika DNA-fluorescencyjnego poprzez skanowanie żelu5,6.

Rozwiązane żele EMSA za pomocą radioaktywnie znakowanych sond DNA wymagają przetwarzania po uruchomieniu za pomocą filmów autoradiograficznych lub systemu fosforowego do wykrywania sygnałów radioaktywnych1,7. Żele EMSA wykorzystujące sondyDNA biotyny-2 lub 3 sprzężone z DIG muszą być również przetworzone i przeniesione na odpowiednią membranę, a następnie wykryte za pomocą chemiluminescencji6. Barwienie żelu na zielono metodą SYBR wymaga barwienia żelem po uruchomieniu i skanera fluorescencyjnego4. Ze względu na to, że w przypadku EMSA stosujących te techniki znakowania DNA wymagane są etapy przetwarzania żelu po przebiegu, rozwiązany żel można oznaczyć tylko raz. W przeciwieństwie do tego, sondy DNA znakowane fluoroforami mogą być bezpośrednio wykryte w żelu wewnątrz szklanych płytek za pomocą skanera. W związku z tym interakcje DNA-białko mogą być monitorowane i oznaczane kilkakrotnie w różnych punktach czasowych podczas przebiegu, co znacznie skraca czas i obniża koszty. Koniugaty barwników fluorescencyjnych DNA, które zostały użyte w EMSA, obejmują Cy36,8, Cy56,8, fluoresceinę9 i barwniki fluorescencyjne w podczerwieni4-6.

Regulacja transkrypcji wymaga interakcji białko-DNA czynników transkrypcyjnych i ich docelowych genów. Koordynacja tych interakcji generuje różne typy komórek ze wspólnego przodka podczas rozwoju zwierząt. Bezstronne badanie genetyczne zidentyfikowało mutację typu missense, G73E, w wysoce konserwatywnej domenie wiążącej DNA HMG czynnika transkrypcyjnego SOX-2 Caenorhabditis elegans. Mutacja powoduje transformację tożsamości komórkowej neuronów węchowych AWB w neurony węchowe AWC na poziomie molekularnym, morfologicznym i funkcjonalnym5,10. SOX-2 w różny sposób reguluje końcowe różnicowanie neuronów AWB i AWC poprzez interakcję z zależnymi od kontekstu czynnikami transkrypcyjnymi partnera i odpowiednimi miejscami docelowymi DNA5,10. SOX-2 współpracuje z LIM-4 (LHX) w końcowym różnicowaniu neuronów AWB, podczas gdy SOX-2 współpracuje z CEH-36 (OTX/OTD) w końcowym różnicowaniu neuronów AWC. Testy reporterowe lucyferazy pokazują, że SOX-2 i zmutowane białkaSOX-2 G73E mają interakcje kooperacyjne z kofaktorami transkrypcyjnymi LIM-4 i CEH-36 w celu aktywacji promotora ulegającego ekspresji w neuronach AWB i AWC. Jednak SOX-2 i zmutowany SOX-2G73E wykazywały zróżnicowane właściwości aktywacji promotora. Aby zbadać molekularne podstawy zróżnicowanej aktywności wiązania DNA SOX-2 i SOX-2G73E, przeprowadzono fEMSA z tymi białkami i ich potencjalnymi miejscami docelowymi.

Po pierwsze, zastosowano podejście bioinformatyczne w celu zidentyfikowania biologicznie istotnych sekwencji wiążących DNA w regionie promotora 1 kb użytym w teście lucyferazy. Ponieważ w całym promotorze obecnych było wiele potencjalnych miejsc wiązania SOX-2, skupiliśmy się na przewidywanych miejscach wiązania SOX-2 sąsiadujących z domniemanymi miejscami wiązania CEH-36 lub LIM-4 i ewolucyjnie konserwatywnych między różnymi gatunkami nicieni. Sekwencje te zostały usunięte lub zmutowane, a następnie przetestowane in vivo pod kątem ich aktywności w zakresie ekspresji transgenów reporterowych GFP w neuronach AWB lub AWC. Dzięki takiemu podejściu zidentyfikowaliśmy potencjalne sąsiednie miejsca docelowe LIM-4 / SOX-2 i CEH-36 / SOX-2, które są specyficznie wymagane do ekspresji GFP w neuronach AWB i AWC, odpowiednio5. Zbadaliśmy potencjalne różnice w wiązaniu DNA SOX-2 i SOX-2G73E za pomocą fEMSA ze zidentyfikowanymi sąsiednimi miejscami docelowymi LIM-4 / SOX-2 i CEH-36 / SOX-2. Nasza analiza EMSA wykazała, że SOX-2G73E nie wiązał sondy DNA zawierającej sąsiednie miejsca docelowe LIM-4 / SOX-2 (wymagane do ekspresji genów w AWB) tak skutecznie, jak zrobił to WT SOX-2. Jednak SOX-2 i SOX-2G73E nie miały różnicy w wiązaniu sondy DNA zawierającej sąsiednie miejsce docelowe CEH-36 / SOX-2 (wymagane do ekspresji genu w AWC)5,10. Nasze analizy fEMSA dostarczają mechanistycznego wglądu w naturę mutacji SOX-2G73E w wpływie na specyficzną aktywność wiązania DNA dla fenotypu transformacji tożsamości komórkowej AWB-do-AWC. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół fEMSA przy użyciu oczyszczonego 6xHis-SOX-2 lub 6xHis-SOX-2G73E wraz z sondami DNA znakowanymi barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni zawierającymi sąsiednie miejsca docelowe LIM-4 / SOX-2 jako studium przypadku mające na celu rozwiązanie ważnego pytania biologicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: EMSA wykorzystujące znakowane fluorescencyjnie sondy DNA lub inne formy znakowanego DNA mają te same protokoły przygotowania ekstraktu białkowego lub komórkowego, reakcji wiązania białko-DNA oraz przygotowania i uruchomienia żelu PAGE (Figura 1A). Kluczowymi różnicami są procedury znakowania DNA, etapy przetwarzania żelu po serii i metody wykrywania.

1. Przygotowanie żelu

  1. Przygotuj 5% natywnego żelu poliakrylamidowego zawierającego 0,5 x TBE (45 mM Tris-Boran, 1 mM EDTA) i 2,5% glicerolu, używając systemu mini żelu białkowego (8,3 cm szerokości x 7,3 cm długości x 0,75 mm grubości).
    1. Aby przygotować 30 ml roztworu żelu na 4 żele, dokładnie wymieszaj 5 ml 30% akrylamidu/Bis (37,5:1), 3 ml 5x TBE (0,45 M tris-boranu, 10 mM EDTA), 1,5 ml 50% glicerolu, 300 μl 10% nadsiarczanu amonu, 15 μl TEMED i 20,2 ml ddH2O.
      UWAGA: Akrylamid jest szkodliwy i toksyczny, należy obchodzić się z nim odpowiednimi środkami ochrony osobistej.
  2. Natychmiast odleć roztwór żelu. Po polimeryzacji owinąć żele w przezroczystą folię spożywczą wstępnie zwilżoną 0,5x TBE i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Przygotowanie sond fluorescencyjnych znakowanych barwnikiem w podczerwieni

UWAGA: Oligonukleotydy znakowane barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni należy trzymać jak najdalej od światła podczas przygotowywania, przechowywania i eksperymentów.

  1. Projektowanie i porządkowanie oligonukleotydów.
    1. Zaprojektuj długi oligonukleotyd dla ~51-mers.
      UWAGA: Długa sekwencja oligonukleotydowa sondy LIM-4/SOX-2 to TATCATATCTATTCTATGATTAAATACCTATTCATTTCAAAATCTTCCC. Długie oligonukleotydy nie wymagają oczyszczania metodą PAGE ani HPLC.
    2. Zaprojektuj komplementarne krótkie oligonukleotydy dla ~14-merów z modyfikacją barwnika fluorescencyjnego w podczerwieni na końcu 5' (5'Dye) i temperaturą topnienia powyżej 37 °C.
      UWAGA: Krótka sekwencja oligonukleotydowa sondy LIM-4/SOX-2 to 5'Dye-GGGAGAAGATTTTG. Minimalna skala syntezy krótkich oligonukleotydów znakowanych barwnikiem 5' wynosi 100 nM. Dlatego oligonukleotydy wymagają oczyszczenia metodą HPLC.
  2. Zawiesić oligonukleotydy w 1x buforze Tris-EDTA (TE: 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) do końcowego stężenia 100 μM.
  3. Wyżarzane krótkie (5'Dye) i długie oligonukleotydy.
    1. Wymieszać 0,6 μl 5'Dye-Short oligo (100 μM), 1,2 μL Long oligo (100 μM) i 28,2 μl buforu chlorku sodu-Tris-EDTA (STE: 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) w probówce o pojemności 1,5 ml.
    2. Umieść probówkę we wrzącej wodzie na 5 minut. Wyłącz źródło ciepła i pozwól, aby woda z wyżarzonymi oligonukleotydami ostygła w ciemności.
  4. Wypełnij 5' zwisy wyżarzonych 5'Dye-Short/Long oligokleotydazy polimerazą DNA Klenowa, aby uzyskać dwuniciowe sondy DNA.
    1. Przygotować reakcję, mieszając 30 μl wyżarzonych krótkich/długich oligonukleotydów ze znacznikiem 5'Dye, 8,5 μl 10x buforu Klenowa, 1,7 μl 10 mM dNTP, 1,7 μl Klenowa (3'->5' egzo-) (5 u/μL) i 43,1 μl ddH2O w probówce PCR o pojemności 0,2 ml.
    2. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C w maszynie do PCR.
    3. Dodać 3,4 μl 0,5 M EDTA, aby zatrzymać reakcję i inaktywować ciepło w temperaturze 75 °C przez 20 minut w maszynie do PCR.
  5. Rozcieńczyć wypełnione sondy (0,7 μM) w STE do końcowego stężenia 0,1 μM.
  6. Oligonukleotydy przechowywać w temperaturze -20 °C w ciemności do czasu użycia. Oligonukleotydy mogą być przechowywane w takim stanie przez okres do roku.
    UWAGA: Aby wygenerować sondy DNA ze zmutowanymi miejscami wiązania, zmutowane wersje długich oligonukleotydów są wyżarzane krótkimi oligonukleotydami znakowanymi barwnikiem 5', a następnie wypełniane są zwisami 5' za pomocą Klenowa. Wykazano, że sonda z jedną nicią znakowaną barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni ma tylko 30% intensywności sondy przy obu pasmach znakowanych barwnikiem. Jeśli intensywność sygnału musi zostać wzmocniona, długie oligonukleotydy obu pasm są znakowane barwnikami fluorescencyjnymi w podczerwieni na końcach 5' i wyżarzane w celu uzyskania sond znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni.

3. Przygotowanie nieoznakowanych/zimnych sond (konkurenci)

Uwaga: Długie oligonukleotydy sekwencji komplementarnych (Long i LongR) wyżarzano w celu uzyskania nieznakowanych sond do analizy konkurencji za pomocą sond znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni.

  1. Wymieszaj 20 μl oligonukleotydów o długości 100 μM, 20 μl oligonukleotydów 100 μM LongR i 60 μl STE w probówce o pojemności 1,5 ml.
  2. Umieść probówkę we wrzącej wodzie na 5 minut, wyłącz źródło ciepła i pozwól wodzie z wyżarzonymi oligonukleotydami ostygnąć przez noc.

4. Reakcja wiązania i elektroforeza

  1. Przygotować 1 ml 5x buforu wiążącego, mieszając 50 μl 1 M Tris-HCl, pH 7,5; 10 μl 5 M NaCl; 200 μL z 1 M KCl, 5 μL z 1 M MgCl2, 10 μL z 0,5 M EDTA, pH 8,0; 5 μl 1 M naziemnej telewizji cyfrowej; 25 μl 10 mg/ml BSA i 695 μl ddH2O.
    UWAGA: 5x bufor wiążący może być porcjowany i przechowywany w temperaturze -20 °C. Inną kwestią do rozważenia jest to, że różne czynniki transkrypcyjne będą miały różne modyfikacje bufora wiążącego.
  2. Tuż przed rozpoczęciem reakcji wiązania należy wstępnie uruchomić 5% natywny żel poliakryloamidowy w 0,5x TBE + 2,5% glicerolu, aby usunąć wszelkie ślady nadsiarczanu amonu przy napięciu 80 V przez 30 - 60 minut lub do momentu, gdy prąd przestanie się zmieniać w czasie.
  3. Ustawić reakcję wiązania w końcowej objętości 20 μl.
    1. Wymieszaj 4 μl 5x buforu wiążącego, 80 - 200 ng oczyszczonego białka A (w 50% glicerolu, tj. SOX-2), 1 μL 0,1 μM sondy sprzężonej z barwnikiem (końcowe stężenie: 5 nM) i ddH2O.
    2. Opcjonalnie: Gdy wymagana jest zimna sonda, dodaj różne stężenia (2x, 10x, 25x, 50x, 100x itd.) zimnych sond.
    3. Opcjonalnie: Podczas badania interakcji między białkami A i B (tj. SOX-2 i LIM-4) dodać 80 - 200 ng oczyszczonego białka B (w 50% glicerolu, tj. LIM-4).
    4. Opcjonalnie: Gdy stosuje się preparat ekstraktu jądrowego i ma zostać zweryfikowane specyficzne wiązanie białka A, dodać przeciwciało specyficzne dla białka A (tj. anty-6xHis, anty-FLAG itp.).
    5. Inkubować w R/T w ciemności przez 15 minut.
  4. Załaduj całą reakcję wiązania na żel i uruchom żel pod napięciem 10 V/cm na żądaną odległość.

5. Obrazowanie

UWAGA: Żel został zeskanowany bezpośrednio w szklanych płytkach za pomocą zaawansowanego systemu obrazowania w podczerwieni. W związku z tym żel może być dalej rozpuszczany i wielokrotnie skanowany (ryc. 1C i 2). System obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni, głównie dla Western blot, został również przetestowany w celu zeskanowania żelu, ale tylko zaawansowany system obrazowania w podczerwieni był w stanie zeskanować żel z dobrą rozdzielczością. Opisana metodologia jest specyficzna dla konkretnego oprogramowania do obrazowania w podczerwieni, chociaż mogą być używane inne pakiety oprogramowania.

  1. Wyczyść łóżko skanera za pomocą ddH2O i dobrze wysusz przed skanowaniem. Wytrzyj do sucha szklane płytki żelu i umieść płytki zawierające żel na łóżku skanera.
  2. Otwórz oprogramowanie do obrazowania w podczerwieni i przejdź do zakładki "Pobierz". Po umieszczeniu cieńszej płytki (1 mm) na stole skanera użyj ustawień Kanał: 700, Intensywność: Auto, Rozdzielczość: 169 μm, Jakość: średnia i Przesunięcie ostrości: 1,5 mm. Po umieszczeniu grubszej płytki (3 mm) na stole skanera należy użyć ustawień Kanał: 700, Intensywność: Auto, Rozdzielczość: 84 μm, Jakość: średnia i Przesunięcie ostrości: 3,5 mm. Przesunięcie ostrości zależy od grubości płyty szklanej.
  3. Wybierz obszar, który żel zajmuje na skanerze. Kliknij "Start", aby rozpocząć skanowanie.
  4. Powtórz elektroforezę i w razie potrzeby skanuj dodatkowo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomarańczowy barwnik ładujący G (6x: 0,12 g pomarańczowego G w 100 ml 30% glicerolu) może zostać dodany do reakcji wiązania przed ładowaniem, aby zobrazować postęp elektroforezy. Inne barwniki obciążające, w tym błękit bromofenolowy, zostaną wykryte podczas skanowania, a tym samym zakłócą analizę obrazu (ryc. 1B).

W niektórych przypadkach EMSA, zwłaszcza jeśli stosuje się preparat ekstraktu jądrowego, poli deoks...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

fEMSA są skutecznym narzędziem do badania interakcji białko-DNA i stanowią alternatywę dla radioaktywnego znakowania DNA. Barwniki fluorescencyjne, takie jak barwniki podczerwone, są dostępne na rynku i stanowią bezpieczniejszą i bardziej przyjazną dla środowiska metodę w porównaniu z radioaktywnym znakowaniem DNA. EMSA wykorzystujące oligonukleotydy znakowane barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni nie wymagają etapów przetwarzania żelu po uruchomieniu, a zatem oszczędzają czas i koszty w porównaniu z innymi technika...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez stypendium badawcze Alfreda P. Sloana (do C.-F.C.) oraz grant NIH R01 (5R01GM098026-05 do C.-F.C.). Dziękujemy Davidowi Crowe'owi za dostęp do zaawansowanego systemu obrazowania w podczerwieni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
30% roztwór akryloamidu/bis, 37,5:1 Bio-Rad1610158Akrylamid jest szkodliwy i toksyczny.
6x-Przeciwciało znacznika epitopu His (HIS. H8)Przeciwciało ThermoFisherMA1-21315
Anti-Flag M2 Sigma-AldrichF3165-.2MG
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) klasa biologii molekularnejNew England BiolabsB9000S
Oligonukleotydy DNA znakowane 5'IRDye700Zintegrowane technologie DNA Niestandardoweoligo DNA Sąone określane w manuskrypcie jako "Oligonukleotydy DNA znakowane barwnikiem 5' lub fluorescencyjnym barwnikiem znakowanym w podczerwieni". Firma będzie niestandardowo syntetyzować oligonukleotydy DNA znakowane 5' IRDye. Wymagane minimum 100  μ Synteza w skali M i oczyszczanie HPLC.
Fragment Klenowa (egzo->-5'New England BiolabsM0212S
LightShif Poly (dI-dC)ThermoFisher20148E
Mini-PROTEAN  Pionowe ogniwo do elektroforezy Bio-Rad1658000FC W manuskrypcie nazywa się to "mini systemem żelu białkowego". Można zastosować dowolny system elektroforetyczny, o ile są to przezroczyste szklane płytki o wymiarach mniejszych niż 25 cm x 25 cm.
System obrazowania w podczerwieni Odyssey CLxLI-COR BiotechnologySystem obrazowania w podczerwieni Odyssey CLxW manuskrypcie jest on określany jako "zaawansowany system obrazowania w podczerwieni".
System obrazowania Odyssey FC LI-COR BiotechnologyOdyssey Fc Dual-Mode Imaging SystemW manuskrypcie jest to określane jako "system obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni głównie dla zachodnich plam".
Oprogramowanie Image Studio (wersja 4.0)Oprogramowanie LI-COR BiotechnologyImage Studio W manuskrypcie jest to określane jako "szczególne oprogramowanie do obrazowania". 
Pomarańczowy GSigma-AldrichO3756-25G
6x Pomarańczowy barwnik ładujący0,25% Pomarańczowy G; 30% Glicerol
0,5x TBE45 mM Tris-Boran; 1 mM EDTA
1x TE10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA
1x STE100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA
5x Bufor wiążący50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM naziemnej telewizji cyfrowej; 250 μ g/ml BSA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  2. Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).
  3. Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations. Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).
  4. Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels. Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).
  5. Alqadah, A., et al. Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2. EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).
  6. Jullien, N., Herman, J. P. LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure. Biotechniques. 51, 267-269 (2011).
  7. Poulin-Laprade, D., Burrus, V. Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes. Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).
  8. Ruscher, K., et al. A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay. J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).
  9. Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
  10. Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. Sox2 goes beyond stem cell biology. Cell cycle. , (2016).
  11. Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins. Biotechniques. 20, 439-444 (1996).
  12. Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe. Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).
  13. Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes. Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).
  14. Steiner, S., Pfannschmidt, T. Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Electrophoretic Mobility Shift AssayInfrared Fluorescent DyeProtein DNA InteractionNon radioactive ProbesNative Polyacrylamide GelOligonucleotide AnnealingDNA Binding ActivityPurified SOX 2 ProteinInfrared Imaging SystemSupershift Assay

Powiązane artykuły