Zoptymalizowany protokół do oznaczania przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej przy użyciu oligonukleotydów znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni

Summary

Opisujemy tutaj zoptymalizowany protokół fluorescencyjnych testów przesunięcia mobilności elektroforetycznej (fEMSA) przy użyciu oczyszczonych białek SOX-2 wraz z sondami DNA znakowanymi barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni jako studium przypadku, aby rozwiązać ważne pytanie biologiczne.

Abstract

Testy EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays) są instrumentalnym narzędziem do charakteryzowania interakcji między białkami a ich docelowymi sekwencjami DNA. Radioaktywność jest dominującą metodą znakowania DNA w EMSA. Jednak ostatnie postępy w dziedzinie barwników fluorescencyjnych i metod skanowania skłoniły do zastosowania fluorescencyjnego znakowania DNA jako alternatywy dla radioaktywności ze względu na zalety łatwej obsługi, oszczędności czasu, obniżenia kosztów i poprawy bezpieczeństwa. Niedawno wykorzystaliśmy fluorescencyjną EMSA (fEMSA), aby skutecznie odpowiedzieć na ważne pytanie biologiczne. Nasza analiza fEMSA zapewnia mechanistyczny wgląd w wpływ mutacji typu missense, G73E, w wysoce konserwatywnym czynniku transkrypcyjnym HMG SOX-2 na dywersyfikację typów neuronów węchowych. Odkryliśmy, że zmutowane białko SOX-2^G73E zmienia specyficzną aktywność wiązania DNA, powodując w ten sposób transformację tożsamości neuronów węchowych. Tutaj przedstawiamy zoptymalizowany i opłacalny protokół krok po kroku dla fEMSA wykorzystujący oligonukleotydy znakowane barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni zawierające sąsiednie miejsca docelowe LIM-4 / SOX-2 i oczyszczone białka SOX-2 (WT i zmutowane białka SOX-2^G73E) jako przykład biologiczny.

Introduction

EMSA są używane do analizy interakcji między DNA a białkami za pomocą natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE) do rozwiązania mieszaniny interesującego białka i znakowanej sondy DNA zawierającej potencjalne miejsca docelowe białka¹. Sonda DNA związana z białkiem będzie migrować wolniej w porównaniu z wolną sondą DNA, a zatem jej migracja przez matrycę poliakryloamidową jest opóźniona. Znakowanie radioaktywne DNA przez ³²P jest dominującą metodą wykrywania w EMSA. Chociaż zastosowanie znakowania radioaktywnego w badaniach biochemicznych jest korzystne, stosuje się alternatywne metody znakowania DNA o porównywalnej czułości ze względu....

Protocol

UWAGA: EMSA wykorzystujące znakowane fluorescencyjnie sondy DNA lub inne formy znakowanego DNA mają te same protokoły przygotowania ekstraktu białkowego lub komórkowego, reakcji wiązania białko-DNA oraz przygotowania i uruchomienia żelu PAGE (Figura 1A). Kluczowymi różnicami są procedury znakowania DNA, etapy przetwarzania żelu po serii i metody wykrywania.

1. Przygotowanie żelu

1. Przygotuj 5% natywnego żelu poliakrylamidowego zawierającego 0,5 x TBE (45 mM Tris-Boran, 1 mM EDTA) i 2,5% glicerolu, używając systemu mini żelu białkowego (8,3 cm szerokości x 7,3 cm długości x 0,75 mm grubości).
   1. Aby przygotować 30 ml roztworu ....

Results

Pomarańczowy barwnik ładujący G (6x: 0,12 g pomarańczowego G w 100 ml 30% glicerolu) może zostać dodany do reakcji wiązania przed ładowaniem, aby zobrazować postęp elektroforezy. Inne barwniki obciążające, w tym błękit bromofenolowy, zostaną wykryte podczas skanowania, a tym samym zakłócą analizę obrazu (ryc. 1B).

W niektórych przypadkach EMSA, zwłaszcza jeśli stosuje się preparat ekstraktu jądrowego, poli deoks.......

Discussion

fEMSA są skutecznym narzędziem do badania interakcji białko-DNA i stanowią alternatywę dla radioaktywnego znakowania DNA. Barwniki fluorescencyjne, takie jak barwniki podczerwone, są dostępne na rynku i stanowią bezpieczniejszą i bardziej przyjazną dla środowiska metodę w porównaniu z radioaktywnym znakowaniem DNA. EMSA wykorzystujące oligonukleotydy znakowane barwnikiem fluorescencyjnym w podczerwieni nie wymagają etapów przetwarzania żelu po uruchomieniu, a zatem oszczędzają czas i koszty w porównaniu z innymi technika.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% roztwór akryloamidu/bis, 37,5:1	Bio-Rad	1610158	Akrylamid jest szkodliwy i toksyczny.
6x-Przeciwciało znacznika epitopu His (HIS. H8)	Przeciwciało ThermoFisher	MA1-21315
Anti-Flag M2	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Albumina surowicy bydlęcej (BSA) klasa biologii molekularnej	New England Biolabs	B9000S
Oligonukleotydy DNA znakowane 5'IRDye700	Zintegrowane technologie DNA Niestandardowe	oligo DNA Są	one określane w manuskrypcie jako "Oligonukleotydy DNA znakowane barwnikiem 5' lub fluorescencyjnym barwnikiem znakowanym w podczerwieni". Firma będzie niestandardowo syntetyzować oligonukleotydy DNA znakowane 5' IRDye. Wymagane minimum 100  μ Synteza w skali M i oczyszczanie HPLC.
Fragment Klenowa (egzo->-5'	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN  Pionowe ogniwo do elektroforezy	Bio-Rad	1658000FC	W manuskrypcie nazywa się to "mini systemem żelu białkowego". Można zastosować dowolny system elektroforetyczny, o ile są to przezroczyste szklane płytki o wymiarach mniejszych niż 25 cm x 25 cm.
System obrazowania w podczerwieni Odyssey CLx	LI-COR Biotechnology	System obrazowania w podczerwieni Odyssey CLx	W manuskrypcie jest on określany jako "zaawansowany system obrazowania w podczerwieni".
System obrazowania Odyssey FC	LI-COR Biotechnology	Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System	W manuskrypcie jest to określane jako "system obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni głównie dla zachodnich plam".
Oprogramowanie Image Studio (wersja 4.0)	Oprogramowanie LI-COR Biotechnology	Image Studio	W manuskrypcie jest to określane jako "szczególne oprogramowanie do obrazowania".
Pomarańczowy G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Pomarańczowy barwnik ładujący			0,25% Pomarańczowy G; 30% Glicerol
0,5x TBE			45 mM Tris-Boran; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA
5x Bufor wiążący			50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM naziemnej telewizji cyfrowej; 250 μ g/ml BSA